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惇植朱
7 years ago
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1 第 14 卷第 4 期 2016 年 7 月生物加工过程 Chinese Journal of Bioprocess Engineering Vol 14 No 4 Jul doi: / j issn 碳氮源对纳豆芽孢杆菌 R127 发酵产维生素 K2 的影响周子民 1, 罗苗苗 2, 邱宏伟 3, 王丽 1, 张绮悦 1, 任路静 2 2, 黄和 (1 徐州医学院药学院, 江苏徐州 ; 2 南京工业大学生物与制药工程学院, 江苏南京 ; 3 丽水双健生物工程有限公司, 浙江丽水 ) 摘要 : 维生素 K2 是一类重要的脂溶性凝血维生素, 在凝血抗骨质疏松等方面具有重要作用以本实验室自主筛选的纳豆芽孢杆菌 (Bacillus subtilis natto) R127 发酵生产维生素 K2, 考察不同含量的碳源氮源对纳豆芽孢杆菌生长底物消耗和维生素 K2 合成能力的影响, 并探究了维生素 K2 的分泌情况结果表明,50 g / L 甘油质量浓度最佳,K2 产量达到 15 8 mg / L; 氮源浓度与生物量成反比, 与维生素 K2 合成量呈正比 ; 此外, 在发酵过程中, 一部分维生素 K2 以水溶性的形式分泌到细胞外, 分泌率约 68 8% 关键词 : 维生素 K2; 纳豆芽孢杆菌 ; 氮源 ; 碳源中图分类号 :Q815 文献标志码 :A 文章编号 : (2016) Effects of carbon and nitrogen source on vitamin K2 production by Bacillus subtilis natto R127 ZHOU Ziming 1,LUO Miaomiao 2,QIU Hongwei 3,WANG Li 1,ZHANG Qiyue 1, REN Lujing 2,HUANG He 2 (1. School of Pharmacy,Xuzhou Medical College,Xuzhou ,China; 2. College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing ,China; 3. Lishui Seejin Biotechnology Co.,Ltd.,Lishui ,China) Abstract:Vitamin K2 is an essential lipid soluble coagulation vitamin that plays an important role in blood clotting and anti osteoporosis. We studied the effects of different content of carbon and nitrogen source on the growth of Bacillus subtilis natto,a Vitamin K2 producer screened by our laboratory.factors studied include substrate consumption and secretion of vitamin K2.Results show that the optimal glycerol concentration was 50 g / L,and the yield of vitamin K2 reached 15 8 mg / L. An inverse correlation was observed between biomass and the concentration of nitrogen source,whereas the yield of vitamin K2 was proportional to the nitrogen concentration In addition, vitamin K2 was a water soluble compound metabolite in the fermentation process,the secretory rate was about 68 8%. Keywords:vitamin K2; Bacillus subtilis natto; nitrogen source; carbon source 维生素 K2 作为一种人体必需的内源高活性维生素, 是甲萘醌类 ( menaquinone) 系列化合物, 根据其分子结构上 C 3 位异戊二烯侧链的长短不同共有 14 种形式 [1], 其中 MK 7 生物活性最为显收稿日期 : 基金项目 : 国家高技术研究发展计划 (863 计划 )(2014AA021701); 国家自然科学基金 ( ); 江苏省自然科学基金 ( BK ); 高等学校博士学科点专项科研基金 ( ) 作者简介 : 周子民 (1993 ), 男, 江苏宿迁人, 研究方向 : 微生物发酵 ; 任路静 ( 联系人 ), 讲师,E mail:renlujing@ njtech.edu.cn

2 30 生物加工过程第 14 卷著, 可快速被肠道吸收, 血液半衰期长, 有能力在除肝脏外的骨骼和动脉中发挥作用, 近年来备受关注 [2] 目前研究和开发的维生素 K2 制备方法 [3] 主要包括化学合成法和微生物发酵法, 但天然维生素 K2 ( MK 7) 仅能通过微生物发酵法获得 [1] 纳豆芽孢杆菌因其生长速度快易于培养维生素 K2 产量高等优势 [4], 成为发酵生产维生素 K2 最主要的微生物, 是目前进行工业化生产维生素 K2 的理想菌种之一在纳豆芽孢杆菌的发酵过程中, 细胞的碳氮代谢对维生素 K2 的产生具有重要作用, 其中碳源和氮源分别为微生物提供生长所需的能量和结构物质所需的氮素因此, 合适的氮碳源以及氮碳 [5] 比对维生素 K2 发酵具有重要作用张丽萍等对纳豆菌培养基的成分进行了优化, 确定了最优组合为 30 g / L 葡萄糖 20 g / L 大豆蛋白胨 2 g / L [6] K 2 HPO 4 2 g / L KH 2 PO 4 Morishita 等利用乳酸菌发酵生产维生素 K2, 以豆浆为底物, 近乎不产 MK [7] 7 Sumi 等以 2 g / L 聚蛋白胨和 3 g / L 甘油为底物,100 r / min 37 培养 2 d,mk 7 产量仅为 [8] 1 4 mg / L Berenjian 等研究发现甘油和大豆蛋白胨具有较强的利用率和转化率本文中, 笔者考察不同含量的甘油和大豆蛋白胨对纳豆芽孢杆菌生长底物消耗和维生素 K2 合成能力的影响, 同时还研究发酵过程中维生素 K2 的分泌率, 以期为维生素 K2 产业化提供指导 1 材料与方法 1 1 菌种纳豆芽孢杆菌 ( Bacillus subtilis natto ) R127 (CCTCC M ), 由本实验室自主筛选获得, 保藏在中国典型培养物保藏中心 1 2 培养基种子培养基 (g / L) 葡萄糖 30, 蛋白胨 40, NaCl 5, 牛肉膏 5, 酵母膏灭菌 30 min [9] 发酵培养基 (g / L) 甘油 50, 大豆蛋白胨 30, 酵母粉 0 6, K 2 HPO 4 0 3, CaCl 2 H 2 O 0 1, MgSO 4 7H 2 O 灭菌 30 min [10] 不同营养组分的培养基以最优碳源甘油为变量, 控制甘油的质量浓度分别为和 60 g / L, 初始大豆蛋白胨为 30 g / L, 其他条件不变以最优氮源大豆蛋白胨为变量, 控制大豆蛋白胨的质量浓度分别为和 150 g / L, 初始甘油为 50 g / L, 其他条件不变以上实验每组设 3 个平行样 1 3 培养方法将 5% 的菌种接入含 100 ml 种子培养基的 500 ml 三角摇瓶中, 纱布封口, r / min 摇床培养一定时间, 取对数生长期细胞接种到发酵培养基中, 接种量 5%, 在 r / min 下培养 96 h 每 12 h 取样测定生物量和甘油含量 1 4 分析方法甘油测定发酵过程中甘油浓度采用滴定法测定, 以酚酞作指示剂, 甘油被高碘酸钠氧化而生成甲醛与甲酸, 过量的高碘酸钠再被过量的乙二醇还原为碘酸钠和乙二醛 NaOH 滴定甲酸从而测定甘油含量具体操作如下 : 取 2 ml 发酵液于 r / min 离心 3 min, 取 1 ml 上清液加入 10 ml 蒸馏水, 加两滴酚酞试剂, 用 0 05 mol / L 的 NaOH 标准液滴定至变色, 记录 NaOH 用量 V 1 然后加入 10 ml 0 1 mol / L 高碘酸钠溶液, 避光反应 5 min, 再加入乙二醇 ( 体积分数 25%)5 ml, 避光反应 5 min 然后用 NaOH 标准液滴定至变色, 记录 NaOH 用量 V 2 w( 甘油 )= (92 1c (V 2 V 1 )) / m 100% (1) 式中 :V 1 空白试验所消耗 NaOH 标准溶液的体积, ml;v 2 测定试料所消耗 NaOH 标准溶液的体积, ml;c 所用 NaOH 标准溶液的浓度,mol / L;m 试样的质量,g;92 1 甘油的摩尔质量,g / mol 生物量测定采用酶标仪测定生物量, 以 200 μl 空白培养基为对照, 在 600 nm 下读取 OD 维生素 K2 测定取 10 ml 发酵液于 250 ml 带挡板的锥形瓶中, 加入异丙醇和正己烷 ( 三者体积比为 1 2 4),210 r / min 振荡 30 min, 静置分层后, 取上清旋转蒸发, 冷凝下来的正己烷回收将所得的产物用异丙醇洗出, 定容到 10 ml 的棕色容量瓶中维生素 K2 含量采用 UltiMate 3000 高效液相色谱仪分析 [11], 采用 C18 柱, 以 100% 甲醇作为流动相流速 1 0 ml / min 进样量 30 μl 柱温 50 波长 270 nm

3 第 4 期周子民等 : 碳氮源对纳豆芽孢杆菌 R127 发酵产维生素 K2 的影响 31 2 结果与讨论 2 1 碳源含量对维生素 K2 发酵性能的影响纳豆芽孢杆菌以甘油为碳源, 为细菌生长提供能量, 为维生素 K2 的合成提供碳架, 因此考察甘油浓度对发酵的影响, 结果如图 1 所示由图 1 可知 : 甘油消耗速率随质量浓度的增加呈先上升后下降的趋势当甘油质量浓度达到 50 g / L 时, 其消耗速率最大为 0 46 g / (L h); 当甘油质量浓度为 20 g / L 时, 甘油消耗速率仅为 0 15 g / ( L h), 低浓度的甘油不足以提供微生物生长所需的养分当甘油质量浓度为 40 g / L 时, 甘油消耗速率为 0 31 g / (L h),72 h 左右基本耗完 ; 当甘油质量浓度为 60 g / L 时, 过量的甘油对底物消耗产生一定的抑制作用, 甘油消耗速率下降, 比 50 g / L 降低了 8 70% 的需求, 导致甘油消耗速率生物量和维生素 K2 产量都较低当甘油质量浓度增加到 60 g / L 时, 维生素 K2 的产量比最优浓度条件下降低了 23 48%, 这可能是因为随着甘油浓度的不断提高, 含水量和渗透压的升高对细胞膜产生不利影响, 抑制了菌体正常生长代谢, 导致维生素 K2 合成减少 [13] 图 2 碳源含量对微生物生物量的影响 Fig 2 Effects of carbon source content on the microbial biomass 图 1 不同碳源含量下的甘油消耗曲线 Fig 1 Glycerol consumption curve of different content of carbon source 不同甘油质量浓度对微生物生长曲线如图 2 所示由图 2 可知 : 其生物量变化趋势基本一致, 发酵前期纳豆芽孢杆菌生物量不断增多, 生物量呈指数上升, 之后逐渐趋于稳定, 生物量随碳源浓度增加而增加当甘油质量浓度为 50 g / L 时, 最大生物量达到 64 9, 比 20 g / L 条件下增加了 33 59%; 而质量浓度超过 50 g / L 时, 纳豆菌的生长又会产生一定的抑制由此可见,50 g / L 的甘油条件下, 微生物生长代谢最佳发酵过程中维生素 K2 的产量如图 3 所示由图 3 可知 : 当甘油质量浓度为 50 g / L 时, 维生素 K2 产量在 72 h 达到最高 15 8 mg / L, 而发酵 96 h 后的产量下降了 9 6%, 这可能是因为一部分维生素 K2 受到了光解作用, 另一部分维生素 K2 作为电子载体参与电子传递链 [12] 当甘油质量浓度为 20 g / L 时, 维生素 K2 的产量为 8 62 mg / L, 因为培养基中低浓度的碳源不能满足细胞生长维生素 K2 合成图 3 碳源含量对维生素 K2 产量的影响 Fig 3 Effects of carbon source content on the yield of vitamin K2 2 2 氮源含量对维生素 K2 发酵性能的影响传统维生素 K2 生产方法是由大豆固态发酵而成, 其预处理复杂, 而大豆蛋白胨含多肽氨基酸和生长因子等有利于纳豆菌产物合成的营养成分, 因此, 笔者选择大豆蛋白胨用来发酵考察了不同质量浓度大豆蛋白胨 ( 和 150 g / L) 对纳豆芽孢杆菌的发酵的影响, 结果如图 4 所示由图 4 可知 : 甘油消耗速率随底物浓度的增加而降低当大豆蛋白胨质量浓度为 50 g / L 时, 甘油消耗速率最大为 0 4 g / (L h); 当质量浓度增加到 100 g / L 和 150 g / L 时, 甘油消耗速率分别为 0 37 g / (L h) 0 25 g / (L h) 可见, 过量的氮源供给对底物消耗产生一定的抑制作用不同浓度氮源条件下细胞生长曲线如图 5 所示由图 5 可知 : 生物量随氮源浓度增加而降低

4 32 生物加工过程第 14 卷在 0 ~ 24 h 之间, 细胞生长速率相差不大,OD 值均约为 29, 而 24 h 之后, 高浓度的氮源逐渐表现出对微生物的抑制作用由于发酵中后期基质浓度下降, 代谢有害物增加, 微生物生长受限制, 进而影响产物合成 [14] 图 6 Fig 6 氮源含量对维生素 K2 产量的影响 Effects of nitrogen source content on the yield of vitamin K2 图 4 不同氮源含量下的甘油消耗曲线 Fig 4 Glycerol consumption curve of different content of nitrogen source 图 5 氮源含量对微生物生物量的影响 Fig 5 Effects of nitrogen source content on the microbial biomass 考察大豆蛋白胨浓度对维生素 K2 的影响, 结果如图 6 所示由图 6 可知 : 维生素 K2 随氮源浓度增加而增加当大豆蛋白胨为 150 g / L 时, 维生素 K2 的产量最高为 mg / L, 这可能是因为大豆蛋白胨含多肽氨基酸和生长因子等有利于维生素 K2 的合成 [9] 发酵 96 h 后, 不同氮源浓度下的维生素 K2 产量分别比 72 h 降低了 27 45% 5 66% 和 6 98%, 这表明在 72 h 时, 纳豆芽孢杆菌积累的维生素 K2 达到饱和, 随着时间增长, 由于甘油不足, 营养物质变少, 有害代谢物质的积累, 导致维生素 K2 产量降低, 所以在发酵过程中一定要控制好合理的发酵结束时间氮源浓度越高, 维生素 K2 合成量越多, 其中,150 g / L 的大豆蛋白胨比 100 g / L 条件下, 维生素 K2 的产量提高了 26 3%, 但高浓度氮源带来的泡沫和成本问题, 是工业化生产需要注意的关键问题 2 3 维生素 K2 分泌情况据报告, 维生素 K2 是在细胞膜上积累的, 在发酵过程中一部分维生素 K2 可以形成水溶性复合物后分泌至胞外, 另一部分仍作为脂溶性维生素 K2 结合在膜上 [15] [16],Sato 等利用诱变菌种 B subtilis K3 176 发酵产维生素 K2, 发现 52 0% ~ 57 9% 的维生素 K2 以水溶性胶束形式存在于发酵液中为探究本研究所用菌株产维生素 K2 的存在形式, 根据上述实验结果, 在 50 g / L 甘油和 150 g / L 大豆蛋白胨条件下进行发酵, 分别对未处理的发酵液离心后发酵液上清液及细胞沉淀进行维生素 K2 的提取和检测, 结果如表 1 所示由表 1 可知 : 维生素 K2 总产量为 (12 88 ± 1 10) mg / L, 胞外维生素 K2 含量为 (8 86±0 39) mg / L, 胞内维生素 K2 的含量为 ( 3 80 ± 0 31) mg / L, 即维生素 K2 的分泌率约 [16] 68 8%, 比 Sato 等的研究结果提高了 15 84% ~ 27 33% 因此, 若能在维生素 K2 合成过程中, 不断刺激膜上维生素 K2 的分泌, 将能大大简便维生素 K2 的提取工艺表 1 Table 1 项目 3 结论发酵液中维生素 K2 的分泌情况 Secretory of vitamin K2 in the broth ρ( 维生素 K2) / (mg L -1 ) 胞外含量 8 86±0 39 分泌率 / % 胞内含量 3 80± 总含量 12 88±1 10 通过考察培养基氮碳源浓度对纳豆芽孢杆菌发酵产维生素 K2 发酵性能的影响, 研究得出 : 纳豆 ( 下转第 75 页 )

5 第 4 期汪桂等 : 春雷霉素的研究现状及展望 ,59(1): [25] HOTTA K,ZHU C B,OGATA T,et al.enzymatic 2 N acetylation of arbekacin and antibiotic activity of its product[ J].J Antibiot, 1996,49(1): [26] KIM C J,CHANG Y K,CHUN G T.Enhancement of kasugamycin production by ph shock in batch cultures of Streptomyces kasugaensis [ J].Biotechnol Prog,2000,16(1): [27] KIM C J,CHANG Y K,CHUN G T,et al.continuous culture of immobilized Streptomyces cells for kasugamycin production [ J]. Biotechnol Prog,2001,17(3): [28] CHO H, CHOI D B, LIM C K. Mutagenesis of Streptomyces kasugaensis for kasugamycin production [ J]. J Environ Sanitary Eng,2008,23(4): [29] ZHU C,KANG Q,BAI L,et al. Identification and engineering of regulation related genes toward improved kasugamycin production [ J].Appl Microbiol Biotechnol,2015. doi: / s ( 责任编辑荀志金 ) ( 上接第 32 页 ) 菌生长代谢与甘油浓度呈先上升后下降的关系,50 g / L 的甘油产维生素 K2 效果最佳, 其产量达到 15 8 mg / L 纳豆菌生物量与氮源浓度呈反比, 而代谢产物维生素 K2 却与氮源浓度呈正比此外, 在最适氮碳源含量条件下, 维生素 K2 的存在形式是一部分以水溶性的形式分泌到细胞外, 分泌率约 68 8%, 而另一部分仍然结合在膜上作为电子传递链的辅酶本研究为实现维生素 K2 的高效优质合成奠定基础参考文献 : [ 1 ] 吴元锋, 郑裕国. 微生物法生产维生素 K2( MK) [ J]. 科技通报,2004,20(5): [ 2 ] BOUCHARD B A,FURIE B C.Vitamin K dependent biosynthesis of γ carboxyglutamic acid[ J].Blood,1999,93(6), [ 3 ] 张华峰, 张华强, 陈天华. 维生素 K 生产工艺进展 [ J]. 饲料生产,2004,25(1): [ 4 ] 布坎南 R E, 吉布斯 N E. 伯杰氏细菌学鉴定手册 [ M]. 北京 : 科学出版社,1984. [ 5 ] 张丽萍, 满丽莉, 马中苏. 纳豆菌高产培养基的成分优化 [ J]. 中国食品学报,2008(1): [ 6 ] MORISHITA T, TAMURA N, MAKINO T, et al. Production of menaquinone by lactic acid bacteria [ J]. J Dairy Sci, 1999, 82 (9): [ 7 ] SUMI H. Edible compositions of Bacillus subtilis natto cells containing water soluble vitamin K: US, [ P ] [ 8 ] BERENJIAN A, MAHANAMA R, TALBOT A, et al. Efficient media for high menaquinone 7 production: response surface methodology approach [ J ]. New Biotechnol, 2011, 28 ( 6 ): [ 9 ] 翟金霞, 陈野. 纳豆菌生产微量生理活性物质的研究 [ J]. 食品科学,2005( 增刊 ): [10] 刘国庆, 赵肖, 胡卫华, 等. 一种利用纳豆芽孢杆菌生产维生素 K2 的方法 : A[P] [11] MANOURY E, JOURDON K, BOYAVAL P, et al. Quantitative measurement of vitamin K2( menaquinones) in various fermented dairy products using a reliable high performance liquid chromatography method [ J ]. J Dairy Sci, 2013, 96 ( 3 ): [12] KUROSU M, BEGARI E. Vitamin K2 in electron transport system: are enzymes involved in vitamin K2 biosynthesis promising drug targets? [ J ]. Molecules, 2010, 15 ( 3 ): [13] BERENJIAN A,MAHANARNA R,Kavanagh J,et al. Vitamin K series: current status and future prospects [ J ]. Crit Rev Biotechnol,2015,35(2):1 10. [14] 储炬, 李友荣. 现代工业发酵调控学 [M]. 北京 : 化学工业出版社,2006. [15] IKEDA H. A vitamin K2 binding factor secreted from Bacillus subtilis[ J].Eur J Biochem,1990,192(1): [16] SATO T,YAMADA Y,OHTANI Y,et al. Efficient production of menaquinone( vitamin K2) by a menadione resistant mutant of Bacillus subtilis[ J]. J Ind Microbiol Biotechnol, 2001, 26 ( 3): ( 责任编辑管珺 )

92 China Biotechnology Vol. 32 No g 3 00ml 5ml 0. 5mol /L 24 % 24 ph NaOH Ca OH ml h 24h 48h 72h OD

92 China Biotechnology Vol. 32 No g 3 00ml 5ml 0. 5mol /L 24 % 24 ph NaOH Ca OH ml h 24h 48h 72h OD 殏檪檪殏檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 China Biotechnology 202 32 3 9-99 殏殏 8 Mitchell Bieniek Mitchell Bieniek 2 Garrett Flack 2 * 00086 2 60506 Clostridium acetobutylicum AS. 7 Clostridium acetobutylicum AS. 32