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磁应麻
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1 高效液相色谱 - 三重四极杆质谱法同时测定番茄中的水杨酸和赤霉酸李腾飞 1, 赵风年 1, 张超 1, 江泽军 1, 刘广洋 1, 王静 1, *, 刘海金 2, 许平金茂俊 1, 金芬 1, 邵华 1, 王珊珊 1, 郑鹭飞 1, 佘永新 (1. 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所, 北京 ; 2. 西藏自治区农畜产品质量安全检验检测中心, 西藏拉萨 ) 摘要 : 建立了番茄中植物激素水杨酸和赤霉酸的液相色谱 - 串联质谱检测方法样品经乙酸 - 乙腈提取, 采用 C 18 固相萃取柱净化,C 18 色谱柱分离,0.5% 甲酸水溶液 - 甲醇作为流动相进行梯度洗脱, 质谱采用电喷雾负离子 (ESI - ) 模式电离, 多反应监测模式 (MRM) 定性, 基质标准曲线外标法定量水杨酸的响应值在 ng/ml 范围内具有良好的线性关系, 相关系数 (R 2 ) 为 ; 赤霉酸的响应值在 ng/ml 范围内具有呈良好的线性关系, 相关系数 (R 2 ) 为 , 在三个加标浓度下, 水杨酸 (1.25, 2.5, 5 μg/kg) 赤霉酸 (10, 50, 100 μg/kg) 的回收率分别为 87.6%~95.3% 83.8%~96.5%, 相对标准偏差不高于 6.9%, 方法的检出限分别为 ng/ml 关键词 : 水杨酸 ; 赤霉酸 ; 液相色谱 - 串联质谱法 ; 番茄 Simultaneous Determination of Salicylic Acid and Gibberellic acid in Tomato by High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry LI Tengfei 1, ZHAO Fengnian 1, ZHANG Chao 1, LIU Guangyang 1, WANG Jing 1,*, LIU Haijin 2, XU Ping 2, JIN Maojun 1, JIN Fen 1, SHAO Hua 1, WANG Shanshan 1, ZHENG Lufei 1, SHE Yongxin 1,* (1. Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agro-Products, Chinese Academy of Agricultural Science,Beijing , China; 2. Tibet Testing Center of Quality and Safety for Agricultural and Animal husbandry Products, lhasa , China) Abstract: A sensitive and selective liquid chromatography-positive mode electrospray ionization-tandem mass spectrometric (LC-MS/MS) method was developed for the determination of salicylic acid (SA) and gibberellic acid (GA 3 ) in tomato. The analyses were extracted by acetic acid and acetonitrile; the extract was purified with solid-phase extraction (SPE) octadecylsilane (C 18 ) column. Then SA and GA 3 in the extract was separated on a reversed phase C 18 column using a gradient elution program of 0.5% formic acid methanol. Qualitative analysis was performed with electrospray ionization in anion mode (ESI - ) under multiple reaction monitoring (MRM) mode. The matrix-matched calibrations were used to quantify the residue concentrations. The calibration curves showed good linearity in the certain concentration for SA and GA 3, with correlation coefficients (R 2 ) more than The average recoveries of SA and GA 3 in tomato were in the range of 87.6%~95.3% and 83.8%~96.5% at three spiked concentration levels, and relative standard deviations (RSD, n=3) were less than 6.9%. The limits of quantitation (LOQ) were ng/mL. The method could be used for the rapid and accurate detection of hormone in tomato. Key words: salicylic acid; gibberellic acid; liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); tomato 中图分类号 :O657.6;S482.3 文献标志码 :A 文章编号 : 植物內源激素是植物体内合成的一系列结构不同的小分子有机化合物, 既可调控植物自身的生长发育, 又可通过与植物所生存的外部环境相互作用调节其对环境的适应 [1-4] 由于植物內源激素在植物生命活动中发挥着重要作用, 对其定量检测已引起了广泛的关注 [5] 植物內源激素的检测方法主要包括毛细管电泳法 [6-7] 气相色谱法 [8] 高效液相色谱法 [9-10] 气相色谱 - 质谱联用法 (GC-MS) [11-13] 液相色谱 - 质谱联用法 [14-17] 等然而, 植物內源激素在植物体内的含量很低 ( 通常在 μg/kg, 甚至 ng/kg 水平上 ), 基体成分复杂, 并且对温度等外界条件敏感, 在不同器官中呈现动态分布, 这对其痕量高灵敏度精确定量检测提出了 1, * 2, 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 十二五国家科技支撑计划 (2014BAD13B05-05) 作者简介 : 李腾飞 (1987 ), 男, 博士研究生, 研究方向为食品安全检测 litengfeibeyond@126.com * 通信作者 : 王静 (1963 ), 博士, 教授, 研究方向为食品安全检测 w_jing2001@126.com 佘永新 (1972 ), 男, 研究员, 博士后, 研究方向为食品安全检测 syx@163.com 1

西藏自治区农畜产品质量安全检验检测中心, 西藏拉萨 850000) 摘要 : 建立了番茄中植物激素水杨酸和赤霉酸的液相色谱 - 串联质谱检测方法样品经乙酸 - 乙腈提取, 采用 C 18 固相萃取柱净化,C 18 色谱柱分离,0.

2 更高要求 [18-19] 液相色谱串联质谱法 (LC-MS/MS) 具有很强的定性定量能力, 是一种更为可靠的分析植物激素的方法 [20-22] 水杨酸 (salicylic acid, SA) 是一种小分子酚类物质, 能够诱导植物提高抗病性 [23-24] ; 赤霉酸 (gibberellic acid, GA 3 ) 是一种四环二萜酸, 可控制茎的伸长打破种子休眠控制开花和性别表达等 [25-26] 目前对番茄中水杨酸和赤霉酸含量同时检测的研究较少, 本文建立了一种高效液相色谱 - 三重四极杆质谱联用方法 (LC-MS/MS), 对不同生长阶段番茄中水杨酸和赤霉酸的含量进行了分析 1 材料与方法 1.1 材料与试剂水杨酸 ( 纯度 97.0%, 由中国食品药品检定研究院提供 ), 赤霉酸 ( 纯度 99.0%, 德国 Dr. Ehrenstofer 公司 ); 甲醇乙腈正己烷 ( 色谱纯, 美国 MREDA 科技公司 ), 甲酸 ( 色谱纯, 迪马公司 ), 氨水氯化钠无水硫酸镁 ( 分析纯, 北京化工厂 ); 其它试剂均为分析纯 ; 实验用水为 Milli-Q 超纯水 1.2 仪器与设备 Agilent 1200 液相色谱仪 ( 美国 Agilent Technologies 公司 ),API 5000 三重四极杆串联质谱仪 (ESI 源 )( 美国 AB Sciex 质谱系统公司 ), 高速匀浆机 ( 匈牙利博朗电器 ); 高速冷冻离心机 ( 美国 Thermo 科技公司 );Vortex-Genie 2 旋涡混合器 ( 美国 Scientific Industries 公司 ); 分析天平 ( 赛多利斯科学仪器有限公司 );MilliQ 纯水机 ( 法国 MILLQ 公司 );TTL-DC II 型氮吹仪 ( 北京同泰联科技发展有限公司 );C 18 SPE 小柱 (Sep-Pak Vac C18 cartridge 美国 waters 公司 ) 1.3 样品前处理提取用高速匀浆机破碎番茄样品后, 称取 10 g 试样 ( 精确至 0.01 g), 于 50 ml 离心试管中, 加入 10 ml 含 1% 乙酸的乙腈, 剧烈震荡 1 min, 加入 4 g 氯化钠和 4 g 无水硫酸镁, 充分震荡涡旋 1 min,5000 r/min 离心 5 min 净化分别用 3 ml 甲醇和水活化 C 18 固相萃取柱, 取 1 ml 用氨水调节 ph 为 8( 氨水含量约 5%) 的上清液上样, 用 1 ml 正己烷淋洗,3 ml 含 5% 乙酸的甲醇洗脱将洗脱液氮吹至干,1 ml 甲醇复溶, 过 0.22 μm 有机滤膜, 上机测定 1.4 方法色谱条件色谱柱 :XTerra MS C18 柱 (2.1 mm 150 mm,5 μm); 柱温 :30 ; 进样体积 :5 μl; 流动相 :0.5% 甲酸水溶液 (A) 和甲醇 (B) 洗脱梯度见表 1; 流速 :300 μl/min 表 1 梯度洗脱程序 Table 1 Setting up for gradient elution program 时间 (min) 流速 (μl/min) A% B% 质谱条件离子源 :ESI 源 ; 扫描方式 : 负离子模式 ; 喷雾电压 (EIS-):-4500 V; 离子源温度 (TEM):500 ; 气帘气 (CUR):20 psi; 碰撞气压力 (CAD):9 psi; 雾化气 (GS1):40 psi; 辅助气 (GS2):40 psi ; 射入电压 (EP):-10 V; 碰撞室出口电压 (CXP):-17 V; 多反应离子监测 (MRM) 模式 ; 水杨酸和赤霉酸的定性离子对和定量离子对的去簇电压 (Declustering potential, DP) 碰撞能量 (Collision energy, CE) 见表 2 表 2 水杨酸和赤霉酸的母离子子离子去簇电压及碰撞能量 Table 2 Parent iron, product ion, declustering potential(dp), collision enegy(ce) parameters of SA and GA 3 分析物母离子子离子去簇电压 (V) 碰撞能量 (V) 水杨酸 * 赤霉酸 *

(LC-MS/MS), 对不同生长阶段番茄中水杨酸和赤霉酸的含量进行了分析 1 材料与方法 1.1 材料与试剂水杨酸 ( 纯度 97.0%, 由中国食品药品检定研究院提供 ), 赤霉酸 ( 纯度 99.0%, 德国 Dr.

3 2 结果与分析 *: 定量离子 (Quantiative ion) 2.1 样品前处理条件优化提取溶剂的选择试验考察了不同浓度 (0.1%, 1%, 5%) 的乙酸乙腈溶液对番茄中的水杨酸和赤霉酸提取效果, 结果表明, 以 1% 乙酸乙腈作为提取剂其提取效率最高, 水杨酸和赤霉酸的回收率均可达 83.8% 以上, 而单纯有机溶剂的提取效率较差因此, 本方法选用 1% 乙酸乙腈作为提取溶剂净化条件的选择本实验分别选择了 QuEChERS 方法 SPE 方法 (C 18 柱和 MAX 混合阴离子交换柱 ), 优化了不同洗脱溶剂的种类和用量, 以基质效应定量表示净化效果, 比较了不同条件的净化效率结果表明, 三种方法的净化效率从高到低依次是 C 18 柱 MAX 柱和 QuEChERS 方法由于 C 18 和 PSA 对水杨酸和赤霉酸有一定的吸附作用, 导致 QuEChERS 方法的回收率较低, 水杨酸和赤霉酸的回收率在 40~60% 之间 ; 而采用 C 18 柱的 SPE 方法回收率最高, 水杨酸和赤霉酸的回收率分别在 87.6~95.3% 83.8~96.5% 之间综合考虑净化效率和成本 (MAX 柱成本较高 ), 选取了 C 18 柱作为番茄中水杨酸和赤霉酸的富集净化柱, 并筛选和优化了上样活化淋洗和洗脱溶剂, 确定了最佳净化程序本实验采用 5% 氨水碱化上样, 甲醇和水活化, 正己烷淋洗,3 ml5% 乙酸甲醇能完全洗脱水杨酸和赤霉酸 2.2 质谱条件的优化根据目标物的性质, 采用负离子扫描模式, 结果表明 : 水杨酸和赤霉酸进入一级质谱后, 易产生稳定的 [M-H] - 分子离子峰水杨酸的母离子为 m/z 137.0,[M-H] - 离子作为母离子进入二级质谱后发生断裂产生不同的碎片离子, 见图 1 m/z 92.8 特征碎片是由母体脱去 COOH 生成, 其响应值高且稳定, 因此, 将 137.0>92.8 作为定量离子对赤霉酸的母离子为 345.2,[M-H] - 离子作为母离子进入二级质谱后发生断裂或重排等反应产生不同的碎片离子, 见图 2 赤霉酸二级质谱的特征碎片 m/z 为和 239.2, 其中 m/z142.9 的响应值高且稳定, 因此, 将 345.0>142.9 作为定量离子对确定目标物的定量定性离子对后, 对其质谱参数进行优化, 优化结果见水杨酸和赤霉酸总离子流图和提取离子流图详见图 3 -MS2 (137.10): 10 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleID) of MT wif... Max. 5.6e7 cps. 5.5e e7 4.5e7 4.0e7 3.5e7 Intensity, cps 3.0e7 2.5e7 2.0e7 1.5e e7 5.0e m/z, amu 图 1 水杨酸的二级质谱图 Fig.1 Product ion spectra of SA 3

4 -MS2 (345.20): 30 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleID) of MT wiff (Turbo Spray) Max. 5.0e5 cps. 5.0e e5 4.6e5 4.4e5 4.2e5 4.0e5 3.8e5 3.6e5 3.4e5 3.2e5 3.0e5 Intensity, cps 2.8e5 2.6e5 2.4e5 2.2e5 2.0e5 1.8e5 1.6e5 1.4e e5 1.0e5 8.0e4 6.0e4 4.0e4 2.0e m/z, amu 图 2 赤霉酸的二级质谱图 Fig.2 Product ion spectra of GA 3 TIC of -MRM (4 pairs): from Sample 6 (sys5ppb+cms50ppb) of shuiyangsuan-chimeisuan.wiff (Turb e5 2.0e5 SA 6.00 Max. 2.8e5 cps. Inte e5 GA Time, min XIC of -MRM (4 pairs): 345.2/143.1 amu from Sample 6 (sys5ppb+cms50ppb) of shuiyangsuan-chime... Max. 4.1e4 cps. GA e4 Inte e Time, min XIC of -MRM (4 pairs): 137.0/93.0 amu from Sample 6 (sys5ppb+cms50ppb) of shuiyangsuan-chimeis... Max. 2.5e5 cps. SA 2.5e e5 Inte e Time, min 图 3 赤霉酸和水杨酸的总离子流和提取离子流图 Fig.3 Total ion chromatogram and extract ion chromatogram of GA 3 (50ng/mL) and SA (5ng/mL) 2.3 线性范围与检出限以甲醇作为溶剂, 分别配制不同浓度梯度的两种工作液, 使水杨酸浓度为 1.25, 2.5, 5,10, 20 μg/kg 和赤霉酸的浓度为 10, 20, 50,100, 200, 1000 μg/kg 将不同浓度的标准溶液在上述选定的液相 - 质谱条件下分别进行测定, 通过液 - 质数据处理软件绘制标准曲线和计算回归方程及其相关系数结果表明 : 两种物质在以上质量浓度范围内, 浓度与其峰面积呈良好的线性关系, 其线性回归方程水杨酸为 y= x R 2 = ; 赤霉酸线性回归方程为 y= x R 2 = 取信噪比 (S/N) 等于 3 所对应的待测物浓度作为检出限, 该方法水杨酸赤霉酸的检出限分别为 0.01 ng/ml 0.15 ng/ml 2.4 方法回收率和精密度为评价方法的准确性, 分别测定了番茄中水杨酸和赤霉酸的加标回收率选择新采集的番茄作为基质样品, 分别添加三个水平 ( 低中高 ) 的上述两种物质标准溶液, 平行测定 3 次, 以基质加标为基准, 计算平均回收率结果显示, 水杨酸添加浓度为 μg/kg 的回收率在 87.6~95.3% 之间, 相对 4

9 265.0 326.5 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 m/z, amu 图 2 赤霉酸的二级质谱图 Fig.

5 标准偏差不大于 6.9%; 赤霉酸添加浓度为 μg/kg 的回收率在 83.8~96.5% 之间, 相对标准偏差不大于 6.7% 本方法准确快速灵敏度高, 可用于番茄中植物內源激素的测定表 3 番茄中水杨酸和赤霉酸的平均回收率及相对标准偏差 Table 3 Average recoveries of different spiked levels and relative standard deviation (RSD) for SA and GA3 in tomato 样品分析物添加水平 (μg/kg) 回收率 /% RSD/% (n=3) 水杨酸番茄赤霉酸实际样品分析为验证该方法在实际样品中的检测能力, 采用上述方法对不同生长阶段 (0, 3, 7, 14, 21, 28d) 的番茄样品进行了水杨酸和赤霉酸的含量测定, 每个样品重复测定 3 次, 结果见表 4 实验表明, 本方法的灵敏度检出限和精密度能够满足番茄中内源植物激素的测定表 4 不同番茄样品中水杨酸和赤霉酸的含量 (μg/kg) Table 4 Content of SA and GA 3 in different tomato samples 样品编号水杨酸 (SA) 赤霉酸 (GA 3 ) 含量 /(μg/kg) RSD/% 含量 /(μg/kg) RSD/% Sample-0d Sample-3d Sample-7d Sample-14d Sample-21d Sample-28d 结论本研究通过对样品前处理方法和色谱质谱条件的筛选和优化, 建立了番茄样品中内源性植物激素水杨酸和赤霉酸高效液相色谱串联质谱检测方法, 并应用于实际样品的分析该方法分析时间短检出限低线性范围宽回收率高, 可适用于番茄等样品中水杨酸和赤霉酸的测定分析参考文献 : [1] COLEBROOK E H, THOMAS S G, PHILLIPS A L, et al. The role of gibberellin signalling in plant responses to abiotic stress[j]. Journal of Experimental Biology, 2014, 217(1): doi: /jeb [2] IQBAL N, UMAR S, KHAN NA, et al. A new perspective of phytohormones in salinity tolerance: Regulation of proline metabolism[j]. Environmental and Experimental Botany, 2014, 100: [3] TANK J G, PANDYA R V, THAKER V S. Phytohormones in regulation of the cell division and endoreduplication process in the plant cell cycle[j]. RSC Advances, 2014, 49(24): [4] 许智宏, 李家洋. 中国植物激素研究 : 过去现在和未来 [J]. 植物学通报, 2006, 23(5):

for SA and GA3 in tomato 样品分析物添加水平 (μg/kg) 回收率 /% RSD/% (n=3) 1.25 95.3 6.0 水杨酸 2.50 95.1 6.9 5.00 87.6 4.6 番茄 10.0 83.8 6.7 赤霉酸 50.0 96.5 6.5 100.0 88.2 6.3 2.

6 [5] 符继红, 孙晓红, 王吉德, 等. 植物激素定量分析方法研究进展 [J]. 科学通报, 2010, 55( 33) : [6] LIU Bifeng, ZHONG Xuehua, LU Yingtang. Analysis of plant hormones in tobacco flowers by micellar electrokinetic capillary chromatography coupled with on-line large volume sample stacking[j]. Journal of Chromatography A, 2002, 945(1): [7] LIU Xin, MA Li, LIN Yawei, et al. Determination of abscisic acid by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection[j]. Journal of Chromatography A, 2003, 1021(1): [8] 刘志勇, 沈春章, 董元彦. 气相色谱法速测油菜中的乙烯释放量 [J]. 化学与生物工程, 2006, 23(2): [9] 周艳明, 忻雪. 高效液相色谱法测定果蔬中 7 种植物激素的残留量 [J]. 食品科学, 2010, 31(18): [10] DOBREV P I, Havlíček L, Vágner M, et al. Purification and determination of plant hormones auxin and abscisic acid using solid phase extraction and two-dimensional high performance liquid chromatography[j]. Journal of Chromatography A, 2005, 1075(1): [11] CLAUDIA B, ANIA K, JOACHIM K. C omprehensive chemical derivatization for gas chromatography mass spectrometry-based multi-targeted profiling of the major phytohormones[j]. Journal of Chromatography A, 2003, 993(1): [12] BARKAWI L S, TAM Y Y, TILLMAN J A, et al. A high-throughput method for the quantitative analysis of indole-3-acetic acid and other auxins from plant tissue[j]. Anal Biochem, 2008, 372(2): [13] CATHERINE R, LARS G K, JOEL P A, et al. A rapid method for profiling of volatile and semi-volatile phytohormones using methyl chloroformate derivatisation and GC-MS[J]. Metabolomics, 2015(11): [14] DURGBANSHI A, ARBONA V, POZO O, et al. Simultaneous Determination of Multiple Phytohormones in Plant Extracts by Liquid Chromatography Electrospray Tandem Mass Spectrometry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(22): [15] PAN Xiangqing, WELTI R, WANG Xuemin. Simultaneous quantification of major phytohormones and related compounds in crude plant extracts by liquid chromatography electrospray tandem mass spectrometry[j]. Phytochemistry, 2008, 69(8): [16] 李艳, 徐继林, 郑立洋, 等. 高效液相色谱 - 三重四极杆质谱法同时测定羊栖菜 5 个部位中 10 种植物激素含量 [J]. 色谱, 2014, 32(8): [17] CUI Kunyuan, LIN Yaying, ZHOU Xi, et al. Comparison of sample pretreatment methods for the determination of multiple phytohormones in plant samples by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry[j]. Microchemical Journal, 2015, 121: [18] SCHMELZ E A, ENGELBERTH J, ALBORN H T, et al. Simultaneous analysis of phytohormones, phytotoxins, and volatile organic compounds in plants[j]. Proc Nati Acad Sci, 2003, 100(18): [19] 白玉, 杜甫佑, 刘虎威. 植物激素检测技术研究进展 [J]. 生命科学, 2010, 22(1): [20] 陈菲, 陈丽璇, 刘鸿洲等. 质谱技术在植物内源激素检测中的应用 [J]. 亚热带植物科学, 2010, 39(4): [21] CAI Baodong, YE Ercui, YUAN Bifeng, et al. Sequential solvent induced phase transition extraction for profiling of endogenous phytohormones in plants by liquid chromatography-mass spectrometry[j]. Journal of Chromatography B, 2015, 1004(1): [22] PAN Xiangqing, WELTI R, WANG Xuemin. Quantitative analysis of major plant hormones in crude plant extracts by high-performance liquid chromatography mass spectrometry[j]. Nature protocols, 2010, 5(6): [23] DELANEY T P, UKNES S, VERAOOIJ B, et al. A central role of salicylic acid in plant disease resistance[j]. Science, 1994, 266(5188): [24] 鲍峰伟, 杨运红, 苏国岁等. 高效液相色谱法测定烟草中的水杨酸 [J]. 烟草科技, 2011(6): [25] 陈红平, 刘新, 王川丕等. 分散固相萃取 - 超高压液相色谱 - 串联质谱法测定茶叶中赤霉酸和 α- 萘乙酸 [J]. 分析化学, 2012, 40(7): [26] 王伟华, 韩占江, 孟庆艳等. 基于 HPLC-MS/MS 的红枣中氯吡脲与赤霉酸同时检测方法的建立 [J]. 中国食品学报, 2014, 14(3):

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DOI /j.issn Food Research And Development UPLC-MS/MS 5 0.

DOI /j.issn Food Research And Development UPLC-MS/MS 5 0. 118 217 5 38 1 DOI 1.3969/j.issn.5-6521.217.1.28 Food Research And Development 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1. 731 2. 731 - UPLC-MS/MS 5. 1 mol/l ProElut PXC 5 % - Thermo Hypersil Gold mm 2.1 mm 1.9 μm ESI