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1 中国农学通报 2014,30(6): Chinese Agricultural Science Bulletin 转基因抗虫玉米的定量检测孙红炜, 李凡, 杨淑珂, 张广远, 路兴波 ( 山东省农业科学院植物保护研究所 / 山东省植物病毒学重点实验室, 济南 ) 摘要 : 建立高效快速准确的抗虫转基因玉米 MIR162 转化体特异性实时荧光 PCR(real-time PCR) 检测方法采用 SYBR Green I 和 Taqman 探针 2 种定量方法对抗虫转基因玉米 MIR162 进行了检测研究 SYBR Green I 法 MIR162 转化体特异性片段和内标基因 zssiib 的熔解曲线均表现为单一峰, 扩增特异性强 ; 二者的扩增效率均在 90%~100% 之间, 标准曲线相关系数 R 2 均大于种定量方法的检测限 (LOD) 均为 24 个拷贝, 定量限 (LOQ) 为 48 个拷贝, 灵敏度较高重复测试结果表明,SYBR Green I 法的标准偏差 () 变化范围为 0.05~0.13, 相对标准偏差 (R) 范围为 0.17%~0.40%,Taqman 探针法的变化范围为 0.03~0.14,R 范围为 0.11%~0.44%, 说明 2 种定量检测方法具有良好的重复性和精密度对 MIR162 含量为 3% 1% 和 0.5% 的混合样品的定量结果为 :3.13% 1.09% 0.53%(SYBR Green I 法 ) 和 3.07% 1.02% 0.50%(Taqman 探针法 ),R 均小于 10%,T 检验分析表明 2 种定量方法定值结果差异不显著本研究建立的 2 种实时荧光定量 PCR 均可有效对转基因玉米 MIR162 进行定量检测, 可根据不同实际需求及实验室条件进行选择相应的检测方法关键词 : 转基因抗虫玉米 ;SYBR Green I;Taqman;real-time PCR 中图分类号 :S513 文献标志码 :A 论文编号 : Quantitative Detection of Pest-resistant Genetically Modified Maize Sun Hongwei, Li Fan, Yang Shuke, Zhang Guangyuan, Lu Xingbo (Institute of Plant Protection, Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Key Laboratory of Plant Virology, Jinan ) Abstract: The aim was to build efficient, rapid and accurate event-specific quantitative real-time PCR detection methods of insect-resistant genetically modified maize MIR162. SYBR Green I and TaqMan Probe quantitative PCR methods were established in this study. The melting curves of MIR162 event-specific and endogenous reference gene zssiib were both single peak which mean the primers were specific. The recovery rates of SYBR Green I and TaqMan were between 90%-100% and their R 2 values were both above The limits of detection (LOD) and limits of quantitation (LOQ) of these two methods were 24 and 48 copies, respectively, which suggested that the two quantitative systems had an acceptable and high sensitivity. Moreover, the standard deviations () and relative standard deviations (R) of repeatability ranged from 0.05 to 0.13 and 0.17% to 0.40% for SYBR Green I; 0.03 to 0.14 and 0.11% to 0.44% for TaqMan. Thereafter, three mixed maize samples (3%, 1%, 0.5%) were quantified to be 3.13%, 1.09%, 0.53% (SYBR Green I) and 3.07%, 1.02%, 0.50% (Taqman) respectively. T-test showed the quantification results of these two methods were not significantly different. The two event-specific quantitative PCR systems established in the studies were 基金项目 : 转基因生物新品种培育重大专项农业生态风险监测与控制技术 (2013ZX ) 第一作者简介 : 孙红炜, 女,1973 年出生, 山东海阳人, 副研究员, 硕士, 主要从事转基因植物检测及环境安全性评价研究通信地址 : 济南市历城区工业北路 202 号山东省农业科学院植物保护研究所,Tel: , hongweisun@126.com 通讯作者 : 路兴波, 男,1970 年出生, 山东新泰人, 研究员, 博士, 主要从事转基因植物检测及环境安全性评价研究通信地址 : 济南市历城区工业北路 202 号山东省农业科学院植物保护研究所,Tel: , luxb99@sina.com 收稿日期 : , 修回日期 :

异性片段和内标基因 zssiib 的熔解曲线均表现为单一峰, 扩增特异性强 ; 二者的扩增效率均在 90%~100% 之间, 标准曲线相关系数 R 2 均大于 0.

2 102 中国农学通报 acceptable and suitable for MIR162 identification and quantification, and the users might select corresponding method based on actual demand and laboratory conditions. Key words: pest-resistant genetically modified maize; SYBR Green I; Taqman; real-time PCR 0 引言截至 2012 年, 全球转基因作物种植面积达到 1.7 亿 hm 2 [1], 其中转基因玉米种植面积居前列作为中国最重要的粮食及饲料作物之一, 国内转基因玉米研发工作进展也较为迅速, 目前有多个转基因玉米优良品系进入环境释放阶段, 申请商业化种植, 其中转植酸酶玉米已经获得安全评价证书在转基因作物迅猛发展的同时, 也伴随着人们对其环境安全和食用安全的关注和质疑因此, 研究和制定转基因作物及其产品成分检测标准, 对于加强转基因作物安全管理, 防止转基因作物未经安全批准进入生产流通环节 ; 保障转基因生物安全和人类健康, 保护消费者利益 ; 消除公众对转基因作物安全性的疑虑, 营造良好的转基因作物产业化氛围具有重要意义转基因抗虫玉米 MIR162 是由先正达公司育成的具有抗秋粘虫甘蔗食心虫玉米穗蛾及其他鳞翅目害虫的转基因玉米, 目前该品系已在美国加拿大巴西和阿根廷获得商业化种植批准, 越南也于近期批准了该转基因品种的田间试验申请随着中国肉类消耗量的增多, 玉米作为饲料的需求激增, 越来越多地从国外进口玉米及以玉米为原料的饲料如 2012 年 1 10 月份, 国内玉米进口量达万 t, 比 2011 年同期增加万 t, 增幅 385.7%, 而进口玉米大部分来自美国, 这些进口玉米中不可避免会含有转基因玉米根据中国农业转基因生物安全管理条例及农业转基因生物标识管理办法规定, 转基因产品必须进行必要的标识管理本研究对该抗虫玉米定量检测方法进行了研究, 旨在建立高效准确方便低成本的转基因玉米 MIR162 定量检测技术, 为转基因玉米 MIR162 的监管提供重要的技术保障 1 材料与方法 1.1 试验材料及 DNA 提取转基因玉米品系为 MIR162 用 DNA 提取试剂盒 (Omega) 提取基因组 DNA, 紫外分光光度计 (Nanovueplus) 对 DNA 的纯度和浓度进行分析 1.2 转化体特异性引物和探针玉米内标基因 zssiib 定量 PCR 引物及探针参照 [2] 李想等研究根据 MIR162 玉米旁侧序列, 采用 Primer Express2.0 软件设计 MIR162 转化体特异性引物和探针引物及探针序列见表 1 表 1 引物及探针序列引物名称 zssiib MIR162 引物及探针序列 (5'-3') F:CGGTGGATGCTAAGGCTGATG R:AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC P:FAM-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-Eclipse F:CTGTCTAATAGTTTGAGTGA R:GTGACTCCCTTAATTCTC P:FAM-CAGATTGTCGTTTCCCGCCTTC-Eclipse 扩增大小 /bp 实时荧光 PCR 扩增 SYBR Green I 法 : 采用罗氏 SYBR Green I 定量 PCR 试剂盒, 反应体系 :2 FastStart Universal SYBR Green Master(Rox) 10 μl, 上游引物 (10 μmol/l) 0.4 μl, 下游引物 (10 μmol/l) 0.4 μl,dna 模板 1 μl, 加水补至 20 μl 反应条件 :95 10 min,95 15 s,60 60 s( 采集荧光信号 ), 共 40 个循环将 SYBR Green I 的扩增产物从 60 缓慢而均匀地以 0.3 /s 的速率升温到 95, 记录荧光信号的变化, 绘制出扩增产物的溶解曲线 Taqman 探针法 : 采用罗氏 Taqman 探针定量 PCR 反应试剂盒反应体系 :2 FastStart Universal Probe Master(Rox) 12.5 μl, 上下游引物 (10 μmol/l) 各 1 μl, 探针 (10 μmol/l) 0.5 μl, 模板 DNA 1 μl, 加水补足至 20 μl 反应程序 :95 10 min;95 15 s,60 1 min( 收集荧光信号 ),40 个循环 1.4 标准曲线的制作将样品 DNA 用 Easy Dilution 缓冲液 (TaKaRa) 依次稀释至 copies/μl, 分别进行 zssiib 及 MIR162 转化体特异性实时荧光 PCR 扩增, 每个梯度设置 3 个平行重复, 绘制标准曲线

Key words: pest-resistant genetically modified maize; SYBR Green I; Taqman; real-time PCR 0 引言截至 2012 年, 全球转基因作物种植面积达到 1.

3 孙红炜等 : 转基因抗虫玉米的定量检测转基因玉米 MIR162 混合样品定量检测玉米内标准基因 zssiib 只有一个拷贝, 而 MIR162 转基因玉米只有一个单拷贝插入位点, 根据 3 次定量实验 Ct 平均值和标准曲线得出样品中内标准基因 zssiib 和 MIR162 转化体特异性序列的 DNA 拷贝数, 按照下面公式计算样品转基因含量 [9] : 转基因含量 = 2 结果与分析转化体特异性序列 DNA 拷贝数内标基因拷贝数 2.1 SYBR Green I 法溶解曲线分析 100% 由于 SYBR Green I 实时荧光定量 PCR 扩增时染料对双链 DNA 的识别不具备特异性, 因此必须要通过溶解曲线来分析反应的特异性对 MIR162 转化体 zssiib 扩增产物溶解曲线分析表明, MIR162 转化体特异性产物 Tm 平均值为 ( 标准偏差 () 为 0.2 ),zssiib 扩增产物 Tm 平均值为 ( 为 0.3 ), 二者扩增产物溶解曲线均呈单一峰型, 空白对照呈平坦直线, 由此判断 MIR162 转化体 zssiib 在 SYBR Green I 定量 PCR 反应过程中, 无非特异性扩增和引物二聚体出现, 所得 Ct 值可信度较高 2.2 标准曲线建立能否建立准确可靠的标准曲线是决定定量检测是否科学准确的主要依据一般来说, 标准曲线的斜率在 -3.1~-3.6 之间, 相关性系数 R 2 在 0.99 以上, 扩增效率在 90%~110% 之间表明标准曲线质量较好, 定量结果可靠 SYBR Green I 方法得到的 MIR162 转化体特异性扩增曲线和标准曲线见图 2, 扩增效率为 %, 转化体特异性片段扩增 Ct 值与起始模板量线性方程为 : Y=-3.437X , 线性相关系数 R 2 =0.998;Taqman 探针法得到的 MIR162 转化体特异性扩增曲线和标准曲线见图 3, 反应扩增效率为 %, 转化体特异性扩增 Ct 值与起始模板量线性方程为 :Y=-3.398X , 线性相关系数 R 2 =0.999 SYBR Green I 方法建立的 zssiib 扩增曲线和标准曲线见图 4,zSSIIb 基因 Ct 值与起始模板量线性方程为 :Y=-3.435X , 线性相关系数 R 2 =0.999, 扩增效率为 %;Taqman 探针法 zssiib 扩增曲线和标准曲线见图 5,zSSIIb 基因 Ct 值与起始模板量线性方程为 :Y=-3.481X , 线性相关系数 R 2 =0.998, 扩增效率为 % 以上数据表明, 这 2 种定量方法所建立的标准曲图 1 MIR162 转化体 (A) 及 zssiib(b) 溶解曲线图 2 SYBR Green I 法 MIR162 转化体特异性扩增曲线 (A) 和标准曲线 (B)

DNA 拷贝数, 按照下面公式计算样品转基因含量 [9] : 转基因含量 = 2 结果与分析转化体特异性序列 DNA 拷贝数内标基因拷贝数 2.

4 104 中国农学通报ＣｙｃｌｅＱｕａｎｔｉｔｙＡＢ图 3 Taqman 探针法 MIR162 转化体特异性扩增曲线(A)和标准曲线(B) ＣｙｃｌｅＱｕａｎｔｉｔｙＡＢ图 4 SYBR Green I 法 zssiib 基因扩增曲线(A)和标准曲线(B) ＣｙｃｌｅＱｕａｎｔｉｔｙＡＢ图 5 Taqman 探针法 zssiib 基因扩增曲线(A)和标准曲线(B) 线相关性高扩增效率适宜因此采用这 2 种方法对个和 6 个阳性信号无法检出全部样品而在 24 个拷贝 MIR162 进行定量检测具备良好的基础及以上时所有重复均能检测到阳性信号说明 2 种定 2.3 检测灵敏度分析量方法能够稳定检测到 24 个拷贝的模板 DNA 因此检测限(LOD)和定量限(LOQ)是衡量检测方法灵确定 2 种定量方法的 LOD 为 24 个拷贝由于 24 个拷敏度的重要指标为确定 SYBR Green I 和 Taqman 2 贝时定量检测 Ct 值的标准偏差 () 较大 0.26 和种方法的 LOD 和 LOQ 将 MIR162 基因组 DNA 依次 0.31 为确保定量结果具有更高的准确度 2 种方法的稀释至 copies/μl 以此为模板分别由 3 定量限(LOQ)均认定为 48 个拷贝总体来看 2 种方位实验人员分别进行 2 种实时荧光 PCR 扩增每次设法检测灵敏度基本一致置 3 个平行重复由表 2 可看出基因组 DNA 为 9.6 个 2.4 定量检测数据稳定性及精密度分析拷贝时 SYBR Green I 和 Taqman 2 种方法分别检出 5 和相对标准偏差(R)是衡量定量结果是否稳

基因扩增曲线(A)和标准曲线(B) 线相关性高扩增效率适宜因此采用这 2 种方法对个和 6 个阳性信号无法检出全部样品而在 24 个拷贝 MIR162 进行定量检测具备良好的基础及以上时所有重复均能检测到阳性信号说明 2 种定 2.

5 孙红炜等 : 转基因抗虫玉米的定量检测 105 表 2 2 种定量检测方法灵敏度分析拷贝数 SYBR Green I 法阳性信号数 Taqman 探针法阳性信号数 /9 a 6/9 注 : a :5/9 表示在 9 次重复中有 5 次为阳性信号定精确的重要指标根据 3 次定量实验得到的 Ct 值计算 2 种方法的和 R, 结果如表 3 所示,SYBR Green I 法的变化范围为 0.05~0.13,Taqman 探针法的变化范围为 0.03~0.14, 数值均较小, 说明这 2 种定量检测方法能够重复获得稳定的检测数据 ; SYBR Green I 法 R 的范围为 0.17%~0.40%;Taqman 探针法 R 的范围为 0.11%~0.44%, 说明这 2 种定量检测方法精密度较高, 结果准确可靠 2.5 样品实测结果采用建立的方法对已知浓度的混合样品进行测定, 按 1.5 公式计算转基因百分含量, 结果显示 : MIR162 含量分别为 3% 1% 0.5% 的 3 个混合样品用 SYBR Green I 法的测定结果分别为 3.13% 1.09% 和 0.53%, 相对误差分别为 4.33% 9% 6%, 其 R 分别为 4.51% 2.65% 和 2.08%; 而 Taqman 探针法的检测结果分别为 3.07% 1.02% 和 0.50%, 相对误差分别为 2.33% 2% 0%,R 为 8.74% 9.07% 和 6.08% 比较来看, 在进行混合样品检测时,SYBR Green I 法检测相对误差大于 Taqman 探针法, 但检测相对标准偏差小于 Taqman 探针法,2 种检测方法 R 均小于 10%, 符 [9] 合欧盟转基因检测方法的要求, 将 2 组定量结果进行 T 检验分析, 结果发现 3 个样品的定量值在 95% 的置信区间无显著差异 ( 表 4) 这些结果表明, 本研究建立的 2 种方法都可作为转基因玉米 MIR162 定量检测的科学有效手段, 可以根据不同检测要求及实验室条件选择相应的方法表 3 2 种定量方法检测数据稳定性及精密度比较模板拷贝数 Ct 平均值 SYBR Green I R/% Ct 平均值 Taqman R/% 表 4 SYBR Green I 法和 Taqman 探针法测定转基因样品的转基因成分含量 MIR162 理论含量 /% MIR162 实测含量 /% 相对误差 /% R/% P a,3.07 b 4.33 a,2.33 b 4.51 a,8.74 b ,1.02 9,2 2.65, ,0.50 6,0 2.08, 注 : a :SYBR Green I 法定量结果 ; b :Taqman 探针法定量结果结果进行 T 检验,α= 结论与讨论转基因作物的检测方法主要有核酸检测法和蛋白质检测法由于蛋白质检测方法繁琐复杂, 检测灵敏度低, 因此日常检测工作中主要应用核酸检测法核酸检测方法有多种形式, 如多重复合 PCR [3-4] 多重巢式 PCR [5] real-time PCR [6-10] [11] 基因芯片环介导等温扩增技术 (LAMP) [12] 等其中, 尤以定性 PCR 检测和实时荧光定量 PCR 检测应用最为广泛定性 PCR 方法简单方便仪器及试剂成本低, 但是存在重复性差, 假阳性高 EB 污染严重等问题, 尤其在进行复杂样品 ( 如混

14, 数值均较小, 说明这 2 种定量检测方法能够重复获得稳定的检测数据 ; SYBR Green I 法 R 的范围为 0.17%~0.40%;Taqman 探针法 R 的范围为 0.11%~0.44%, 说明这 2 种定量检测方法精密度较高, 结果准确可靠 2.

6 106 中国农学通报合样品 ) 检测时, 定性 PCR 方法更容易因为模板成分复杂等原因产生互相干扰等问题而影响检测结果的判断而定量 PCR 方法以其快速准确灵敏自动化程度高重现性好污染少等优势在实际检测工作中得到越来越广泛的应用 [6-10] 目前 Taqman 探针实时荧光 PCR 是国际标准中普遍使用的定量方法 [13-14], 国内标准中部分涉及到定量 PCR 检测方法, 并且大部分采用 Taqman 探针法, 但仅限于转基因玉米及大豆等少数品种, 而且, 大部分标准中虽然使用了 Taqman 探针法, 但只是用定量方法进行定性判断, 并未对产品进行定量 [15-16] Permingeat [17] 对 4 种欧盟认可的转基因玉米及食品中转基因玉米的成分进行了实时定量 PCR 检测, 其检测低限可达 0.1%, 约 36 个拷贝, 对不同转基因玉米品种检测的标准偏差为 5%~20% 而本实验中采用的 2 种定量方法的检测限均为 24 个拷贝, 定量限为 48 个拷贝, 相对标准偏差均小于 1%, 灵敏度高于 Permingeat 的研究结果, 相对标准偏差小于 Permingeat [18] 的研究结果, 说明该方法精密度非常高 ; 宋君等根据转基因玉米 NK603 外源基因的旁侧序列设计引物和 Taqman 探针, 建立转基因玉米 NK603 品系特异定量 PCR 检测方法, 曲线斜率为 -3.6~-3.1, 相关系数大于 0.99, 扩增效率为 100.2%, 在 90%~110% 范围内 ; 采用该法检测 2% 含量的 NK603 标准品, 检测结果 (1.9%), [19] 不确定度为 10% Hird 等利用 RQ-PCR 对若干植物及其加工产品的转基因成分进行了检测, 检测结果显示 RQ-PCR 的转基因大豆检测结果与标准含量的误差仅为 1.0%, 在 3 种不同玉米标准品中误差仅为 :2.0% 10.0% 7.0% 本研究中,Taqman 探针法各项技术指标如曲线斜率相关系数扩增效率均满足定量 PCR 检测的要求, 采用这 2 种方法对已知含量样品进行检测, [18] [19] 相对标准偏差均小于 10%, 与宋君等 Hird 等的研究结果一致, 说明采用本研究中建立的 Taqman 探针方法对转基因玉米 MIR162 进行检测科学准确尽管本研究中建立的 MIR162 Taqman 检测技术特异性强灵敏度高, 但 Taqman 探针法也有不足之处即通用性不好, 必须特定引物与特定探针配合使用, 且探针合成成本较高与 Taqman 探针法相比, 染料法无需合成探针, 因此比较简单经济但 SYBR Green I 染料法不具有特异性, 染料与所有双链 DNA 均结合, 因此引物二聚体非特异扩增等均会影响结果, 因此需要在 PCR 反应结束后, 通过逐渐升温同时监测每一步的 R n 值绘制溶解曲线来判断扩增反应的特异性本研究中 MIR162 转化体片段和 zssiib 基因的溶解曲线均为单一峰型, 空白对照为一条平坦直线, 说明反应过程无非特异性扩增产物和引物二聚体出现, 表明本引物特异性好, 而且, 该法标准曲线相关系数 R 2 均大于 0.998, 相关性非常强因此, 利用本研究中的转化体特异性引物, 采用 SYBR Green I 法对转基因抗虫玉米进行定量是可行的从 2 种方法对比来看, 各项检测指标如反应灵敏度相关系数扩增效率,LOD LOQ, R 差异不显著应用本研究建立的 2 种定量 PCR 对转基因玉米 MIR162 含量分别为 3% 1% 和 0.5% 的混合玉米样品进行定量检测, 测得结果与实际值接近, 相对误差均小于 10%, 且 2 种定量方法在统计学上没有显著差异, 表明染料法和探针法荧光定量 PCR 均能够较为准确地对含有 MIR162 成分的转基因玉米混合样品进行定量本研究建立的检测方法能够为中国有效监测及监管转基因玉米 MIR162 提供科学的技术手段, 检测人员可以根据实际情况灵活选用 2 种检测方法本研究中采用的实时荧光定量 PCR 具有重复性好灵敏度高核酸交叉污染少等优点, 克服了传统定量只能终点检测的局限, 但也存在着很多不足, 比如, 在标准曲线定量中, 标准品必不可少, 但目前成熟稳定商品化的标准品极少, 各实验室所用生成标准曲线的样品各不相同, 因此实验结果缺乏可比性 ; 另外, 仪器昂贵探针制备成本高, 无法进行多样品同时检测等也是定量 PCR 检测面临的问题因此, 如何进一步提高检测的灵敏度, 降低检测成本, 加强转基因检测标准物质的研制, 提高定量 PCR 的可比性, 是今后研究的主要方向参考文献 [1] Clive J. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops[R]. ISAAA,2012. [2] Li X, Yang L T, Zhang J, et al. Simplex and duplex polymerase chain reaction analysis of Herculex RW (59122) maize based on one reference molecule including separated fragments of 5' integration site and endogenous gene [J]. J AOAC Int,2009,92(5): [3] James D, Schmidt A M, Wall E, et al. Reliable detection and identification of genetically modified maize, soybean, and canola by multiplex PCR analysis[j]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2003,51(20): [4] 金芜军, 郝旸, 程红梅, 等. 用复合 PCR 方法检测 6 种转基因玉米中外源 DNA 的特异性 [J]. 农业生物技术学报,2005,13(5): [5] Lam W Y, Yeung A C M, Tang J W, et al. Rapid multiplex nested PCR for detection of respiratory viruses[j].journal of Clinical Microbiology,2007,45(11):

[6-10] 目前 Taqman 探针实时荧光 PCR 是国际标准中普遍使用的定量方法 [13-14], 国内标准中部分涉及到定量 PCR 检测方法, 并且大部分采用 Taqman 探针法, 但仅限于转基因玉米及大豆等少数品种, 而且, 大部分标准中虽然使用了

7 孙红炜等 : 转基因抗虫玉米的定量检测 107 [6] Grohmann L, Brunen-Nieweler C, Nemeth A, et a1. Collaborative Trial validation studies of real-time PCR-based GMO screening methods for detection for detection of the bar gene and the ctp2-cp4epsps construct [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2009,57: [7] Taverniers I, Windels P, Vaitilinggom M, et a1. Event-specific Plasmid Standards and Real-time PCR Methods for Transgenic Bt11, Bt176, and GA21 Maize and Transgenic GT73 Canola [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2005,53: [8] Li X, Shen K L, Yang L T, et a1. Applicability of a novel reference molecule suitable for event-specific detections of maize NK603 based on both 5 and 3 flanking sequences[j], Food Control,2010,21: [9] 于彩虹, 田少亭, 路兴波, 等. 转植酸酶基因 (phya2) 玉米定性定量 PCR 检测 [J]. 农业生物技术学报,2012,20(4): [10] 翟勇, 武玉花, 吴刚, 等. 转基因玉米 MON88017 转化事件特异性定性 PCR 检测方法及其标准化 [J]. 农业生物技术学报,2010,18(6): [11] Germini A, Rossi S, Zanetti A, et al. Development of a peptide nucleic acid array platform for the detection of genetically modified organisms in food[j]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005,53(10): [12] 王永, 兰青阔, 赵新, 等. 转基因作物外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法的建立及应用 [J]. 中国农业科学,2009,42(4): [13] Kuribara H, Shindo Y, Matsuoka T, et al. Novel reference molecules for quantification of genetically modified maize and soybean[j]. Journal of AOAC International,2002,85: [14] ENGL (European Union Network for GMO Laboratories). Definition of minimum performance requirements for analytical methods of GMO testing[z] [15] GB 转基因产品检测核酸定量 PCR 检测方法 [S]. 北京 : 中国标准出版社,2007. [16] 农业转基因生物安全标准 2011 版 [S]. 北京 : 中国农业出版社 [17] Permingeat H R, Reggiardo M I, Vallejos R H. Detection and quan-tification of transgenes in grains by multiplex and real-time PCR[J]. J Agric Food Chem,2002,50(16): [18] 宋君, 雷绍荣, 刘勇, 等. 转基因玉米 NK603 品系特异定量 PCR 检测方法的建立 [J]. 生物技术通讯,2012,23(2): [19] Hird H, Powell J, Johnson M L, et al. Determination of percentageof roundup ready soya in soya flour using real -time poly merasechain reaction: interlaboratory study [J]. AOAC Int, 2003,86 (1):66-71.

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说明为了反映教运行的基本状态, 为校和院制定相关政策和进行教建设与改革提供据依据, 校从程资源 ( 开类别开量规模 ) 教师结构程考核等维度, 对 2015 年春季期教运行基

说明为了反映教运行的基本状态, 为校和院制定相关政策和进行教建设与改革提供据依据, 校从程资源 ( 开类别开量规模 ) 教师结构程考核等维度, 对 2015 年春季期教运行基内部资料东北师范大教运行基本状态据报告 2015 年春季期教务处 2015 年 10 月 27 日说明为了反映教运行的基本状态, 为校和院制定相关政策和进行教建设与改革提供据依据, 校从程资源 ( 开类别开量规模 ) 教师结构程考核等维度,