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1 2011 年第 56 卷第 6 期 :370 ~ csb.scichina.com 中国科学 杂志社 SCIENCE CHINA PRESS 基于拷贝数变异的遗传关联研究 周雪崖 1 12, 张学工 1 清华大学生物信息学教育部重点实验室, 清华信息科学与技术国家实验室 ( 筹 ) 生物信息学研究部, 清华大学自动化系, 北京 ; 2 清华大学医学院, 北京 xy-zhou09@mails.tsinghua.edu.cn 收稿, 接受国家自然科学基金资助项目 ( , ) 摘要存在于自然群体中 DNA 片段的拷贝数变异 (copy number variations, CNVs) 是基因组结构性差异的常见形式. 人们早已意识到它在人群中普遍存在, 并设计出多种实验方法对其进行检测和量化. 近年来, 伴随着实验技术的进步, 人群的 CNV 图谱被不断完善 细化 ; 许多 CNVs 和疾病的相关性被陆续报道. 对复杂疾病的 CNV 关联研究已成为当前医学遗传学研究的重要内容. 本文将总结和关联研究有关的 CNV 遗传特性, 分析 CNV 与疾病关联研究的进展与问题, 并探讨实验设计和数据分析策略. 关键词拷贝数变异复杂疾病关联研究实验设计数据分析 寻找导致个体表型差异 ( 尤其是疾病易感性 ) 的 DNA 分子水平差异及其对应的基因是遗传学研究的重要目标. 关联研究 (association study) 是实现这一目标的策略之一, 它通过直接检验分子标记的基因型与个体表型的相关性来定位易感基因. 分子标记本身可直接影响表型, 但很多情况下是通过连锁不平衡 (linkage disequilibrium, LD) 和致病变异相关. 单核苷酸多态 (SNP) 是近年来关联研究中使用最为广泛的分子标记, 也被认为是人与人之间最常见的 DNA 多态性. 通过将不同个体的 DNA 片段比对到参照基因组, 可以发现 SNPs 并建立它们的位置图谱 [1]. 人群单倍型图谱计划 (The Haplotype Map Project) 详细揭示了全基因组尺度上不同人群中常见 SNP 之间的 LD 关系 [2~4]. 这一资源为基于 SNP 关联研究的标记选择 结果比较和统合分析 (meta-analysis) 等奠定了基础 [5]. 同时 SNP 芯片技术的成熟使得高通量 SNP 分型的成本大大降低. 从 2007 年至今, 已有超过 500 篇全基因组关联研究 (genome-wide association study, GWAS) 的报道建立起上千个染色体区域与疾病易感的相关性 ( 见 数据分析流程也基本 标准化 [6]. 由于 SNP 标记及与其相关联的其他变异主要为常见多态, 因而 SNP 关联研究建立在 常见疾病常见变异 (common disease-common variants, CD- CV) 的假设之上 [7] : 即认为致病变异是存在自然人群中的常见多态, 它们和环境共同作用增加携带者的患病风险. 在目前已知的复杂疾病易感位点中, 绝大多数的效应量都很小, 它们的累加作用只能解释复杂疾病很小一部分的遗传度 [8] ; 剩下的那部分未被归因的遗传度可以部分地由罕见变异的作用来解释 [9]. 某些具有遗传异质性的性状可受到多个位点上大效应量的罕见变异影响 [10]. 由于罕见变异不能被常见 SNP 标记, 关联研究需要直接检测所有的 DNA 变异. 另一方面, 从 2004 年开始, 人们逐渐意识到染色体结构性差异在人群中普遍存在 [11~13]. 拷贝数变异 (CNV) 是其中一种形式, 它通常指基因组上长度在几千到几兆碱基对的连续 DNA 片段的个体间差异. CNV 可通过改变基因的份数从而影响其表达剂量 打乱基因的编码区结构 改变基因调控序列的位置或长度 暴露隐性突变等方式影响个体的表型 [14]. 因而人们对利用拷贝数与表型的关联发现新 英文引用格式 : Zhou X Y, Zhang X G. Copy number variation based genetic association studies (in Chinese). Chinese Sci Bull (Chinese Ver), 2011, 56: , doi: /

2 的致病基因寄予了很高的期望. 与关联研究发展的大背景一致, CNV 关联研究也分为常见和罕见 CNV 两条路线. 常见 CNV( 亦称拷贝数多态, CNP) 的关联研究同样基于 CDCV 假设, 依赖已知的 CNP 图谱 ( 包括 CNP 的基因组位置 人群中不同拷贝数的出现频率 与周围 SNPs 的 LD 关系等 ), 需要能区分 CNP 拷贝数目的实验技术. 此外, 对 CNP 的全基因组关联研究还需要一整套完备的数据分析方法. 本文中, 我们将类比 SNP 来总结 CNV 的遗传特性, CNP 关联研究的现状和问题, 并探讨基于 CNP 全基因组关联研究的实验设计和数据分析的策略. 罕见 CNV 的关联研究实际是高通量测序技术普及之前研究罕见变异对疾病贡献的主要手段. 传统的染色体组型分析可发现导致出生缺陷的大规模染色体异常, 著名案例包括 21 号染色体的三体性导致唐氏综合征 (Down s syndrome). 某些单基因遗传病也被报道是由基因的缺失或加倍导致, 如 PMP-22 基因的扩增可导致 Charcot-Marie-Tooth 病 1A 型 [15]. 近年来的大规模关联研究表明, 罕见 CNV 能解释一些神经发育类疾病的遗传异质性 [16], 也是部分散发疾病尤其是先天缺陷的致病原因之一 [17]. 本文中, 我们将总结罕见 CNV 关联研究的常见策略, 并讨论如何利用该领域目前的进展指导未来关联研究的实验设计. 1 CNV 的遗传特性 1.1 产生 CNV 的突变机制关联研究和遗传标记的群体遗传特性关系密切, 而后者是由多态性的突变机制和群体进化历史决定的. 相比由历史上单个碱基对替换产生的 SNP, CNV 源自进化历史上发生的 DNA 片段的缺失 扩增, 可以由多种突变机制产生. 目前认为 CNV 的产生和减数分裂时期的重组 DNA 毁坏后有缺损的修复 DNA 移动元件的活动等有关 [18]. 在减数分裂前期同源染色体联会时, 非等位同源 DNA 序列之间会因高度的序列相似而发生配对. 如果交叉重组发生在非等位配对区域, 就被称为非等位同源重组 (non-allelic homologous recombination, NAHR), 重复序列之间的区域会产生拷贝数目变异甚至染色体结构重排. 散布于染色体上的低拷贝重复序列 (low copy repeats, LCR; 亦称片段重复, segmental duplication) 是导致 NAHR 的主要原因. 和等 位同源重组一样, NAHR 的发生频率在染色体上的分布存在高度异质性 [19]. NAHR 热点就是产生 CNV 的突变热点区, 其中包含多个已知的出生缺陷综合征的致病位点 [20]. NAHR 热点区的 CNV 突变频率可以利用精子分型直接度量 [21], 或者根据出生缺陷综合症的发生频率间接估算 [17]. 在已知突变热点区内, CNV 产生频率在每代每个位点 10 6 到 10 4 之间, 为单核苷酸替换频率 ( 每个碱基对每代约 [22] ) 的上千倍, 是目前已知的频率最高的可遗传的突变形式. 在非 NAHR 热点区域, LCR 也被发现在常见 CNV 的边界富集 [23,24], 说明 NAHR 是产生 CNV 的主要机制. LCR 序列除了能导致 NAHR 之外本身也可以是 CNV. 基于基因芯片等 DNA 杂交的实验技术无法检测重复序列的拷贝数目, 因为探针的设计通常避开重复序列. 人们还发现, 高通量芯片上映射到 LCR 区域内的探针会降低 CNV 检测的敏感度 增加假阴性率, 利用基因芯片进行 CNV 检测之前应考虑滤除定位到 LCR 区域的探针 [25]. 人们对 DNA 毁坏的不完全修复产生 CNV 的分子机制还知之甚少, 现有模型包括非同源末端连接 (non-homologous end joining, NEHJ) 复制叉停滞和模板转换 (fork stalling and template switching, FoSTeS) 等 [26]. 尽管有多种 DNA 基序被发现在 CNV 边界富集 [27], 非 NAHR 产生的 CNV 的边界没有可预测的序 [28] 列特征. 最近 Conrad 等人利用靶向序列捕获结合高通量测序技术获取了部分高精度非 NAHR-CNV 的边界序列. 他们发现多数缺失变异的边界存在微同源序列, 但插入变异的边界则少有微同源序列 ; 还有少数 CNV 边界存在复杂的序列重排. 这表明存在多种产生 CNV 的 DNA 损坏修复机制. 在这类机制下, 同一位点处重复突变产生的 CNV 具有不同的分界点, 因而可能对表型产生不同的影响. 在关联研究中, 精细定位 CNV 边界并寻找病例共享的 CNV 区域可以帮助缩小致病基因的位置 ( 在 Pelizaeus- Merzbacher 病例中检测到的 PLP1 位点的多种序列扩增模式便是一个例证 [29] ). DNA 片段还可跳变到基因组的其他位置产生 CNV, 插入序列也可能不存在于参照基因组序列中. [30] 通过 fosmid 质粒文库的双端测序或对新一代测序技术产生的短读段进行重头拼装 (de novo assembly) [31] 可以发现并定位这类外源 DNA 片段, 而依靠参照基因组序列的实验技术 ( 如 SNP 芯片 比较基因 371

3 2011 年 2 月第 56 卷第 6 期 组杂交等 ) 只能检测内源 DNA 片段插入产生的 CNV 且不能推断它们的基因组位置. 对全基因组 CNP 的计算分析表明, 不少扩增序列并非位于原始序列附近, 而是散布到远离原始序列的其他位置 [27]. 这将给关联研究定位致病基因带来困难, 因为扩增序列可通过扰乱插入区域的基因产生效应, 只有得到实际的插入位置才能定位致病基因. 目前的实验手段中只有荧光原位杂交技术 (fluorescence in situ hybridization, FISH) 可粗略定位插入序列的染色体位置. 相比之下, 在 SNP 关联研究中致病基因通常在关联位点附近. 1.2 CNV 的群体特征 CNV 在群体中出现的拷贝数及其频率 CNV 与 SNP 的连锁不平衡 (LD) 关系对关联研究的实验设计和结果分析有着重要影响. 和其他分子标记 ( 如 SNP 微卫星等) 不同, 目前的实验技术只能得到个体 CNV 的拷贝数而非基因型. 双等位 CNV 最多具有 3 种不同的拷贝数目, 可根据个体的拷贝数推断其基因型. 例如, 具有正常 / 缺失两种等位的 CNV 在人群中可能出现的拷贝数目是 0, 1, 2, 分别对应纯合缺失 杂合缺失和正常 ; 基因型频率应符合 Hardy-Weinberg 平衡. 多于 3 种拷贝数目的 CNV 由历史上重复发生的缺失或扩增产生, 不同的拷贝片段可能具有不同边界, 或散布在染色体不同位置. DNA 微阵列技术可以在全基因组范围内检测 CNV [32]. 存在拷贝数差异的样本 DNA 和探针的杂交强度会在对应的 CNV 区域产生差异, 比较基因组杂交芯片 (array comparative genomic hybridization, array-cgh) 可用来检测这种差异并发现 CNV. DNA 片段缺失可导致常见 SNP 位点的杂合度缺失, 而扩增会使杂合 SNP 位点的等位偏离 1:1 的信号强度 ; 基于 SNP 芯片的检测方法还可以利用和等位有关的信息. 对那些已知具有拷贝数多态的 DNA 片段可通过定量 PCR 多重连接依赖式探针扩增(mu- ltiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA) 等方法量化其拷贝数目 [14]. 上述检测 CNV 的方法都是基于 DNA 杂交技术, 它们所推断出的拷贝数目都是和某个基准比较的相对值, 且 DNA 和探针的反应强度会随着拷贝数的增加而趋于饱和 [25]. CNV 检测和分型技术的改进使得 HapMap 人群 上的 CNP 图谱被不断细化 [33,34,27]. 对 CNP 图谱的研究表明, CNP 大多是双等位, 能符合孟德尔模式稳定遗传. 双等位 CNP 大多由单次历史突变产生, 因而具有和 SNP 类似的性质 : 被不同的人群共享 基因型频率分布符合 Hardy-Weinberg 平衡 与周围 SNP 相关 [4,33,34]. 在 HapMap 欧亚人群中观察到有大约 80% 双等位 CNPs( 罕见等位频率 >5%) 可以在 CNP 边界附近找到 HapMap 上与它高度相关的标签 SNPs(LD r 2 >0.8); 且大约 50%~75% 的 CNP 可以在现有 SNP 芯片上找到对应的标签 SNP( 依芯片型号而异 ) [34,27]. 于是有不少学者认为 CNP 关联研究很大程度上可以被 SNP 关联所涵盖 [8], 且 CNP 对 SNP- GWAS 所不能解释的遗传度贡献不大 [27]. 事实上不少 CNP 和疾病的关联是通过跟踪 SNP-GWAS 最显著结果发现的, 比如 IRGM 基因启动子区 20-kb 缺失和局限性肠炎的易感 [35] NEGR1 上游 45 kb 缺失和肥胖 [36] 以及 LCE3B/LCE3C 区域的 32 kb 的序列缺失和银屑病易感 [37]. 由于这些 CNPs 和其他包括 SNPs 在内的变异相关, 它们是否为致病变异还需功能实验的支持. 另一方面, 群体遗传学理论表明, 产生历史较近的罕见变异或者历史上的重复突变会降低多态性之间的 LD [38] ; 因此罕见 CNV 和多等位 CNP 不容易被已知的 SNP 所标记. 还有部分序列扩增产生的 CNV 可能被插入到基因组其他位置, 因此和原始序列周围的 SNP 不相关 [39,40]. 这几类不能被 SNP 标记的 CNV 应成为 CNV 关联研究的重点关注对象. CNP 图谱还表明, 被不同人群共享的常染色体上 CNP 拷贝数频率的人群分化程度和 SNP 类似 [33] ; 全基因组范围的个体 CNP 分型可以反映全球主要人群的群体结构 [41]. 还有部分 CNPs 可能因提高人类对新环境的适应度而受人群特异的定向自然选择作用. 这类 CNP 的拷贝数分布存在高度的人群分化, 例如淀粉糖化酶 AMY1, CCL3L1 趋化因子和 UGT2B17 基因 CNPs [42]. 关联研究可以为理解这类 CNP 的功能提供线索. 比如 AMY1 的高拷贝数 (>2) 可增强个体对淀粉类食物的消化能力 [43] ; CCL3L1 的高拷贝数 (>2) 能提高个体对 HIV-1/AIDS 的抗性 [44]. 而 UGT2B17 的功能尚不清楚 ; 最近有报道, 在器官移植手术中 HLA 血清型匹配的器官捐赠者和接受者之间 UGT2B17 拷贝数差异可增大排异反应的风险, 这表明该基因可能 372

4 参与个体的自身免疫反应 [45]. 与 SNP 关联研究类似, 人群中拷贝数频率分化也可导致因病例 - 对照的人群组成存在系统偏差而产生假阳性 [46]. 尽管 CNP 通常被多个人群共享, 在非 NAHR 热点区的罕见 CNVs 中有不少是人群特异的, 因为产生这类 CNV 的历史突变发生地较晚且重复突变概率低. 比如最近在韩国人群的 CNV 图谱中发现了大量之前在其他人群中未发现的 CNV 位点, 绝大多数是罕见变异 [47]. 负自然选择也能降低 CNV 频率, 比如覆盖基因外显子的 CNV 中罕见 CNV 的比例要高于非基因区 CNV 中罕见 CNV 的比例. 这说明有功能影响的罕见 CNV 中有部分会降低个体的适应度, 而被淘汰出群体 [24,27]. 位于 NAHR 热点区的出生缺陷致病 CNV 虽然通常不能被遗传到下一代, 但高频率的复现突变仍会将致病 CNV 重新引入人群, 使致病 CNV 在人群中低频地出现. 由于罕见 CNV 普遍存在, 在分子诊断中, 未在公共数据库中出现的罕见 CNV 的致病性通常需要根据它是否在家系中和性状共同分离 是否影响功能相关的基因等因素综合判断 [48,49]. 2 基于 CNP 的关联研究 2.1 候选基因的 CNP 关联研究候选基因的 CNP 关联研究通常优先考虑功能上和疾病有关 且存在个体间拷贝数差异的基因作为候选位点, 根据 CNP 的基因组位置设计分型实验. 在得到个体离散的 CNV 拷贝数后, 进行关联分析可以有多种办法 : 可把离散拷贝数作为协变量加入预测疾病状态的回归模型中, 检验回归系数的显著性 ; 也可把 CNP 根据某些拷贝数阈值 ( 如 <2, 2~4, >4) 进 行分类, 然后分别统计不同拷贝数在病例 对照中的出现次数, 并对列联表做卡方检验. 统计模型中通常假设疾病相对风险的对数期望值和拷贝数具有线性关系 ( 加性模型 ), 但目前也有研究报道 ( 表 1) 某些基因 CNP 的拷贝数大于或小于 2 都会增加疾病的风险, 这类相关性无法在加性模型下检验. 因此也有必要将拷贝数视作无序的分类变量, 或采用非参数统计的方法检验病例 - 对照中 CNV 拷贝数是否具有相同的分布. 后者可克服对模型界定错误的影响, 但也会降低统计检验的功效. 对现有 CNP 图谱的分析表明, 和 CNP 有重叠的基因在免疫反应 细胞对外界的感应等功能集合上有显著富集 [50]. 目前已建立起来的 CNP 和疾病的相关性也集中在自身免疫类和传染性疾病, 并且同一个 CNP 可以和多个免疫系统调节的疾病相关 ( 比如 FCGR3B 基因缺失会增大多种系统性自身免疫类疾病的风险 [51] ), 这支持这类疾病共享致病基因的认识 [52]. 免疫类基因 CNP 的作用也存在多向性 ( 表 1). 比如 DEFB4 基因的低拷贝 (<4) 会增加局限性肠炎的易感性 [55], 但对银屑病是保护性的 [56]. 这说明人体免疫系统中的各个基因之间相互协同工作, 存在精细的动态平衡 ; 过多或过少都会引起失衡而增加自身免疫类疾病的风险. 这些发现也促使人们检验这些已知的易感 CNPs 是否对其他同类疾病有相同或相反的作用, 比如最近有研究检验 FCGR3B 对非系统性自身免疫类疾病的贡献 [57] CCL3L1 拷贝数对 Ⅰ [58] 型糖尿病和风湿性关节炎的关联等. 由于目前已发表的候选 CNP 关联研究集中在欧洲人群, 检验这些相关性能否拓展到其他人群也是一个值得研究的方向 [59]. 表 1 候选基因 CNP 关联研究的总结 基因 位置 疾病 人群 风险拷贝数 参考文献 肾小球性肾炎 北欧 <2 [53] FCGR3B 1q23 系统性红狼疮 Wegener 肉芽肿 显微镜下多动脉炎 英国 / 法国 <2 [51] Sjögren s 综合症西班牙 <2 或 >2 [57] HIV 感染 多种人群 <2 [44] CCL3L1 17q12 系统性红狼疮 欧洲 <2 或 >2 [54] 风湿性关节炎 新西兰 / 英国 >2 [58] DEFB4 8p23 局限性肠炎欧洲 <4 [55] 银屑病荷兰 / 德国 >4 [56] C4 MHC 系统性红狼疮 欧美 <2 [62] 373

5 2011 年 2 月第 56 卷第 6 期 已报道的疾病易感 CNPs 大多是多拷贝的, 它们的拷贝数和周围 SNP 等位无显著相关, 因而对疾病的作用也不能由周围 SNPs 来解释 [60]. 这类工作都有直接或间接的功能实验, 表明 CNP 导致疾病易感是通过改变基因的表达剂量. 但 CNP 对表型的影响并不仅限于直接改变基因的表达剂量, 比如 Stranger [61] 等人就发现在 HapMap 人群中至少有 5%~15% 的 CNV 拷贝数和相邻基因的表达呈负相关. CNP 还可与 CNP 区域内或基因组上的其他遗传多态交互作用. 比如个体间 C4 基因的拷贝数差异影响系统性红斑狼疮 (systemic lupus erythematosis, SLE) 的易感性, 低拷贝增大 SLE 易感. C4 基因有两个不同的转录异构体 C4A 和 C4B, C4 的拷贝数是这两个异构体拷贝数之和 ; C4 拷贝数和 SLE 的相关可由 C4A 的作用来解释, 因为 C4B 的拷贝数分布在病对照中没有显著差别 [62]. 另一个例子是, 当 CCL3L1 低拷贝和另一个 HIV 抗性相关的突变 CCR5-32 同时存在时, 个体对 HIV 入侵的免疫能力比两个变异独立作用的累加效果更弱 [44]. 对疾病易感 CNP 的功能研究将有助于理解复杂疾病的致病机制. 2.2 基于 CNP 的全基因组关联研究 候选基因关联研究利用已知基因的功能构想假设并加以检验. 基于 SNP 全基因组关联研究 (SNP-GWAS) 的成功让我们相信不带任何先验地对全基因组 CNP 和疾病作关联分析有可能发现新的易感基因. 但截至目前, 能在独立人群上得到验证的 CNP-GWAS 发现寥寥无几 ( 仅有文献 [63,64]). 之所以 CNP-GWAS 还是一个不成熟的领域, 主要有以下两方面原因 : (1) 针对 CNP-GWAS 的公共资源库尚不完善. 到 2010 年之前在 HapMap 人群上精确定位和分型的 CNP 仅有 1400 个左右, 且大多数 CNP 能被周围 SNP 所标记 [34,4]. 目前 CNP 的关联研究多数不依赖 HapMap, 而根据芯片的原始数据重新发现 CNV. 实际存在的 CNV 能否被检测出来 ( 灵敏度 ) 和检测出来的 CNV 是否真实存在 ( 特异性 ) 之间存在取舍. 为减少假阳性的发现, CNV 检测中的灵敏度通常较低, 这会使检测得到 CNV 的频率低于真实频率, 从而降低统计检验的效能. 病例 - 对照中 CNP 检测的灵敏度 和特异性的差异还会给后续关联分析引入差异偏置而产生假关联 [65]. 目前常用 CNV 检测的软件 ( 比如 PennCNV [66], QuantiSNP [67] 等 ) 对大于 4 拷贝的 CNV 无法得到正确的拷贝数估计, 因此不能直接比较高拷贝数 CNP 在病例 - 对照中的拷贝数分布差异. (2) SNP 芯片的 CNV 覆盖面不足 信噪比较低. SNP 芯片可以同时用于 SNP-GWAS 研究且成本低于专门的 CNV 平台 ( 如 array-cgh), 并且 SNP 芯片的分型结果有助于确定家系样本的亲缘关系, 因此目前大多数科研机构把 SNP 芯片作为 CNV 研究的主要实验平台. 但第一代 SNP 芯片 ( 包括 Affymetrix GeneChip 500k, Illumina HumanHap 650k 等 ) 的探针选取依赖 HapMap 的常见 SNP 图谱. 许多 CNV 所在基因组区域不是没有组装完整就是该区域内的 SNP 难以被准确分型, 因此许多 CNV 未被第一代 SNP 芯片的探针所覆盖. 例如前述几个疾病相关的候选 CNP 中 CCL3L1, C4A/C4B, 和 FCGR3B 所在区域都不能在第一代芯片上找到对应的探针. CNV 覆盖面的问题在第二代芯片中有所解决. 比如, Affymetrix 的 SNP 5.0 和 6.0 芯片都精简了 SNP 探针的设计, 并在全基因组范围内无偏置地加入 CNV 探针 [34]. 而 Illumina 则在 610K 以后的 SNP 芯片中探针的分布不再受 HapMap 的限制, 即使在 SNP 分型容易出错的 CNP 区域也设计 SNP 探针, 同时在无 SNP 的区域内添加 CNV 探针. 前述几个一代芯片上的 CNV 盲区 都已在二代芯片中被填补. 尽管如此, SNP 芯片的设计初衷是为了区分已知 SNP 的两个等位, 因而对 DNA 拷贝数的灵敏度不如专门的 CNV 平台. Wellcome Trust Case Control Consortium (WTCCC) 的 CNV 项目前期评估了多种平台的 CNV 分型质量, 他们发现 Agilent array-cgh 平台的信噪比优于 Illumina SNP 芯片 [68]. 在最近两年, CNV 领域的一系列进展可以让我们重新审视 CNP-GWAS 的必要性和可行性 : 参照人群中已知 CNP 的数目和精度不断提高 ; Conrad 等 [27] [69] 人和 Park 等人分别在 HapMap 人群和东亚人群中得到了高精度 CNP 图谱. 同时, 对已知 CNP 分型的统计方法也被陆续提出, 基本原理是先对 CNP 区域内多个探针信号强度进行降维, 然后对降维后的统计量做聚类 [70,71]. CNP-GWAS 的研究路线正开始向 374

6 SNP-GWAS 靠拢. 比如最近在心肌梗塞的研究中就采用 Affymetrix 6.0 芯片对 HapMap 人群中的已知 CNPs 进行分型, 经过严格的质量控制后用分型得到拷贝数做疾病的关联分析 [72] 年初发表的 WTCCC 对 8 种复杂疾病的 CNP- GWAS 工作延续并拓展了这一策略 [68], 它是 CNP- GWAS 领域的一个里程碑, 在方法学上有一系列指导意义 : (ⅰ) 应当区分 CNP 检测和 CNP 分型. CNP 检测是指在人群中发现常见 CNVs 并确定它们的位置 ; CNP 分型则根据 CNP 区域内的芯片信号推断个体 DNA 片段的拷贝数. WTCCC 采用多个参照人群中发现的 CNP 位点作为目标区域, 并设计专门的 CNP 分型芯片. ( ⅱ ) 对原始芯片信号应采用多种归一化方法 [73]. CNP-GWAS 的统计功效除了受样本量和致病位点效应量的影响, 还和 CNP 的分型质量密切相关. WTCCC 的研究者注意到, 没有一种对所有 CNPs 都最优的信号归一化方法. 对不同的 CNP 应选择对其最优的归一化信号进行分型, 并进行严格的质量控制, 比如根据能确定拷贝数的个体比例 CNP 分型的分离度等指标进行过滤. (ⅲ) 关联分析中需要考虑 CNP 分型的误差. 对信噪比较低的 CNV 实验平台, 分型得到的离散拷贝数具有统计不确定性. 目前有 2 类处理办法 : 一种是不推断拷贝数而直接利用归一化后信号强度建立和 [61] 表型的相关, 比如 Stranger 等人研究 CNV 对基因表达影响的工作中利用 array-cgh 杂交信号强度与基因表达量作回归分析. WTCCC 采用了另一种办法, 将拷贝数视作随机变量并在似然函数中考虑拷贝数的概率分布 ; 然后分别拟合在病例 - 对照拷贝数分布有无差异的模型, 并用似然比检验比较模型的拟合优度 [71]. (ⅳ) 需要校正批次效应. 和其他基因芯片研究类似, 不同实验批次造成芯片信号强度的系统偏差会给 CNP-GWAS 引入混淆因素 [74]. 这和人群结构对 SNP-GWAS 产生的影响类似. 对存在批次效应的芯片数据, 需要在下游的统计分析中加以校正. 比如在回归模型中引入批次作为协变量 [75], 或者允许信号强度具有批次特异的统计特性 [71]. 也可借鉴校正人群结构的 PCA 方法, 对探针信号强度矩阵做 PCA, 取原始信号对前几个 PC 坐标的数值 做线性回归后的残差作为校正后的信号强度 [76]. 和 SNP-GWAS 一样, 检验统计量的经验分布和理论空分布的 QQ 图可以用来评估混淆因素对统计检验的影响和校正效果. 但任何形式的校正都会降低统计检验效能, 最佳的办法是在芯片实验前就做好病例对照的随机化区组设计, 并在短时间内完成所有实验. (ⅴ) 初筛结果需要验证. 和 SNP-GWAS 一样, 全基因组扫描得到的结果必须在独立人群上得到验证才能令人信服. 验证实验的设计需要考虑 CNP 和周围 SNP 的 LD 关系 : 如果 CNP 被已知 SNP 标记, 只需在验证样本上检验标签 SNP 和疾病的关联 ; 否则, 需要对候选 CNP 直接进行分型, 并检验 CNP 拷贝数和疾病的相关性. 在 CNP 关联研究中, 有时还须对初筛样本采用不同的实验技术进行 CNP 分型 ( 称为 validation), 以保证芯片上得到的分型结果和相关性是可靠的. 尽管 WTCCC 的工作并没有发现已知 SNP 相关位点之外新的疾病易感 CNP, 这种研究策略值得在其他疾病的 CNP-GWAS 研究中借鉴和尝试. 现有的大规模 SNP 芯片数据可同时用于 CNP 检测和分型. 上述策略可以用于 SNP 芯片的 CNP 全基因组关联分析, 图 1 中我们总结了数据处理流程的主要步骤. 3 罕见 CNV 和复杂疾病目前罕见 CNV 的关联研究主要集中在神经发育类疾病, 包括精神分裂 自闭症 智力障碍等. 已发现的罕见致病 CNVs 对疾病不完全外显, 但都具有高风险 ( 优势比 >5). 单个致病 CNV 只能解释不到 1% 的病例, 说明这类复杂疾病具有遗传异质性 [16]. 和 SNP-GWAS 类似, 对多个数据集的统合分析可以增加样本量 提高统计检验功效 ( 例如文献 [77]). 罕见 CNV 在正常人群中出现频率通常在 0.5% 以下, 单位点关联研究需要几千人的样本量才能获得达到全基因组显著性水平的发现. 罕见 SNP 的关联研究发现, 在同一候选基因的上改变基因编码的不同罕见 SNPs 在病例中出现频率高于对照 ( 例如文献 [78]). 类似地, 在罕见 CNV 的研究中, 也可以把覆盖同一基因外显子或调控区的 CNV 合在一起, 检验它们在病例对照中出现频率的差异 ( 例如文献 [79]). 罕见 CNV 关联研究通常直接利用 CNV 检 375

7 2011 年 2 月第 56 卷第 6 期 图 1 基于 SNP 芯片数据的 CNP-GWAS 数据处理流程假设所有样本已通过质量控制. 首先对原始芯片数据做信号的归一化, 检测常见 CNV 的位置并和已知 CNP 图谱合并后得到一组候选 CNP 的基因组位置. 然后利用目标区域的归一化信号对病例 - 对照的 CNP 进行分型, 再根据高质量 CNP 分型检验拷贝数和表型的相关性. 相关性分析可以简单地比较离散化后的拷贝数频率分布在病例 - 对照中的差异 ; 也可以对连续信号分布拟合混合高斯模型, 然后比较有无致病效应下模型的拟合优度. 其中 CNP 分型和关联分析都需要考虑校正芯片批次等混淆因素的影响. 在得到每个位点的检验统计量和 P 值后, 利用 QQ 图评估观察到的统计量和空分布下期望值是否除在尾部之外具有相同的分布. 如果检验统计量在非尾部就显著偏离空分布, 则应检查是否存在未被校正的混淆因素, 或者采用其他信号归一化方法. 通过全基因组扫描得到的显著位点还应在独立人群上加以验证, 并通过功能实验研究其致病机理 测的结果进行基因型和表型的相关性检验, 这就可能因对照人群中 CNV 检测灵敏度低于病例而导致假阳性的发现. 当采用多个实验平台 数据产生自不同批次实验时, 这一问题尤其严重. 因此有必要建立多平台 高精度 大样本量的对照人群 CNV 数据库帮助评估罕见 CNV 的致病性. 例如 Shaikh [80] 等人利用无常见疾病的对照人群建立了公共的对照 CNV 数据库 ; 利用这一资源他们观察到某些 先前报道的高风险致病 CNV 在对照人群亦频繁出现, 因而可能为假阳性的发现. 在样本量有限的情况下, 经常可以观察到只在病例群体中出现一次的 CNV. 通常它们不具有致病性, 因为个体私有的 CNV 普遍存在. 为了检验病例中发现的罕见 CNV 是否具有医学意义, 可以考查病例个体中罕见或新产生 CNV 的总量. 比如, 研究发现散发类自闭症和精神分裂病例的核心家系中新 376

8 产生 CNV 的频率要显著高于对照家系 [81,82] ; 在无亲缘关系的精神分裂症病例中罕见 CNV 的总量和影响的基因数目要显著高于对照组 ( 例如文献 [83,84]). 因此在上述病例中检测出的新产生和罕见 CNV 中有部分是致病性的. 由于检测新产生 CNV 或者罕见 CNV 总量的影响因素众多, 包括 CNV 检测平台 实验批次 DNA 来源等 ; 对 CNV 总量差异的研究需要在实验设计阶段就控制各种混淆因素的影响, 并在统计分析中加以校正 [83]. 罕见 CNV 的关联研究通常把 CNV 作为致病变异而不是分子标记. 目前报道的疾病相关 CNV 都是影响基因的 DNA 片段, 很多情况下致病基因尚未明确. 基因集的功能富集分析可以进一步支持罕见 CNV 对神经发育类疾病的致病性. 例如, 受自闭症 精神分裂症病例中罕见 CNV 影响的基因, 在神经元活动 信号转导等功能上富集 [16,85] ; 对于智力低下患者中筛选出的致病 CNVs, 在老鼠中敲除直系同源基因后显著富集的表型影响是导致神经元和轴突异常 [86]. 发现显著富集的基因功能集合可以缩小致病基因的范围, 或从病例中发现的罕见 CNV 中筛选可能的致病 CNV 后在大规模样本上进行验证 [87]. 在分析受 CNV 影响的基因功能富集的显著性时需要控制基因长度 病例 - 对照中 CNV 数目差异等混淆因素的影响 [88]. 值得注意的是, 目前能在独立群体中得到验证的近 10 个罕见致病 CNV 无一例外地出现在 NAHR 的热点区域. 所以 NAHR 热点区域可作为候选位点加以系统地研究, 来发现新的疾病易感位点 [89]. 由于 NAHR 产生的 CNV 具有可预测的边界 ( 侧翼 LCR 序列 ), 对目标区域做 CNV 分型可提高 CNV 的检测灵敏度 减少关联研究的差异偏置. 罕见 CNV 分型 可以在统计上归结为离群值检验问题, 最近的研究表明, Illumina 平台下只需要多于 5 个合理选择的探针就能以高于 90% 的统计功效和低于 20% 的错误检出率 (false discovery rate, FDR) 检测出罕见 CNV [90]. 这种候选位点的策略具有 CNV 检测的高敏感度 低成本 可定制 ( 利用 Illumina Golden Gate 平台 ) 等优势, 并能降低多检验矫正对统计检验功效的影响. 通常 NAHR 热点内的高频率重复突变使致病 CNV 出现在不同人群中, 而人群特异的 NAHR 热点也可产生人群特异的致病 CNV. 例如欧洲人群特有的 17q21.31 缺失综合症, 是受该区域内的序列颠倒变异 (inversion variant) 的影响 ; 这一颠倒变异在欧洲大陆外的人群中极少出现 [91,92]. 对不同种族人群的罕见 CNV 关联研究也有助于发现新的人群特异的致病位点和基因组特性. 与候选基因 CNP 类似, 罕见致病 CNV 对表型的影响也具有多向性 ( 如表 2). 比如 1q21.1 区域的缺失 扩增会导致精神 认知 心脏发育等多方面出生缺陷 [93,94]. 又如 16q11.2 缺失在约 1% 的自闭症患者中出现 [98] ; 携带该 CNV 的病例也被报道还具有其他先天缺陷, 如发育迟缓 智力障碍 癫痫 早发性肥胖 面部形态异常等 [103]. 检验已知致病 CNV 是否影响其他神经发育类疾病可以拓展已知致病 CNV 对表型的影响 ( 例如文献 [104]); 而在新的研究中根据表型筛选病例则可能提高致病 CNV 在病例中出现的频率. 在最近的早发性肥胖症的研究中, 选择同时具有早发性肥胖和胚胎期发育迟缓的病例, 可以使携带该 16q11.2 缺失 CNV 的病例占肥胖病例的 3%, 从而提高了统计检验功效 [105]. 在图 2 中, 我们总结了罕见 CNV 关联研究的实验设计和分析流程. 表 2 部分神经发育类疾病的致病 CNVs a) CNV 位置 疾病表型 风险拷贝数 参考文献 发育迟缓 智力低下 DEL/DUP [94] 1q21 头颅畸形 DEL/DUP [95] 先天性心脏病 DEL [96,97] 自闭症 DEL/DUP [98] 16p11.2 精神分裂 DUP [99] 早发性肥胖 DEL [100,105] 15q13.3 发育迟缓 智力低下 DEL [101] 全身性癫痫 DEL [102] a) DEL, 缺失 ; DUP, 扩增 377

9 2011 年 2 月第 56 卷第 6 期 图 2 罕见 CNV 关联研究的策略和流程为得到罕见 CNV, 可利用高通量芯片技术在全基因组范围内检测, 然后排除常见 CNV, 或者直接对候选 NAHR 热点区进行分型. 有多个标准可用来评估单个 CNV 的致病性, 例如 : 病例中单点 CNV 频率显著高于对照, 与已知致病 CNV 或致病基因重合, 在家系中和表型共分离等. 也可采用全局关联的方法, 例如 : 检验病例 - 对照中检测出的罕见或新生 CNV 的总数是否存在显著差异. 在建立起全局关联之后, 基因集功能富集的分析可以帮助筛选可能的致病基因 ; 罕见 CNV 是否包含显著基因集中的基因则可用来评价它的致病性. 对从芯片中检测到的 CNV 还需用其他的实验技术加以验证. 此外, 详细描述携带致病 CNV 的病例临床特征可以为后续研究提供案例资源 4 总结在 SNP-GWAS 的热潮过后, 人们的研究兴趣开始转向其他形式的变异 ; CNV 和复杂疾病的关联研究已成为医学遗传学研究的重要内容. 本文强调对 CNV 群体特性的理解有助于把握 CNV 关联研究的适用范围 实验设计和结果解读. 研究者可以进一步挖掘 SNP-GWAS 产生的大量芯片数据用于 CNV 关 联研究. 尽管目前 CNP-GWAS 的阳性报道很少, 罕见 CNV 的研究集中于神经发育类疾病 ; 本文总结的多种研究策略仍值得在其他疾病的数据上尝试. 不论是 CNP 关联分析还是对罕见 CNV 总量的比较都受芯片实验批次的影响. 这些问题应该在关联研究的项目规划实验设计阶段就予以考虑 ; 同时数据分析人员应掌握相关的统计校正方法, 减少假阳性的发现. 参考文献 1 Altshuler D, Pollara V J, Cowles C R, et al. An SNP map of the human genome generated by reduced representation shotgun sequencing. Nature, 2000, 407: The International HapMap Consortium. A haplotype map of the human genome. Nature, 2005, 437: The International HapMap Consortium. A second generation human haplotype map of over 3.1 million SNPs. Nature, 2007, 449: The International HapMap 3 Consortium. Integrating common and rare genetic variation in diverse human populations. Nature, 2010, 467: Manolio T A, Brooks L D, Collins F S. A HapMap harvest of insights into the genetics of common disease. J Clin Invest, 2008, 118: McCarthy M I, Abecasis G R, Cardon L R, et al. Genome-wide association studies for complex traits: Consensus, uncertainty and challenges. Nat Rev Genet, 2008, 9: Risch N, Merikangas K. The future of genetic studies of complex human diseases. Science, 1996, 273: Manolio T A, Collins F S, Cox N J, et al. Finding the missing heritability of complex diseases. Nature, 2009, 461: Eichler E E, Flint J, Gibson G, et al. Missing heritability and strategies for finding the underlying causes of complex disease. Nat Rev Genet, 2010, 11: McClellan J, King M C. Genetic heterogeneity in human disease. Cell, 2010, 141: Iafrate A J, Feuk L, Rivera M N, et al. Detection of large-scale variation in the human genome. Nat Genet, 2004, 36: Sebat J, Lakshmi B, Troge J, et al. Large-scale copy number polymorphism in the human genome. Science, 2004, 305: Tuzun E, Sharp A J, Bailey J A, et al. Fine-scale structural variation of the human genome. Nat Genet, 2005, 37: Feuk L, Carson A R, Scherer S W. Structural variation in the human genome. Nat Rev Genet, 2006, 7:

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