酰胺型硅胶基质纳米粒子的制备及其在毛细管电泳中的应用

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1 目 录 液 相 色 谱 应 用 技 术 酰 胺 型 硅 胶 基 质 纳 米 粒 子 的 制 备 及 其 在 毛 细 管 电 泳 中 的 应 用... 张 俊 磊, 包 建 民, 丁 国 生 1 电 渗 驱 动 在 线 单 滴 液 液 微 萃 取 - 毛 细 管 电 泳 联 用 新 技 术 研 究... 张 俊 磊, 包 建 民, 丁 国 生 3 HPLC-WBE 二 维 联 用 系 统 的 研 究... 李 优 鑫, 方 欣, 翟 婷 婷, 赵 世 斌, 包 建 民 5 大 管 电 泳 - 毛 细 管 电 泳 多 功 能 系 统 的 研 究... 李 优 鑫, 但 勇 波, 方 欣, 包 建 民 9 大 管 电 泳 样 品 在 线 转 移 可 行 性 研 究... 李 优 鑫, 方 欣, 但 勇 波, 包 建 民 13 一 种 新 型 紫 杉 醇 纳 米 制 剂 在 小 鼠 体 内 的 药 代 动 力 学 研 究.... 孟 素 蕊, 焦 建 杰, 高 洋, 李 芹, 韩 晓 文, 何 景 华, 牛 瑞 芳 17 HPLC 法 对 甲 钴 胺 注 射 液 有 关 物 质 方 法 学 研 究... 李 瑾, 于 润 芳 21 柱 前 衍 生 HPLC 法 测 定 生 物 样 品 中 甲 醛 的 浓 度... 张 梦 晓, 董 伟 林 24 灯 盏 花 素 对 细 胞 色 素 P4502D6 酶 活 性 影 响... 李 芹, 韩 晓 文, 孟 素 蕊, 焦 建 杰, 娄 建 石 29 跌 打 红 药 片 的 质 量 标 准 研 究... 周 德 英, 刘 志 华 33 高 效 液 相 色 谱 - 蒸 发 光 检 测 法 分 离 蚕 沙 中 的 生 物 碱... 亓 晖, 张 业 云, 刘 新 来, 赵 辉, 王 鹏, 花 同, 朱 元 元 35 液 相 色 谱 测 定 食 品 中 的 七 种 添 加 剂... 张 静, 于 洁, 高 秀 谦, 寇 登 民 37 应 用 可 逆 加 成 - 链 转 移 聚 合 法 合 成 四 环 素 分 子 印 迹 聚 合 物 微 球 及 表 征... 韩 建 坊, 董 襄 朝 40 快 速 亲 和 毛 细 管 电 泳 法 测 定 普 罗 帕 酮 和 牛 血 清 白 蛋 白 之 结 合 常 数... 张 勃, 包 建 民 42 无 机 - 有 机 聚 合 物 整 体 柱 的 制 备 及 其 在 蛋 白 分 离 方 面 的 应 用... 杨 更 亮, 程 佳, 白 立 改 45 柱 前 衍 生 RP-HPLC 法 检 测 血 浆 中 ADMA 浓 度 的 研 究 及 临 床 应 用... 董 茜, 张 和 顺 48 高 效 液 相 色 谱 法 - 蒸 发 光 散 射 检 测 器 测 定 保 健 食 品 中 人 参 皂 甙 主 要 成 分 的 含 量... 渠 志 华, 马 永 民, 李 建 平 52 灯 盏 花 素 对 细 胞 色 素 P4503A4 酶 活 性 的 影 响 韩 晓 文, 李 芹, 焦 建 杰, 高 思 楠, 孟 素 蕊, 刘 艳 霞, 娄 建 石 56 快 速 响 应 温 敏 性 PNIPAAm 整 体 柱 的 制 备 及 其 应 用... 杨 更 亮, 刘 名 权, 刘 海 燕 60 固 相 萃 取 盘 - 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 自 来 水 中 丙 烯 酰 胺... 张 勃, 祁 悦, 高 赫 男, 包 建 民 64 中 空 纤 维 膜 液 液 微 萃 取 法 测 定 盐 酸 普 罗 帕 酮 - 蛋 白 质 结 合 率 宝 贵 荣, 梁 清 刚, 闫 晨, 包 建 民 68 HPLC 法 初 探 酶 解 对 黄 芪 总 皂 苷 组 成 的 影 响... 钟 丹 丹, 张 金 红 71 柱 前 衍 生 - 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 饮 用 水 中 草 甘 膦 残 留 量 的 研 究 夏 义 平, 李 建 平, 马 永 民 74 大 管 区 带 电 泳 - 在 线 紫 外 检 测 技 术 对 有 机 酸 分 析 方 法 的 建 立... 孙 小 春, 包 建 民 76 酒 石 酸 托 特 罗 定 有 关 物 质 检 查 方 法 研 究... 靳 朝 东, 许 瑞 征, 薛 津 80 基 质 固 相 分 散 - 分 子 印 迹 固 相 萃 取 联 用 测 定 土 壤 和 葡 萄 中 三 唑 类 杀 菌 剂.... 刘 维 娟, 张 玲, 郭 亚 萍, 张 智 超 82 拉 莫 三 嗪 片 有 关 物 质 测 定 方 法 研 究... 夏 锦 辉, 王 琳 86 离 子 交 换 树 脂 固 相 萃 取 离 子 对 色 谱 法 检 测 稻 田 水 样 中 的 春 雷 霉 素.... 张 春 涛, 郭 亚 萍, 张 玲, 张 智 超 88 高 效 毛 细 管 电 泳 法 用 于 沃 尼 妙 林 的 药 代 动 力 学 研 究... 李 志 伟, 赵 云 超, 齐 建 敏 91 CH8 培 养 液 中 球 毛 壳 甲 素 的 检 测 和 分 离 陈 煌, 郝 晓 冉, 牛 学 良, 毕 建 男, 吕 宪 禹, 朱 旭 东 94 HPLC 法 测 定 镇 咳 药 TY 的 含 量... 薛 津, 许 瑞 征, 靳 朝 东 96 I

2 HPLC 法 筛 选 10- Deacetyl BaccatinⅢ 产 生 菌 及 其 萃 取 方 法 的 选 择 牛 学 良, 毕 建 男, 郝 晓 冉, 吕 宪 禹, 朱 旭 东 98 反 相 高 效 液 相 色 谱 法 检 测 辛 伐 他 汀 的 血 药 浓 度... 毕 丹, 董 伟 林 102 发 酵 液 中 紫 杉 醇 的 高 效 液 相 色 谱 分 离 条 件 的 优 化 毕 建 男, 牛 学 良, 郝 晓 冉, 陈 煌, 潘 皎, 吕 宪 禹, 朱 旭 东 105 蚕 沙 中 1- 脱 氧 野 尻 霉 素 三 种 含 量 测 定 方 法 的 比 较... 亓 晖, 赵 辉, 朱 元 元 107 分 子 印 迹 固 相 萃 取 - 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 火 腿 肠 制 品 中 的 四 种 苏 丹 红 含 量 乔 晋 东, 闫 宏 远, 王 慧, 杨 更 亮 109 原 子 转 移 自 由 基 聚 合 (ATRP) 法 制 备 聚 苯 乙 烯 -2 乙 烯 苯 高 分 子 包 覆 硅 胶 固 定 相 徐 丹, 张 海 燕, 董 襄 朝 111 毛 细 管 电 泳 分 离 手 性 类 氨 基 酸 药 物... 李 保 会 1, 田 宝 娟 112 大 田 软 海 绵 酸 的 高 效 液 相 色 谱 荧 光 检 测 方 法 王 丽, 王 向 红, 桑 亚 新, 周 群 标, 吉 爽 爽, 叶 婧 114 对 硫 磷 分 子 印 迹 聚 合 物 固 相 萃 取 材 料 的 合 成 及 其 应 用..... 苏 晓 倩, 高 瑞 霞, 孙 祥 丽, 林 冬, 陈 朗 星 118 HPLC 法 在 PDS 靶 标 酶 除 草 剂 筛 选 中 的 应 用... 戎 清 清, 马 荣, 朱 晔 荣, 吕 宪 禹, 王 勇 119 高 效 毛 细 管 电 泳 法 用 于 麻 保 沙 星 的 测 定... 李 志 伟, 崔 哲, 赵 云 超 121 毛 细 管 区 带 电 泳 法 拆 分 匹 伐 他 汀 钙 对 映 体... 杨 更 亮, 程 晓 昆, 王 利 娟 124 基 于 原 子 转 移 自 由 基 聚 合 和 点 击 化 学 方 法 制 备 手 性 色 谱 固 定 相... 王 怀 松, 姜 萍, 张 敏, 董 襄 朝 126 利 用 UHPLC 技 术 优 化 药 典 2010 版 甘 草 的 含 量 测 定 方 法... 肖 尧 128 液 相 色 谱 法 同 时 测 定 3 种 B 族 维 生 素 的 研 究... 李 建 平, 党 亚 敏, 夏 义 平, 渠 志 华, 马 永 民 132 按 照 美 国 药 典 对 地 塞 米 松 磷 酸 钠 注 射 液 含 量 测 定 的 方 法 学 探 讨... 于 润 芳, 李 瑾, 王 虹 135 高 效 液 相 色 谱 法 对 呋 塞 米 注 射 液 含 量 检 测 的 方 法 学 验 证... 于 润 芳, 唐 洪 138 反 相 高 效 液 相 色 谱 法 分 离 九 种 精 神 类 药 物... 程 明, 王 芳, 李 广 庆 143 茶 饮 料 中 咖 啡 因 检 测 存 在 问 题 的 探 讨 和 研 究... 张 明 月, 夏 义 平 145 高 效 液 相 法 测 定 比 卡 鲁 胺 含 量... 张 莹, 张 建 柱, 李 博, 周 丽, 汪 群 杰 149 紫 杉 醇 真 菌 未 知 代 谢 产 物 的 研 究... 吴 迪, 王 伟, 曹 淑 珍, 吕 宪 禹 152 高 效 液 相 色 谱 - 示 差 检 测 法 分 离 蚕 沙 中 的 生 物 碱... 亓 晖, 张 业 云, 刘 新 来, 赵 辉, 王 鹏, 花 同, 朱 元 元 155 紫 云 喷 雾 剂 制 备 及 其 阿 魏 酸 含 量 测 定... 李 瑾 157 气 相 色 谱 应 用 技 术 空 气 中 异 丁 烷 气 体 标 准 物 质 的 研 制... 袁 岭 161 室 内 环 境 空 气 中 TVOC 测 定 注 意 要 点... 闫 卿 卿, 苏 广 志, 杨 绍 康 165 氮 中 甲 烷 乙 烷 丙 烷 和 正 丁 烷 混 合 气 体 标 准 物 质 的 研 制... 袁 岭 167 高 纯 CO2 中 微 量 气 体 分 析 气 相 色 谱 仪 的 改 装... 张 令 甲, 吕 宪 禹, 张 钰 浩 171 Prediction of retention times in multiple-ramp temperature programmed gas chromatography using non-linear plate theory... Huang-fu Xu-dan, Li Xiao-wei,Li Wen-chen 173 The hold-up time has no effect on the prediction of retention times in temperature- programmed II

3 gas chromatography using plate theory...huang-fu Xu-dan, Ao Min, Lan Che 177 The effect of temperature on the entropy and enthalpy in the prediction of temperature programmed retention times...huang-fu Xu-dan, Li Deng-ke 180 Using Plate Theory for the prediction of retention times in programmed temperature analyses.... ZHANG Lan-lan, Li Deng-ke 182 塔 板 理 论 预 测 恒 流 模 式 下 变 化 柱 长 毛 细 管 色 谱 程 序 升 温 保 留 时 间.. 张 兰 兰, 敖 敏, 张 仲 荣 185 塔 板 理 论 对 毛 细 管 色 谱 程 序 温 度 流 量 模 式 下 保 留 时 间 预 测 的 研 究..... 张 兰 兰, 李 笑 玮, 颜 昊, 孙 志 豪, 王 伟 189 气 相 色 谱 法 测 定 涂 料 中 挥 发 性 卤 代 烃... 张 克 贤 192 气 相 色 谱 法 测 定 烃 中 环 丁 砜 的 研 究... 徐 忠 贤 195 气 相 色 谱 法 测 定 原 油 高 温 模 拟 蒸 馏... 徐 忠 贤 197 基 质 固 相 分 散 - 气 相 色 谱 法 测 定 水 产 品 中 痕 量 菊 酯 类 药 物 含 量... 刘 宝 蜜, 闫 宏 远, 杜 精 精, 褚 春 霞, 杨 更 亮 201 硫 化 氢 分 析 浅 析... 纪 玉 金, 马 秀, 唐 太 平 203 顶 空 气 相 色 谱 法 测 定 DT 中 有 机 溶 剂 残 留 量... 蔡 振 华, 李 月 鹏, 蒋 庆 峰 206 顶 空 气 相 色 谱 法 测 定 HHL 中 大 孔 树 脂 有 机 溶 剂 残 留 量... 金 松 子, 胡 佰 艳, 蔡 振 华, 蒋 庆 峰 209 质 谱 应 用 技 术 GC-MS 法 评 估 陈 皮 原 料 品 质... 周 德 英, 刘 志 华 213 超 临 界 CO2 萃 取 法 与 水 蒸 气 蒸 馏 法 提 取 陈 皮 挥 发 油 的 化 学 成 分 比 较... 周 德 英, 刘 志 华 216 超 临 界 CO2 萃 取 法 与 蒸 馏 法 提 取 连 翘 挥 发 油 的 成 分 比 较... 周 德 英, 刘 志 华 219 Nano-LC/MS/MS 鉴 定 组 蛋 白 翻 译 后 修 饰... 陈 英, 张 锴 222 青 翘 与 老 翘 挥 发 油 的 化 学 成 分 比 较... 周 德 英, 刘 志 华 224 TSQ Quantum 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 测 定 十 种 全 氟 烷 基 化 合 物... 刘 飞, 王 勇 为, 刘 婷 227 高 效 液 相 色 谱 串 联 质 谱 法 测 定 五 种 微 囊 藻 毒 素... 刘 飞, 王 勇 为 230 高 效 液 相 色 谱 串 联 质 谱 法 筛 选 10- 脱 乙 酰 基 巴 卡 丁 Ⅲ 产 生 菌... 郝 晓 冉, 牛 学 良, 陈 煌, 吕 宪 禹, 朱 旭 东 232 熊 果 酸 脂 质 体 人 体 药 代 动 力 学 研 究... 黄 月 珍, 阎 昭, 董 伟 林 235 海 洋 生 物 体 中 的 多 环 芳 烃 的 检 测 方 法 探 讨... 降 升 平 239 用 固 相 萃 取 和 色 质 联 用 技 术 分 析 柴 油 组 成... 袁 维 242 超 声 提 取 -GC/MS 测 定 贝 类 产 品 中 的 多 氯 联 周 群 标, 王 向 红, 桑 亚 新, 王 丽, 吉 爽 爽, 叶 静 245 药 物 中 杂 质 鉴 定 新 技 术 MassWorks... 顾 鸣, 李 卫 建, 李 宗 华 250 聚 丙 烯 酸 高 级 酯 的 裂 解 色 谱 质 谱 分 析 研 究.... 张 红 玲, 范 国 樑, 徐 海 红, 贾 子 麒, 李 春 漫, 李 国 平 252 聚 丙 烯 酸 十 八 酯 的 热 裂 解 规 律 的 研 究 张 红 玲, 范 国 樑, 徐 海 红, 贾 子 麒, 李 春 漫, 李 国 平 254 GC-MS 法 测 定 抑 尘 剂 中 的 甲 醛 乙 醛 含 量... 李 静, 何 秀 坤, 那 顺 256 利 用 GC-MS 鉴 别 蜂 胶 提 取 物 中 化 学 成 分... 高 振 中, 降 升 平, 杨 志 岩 260 二 维 液 相 色 谱 质 谱 联 用 方 法 分 析 人 血 清 中 的 磷 脂 类 化 合 物 李 珉, 聂 洪 港, 白 玉, 刘 虎 威 263 分 子 蒸 馏 提 取 紫 苏 油 蒸 出 物 的 GC-MS 分 析 杨 志 岩, 降 生 平, 高 振 中 264 III

4 应 用 QTRAP TM 串 联 质 谱 仪 分 析 和 鉴 定 中 药 有 效 成 分... 张 克 荣 266 质 谱 鉴 定 激 酶 中 低 丰 度 蛋 白 修 饰 的 研 究... 朱 金 蕾, 张 锴 269 利 用 固 相 萃 取 和 色 质 联 用 技 术 分 析 柴 油 组 成... 袁 维 271 基 础 理 论 研 究 及 其 它 离 子 液 体 辅 助 诺 氟 沙 星 分 子 印 迹 整 体 柱 的 制 备 及 性 能 考 察 孙 祥 丽, 刘 烜, 何 锡 文, 陈 朗 星, 张 玉 奎 274 磺 胺 甲 噁 唑 印 迹 纳 米 硅 球 的 制 备 及 其 与 传 统 分 子 印 迹 聚 合 物 的 比 较 高 瑞 霞, 苏 晓 倩, 陈 朗 星, 何 锡 文, 张 玉 奎 275 氯 霉 素 分 子 印 迹 整 体 柱 的 制 备 及 其 在 色 谱 分 离 中 的 应 用 林 冬, 孙 祥 丽, 苏 晓 倩, 陈 朗 星 276 制 备 大 孔 硼 酸 亲 和 整 体 柱 用 于 糖 蛋 白 分 离 杨 帆, 何 锡 文, 张 玉 奎, 陈 朗 星 277 苯 硼 酸 修 饰 阳 离 子 交 换 整 体 柱 的 制 备 及 在 蛋 白 质 分 离 复 性 中 的 应 用 孙 祥 丽, 林 冬, 何 锡 文, 张 玉 奎, 陈 朗 星 278 点 击 化 学 修 饰 疏 水 有 机 聚 合 物 整 体 柱 的 制 备 及 其 在 蛋 白 质 分 离 中 的 应 用 孙 祥 丽, 林 冬, 何 锡 文, 陈 朗 星, 张 玉 奎 279 转 铁 蛋 白 分 子 印 迹 颗 粒 的 制 备 及 应 用 李 沁 然, 刘 晋 湘, 杨 开 广, 张 丽 华, 梁 振, 单 亦 初, 张 玉 奎 280 蛋 白 质 印 迹 材 料 制 备 及 其 识 别 性 能 研 究... 邓 启 良, 刘 晋 湘, 梁 振, 张 丽 华, 张 玉 奎 281 一 种 新 的 非 平 衡 传 质 模 型 对 柱 内 外 色 谱 峰 形 的 描 述... 张 兴 华, 李 笑 玮, 孙 志 豪 283 非 平 衡 塔 板 理 论 和 经 典 塔 板 理 论 在 描 述 色 谱 峰 形 方 面 的 定 性 比 较.. 张 兴 华, 李 登 科, 王 伟 287 非 平 衡 塔 板 理 论 和 经 典 塔 板 理 论 在 描 述 色 谱 峰 形 方 面 的 数 学 关 系 的 定 量 研 究 张 兴 华, 敖 敏 290 在 线 速 度 改 变 的 条 件 下 塔 板 理 论 对 柱 内 外 色 谱 峰 形 的 描 述... 张 兴 华 293 有 机 无 机 复 合 聚 合 物 整 体 柱 的 制 备 及 其 在 分 离 蛋 白 中 的 应 用... 杨 更 亮, 白 立 改 296 ELSD 简 介 及 在 生 物 碱 成 分 分 析 中 的 应 用... 赵 辉, 亓 晖, 朱 元 元 299 离 子 液 体 在 色 谱 领 域 的 应 用... 张 静, 寇 登 民 301 色 谱 技 术 在 阿 莫 西 林 中 有 关 物 质 的 分 析 和 鉴 定 中 的 应 用 雷 勇 胜, 金 松 子, 姜 喜 成, 宋 丽 明, 王 琳, 蒋 庆 峰 303 球 型 高 分 子 共 聚 物 GDX 型 气 相 色 谱 填 料 即 固 定 相 的 结 构 特 征... 张 策 307 几 类 固 相 萃 取 柱 使 用 的 填 料 产 品 概 述... 张 策 308 蜂 胶 活 性 成 分 及 质 量 控 制 的 研 究... 张 明 月 310 植 物 激 素 茉 莉 酸 的 短 端 进 样 快 速 CE 手 性 分 离... 韩 晔 华, 白 玉, 刘 虎 威 314 免 疫 亲 和 色 谱 LC-QTOF MS 联 用 分 离 分 析 植 物 多 肽 系 统 素 的 研 究 杜 甫 佑, 白 玉, 刘 虎 威 315 动 物 信 息 素 的 分 离 检 测 方 法 研 究 进 展... 翁 瑞, 张 晓 丽, 刘 虎 威 316 磁 性 分 离 在 植 物 类 转 基 因 食 品 检 测 中 的 应 用 王 爱 迪, 冉 晓 华, 万 谦 宏, 赵 卫 东, 陈 磊 317 原 子 层 沉 积 法 制 备 键 合 相 硅 胶... 肖 得 力, 万 谦 宏, 陈 磊 320 谈 谈 同 一 物 质 色 谱 分 析 方 法 的 多 样 性... 张 令 甲, 朱 瑞 林, 吕 宪 禹 323 TCF7L2 AKT2 FOXO1 基 因 多 态 性 与 2 型 糖 尿 病 的 相 关 性 研 究... 张 婕, 刘 德 敏 327 IV

5 新 配 方 汽 油 分 析 仪 M3 的 应 用... 袁 维 328 含 硫 化 合 物 类 蔬 菜 中 农 药 多 残 留 快 速 分 析 方 法 的 研 究... 陈 子 雷 329 农 兽 药 残 留 检 测 中 串 联 质 谱 方 法 优 化 策 略... 牛 增 元 330 饮 用 水 中 痕 量 有 机 污 染 物 色 质 联 用 快 速 筛 查 技 术 研 究... 贾 瑞 宝, 赵 清 华, 孙 韶 华 331 气 质 联 用 技 术 在 非 食 品 消 费 品 安 全 中 的 的 应 用... 高 崔 玲 332 食 品 中 富 马 酸 二 甲 酯 的 气 相 色 谱 测 定... 陈 旭 艳, 葛 宝 坤, 赵 孔 祥 333 废 水 及 高 纯 三 甲 胺 中 痕 量 一 二 甲 胺 的 气 相 色 谱 分 析... 李 洪 宽 336 化 妆 品 中 残 留 右 美 沙 芬 的 高 效 液 相 色 谱 检 测 方 法... 吴 延 晖, 许 泓, 何 佳, 肖 亚 兵, 张 骏 338 光 引 发 Fe(Ⅲ)- 柠 檬 酸 钠 配 合 物 对 环 境 内 分 泌 干 扰 物 的 降 解 及 羟 基 自 由 基 的 测 定... 张 长 波, 王 蕾, 唐 世 荣, 宋 宁 宁, 王 芳 丽 341 液 相 色 谱 - 质 谱 / 质 谱 法 测 定 肉 及 肉 制 品 中 2,4- 滴 残 留 量.... 何 佳, 许 泓, 林 安 清, 张 曼, 吴 延 晖, 张 骏 345 DMI-GCMS 快 速 测 定 土 壤 中 16 种 多 环 芳 烃..... 孙 碧 霞, 郭 德 华, 丁 卓 平, 冀 峰, 董 吉 川, 姚 劲 挺 348 离 子 阱 - 飞 行 时 间 串 联 质 谱 快 速 筛 查 蔬 菜 中 189 种 农 药 残 留... 孙 碧 霞, 郭 德 华, 丁 卓 平, 冀 峰, 董 吉 川, 姚 劲 挺 352 V

6 酰 胺 型 硅 胶 基 质 纳 米 粒 子 的 制 备 及 其 在 毛 细 管 电 泳 中 的 应 用 张 俊 磊 1 丁 国 生 2 包 建 民 1 (1. 天 津 大 学 药 学 院, 天 津 ;2. 天 津 大 学 分 析 测 试 中 心, 天 津 ) 本 文 合 成 了 新 型 的 辛 基 - 酰 胺 型 纳 米 粒 子 (OA-NPs) 并 研 究 了 其 在 色 谱 分 离 方 面 的 优 越 性 在 硅 胶 纳 米 粒 子 (20 nm) 表 面 成 功 键 合 了 辛 基 - 酰 胺 基 团, 实 现 了 反 向 电 渗 流 条 件 下 对 四 种 酸 性 化 合 物 的 快 速 分 离 ; 键 合 基 团 中 的 辛 基 可 参 与 到 中 性 化 合 物 的 分 配 和 保 留 中 去, 从 而 起 到 改 善 分 离 度 提 高 柱 效 的 作 用 [1] 同 常 规 的 电 色 谱 [2] 相 比, 使 用 纳 米 粒 子 作 为 假 固 定 相 的 纳 米 粒 子 电 色 谱 技 术 因 无 需 填 充 和 柱 塞 制 备 等 步 骤 而 更 加 方 便, 易 于 实 现 此 外, 该 技 术 可 以 实 现 良 好 的 柱 更 换, 避 免 了 进 行 复 杂 样 品 分 析 时 所 造 成 的 柱 污 染 1 试 验 部 分 1.1 仪 器 和 试 剂 UV3000 可 变 波 长 紫 外 / 可 见 分 光 检 测 器 ( 北 京 创 新 通 恒 科 技 有 限 公 司 ),HB-F203-1AC 直 流 高 压 电 源 ( 天 津 恒 搏 高 压 电 源 厂 ), 配 备 N2000 双 通 道 色 谱 工 作 站 ( 浙 江 大 学 智 达 信 息 工 程 有 限 公 司 ); 四 乙 氧 基 硅 烷 (TEOS, 分 析 纯, 天 津 大 学 科 威 公 司 ), 氨 丙 基 三 乙 氧 基 硅 烷 (APTES,99%, 百 灵 威 ), 正 辛 基 酰 氯 ( 分 析 纯,Sigma 公 司 ), 所 用 水 为 Barnstead Nanopure II 超 纯 水, 其 它 试 剂 皆 为 分 析 纯 试 剂 1.2 酰 胺 型 纳 米 粒 子 的 制 备 制 备 过 程 参 考 文 献 [2] 2 试 验 结 果 2.1 对 酸 性 化 合 物 的 分 离 研 究 发 现 所 制 备 OA-NPs 在 缓 冲 中 作 为 假 固 定 相 时, 在 低 ph 值 的 弱 酸 性 条 件 下 产 生 反 向 电 渗 流, 与 酸 性 化 合 物 的 离 子 迁 移 方 向 一 致, 所 以 可 实 现 酸 性 化 合 物 的 快 速 分 离 酸 性 化 合 物 在 柱 上 进 行 分 离 时, 除 了 与 纳 米 粒 子 表 面 键 合 的 辛 基 发 生 疏 水 作 用, 电 泳 机 理 也 会 参 与 其 中 图 1 为 四 种 常 见 有 机 酸 在 ph 值 3.0 的 流 动 相 条 件 下 的 分 离 结 果 在 流 动 相 ph 值 为 3 时, 由 于 大 部 分 酸 的 解 离 受 到 抑 制, 其 疏 水 性 较 强, 所 以 此 时 主 要 依 据 疏 水 性 增 大 的 顺 序 而 依 次 被 洗 脱, 实 现 了 四 种 酸 的 快 速 分 离 计 算 四 种 酸 保 留 时 间 的 RSD%(n=4) 在 5-8%, 证 明 其 重 复 性 良 好 2.2 对 中 性 化 合 物 的 分 离 如 图 2 所 示, 对 DMP DEP 和 硫 脲 进 行 分 离 时,a 图 为 未 加 入 纳 米 粒 子 的 电 泳 分 离 结 果 图 ; b 图 在 同 样 色 谱 条 件 下 加 入 OA-NPs 纳 米 粒 子 后 结 果 图, 三 种 中 性 样 品 达 到 了 基 线 分 离, 且 峰 形 改 善, 柱 效 明 显 提 高 这 是 由 于 OA-NPs 作 为 假 固 定 相, 表 面 键 合 的 辛 基 - 酰 胺 基 团 中 的 辛 基, 参 与 了 中 性 化 合 物 的 分 配 和 保 留 的 结 果 1

7 Absorbance(mV) Migration time(min) 4 Absorbance(mV) b a Migration time(min) 图 1 纳 米 粒 子 电 色 谱 对 四 种 酸 的 分 离 结 果 图 3 结 论 OA-NPs 在 电 泳 缓 冲 溶 液 中 作 为 假 固 定 相, 在 ph 的 范 围 可 形 成 从 负 极 到 到 正 极 的 电 渗 流, 和 酸 性 化 合 物 的 电 泳 方 向 一 致, 所 以 可 实 现 酸 性 化 合 物 的 快 速 高 效 分 离 在 对 中 性 化 合 物 分 离 的 实 验 中,OA-NPs 的 加 入 明 显 改 善 了 分 离 的 效 果 参 考 文 献 [1] Nilsson C, Nilsson S, Nanoparticle-based pseudostationary phases in capillary electrochromatography, Electrophoresis, 2006, 27: [2] Ding GS, Zhang JL, Bao JJ. Preparation and evaluation of amphilic silica-based monolithic column having surface-bound octanoyl-aminopropyl moieties for capillary electrochromatography, Electrophoresis, 2010, 31(12): 图 2 加 入 纳 米 粒 子 前 后 对 三 种 中 性 化 合 物 Preparation and Evaluation of Amphilic Silica-based Nanoparticles Having Surface-bound Octanoyl-aminopropyl Moieties for Capillary Electrochromatography 分 离 结 果 比 较 图 ZHANG Junlei 1 DING Guosheng 1,2 BAO James J 2 (1,School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University, Tianjin ,China 2,Analysis Center, Tianjin University, Tianjin ,China) In this thesis, novel amphiphilic silica-based nanoparticles having surface-bound octanoyl-aminopropyl moieties (OA-NPs) were successfully prepared. The potential use of OA-NPs as a pseudostationary phase (PSP) in CE for the separation of different kinds of compounds was investigated. As expected, fast and efficient separation of four aromatic acids was obtained with high column efficiency, because they could migrate in the same direction with the EOF under optimum experimental conditions. Since the existence of octyl groups on the surface, OA-NPs could participate in the distribution and retention of neutral compounds resulting in improved column performance and resolution. In comparison with classical capillary electrochromatography (CEC) technique, this technique is much easier to be realized because it does not need some steps such as preparation of the frits, packing of the stationary phases. Keywords: Capillary Electrophoresis, Nanoparticles; Capillary Electrochromatography 2

8 电 渗 驱 动 在 线 单 滴 液 液 微 萃 取 - 毛 细 管 电 泳 联 用 新 技 术 研 究 张 俊 磊 1 1 2, 包 建 民, 丁 国 生 (1. 天 津 大 学 药 学 院, 天 津 ;2. 天 津 大 学 分 析 测 试 中 心, 天 津 ) 借 助 无 歧 视 电 动 进 样 技 术 [1], 通 过 电 极 的 切 换 实 现 了 单 滴 液 液 微 萃 取 (SDME) 与 毛 细 管 电 泳 (CE) 的 在 线 联 用 使 用 该 技 术, 实 现 了 对 酸 性 化 合 物 ( 布 洛 芬 和 水 杨 酸 ) 碱 性 化 合 物 ( 麻 黄 碱 ) 和 中 性 化 合 物 ( 邻 苯 二 甲 酸 二 甲 酯 和 邻 苯 二 甲 酸 二 乙 酯 ) 的 高 倍 富 集, 大 大 降 低 了 样 品 的 检 测 限, 提 高 了 检 测 灵 敏 度 与 压 力 驱 动 的 在 线 SDME [2] 技 术 相 比, 该 技 术 依 靠 高 压 电 源 控 制, 无 需 外 加 的 压 力 装 置, 更 加 简 单 经 济 和 易 于 控 制 1 试 验 部 分 1.1 仪 器 UV3000 可 变 波 长 紫 外 / 可 见 分 光 检 测 器 ( 北 京 创 新 通 恒 科 技 有 限 公 司 ),HB-F203-1AC 直 流 高 压 电 源 ( 天 津 恒 搏 高 压 电 源 厂 ), 配 备 N2000 双 通 道 色 谱 工 作 站 ( 浙 江 大 学 智 达 信 息 工 程 有 限 公 司 ) 1.2 试 验 原 理 本 实 验 根 据 电 渗 驱 动 原 理 [1], 通 过 电 极 反 转 在 毛 细 管 入 口 处 形 成 三 相 和 两 相 液 滴, 从 而 实 现 目 标 化 合 物 的 高 效 富 集 和 分 离 2 试 验 结 果 2.1 对 酸 性 化 合 物 的 富 集 Absorbance(mV) b a Migration time(min) 图 1 布 洛 芬 富 集 前 后 的 比 较 图 在 优 化 实 验 条 件 下, 利 用 三 相 的 SDME 实 现 了 对 布 洛 芬 的 富 集 和 分 离, 结 果 见 图 1 其 中 a 为 布 洛 芬 样 品 的 电 泳 图 ;b 为 该 样 品 液 用 ph 为 2.0 的 的 磷 酸 盐 缓 冲 (20 mm) 稀 释 300 倍, 经 过 15 min 富 集 后 进 样 的 电 泳 图 经 过 计 算, 布 洛 芬 的 富 集 倍 率 可 达 到 585 倍, 达 到 了 较 为 理 想 的 富 集 效 果 2.2 对 碱 性 化 合 物 的 富 集 同 样 利 用 三 相 SDME 的 原 理, 在 以 0.1 M 的 盐 酸 水 溶 液 作 为 接 收 相, 含 5% 磷 酸 钠 的 0.2 M 氢 氧 化 钠 水 溶 液 作 为 给 出 相,pH 值 为 4.90 的 磷 酸 盐 缓 冲 作 为 分 离 缓 冲 液 的 条 件 下 对 麻 黄 3

9 碱 进 行 富 集, 达 到 了 理 想 的 富 集 效 果, 富 集 倍 率 145 倍 实 验 结 果 表 明 给 出 相 中 磷 酸 盐 的 存 在, 降 低 了 麻 黄 碱 在 给 出 相 中 的 溶 解 度, 从 而 促 进 了 SDME 过 程 2.3 对 中 性 化 合 物 的 富 集 8 7 Absorbance(mV) b a Migration time(min) 图 2 对 DMP 和 DEP 富 集 前 后 的 比 较 图 运 用 胶 束 电 动 色 谱 分 离 模 式, 采 用 两 相 SDME 富 集 方 法, 对 DMP 和 DEP 的 混 合 样 同 时 进 行 了 富 集 和 分 离, 试 验 结 果 如 图 2 所 示 经 过 计 算, 对 DMP 和 DEP 的 平 均 富 集 倍 率 分 别 为 121 倍 和 511 倍 3 结 论 在 课 题 组 前 期 研 究 的 基 础 上, 通 过 电 极 的 切 换 实 现 了 SDME 与 CE 的 在 线 联 用 并 将 其 用 于 不 同 性 质 样 品 的 高 倍 富 集 和 快 速 分 离 参 考 文 献 [1] Yang Y, Bao JJ, An electrical pumping approach to eliminate sample bias in capillary electrokinetic injection, Electrophoresis, 2007, 28: 1063~1071. [2] Choi K, Kim S J, Jin Y G, et al. Single drop microextraction using commercial capillary electrophoresis, Anal Chem, 2009, 81(1): 225~230. On-line Hyphenation of Single Drop Microextraction with Capillary Electrophoresis Separation by Using an Electrical Pumping Approach ZHANG Jun-lei 1 DING Guo-sheng 1,2 BAO James J 2 (1,School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University, Tianjin ,China 2,Analysis Center, Tianjin University, Tianjin ,China) Abstract:In this thesis, a unique on-line single drop microextraction (SDME)-CE technique was developed by using an electroosmotic pump pumping process. High enrichment factors for ionic and neutral samples were realized by using three-phase and two-phase SDME processes separately. New techniques was more economical,convenient and easier to be implemented comparing with previously reported pressure-driven online SDME-CE technique for it does not need any external pressure device. Keywords: Capillary Electrophoresis; Single Drop Microextraction; Hyphenation. 4

10 HPLC-WBE 二 维 联 用 系 统 的 研 究 李 优 鑫, 方 欣, 翟 婷 婷, 赵 世 斌, 包 建 民 ( 天 津 大 学 药 物 科 学 与 技 术 学 院, 天 津 ) 随 着 人 类 基 因 测 序 的 基 本 完 成, 一 个 以 蛋 白 质 为 研 究 对 象 的 后 基 因 组 时 代 已 经 拉 开 序 幕 [1-2] 但 由 于 蛋 白 质 本 身 存 在 形 式 和 活 动 规 律 的 不 同, 如 翻 译 后 修 饰 蛋 白 质 间 相 互 作 用 以 及 蛋 白 质 的 构 象 等, 导 致 每 个 个 体 包 含 的 蛋 白 质 的 种 类 和 数 量 都 存 在 着 差 异, 即 使 是 同 一 细 胞, 不 同 的 活 动 周 期 也 产 生 着 千 变 万 化, 因 此 蛋 白 质 研 究 更 复 杂 [3-5] 在 蛋 白 质 研 究 中, 分 析 技 术 是 关 键 近 年 来, 高 效 液 相 色 谱 (HPLC) 和 毛 细 管 电 泳 (CE) 的 发 展 为 蛋 白 质 的 分 离 分 析 提 供 新 的 手 段 然 而 一 维 分 离 模 式 所 能 提 供 的 分 辨 率 和 峰 容 量 往 往 十 分 有 限 反 相 液 相 色 谱 - 毛 细 管 区 带 电 泳 (2D-RPLC-CZE) 二 维 系 统, 凭 借 着 以 下 优 势 成 为 目 前 研 究 最 多 最 受 欢 迎 的 二 维 联 用 系 统 [6-9] :(1)RPLC 与 CZE 具 有 完 全 不 同 的 分 离 机 制 : 在 RPLC 中, 各 组 分 根 据 疏 水 性 的 不 同 得 到 分 离, 而 在 CZE 中, 各 组 分 根 据 质 荷 比 的 差 异 而 分 开 ;(2) 这 两 种 分 离 模 式 的 缓 冲 液 具 有 兼 容 性 ;(3)CZE 分 离 速 度 快, 操 作 简 单 由 于 CE 分 析 速 度 快, 且 与 LC 具 有 较 好 的 互 补 性, 因 此,LC 与 CE 是 非 常 理 想 的 结 合, 可 能 会 实 现 各 种 复 杂 样 品, 特 别 是 生 物 样 品 中 不 同 性 质 组 分 的 高 效 高 分 辨 率 快 速 分 离 但 由 于 毛 细 管 的 微 观 尺 度 和 低 载 样 量 的 限 制, 使 得 这 一 技 术 仍 需 不 断 的 改 进 探 索 针 对 这 一 问 题, 本 文 提 出 了 高 效 液 相 色 谱 - 大 管 电 泳 (HPLC-WBE) 二 维 联 用 系 统 大 管 电 泳 是 我 实 验 室 独 创 的 一 种 半 制 备 毛 细 管 电 泳 技 术, 通 过 引 入 内 制 冷 机 制, 克 服 了 传 统 大 内 径 毛 细 管 电 泳 焦 耳 热 的 局 限, 极 大 地 提 高 了 CE 的 载 样 量 和 检 测 灵 敏 度 因 此, 在 HPLC-WBE 离 线 联 用 系 统 中,WBE 具 有 直 接 检 测 HPLC 流 出 物 的 潜 力 和 实 力 同 时, 由 于 大 管 电 泳 具 有 独 立 于 分 离 通 道 的 进 样 系 统, 故 HPLC-WBE 在 线 联 用 既 不 需 要 构 造 LC-CE 联 用 所 需 的 复 杂 接 口, 又 不 需 要 多 元 件 辅 助, 直 接 以 简 单 的 多 通 阀 连 接 即 可, 这 一 简 化 设 计 将 为 复 杂 样 品 分 析 提 供 极 大 的 便 捷 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 和 试 剂 自 组 装 大 管 电 泳 系 统 : 包 括 Spectra 100 UV 检 测 器 ( 美 国 Thermo Electron 公 司 ), 分 离 通 道 石 英 管 ( 辽 宁 锦 州 石 英 光 源 厂 ), 内 制 冷 毛 细 管 ( 河 北 永 年 锐 沣 色 谱 器 件 有 限 公 司 ), 大 管 电 泳 cartridge( 自 制 ),MODEL 2350 制 备 液 相 泵 ( 美 国 ISCO INC 公 司 ) 数 据 采 集 卡 ( 浙 江 大 学 智 能 信 息 工 程 研 究 所 ),N2000 双 通 道 色 谱 工 作 站 ( 浙 江 大 学 智 能 信 息 工 程 研 究 所 );Waters 486 高 效 液 相 色 谱 仪 ( 美 国 Waters 公 司 );ConstaMetric 3000 型 分 析 液 相 泵 ( 美 国 Milton Roy 公 司 )Baulo ODS 250*4.6mm 色 谱 柱 ( 天 津 奥 秘 科 技 有 限 公 司 ); 微 量 进 样 器 ( 上 海 高 鸽 工 贸 有 限 公 司 ); 微 量 移 液 器 (Finnpipette);DELTA-320 酸 度 计 ( 梅 特 勒 - 托 利 多 仪 器 ( 上 海 ) 有 限 公 司 );AL104 分 析 天 平 ( 梅 特 勒 - 托 利 多 仪 器 ( 上 海 ) 有 限 公 司 ); 真 空 过 滤 系 统 ( 上 海 申 东 ) 氢 氧 化 钠 浓 盐 酸 (36%-38%) 36% 冰 醋 酸 无 水 乙 酸 钠 苯 甲 酸 苯 乙 酸 均 为 分 析 纯, 甲 醇 为 色 谱 纯, 均 购 自 天 津 大 学 科 威 公 司 ; 羟 乙 基 纤 维 素 (HEC) 为 医 用 纯, 购 自 中 国 ( 天 津 ) 医 药 集 团 ; 蒸 馏 水 购 自 永 源 纯 水 开 发 中 心 1.2 大 管 cartridge 前 处 理 每 天 使 用 大 管 cartridge 前 用 1.0 mol/l NaOH 0.1 mol/l HCl H2O 溶 液 冲 洗 15 min, 基 金 项 目 : 天 津 市 科 委 重 点 培 育 项 目 (08ZCKFSH00500) 第 一 作 者 : 李 优 鑫 (1981- ), 女, 天 津 大 学 博 士 通 讯 作 者 : 包 建 民 (1961- ), 男, 天 津 大 学 博 士 生 导 师, 主 要 从 事 药 物 分 析 研 究 5

11 再 用 大 管 电 泳 缓 冲 液 冲 洗 5 min, 最 后 用 大 管 缓 冲 液 平 衡 20 min 每 天 实 验 结 束 后, 用 1.0 mol/l NaOH 溶 液 冲 洗 15 min, 再 用 水 洗 2 结 果 与 讨 论 2.1 大 管 电 泳 系 统 构 造 大 管 电 泳 的 分 离 机 理 与 传 统 毛 细 管 电 泳 相 同, 也 主 要 包 括 高 压 电 源 分 离 管 道 及 检 测 器 等 但 由 于 大 管 电 泳 系 统 引 入 了 内 制 冷 元 件, 因 此 在 构 造 上 有 着 独 具 的 体 征, 详 细 结 构 如 图 1(a) 所 示 图 1(b) 描 绘 了 分 离 通 道 横 截 面 的 构 造, 其 中 内 外 两 管 间 的 环 状 夹 层 即 为 实 际 有 效 的 分 离 通 道 2.2 HPLC-WBE 离 线 联 用 研 究 由 于 HPLC 流 动 相 对 样 品 的 稀 释 作 用, 目 前 所 报 道 的 HPLC-CE 离 线 联 用, 多 为 收 集 含 目 标 组 分 的 HPLC 流 出 液, 经 过 蒸 干 复 溶 等 样 品 处 理 过 程, 使 其 浓 缩, 再 进 行 CE 分 析 但 这 些 复 杂 的 处 理 过 程 易 使 蛋 白 质 等 生 物 样 品 因 受 热 和 长 时 间 暴 露 而 失 活, 因 此 难 以 应 用 于 生 物 样 品 的 分 析 上 相 比 之 下, 大 管 电 泳 采 用 大 内 径 的 石 英 管 作 为 分 离 通 道, 载 样 量 可 达 到 800 nl, 大 大 提 高 了 检 测 的 灵 敏 度, 故 HPLC 上 流 出 的 目 标 组 分, 无 需 经 过 处 理, 即 可 直 接 进 行 大 管 电 泳 分 析 苯 甲 酸 苯 乙 酸 结 构 相 似 极 性 相 近, 在 高 效 液 相 色 谱 上 两 峰 重 叠, 无 法 进 行 进 一 步 的 分 析, 故 选 用 此 二 种 化 合 物 作 为 分 离 模 型, 以 证 明 HPLC-WBE 联 用 的 意 义 对 比 图 2(A) 和 2(B) 可 以 看 出, 在 HPLC 上, 苯 甲 酸 苯 乙 酸 两 峰 重 叠 在 一 起, 完 全 不 能 分 离 收 集 含 目 标 组 分 的 HPLC 流 出 液, 取 400 nl, 进 行 大 管 电 泳 分 析, 结 果 表 明 苯 甲 酸 苯 乙 酸 获 得 了 良 好 的 分 离 HPLC-WBE 的 离 线 联 用 不 仅 省 去 了 耗 时 费 力 的 样 品 处 理 过 程, 更 扩 大 了 其 应 用 范 围, 为 分 析 复 杂 生 物 样 品 提 供 了 一 种 新 方 法 2.3 HPLC-WBE 在 线 联 用 研 究 HPLC-WBE 连 接 接 口 的 设 计 由 于 大 管 电 泳 具 有 独 立 的 进 样 毛 细 管, 因 此 可 以 利 用 液 相 手 动 进 样 阀 方 便 的 建 立 图 1 大 管 电 泳 体 系 构 造 示 意 图 (a) 大 管 电 泳 体 系 (b) 分 离 通 道 横 截 面 积 (1) 内 制 冷 毛 细 管 ;(2) 石 英 大 管 ;(3) 检 测 窗 口 ;(4) 进 样 毛 细 管 ;(5) 缓 冲 液 槽 ;(6) 缓 冲 液 槽 ;(7) 高 压 电 源 ;(8) 制 冷 液 ;(9) 输 液 泵 ; (10) 散 热 盘 管 ;(11) 底 座 图 2 HPLC-WBE 离 线 联 用 分 析 苯 甲 酸 和 苯 乙 酸 (A) 色 谱 图 (B) 电 泳 图 实 验 条 件 : 色 谱 条 件 : 色 谱 柱 :C18; 流 动 相 : 0.02 mol/l 磷 酸 二 氢 钾 (ph 5.0)- 甲 醇 (v/v: 50/50); 流 速 :0.8 ml/min; 检 测 波 长 :214 nm; 样 品 1:0.1 mg/ml 苯 甲 酸, 样 品 2:1.0 mg/ml 苯 乙 酸 ; 混 合 样 品 :0.1mg/mL 的 苯 甲 酸 和 苯 乙 酸 ; 进 样 量 :20 μl; 电 泳 条 件 : 大 管 总 长 / 有 效 长 度 :40/32 cm, 分 离 电 压 :6.0 kv, 缓 冲 液 :20 mmol/l 醋 酸 缓 冲 液 (ph 4.0, 含 0.6 % HEC), 检 测 波 长 :214 nm, 进 样 量 :400 nl; 内 制 冷 水 流 速 :18 ml/min, 约 苯 甲 酸 ;2. 苯 乙 酸 HPLC-WBE 连 接 桥 梁, 详 见 图 3 其 中 1 4 间 连 接 一 段 容 积 为 400 nl 的 毛 细 管 定 量 环, 2 连 接 液 相 色 谱 柱,3 接 废 液 池,6 接 大 管 进 样 毛 细 管 进 样 阀 的 进 样 口 在 inject 状 态 下 与 5 口 相 连,load 状 态 下 与 4 口 相 连 液 相 运 行 时, 连 接 阀 至 于 load 状 态, 当 载 有 目 标 组 分 的 流 动 相 流 出 色 谱 柱 时, 将 连 接 阀 切 换 至 inject 状 态, 待 目 标 组 分 流 经 定 量 环 后, 再 切 换 至 load 状 态 随 后, 利 用 进 样 针 自 连 接 阀 外 部 进 样 口 推 送 一 定 量 缓 冲 液, 确 保 将 定 量 环 中 的 所 有 目 标 组 份 推 进 大 管 中 进 行 电 泳 分 离 结 果 表 明, 连 接 阀 不 但 成 功 实 现 了 向 大 管 中 进 6

12 样, 而 且 通 过 此 阀 进 样 与 直 接 进 样 的 电 泳 结 果 几 乎 没 有 差 异, 由 此 证 明 了 进 样 连 接 阀 可 以 用 于 HPLC-WBE 在 线 联 用 图 3 高 效 液 相 色 谱 - 大 管 电 泳 接 口 示 意 图 HPLC-WBE 在 线 联 用 可 行 性 验 证 与 二 维 LC 或 CE 不 同, 在 HPLC-CE 联 用 分 析 中, 并 非 HPLC 全 部 流 出 液 均 需 注 入 CE 系 统 分 析, 而 只 分 析 感 兴 趣 的 目 标 组 分 在 HPLC-WBE 中 也 采 用 同 样 的 方 式, 首 先 检 测 流 出 物 在 HPLC 柱 上 保 留 行 为, 然 后 确 定 流 出 液 中 目 标 组 分 达 到 最 高 浓 度 的 时 间, 在 前 述 设 计 的 接 口 连 接 下, 切 换 连 接 阀 至 inject 状 态, 持 续 6 s, 确 保 流 出 液 充 满 定 量 环 后, 再 切 换 至 load 状 态 同 时, 由 进 样 口 推 送 缓 冲 液, 将 目 标 组 分 推 进 大 管 中 进 行 电 泳 ( 图 4) HPLC-WBE 在 线 连 续 联 用 系 统 可 行 性 验 证 在 二 维 在 线 联 用 分 离 系 统 中, 为 达 到 最 大 的 分 离 效 率, 要 求 高 维 的 分 离 速 度 快 于 低 维 的 分 离 速 度, 从 而 可 以 避 免 已 经 分 开 组 分 在 高 维 分 离 中 再 混 合 同 时 为 了 避 免 组 分 丢 失, 通 常 在 离 线 HPLC-CE 分 析 中, 要 求 高 维 至 少 连 续 4 次 分 析 低 维 同 一 目 标 峰 但 不 同 时 间 点 的 流 出 物, 对 于 在 线 HPLC-CE, 也 要 至 少 连 续 检 测 3 次, 为 此 我 们 仍 以 苯 甲 酸 和 苯 乙 酸 为 模 型 混 合 物, 通 过 增 大 二 者 浓 度, 促 使 色 谱 峰 展 宽, 以 此 提 供 模 拟 连 续 分 析 的 样 品 实 验 结 果 表 明 :(1)HPLC-WBE 能 够 实 现 连 续 进 样, 此 系 统 最 短 进 样 间 隔 为 120 s;(2) 通 过 对 比 连 续 联 用 获 得 的 电 泳 图 得 知, 随 着 色 谱 峰 出 峰 时 间 的 延 长, 苯 甲 酸 相 对 含 量 在 逐 渐 增 加, 而 苯 乙 图 4 HPLC-WBE 在 线 联 用 分 离 苯 甲 酸 苯 乙 酸 电 泳 图 实 验 条 件 : 除 流 动 相 为 0.5 ml/min 外, 大 管 电 泳 总 长 / 有 效 长 :15/8 cm; 大 管 电 泳 : 3.0 kv, 其 它 条 件 与 图 2 相 同 酸 的 相 对 含 量 在 逐 渐 下 降 尽 管 苯 甲 酸 和 苯 乙 酸 的 混 合 物 在 HPLC 上 表 现 出 单 一 的 重 叠 峰, 但 依 据 HPLC-WBE 连 续 样 品 分 析 图, 可 以 反 推 在 HPLC 中 苯 乙 酸 的 出 峰 时 间 较 苯 甲 酸 稍 早, 这 符 合 反 相 液 相 色 谱 分 离 机 制 HPLC-WBE 在 线 联 用 系 统 的 改 进 二 维 分 离 通 常 要 求 第 二 维 的 分 离 速 度 远 高 于 第 一 维 的 分 离 速 度, 才 能 满 足 快 速 连 续 取 样 分 析 的 要 求 在 前 述 HPLC-WBE 联 用 接 口 设 计 中, 由 于 大 管 只 有 一 个 进 样 口, 为 了 防 止 峰 的 重 叠, 连 续 进 样 受 到 一 定 时 间 间 隔 的 限 制 在 实 际 样 品 分 析 中, 若 想 获 得 更 多 的 样 品 信 息, 需 进 一 步 缩 短 连 续 进 样 间 隔 为 此, 我 们 利 用 石 英 管 与 毛 细 管 内 外 径 存 在 差 异, 通 过 设 置 多 根 进 样 毛 细 管, 以 空 间 间 距 缩 短 连 续 进 样 所 需 要 的 时 间 间 隔 实 验 结 果 表 明, 最 短 时 间 间 隔 可 缩 短 至 60 s 3 结 论 7

13 通 过 以 上 HPLC-WBE 在 线 联 用 系 统 的 初 步 研 究, 发 现 此 系 统 具 有 如 下 优 势 : 首 先, 当 前 HPLC-CE 多 限 于 离 线 联 用, 即 将 高 效 液 相 色 谱 流 出 的 目 标 组 份 经 收 集 蒸 干 复 溶 等 处 理 后, 再 进 行 CE 分 析 这 种 做 法 费 时 耗 力, 且 难 以 应 用 于 生 物 样 品 的 分 析 由 于 大 管 电 泳 以 大 内 径 石 英 管 作 为 分 离 通 道, 具 有 较 高 的 载 样 量 和 灵 敏 度, 可 直 接 用 于 HPLC 流 出 物 的 再 分 离 其 次, 大 管 电 泳 还 具 有 独 立 的 进 样 毛 细 管, 通 过 简 单 的 进 样 阀 即 可 连 接 高 效 液 相 色 谱 和 大 管 电 泳 系 统, 实 验 证 实 了 HPLC-WBE 在 线 联 用 的 可 行 性 同 时, 以 空 间 缩 短 时 间 的 连 续 进 样 模 式, 实 现 了 HPLC-WBE 的 快 速 连 续 分 析, 由 此 可 以 获 得 更 多 的 峰 信 息 另 外, 若 在 HPLC-WBE 系 统 后 设 置 质 谱 鉴 定 系 统, 将 极 大 地 提 高 样 品 的 分 析 能 力, 从 而 为 复 杂 生 物 样 品 分 析 提 供 简 单 快 速 的 新 方 法 参 考 文 献 : [1] Brunner E, Ahrens CH, Mohanty S, Baetschmann H, Loevenich S, Potthast F, Deutsch EW, Panse C, Lichtenberg UD, Rinner O, Lee H, Pedrioli PGA, Malmstrom J, Koehler K, Schrimpf S, Krijgsveld J, Kregenow F, J R Heck A, Hafen E, Schlapbach R, Aebersold R. [J]. Nat Biotechnol, 2007, 25: [2] Kuruma H, Egawa S, Oh-Ishi M, Kodera Y, Maeda T. [J]. Prostate Cancer and P. D., 2005, 8: [3] Veenstra TD, Prieto DA, Conrads TP. [J]. Drug Discov Today, 2004, 9 (20): [4] Cho WCS. [J]. Proteomics & Bioinformatics, 2007, 5 (2): [5] Licker V, Kövari E, Hochstrasser DF, Burkhard PR. [J]. J Proteomics, 2009, 73 (1): [6] Raikos V, Hansen R, Campbell L, Euston SR. [J]. Food Chem, 2006, 99 (4): [7] Krieg RC, Dong Y, Schwamborn K, Knuechel R. [J]. J Biochem Bioph Methods, 2005, 65 (1): [8] van der Klift EJC, Vivó-Truyols G, Claassen FW, Holthoon FLV, Beek TAV. [J]. J Chromatogr A, 2008, 1178 (1-2): [9] Cao P, Stults JT. [J]. Mass Spectrom, 2000, 141 (17): Study on a novel two-dimensional HPLC-WBE system LI You-xin, FANG Xin, ZHAI Ting-ting, ZHAO Shi-bin, BAO Jian-min (School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University, Tianjin , P. R. China) Abstract: For its high separation efficiency, multidimensional chromatography technology has become an effective means for the analysis of complex samples. With the complementary advantages and the rapid analysis of CE, high performance liquid chromatography-capillary electrophoresis (HPLC-CE) showed great potential in complex bioassays. However, due to the micro-scale of capillary, the construction of two-dimensional HPLC-CE system is facing great difficulties. A novel two-dimensional hybrid of high performance liquid chromatography (HPLC) and wide bore electrophoresis (WBE), HPLC-WBE, was introduced in this paper. The effluent from HPLC could be directly separated and detected in WBE without the sample treatment such as collection, dried, or reconstitution in offline HPLC-CE. Moreover, by using an injection valve, the online 2D HPLC-WBE was built and showed significant improvement in separation of two model compounds. Furthermore, the idea of multi-position injection was adopted to shorten the interval between two consecutive WBE injections. This powerful system has overcome several limitations of traditional HPLC-CE and offers much potential for broad applications. Key words: Multidimensional chromatography; Capillary electrophoresis; Wide bore electrophoresis; High performance liquid chromatography-wide bore electrophoresis. 8

14 大 管 电 泳 - 毛 细 管 电 泳 多 功 能 系 统 的 研 究 李 优 鑫, 但 勇 波, 方 欣, 包 建 民 ( 天 津 大 学 药 物 科 学 与 技 术 学 院, 天 津 ) 随 着 科 学 的 进 步, 对 目 标 组 分 进 一 步 分 析 研 究 已 成 为 大 势 所 趋 但 由 于 毛 细 管 电 泳 存 在 着 分 离 通 道 内 径 小, 载 样 量 低 的 缺 陷, 其 目 前 还 局 限 于 分 析 水 平, 主 要 以 高 效 快 速 分 离 在 柱 检 测 为 目 标, 对 于 各 分 离 组 分 的 进 一 步 转 移 收 集 鉴 定 离 线 及 在 柱 酶 反 应 再 分 离 等 还 存 在 一 定 的 困 难 为 了 增 加 人 们 对 纷 繁 复 杂 样 品 的 认 知, 进 一 步 分 析 特 定 的 组 分 已 成 为 进 一 步 研 究 的 瓶 颈 针 对 毛 细 管 电 泳 的 缺 陷, 我 们 实 验 室 首 创 了 大 管 电 泳 (WBE), 其 显 著 提 高 了 毛 细 管 电 泳 的 载 样 量 和 检 测 灵 敏 度 [1-3] 本 文 在 此 基 础 上, 设 计 了 大 管 电 泳 - 毛 细 管 电 泳 多 功 能 系 统 该 系 统 有 如 下 优 点 :(1) 具 有 内 制 冷 管 的 大 管 系 统 可 以 解 决 电 泳 过 程 中 产 生 的 焦 耳 热 问 题 ;(2) 大 横 截 面 的 大 管 系 统 可 以 解 决 载 样 量 小 和 灵 敏 度 低 的 难 题 ;(3) 该 系 统 可 实 现 大 管 电 泳 - 毛 细 管 电 泳 零 死 体 积 连 接, 可 实 现 样 品 连 续 在 线 转 移, 不 会 引 入 样 品 区 带 展 宽 组 分 稀 释 柱 效 降 低 等 问 题 ;(4) 该 系 统 具 有 较 高 的 集 成 性 酶 组 成 复 杂, 但 广 泛 存 在 于 生 物 样 品 中, 是 具 有 生 物 活 性 的 特 殊 蛋 白 质, 具 有 反 应 条 件 温 和 高 的 空 间 和 立 体 专 一 选 择 性 及 高 效 催 化 的 优 点, 其 不 但 会 随 着 身 体 情 况 的 变 化 而 随 时 自 动 对 机 体 产 生 调 节 作 用, 而 且 当 身 体 发 生 异 常 时, 酶 自 身 的 活 性 浓 度 分 布 等 也 会 随 之 进 行 精 密 地 调 节, 亦 即 酶 在 生 物 体 内 起 着 举 足 轻 重 的 作 用 [4-5] 因 此 对 酶 的 研 究, 有 助 于 了 解 酶 在 代 谢 中 的 作 用 或 某 些 药 物 作 用 的 机 理 等 另 外, 酶 的 研 究 又 是 现 代 药 物 筛 选 的 基 础 之 一, 许 多 药 物 的 筛 选 都 是 借 助 于 酶 作 为 筛 选 的 生 物 靶 子 而 实 现 的, 因 此 对 酶 的 研 究 具 有 重 要 的 理 论 意 义 和 实 践 意 义 本 文 以 碱 性 磷 酸 酶 可 催 化 的 底 物 对 硝 基 苯 磷 酸 二 钠 为 酶 反 应 模 型, 以 此 研 究 大 管 电 泳 - 毛 细 管 电 泳 多 功 能 分 析 系 统 的 可 行 性 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 和 试 剂 自 组 装 大 管 电 泳 系 统 : 包 括 Spectra 100 UV 检 测 器 ( 美 国 Thermo Electron 公 司 ), 分 离 通 道 石 英 管 ( 辽 宁 锦 州 石 英 光 源 厂 ),101U 蠕 动 泵 ( 美 国 Watson-Marlow 公 司 ),APTC-1 制 冷 器 ( 天 津 Auto-Science 公 司 ),HPE100 高 效 毛 细 管 电 泳 仪 ( 美 国 Bio-Rad 公 司 )/ 高 压 电 源 ( 天 津 市 恒 博 高 压 电 源 厂 ),XCDY 微 流 控 芯 片 智 能 高 压 电 源 ( 山 东 省 化 工 研 究 所 仪 器 仪 表 研 究 所 ), 毛 细 管 (530/690μm i.d./o.d., 75/375μm i.d./o.d., 河 北 永 年 锐 沣 色 谱 器 件 有 限 公 司 ), 大 管 电 泳 cartridge( 自 制 ),MODEL 2350 制 备 液 相 泵 ( 美 国 ISCO INC 公 司 ) 数 据 采 集 卡 ( 浙 江 大 学 智 能 信 息 工 程 研 究 所 ),N2000 双 通 道 色 谱 工 作 站 ( 浙 江 大 学 智 能 信 息 工 程 研 究 所 ); 微 量 进 样 器 ( 上 海 高 鸽 工 贸 有 限 公 司 ); 微 量 移 液 器 (Finnpipette);DELTA-320 酸 度 计 ( 梅 特 勒 - 托 利 多 仪 器 ( 上 海 ) 有 限 公 司 );AL104 分 析 天 平 ( 梅 特 勒 - 托 利 多 仪 器 ( 上 海 ) 有 限 公 司 ); 真 空 过 滤 系 统 ( 上 海 申 东 ) 碱 性 磷 酸 酶 标 准 品 购 自 Toyobo 公 司, 对 硝 基 苯 磷 酸 二 钠 (pnpp) 标 准 品 购 自 美 国 Amresco 公 司 ; 氢 氧 化 钠 浓 盐 酸 (36%-38%) 硼 砂 硼 酸 对 硝 基 苯 酚 均 为 分 析 纯, 均 购 自 天 津 大 学 科 威 公 司 ; 羟 乙 基 纤 维 素 (HEC) 为 医 用 纯, 购 自 中 国 ( 天 津 ) 医 药 集 团 ; 蒸 馏 水 购 自 永 源 纯 水 开 发 中 心 1.2 大 管 cartridge 前 处 理 每 天 使 用 大 管 - 毛 细 管 系 统 使 用 前 用 1.0 mol/l NaOH 0.1 mol/l HCl H2O 溶 液 冲 洗 基 金 项 目 : 天 津 市 科 委 重 点 培 育 项 目 (08ZCKFSH00500) 第 一 作 者 : 李 优 鑫 (1981- ), 女, 天 津 大 学 博 士 通 讯 作 者 : 包 建 民 (1961- ), 男, 天 津 大 学 博 士 生 导 师, 主 要 从 事 药 物 分 析 研 究 9

15 15 min, 再 用 大 管 电 泳 缓 冲 液 冲 洗 5 min, 最 后 用 大 管 缓 冲 液 平 衡 20 min 每 天 实 验 结 束 后, 用 1.0 mol/l NaOH 溶 液 冲 洗 15 min, 再 用 水 洗 2 结 果 与 讨 论 2.1 大 管 电 泳 - 毛 细 管 电 泳 离 线 酶 反 应 多 功 能 系 统 构 造 为 便 于 了 解 大 管 电 泳 - 毛 细 管 电 泳 (WBE-CE) 多 功 能 系 统 的 工 作 机 理, 首 先 介 绍 一 下 此 系 统 的 物 理 构 造 WBE-CE 多 功 能 系 统 的 基 本 机 理 与 传 统 毛 细 管 电 泳 相 同, 借 鉴 了 电 泳 微 芯 片 集 成 性 思 想, 将 大 管 电 泳 与 多 个 毛 细 管 电 泳 有 机 的 结 合 到 一 起, 具 体 构 造 见 图 1 样 品 自 进 样 毛 细 管 (5) 进 入 到 大 管 分 离 通 道 内, 在 缓 冲 液 槽 (3) 和 (4) 处 所 施 加 的 高 压 作 用 下, 在 大 管 电 泳 内 实 现 初 次 分 离 ; 当 样 品 迁 移 至 转 移 毛 细 管 与 大 管 电 泳 接 口 处 时, 部 分 样 品 在 转 移 电 压 的 牵 引 下, 进 入 毛 细 管, 并 被 收 集 于 样 品 收 集 器 (7) 处 ; 通 过 引 入 一 定 图 1 大 管 电 泳 - 毛 细 管 电 泳 离 线 酶 反 应 多 功 能 系 统 示 意 图 (1) 内 制 冷 毛 细 管 ;(2) 石 英 大 管 ;(3) 大 管 缓 冲 液 槽 ; (4) 大 管 缓 冲 液 槽 ;(5) 进 样 毛 细 管 ;(6) 转 移 毛 细 管 ; (7) 样 品 收 集 器 离 线 酶 反 应 点 ;(8) 检 测 窗 口 ;(9) 分 离 毛 细 管 ;(10) 毛 细 管 缓 冲 液 槽 量 的 酶 及 反 应 试 剂, 当 耗 时 较 长 的 生 物 反 应 进 行 一 定 时 间 后, 再 在 一 定 电 压 作 用 下, 将 离 线 酶 反 应 的 底 物 与 生 成 的 产 物 引 入 到 分 离 毛 细 管 内, 实 现 再 分 离 检 测, 由 此 实 现 对 复 杂 样 品 的 一 次 分 析 另 外, 由 于 大 管 电 泳 的 载 样 量 较 毛 细 管 电 泳 高, 且 只 需 部 分 样 品 转 移 至 转 移 毛 细 管 内, 因 此 可 以 在 大 管 电 泳 分 离 通 道 上 设 置 不 同 的 转 移 再 分 析 系 统, 由 此 可 以 实 现 样 品 实 时 多 功 能 多 角 度 分 析 2.2 大 管 电 泳 - 毛 细 管 电 泳 离 线 酶 反 应 可 行 性 验 证 图 2 为 WBE-CE 离 线 酶 反 应 电 泳 图, 此 结 果 表 明,(1)pNPP 可 以 自 大 管 电 泳 迁 移 至 转 移 毛 细 管 内 ;(2)WBE-CE 转 移 出 来 的, 样 品 可 以 被 收 集 于 样 品 收 集 器 内, 尽 管 收 集 过 程 中 造 成 了 很 大 程 度 上 的 稀 释, 但 所 收 集 的 量 完 全 满 足 了 再 次 检 测 需 求, 这 充 分 体 现 了 大 管 电 泳 和 转 移 的 优 势 ;(3) 离 线 酶 反 应 是 可 行 的 ;(4)CE 法 可 以 有 效 实 现 底 物 和 产 物 的 分 离, 避 免 互 相 干 扰, 从 而 达 到 监 测 离 线 酶 反 应 的 目 的 与 常 规 的 酶 联 免 疫 等 方 法 相 比 [6], 该 法 具 有 更 高 的 检 测 灵 敏 度 对 于 催 化 速 度 慢 的 酶 反 应 来 说, 将 分 离 底 物 收 集 后, 在 离 线 状 态 下 加 入 酶, 可 以 使 之 能 与 底 图 2 大 管 电 泳 转 移 pnpp 离 线 酶 解 毛 细 管 电 泳 图 电 泳 条 件 : 大 管 电 泳 : 大 管 总 长 / 有 效 长 度 :15/8 cm; 缓 冲 液 : 20 mmol/l 硼 酸 缓 冲 液 (ph 8.4, 含 0.6 % HEC), 分 离 电 压 :2.0 kv; 样 品 :1.0 mg/ml pnpp, 600 nl; 负 极 进 样 ; 内 制 冷 水 流 速 :4 ml/min, 约 10 转 移 毛 细 管 : 转 移 毛 细 管 长 度 : 20 cm; 转 移 电 压 :8.0 kv; 离 线 酶 反 应 点 : 10 μl 60 mmol/l 硼 酸 缓 冲 液 (ph 8.4); 分 离 毛 细 管 : 总 长 / 有 效 长 度 :20/10 cm; 缓 冲 液 :60 mm 硼 酸 缓 冲 液 (ph 8.4); 进 样 :-8.0 kv,25 s; 分 离 电 压 :-8.0 kv; 检 测 波 长 :405 nm. 10

16 物 充 分 接 触 反 应 总 之, 该 离 线 酶 反 应 为 将 来 临 床 等 实 际 样 品 的 分 离 分 析 转 移 储 存 离 线 反 应 鉴 定 及 再 检 测 奠 定 了 理 论 基 础 和 实 验 数 据 2.3 大 管 电 泳 - 毛 细 管 电 泳 在 柱 酶 反 应 系 统 构 造 对 于 那 些 反 应 速 度 较 快 的 酶 反 应 来 说, 若 依 然 采 用 离 线 酶 反 应 会 引 来 一 系 列 的 问 题, 首 先, 分 离 组 分 的 离 线 收 集 在 很 大 程 度 上 会 将 其 稀 释, 降 低 了 底 物 的 浓 度, 这 会 给 后 续 的 毛 细 管 电 泳 再 检 测 带 来 隐 患 其 次, 酶 反 应 瞬 间 发 生, 与 电 泳 检 测 所 需 时 间 有 一 定 的 差 异 若 想 实 时 监 控 酶 促 反 应, 需 多 次 重 复 收 集 底 物 并 进 行 多 次 酶 反 应, 这 不 仅 会 造 成 时 间 经 济 等 的 极 大 浪 费, 而 且 多 次 重 复 可 能 会 引 起 较 大 误 差 在 柱 酶 反 应 既 可 以 避 免 底 物 稀 释, 又 可 以 降 低 重 复 误 差 另 外, 在 优 化 的 条 件 下, 通 过 一 步 EMMA 反 应, 可 以 快 速 测 定 酶 促 反 应 动 力 学 参 数, 该 法 为 我 们 课 题 组 专 利 方 法, 已 在 毛 细 管 电 泳 中 成 功 验 证 为 便 于 了 解 大 管 转 移 在 柱 酶 反 应 系 统 的 工 作 机 理, 首 先 介 绍 一 下 该 装 置 的 物 理 构 造 该 装 置 中 大 管 电 泳 及 转 移 部 分 与 图 1 所 示 装 置 完 全 相 同, 在 转 移 毛 细 管 出 口 处 设 置 了 独 特 的 四 通, 其 作 用 有 二 : 一 是 将 四 根 毛 细 管 连 接 在 一 起, 二 是 底 物 在 四 通 中 心 与 酶 溶 液 相 遇, 为 酶 反 应 的 发 生 提 供 固 定 场 所 这 四 根 毛 细 管 分 别 为 转 移 毛 细 管 酶 溶 液 进 样 毛 细 管 酶 溶 液 出 样 毛 细 管 分 离 毛 细 管, 详 细 结 构 如 图 3 大 管 电 泳 - 毛 细 管 电 泳 在 柱 酶 反 应 多 功 能 系 统 示 意 图 (1) 内 制 冷 毛 细 管 ;(2) 石 英 大 管 ;(3) 转 移 毛 细 管 ;(4) 分 离 毛 细 管 ;(5) 酶 溶 液 进 样 毛 细 管 ;(6) 废 液 毛 细 管 ; (7) 在 柱 酶 反 应 点 ;(8) 进 样 毛 细 管 ;(9) 检 测 窗 口 ;(10) 大 管 缓 冲 液 槽 ;(11) 大 管 缓 冲 液 槽 ;(12) 毛 细 管 缓 冲 液 槽 图 3 所 示 2.4 大 管 电 泳 - 毛 细 管 电 泳 在 柱 酶 反 应 可 行 性 验 证 实 验 结 果 表 明,WBE-CE 在 柱 酶 反 应 是 完 全 可 行 的 通 过 在 柱 检 测 pnpp 及 生 成 的 pnp, 可 以 证 明 对 于 反 应 较 快 的 酶 促 反 应 来 说, 完 全 可 以 通 过 在 线 分 离 转 移 底 物 及 在 柱 酶 反 应 一 步 完 成 检 测 当 然, 对 于 纷 繁 复 杂 的 生 物 样 品 来 说, 大 管 分 离 和 转 移 各 种 生 物 酶 将 会 更 有 意 义, 从 前 述 大 管 分 离 转 移 蛋 白 质 的 实 验 可 以 证 明, 此 系 统 具 备 在 线 转 移 生 物 样 品 的 能 力, 但 是 受 到 样 品 供 应 和 检 测 的 限 制, 在 此 未 进 行 确 认 图 4 大 管 电 泳 - 毛 细 管 电 泳 在 柱 酶 反 应 电 泳 图 (A)405nm 下 检 测 ALP;(B) 大 管 电 泳 在 线 转 移 pnpp; (C) 在 柱 酶 解 大 管 电 泳 在 线 转 移 的 pnpp. 电 泳 条 件 : 大 管 电 泳 条 件 与 图 2 相 同 转 移 系 统 : 转 移 毛 细 管 长 10 cm; 酶 进 样 毛 细 管 :10 cm; 废 液 毛 细 管 :5 cm; 分 离 毛 细 管 :30/20 cm; 在 电 泳 进 行 7.5 min 后 手 动 将 11

17 200 nl 浓 度 为 9 U/mL 的 ALP 从 酶 进 样 毛 细 管 推 入, 此 酶 将 多 余 的 酶 溶 液 会 从 废 液 毛 细 管 流 出, 保 证 四 通 交 叉 点 处 充 满 酶 ; 转 移 和 分 离 毛 细 管 缓 冲 液 :ph 8.4 的 60 mmol/l 硼 酸 缓 冲 液 ; 转 移 电 压 :+8.0 kv; 检 测 波 长 :405 nm 3 结 论 对 于 纷 繁 复 杂 的 未 知 生 物 样 品 来 说, 欲 了 解 其 各 种 性 质, 将 其 逐 一 分 离 再 进 行 分 析 至 关 重 要 所 开 发 的 大 管 电 泳 - 毛 细 管 电 泳 多 维 分 析 系 统, 具 有 较 强 的 分 离 能 力, 具 备 较 大 的 样 品 载 样 量, 我 们 以 碱 性 磷 酸 酶 在 碱 性 条 件 下 催 化 pnpp 生 成 pnp 这 一 典 型 酶 反 应, 实 现 了 将 感 兴 趣 样 品 在 线 转 移 收 集 储 存 再 检 测, 并 通 过 离 线 及 在 柱 酶 反 应 鉴 定 底 物 与 酶 相 互 作 用 的 研 究, 这 为 后 续 大 管 微 芯 片 的 发 展 奠 定 了 强 有 力 的 基 础 同 时 通 过 控 制 电 泳 等 条 件 来 研 究 酶 的 性 质, 并 用 质 谱 等 离 线 或 在 线 鉴 定 未 知 物 将 是 将 来 的 研 究 方 向 之 一 参 考 文 献 : [1] Guo, Y. G., Liu, D. N., Wang, H. F., Yuan, R. J., Bao, J. J., Chem. Lett. 2006, 35, [2] Yuan R, Ding G, Guo Y, Liu D, Bao JJ. [J]. Electrophoresis, 2007, 28: [3] Liu DN, Wang J, Guo YG, Yuan RJ, Wang HF, Bao J J. [J]. Electrophoresis, 2008,29 (4): [4] Latini R, Tognoni G, Maggioni A P, Baigent C, Braunwald E, Chen ZM, Collins R, Flather M, Franzosi M, Kjekshus J, Køber L, Liu LS, Peto R, Pfeffer M, Pizzetti F, Santoro E, Sleight P, Swedberg K, Tavazzi L, Wang W, Yusuf S. [J]. J Am Cardiol, 2000, 35 (7): [5] Fernandes SS, Furriel RPM, Petenusci SO, Leone FA. [J]. Biochem Pharmacol, 1999, 58 (5): [6] Chen CC, Tai YC, Shen SC, Tu YY, Wu MC, Chang HM. [J]. Food Chem, 2006, 95 (2): Study on a multifunctional system integrated wide-bore and capillary electrophoresis LI You-xin, DAN Yong-bo, FANG Xin, BAO Jian-min (School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University, Tianjin , P. R. China) Abstract: This paper presents the results obtained from a novel multifunctional analysis platform established on the basis of a wide bore electrophoresis (WBE) and a CE. The WBE-CE system integrated various analytical steps including separation, transfer, reaction, detection, and storage into a single system. The results indicated that the resolution achieved on this WBE-CE system was better than either the WBE or the CE alone. Further, samples transferred out of the WBE system could participate in online reaction, such as enzymatic reaction in the CE. Alternatively, samples from the WBE system could be transferred out and stored offline in a vial for post transfer reaction. The results demonstrated that this WBE-CE system has the potential to be a multifunctional platform for a range of applications. Key words: Capillary electrophoresis; Wide bore electrophoresis; Multifunctional system. 12

18 大 管 电 泳 样 品 在 线 转 移 可 行 性 研 究 李 优 鑫, 方 欣, 但 勇 波, 包 建 民 ( 天 津 大 学 药 物 科 学 与 技 术 学 院, 天 津 ) 在 常 规 毛 细 管 电 泳 中, 为 实 现 柱 后 馏 分 的 转 移 收 集, 或 用 半 透 膜 或 砂 芯 接 头 使 分 离 电 压 在 毛 细 管 出 口 构 成 回 路 或 采 取 停 滞 后 更 换 出 口 电 极 瓶 收 集 [1], 留 下 出 口 用 作 在 线 收 集 [2] 由 于 毛 细 管 电 泳 本 身 载 样 量 的 局 限, 致 使 两 者 所 转 移 的 样 品 都 十 分 有 限, 另 外 前 者 操 作 复 杂, 且 稀 释 馏 分 ; 后 者 装 置 复 杂, 容 易 引 入 死 体 积 而 影 响 分 离 效 率 同 时, 由 于 毛 细 管 电 泳 存 在 着 分 离 通 道 内 径 小, 载 样 量 低 的 缺 陷, 其 目 前 还 局 限 于 分 析 水 平, 这 就 更 增 加 了 各 分 离 组 分 的 进 一 步 转 移 分 析 的 难 度 针 对 此 问 题, 本 文 在 本 实 验 室 发 展 的 大 管 电 泳 系 统 基 础 上 [3-4], 设 计 制 作 并 发 展 了 大 管 电 泳 样 品 在 线 转 移 系 统 该 系 统 是 利 用 毛 细 管 外 径 (375 μm o.d.) 和 石 英 大 管 内 径 ( 1000 μm i.d.) 之 间 的 差 异, 将 毛 细 管 按 90 方 向 直 接 引 入 并 固 定 于 石 英 大 管 内 表 面, 样 品 首 先 在 大 管 上 实 现 初 步 分 离, 随 后 在 转 移 电 压 作 用 下, 进 入 与 之 垂 直 的 转 移 毛 细 管 中, 以 实 现 在 线 转 移 进 一 步 分 离 及 在 柱 检 测 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 和 试 剂 自 组 装 大 管 电 泳 系 统 : 包 括 Spectra 100 UV 检 测 器 ( 美 国 Thermo Electron 公 司 ), 分 离 通 道 石 英 管 ( 辽 宁 锦 州 石 英 光 源 厂 ),101U 蠕 动 泵 ( 美 国 Watson-Marlow 公 司 ),APTC-1 制 冷 器 ( 天 津 Auto-Science 公 司 ),HPE100 高 效 毛 细 管 电 泳 仪 ( 美 国 Bio-Rad 公 司 )/ 高 压 电 源 ( 天 津 市 恒 博 高 压 电 源 厂 ),XCDY 微 流 控 芯 片 智 能 高 压 电 源 ( 山 东 省 化 工 研 究 所 仪 器 仪 表 研 究 所 ), 毛 细 管 (530/690μm i.d./o.d., 75/375μm i.d./o.d., 河 北 永 年 锐 沣 色 谱 器 件 有 限 公 司 ), 大 管 电 泳 cartridge( 自 制 ),MODEL 2350 制 备 液 相 泵 ( 美 国 ISCO INC 公 司 ) 数 据 采 集 卡 ( 浙 江 大 学 智 能 信 息 工 程 研 究 所 ),N2000 双 通 道 色 谱 工 作 站 ( 浙 江 大 学 智 能 信 息 工 程 研 究 所 ); 微 量 进 样 器 ( 上 海 高 鸽 工 贸 有 限 公 司 ); 微 量 移 液 器 (Finnpipette); DELTA-320 酸 度 计 ( 梅 特 勒 - 托 利 多 仪 器 ( 上 海 ) 有 限 公 司 );AL104 分 析 天 平 ( 梅 特 勒 - 托 利 多 仪 器 ( 上 海 ) 有 限 公 司 ); 真 空 过 滤 系 统 ( 上 海 申 东 ) 氢 氧 化 钠 浓 盐 酸 (36%-38%) 36% 醋 酸 无 水 乙 酸 钠 磷 酸 磷 酸 二 氢 钠 乙 腈 对 甲 基 苯 磺 酸 苯 甲 酸 肉 桂 酸 1- 萘 胺 对 甲 氧 基 苯 胺 均 为 分 析 纯, 乙 醇 为 色 谱 纯, 以 上 材 料 均 购 自 天 津 大 学 科 威 公 司 ; 羟 乙 基 纤 维 素 (HEC) 为 医 用 纯, 购 自 中 国 ( 天 津 ) 医 药 集 团 ; 溶 菌 酶 细 胞 色 素 C 和 核 糖 核 酸 酶 A 标 准 品 购 自 Sigma 公 司 ; 蒸 馏 水 购 自 永 源 纯 水 开 发 中 心 1.2 大 管 转 移 系 统 前 处 理 每 天 使 用 大 管 系 统 系 统 前 依 次 用 1.0 mol/l NaOH 0.1 mol/l HCl H2O 溶 液 冲 洗 15 min, 再 用 大 管 电 泳 缓 冲 液 冲 洗 5 min, 最 后 用 大 管 缓 冲 液 平 衡 20 min 每 天 实 验 结 束 后, 用 1.0 mol/l NaOH 溶 液 冲 洗 15 min, 再 用 水 洗 2 结 果 与 讨 论 2.1 大 管 转 移 系 统 构 造 基 金 项 目 : 天 津 市 科 委 重 点 培 育 项 目 (08ZCKFSH00500) 第 一 作 者 : 李 优 鑫 (1981- ), 女, 天 津 大 学 博 士 通 讯 作 者 : 包 建 民 (1961- ), 男, 天 津 大 学 博 士 生 导 师, 主 要 从 事 药 物 分 析 研 究 13

19 为 便 于 了 解 大 管 - 毛 细 管 转 移 系 统 的 工 作 机 理, 首 先 介 绍 一 下 大 管 转 移 装 置 的 物 理 构 造 大 管 转 移 装 置 中 大 管 电 泳 的 分 离 机 理 与 传 统 毛 细 管 电 泳 相 同, 电 泳 装 置 也 主 要 包 括 高 压 电 源 分 离 管 道 及 检 测 器 等 但 由 于 大 管 电 泳 分 离 系 统 内 部 引 入 了 内 制 冷 部 件, 表 面 引 入 了 单 独 的 进 样 毛 细 管 和 转 移 毛 细 管, 因 此 在 构 造 上 有 着 独 具 的 体 征, 详 细 结 构 如 上 图 1 (a) 所 示 图 1(b) 描 绘 了 分 离 通 道 与 转 移 毛 细 管 横 截 面 的 构 造, 其 中 内 外 两 管 间 的 环 状 夹 层 即 为 实 际 有 效 的 分 离 通 道, 转 移 毛 细 管 与 大 管 分 离 通 道 表 面 的 接 口 为 第 二 维 分 离 的 进 样 口, 检 测 窗 口 位 于 转 移 毛 细 管 上 通 常, 对 于 多 组 分 样 品 的 毛 细 管 二 维 分 离, 需 要 摸 索 并 精 确 计 算 第 一 维 样 品 到 达 接 口 处 的 时 间, 或 间 断 或 交 叉 在 不 同 维 度 加 电, 使 得 样 品 逐 个 进 入 第 二 维 为 了 避 免 推 断 转 移 电 压 启 始 施 加 时 间 带 来 的 误 差 间 歇 供 电 造 成 的 样 品 区 带 展 宽 电 泳 重 现 性 差 等 问 题 的 干 扰, 本 大 管 电 泳 转 移 系 统 采 取 独 特 的 连 续 电 泳 模 式, 即 样 品 在 多 通 道 电 源 中 两 个 通 道 连 续 输 出 的 电 压 共 同 作 用 下 电 泳 被 分 析 样 品 自 进 样 毛 细 管 进 入 大 管 分 离 通 道, 在 两 电 源 共 同 作 用 下 分 离, 第 一 个 组 分 到 达 转 移 毛 细 管 入 口 处 时, 一 部 分 样 品 被 另 一 电 源 电 牵 引 进 入 转 移 毛 细 管 完 成 进 一 步 分 离, 剩 余 部 分 样 品 仍 在 大 管 中 继 续 向 前 运 行, 后 续 组 分 也 按 照 相 同 原 理 转 移 2.2 大 管 转 移 系 统 可 行 性 验 证 图 1 大 管 电 泳 转 移 体 系 构 造 示 意 图 为 了 证 明 此 系 统 具 有 更 好 的 分 离 能 力, 我 们 以 对 甲 苯 磺 酸 苯 甲 酸 肉 桂 酸 的 混 合 物 为 样 品, 并 在 相 同 条 件 下 与 大 管 系 统 毛 细 管 系 统 的 分 离 效 果 作 对 比 同 时, 有 些 有 机 酸 也 是 常 用 的 药 用 化 合 物, 因 此 选 择 有 机 酸 作 为 多 组 (1) 内 制 冷 毛 细 管 ;(2) 石 英 大 管 ;(3) 转 移 毛 细 管 ;(4) 进 样 毛 细 管 ;(5) 检 测 窗 口 ; (6) 缓 冲 液 槽 ;(7) 缓 冲 液 槽 ;(8) 电 源 1; (9) 电 源 2;(10) 底 座 ;(11) 制 冷 液 ;(12) 输 液 泵 ;(13) 散 热 盘 管 分 分 析 样 品 具 有 一 定 的 代 表 性 和 相 应 的 实 际 效 用 实 验 结 果 见 图 2 图 2 三 种 酸 性 化 合 物 在 不 同 体 系 内 分 离 电 泳 图 (A) 大 管 (B) 毛 细 管 (C) 大 管 转 移 系 统 实 验 条 件 :(A) 大 管 系 统 : 大 管 总 长 / 有 效 长 度 :15/8 cm; 缓 冲 液 :ph 4.0 的 20 mmol/l 醋 酸 缓 冲 液 ( 含 0.6 % HEC 和 10 % 乙 腈 ); 样 品 :1.0 mg/ml 三 种 芳 香 酸 ; 负 极 进 样 ; 进 样 量 :600 nl; 检 测 波 长 :214 nm; 大 管 电 压 :2.0 kv; 内 制 冷 水 流 速 :4 ml/min, 约 10 (B) 毛 细 管 系 统 : 总 长 / 有 效 长 度 :20/10 cm;ph 4.0 的 40 mmol/l 醋 酸 缓 冲 液 ; 样 品 :1.0 mg/ml 三 种 芳 香 酸 ; 负 极 进 样 :8.0 kv,3s; 检 测 波 长 :214 nm; 14

20 分 离 电 压 :8.0 kv;(c) 转 移 系 统 : 大 管 系 统 和 转 移 系 统 的 物 理 叠 加 从 图 2 可 以 看 出, 转 移 系 统 具 有 较 单 独 的 毛 细 管 和 大 管 系 统 均 好 的 分 离 效 率, 说 明 样 品 在 完 成 转 移 之 后 又 得 到 了 进 一 步 的 分 离, 这 对 复 杂 化 合 物 尤 其 有 利, 并 为 后 续 真 正 的 二 维 分 离 奠 定 了 基 础 2.3 大 管 转 移 系 统 转 移 碱 性 化 合 物 为 考 察 大 管 转 移 系 统 的 普 适 性, 我 们 又 分 离 转 移 了 碱 性 化 合 物 通 常 情 况 下, 许 多 碱 性 小 分 子 中 含 胺 基, 在 酸 性 电 泳 缓 冲 液 中 会 与 氢 离 子 结 合 呈 正 电 性, 电 泳 过 程 中 电 泳 流 和 电 渗 流 方 向 相 同, 故 需 要 转 换 加 电 模 式 若 仍 用 酸 性 化 合 物 大 管 转 移 装 置 就 需 要 采 用 下 列 加 电 模 式 之 一 (1) 正 极 加 于 大 管 进 样 端, 零 极 加 于 转 移 端, 转 移 口 处 将 呈 现 正 电 势, 若 想 顺 利 将 样 品 转 移, 需 在 转 移 毛 细 管 出 口 端 施 加 一 负 压, 即 该 电 源 能 提 供 真 正 的 正 极 到 负 极 的 电 压 ;(2) 将 零 电 极 置 于 大 管 进 样 端, 在 大 管 出 液 口 及 转 移 毛 细 管 出 口 端 分 别 施 加 不 同 的 负 压 考 虑 到 电 源 设 备 实 际 供 应 问 题, 我 们 重 新 设 计 了 大 管 转 移 系 统, 将 转 移 毛 细 管 置 于 大 管 电 泳 出 口 端, 以 对 甲 氧 基 苯 胺 和 1- 萘 胺 混 合 物 为 样 品, 并 在 相 同 条 件 下 与 大 管 系 统 毛 细 管 图 3 两 种 碱 性 化 合 物 在 不 同 体 系 内 分 离 电 泳 图 (A) 毛 细 管 (B) 大 管 (C) 大 管 转 移 系 统 实 验 条 件 : 毛 细 管 : 总 长 / 有 效 长 度 :40/30 cm; 进 样 :-8.0 kv, 3 s; 样 品 : 对 甲 氧 基 苯 胺 和 1- 萘 胺 ; 零 极 进 样 ; 分 离 电 压 :-8.0 kv; 大 管 转 移 系 统 毛 细 管 总 长 / 有 效 长 度 :40/30 cm; 其 它 条 件 与 图 2 相 同 系 统 的 分 离 效 果 作 对 比 图 3 所 示 结 果 表 明, 所 建 立 的 大 管 转 移 系 统 不 但 可 以 转 移 酸 性 物 质, 还 可 以 转 移 碱 性 物 质, 具 有 一 定 的 适 用 性 2.4 大 管 转 移 系 统 转 移 蛋 白 质 图 4 三 种 碱 性 蛋 白 质 在 不 同 体 系 下 分 离 电 泳 图 (A) 毛 细 管 (B) 大 管 (C) 大 管 转 移 系 统 实 验 条 件 : 样 品 :1.0 mg/ml 的 溶 菌 酶 细 胞 色 素 C 和 核 糖 核 酸 酶 A;(A) 大 管 系 统 : 缓 冲 液 :ph 2.3 的 10 mm 磷 酸 缓 冲 液 ( 含 0.6 % HEC);(B) 毛 细 管 : ph 2.3 的 30 mm 磷 酸 缓 冲 液 ;(C) 转 移 系 统 : 大 管 系 统 和 转 移 系 统 的 叠 加 其 它 条 件 与 图 3 相 同 前 面 转 移 的 化 合 物 中, 无 论 是 酸 性 化 合 物 还 是 碱 性 化 合 物, 其 分 子 量 均 较 小, 转 移 相 对 容 易 而 电 泳 相 对 于 其 它 分 离 分 析 技 术 ( 如 高 效 液 相 色 谱 ) 而 言, 其 突 出 优 势 之 一 能 分 离 分 子 量 达 几 万 甚 至 几 十 万 的 生 物 大 分 子 ( 如 蛋 白 质 ), 且 分 离 效 率 较 高 为 了 进 一 步 考 察 转 移 系 统 的 普 适 性, 充 分 发 挥 电 泳 在 分 离 蛋 白 质 方 面 的 优 势, 我 们 以 三 种 碱 性 蛋 白 质 为 模 型 化 合 物, 在 大 管 上 将 其 分 离 后 再 将 其 转 移 至 毛 细 管 内 进 行 检 测, 以 此 来 探 讨 该 系 统 转 移 分 子 量 较 大 的 蛋 白 质 的 可 行 性 为 了 进 一 步 体 现 转 移 系 统 在 15

21 分 离 方 面 的 优 势, 我 们 又 分 别 在 大 管 电 泳 系 统 和 毛 细 管 系 统 中 分 离 了 三 种 碱 性 蛋 白, 并 将 其 结 果 与 转 移 系 统 所 得 结 果 进 行 对 比, 考 察 转 移 系 统 的 分 离 能 力 显 而 易 见, 单 独 使 用 大 管 电 泳 系 统 和 单 独 使 用 毛 细 管 系 统 在 所 选 的 电 泳 条 件 下, 均 不 能 将 三 种 碱 性 蛋 白 完 全 分 开 而 我 们 建 立 的 转 移 系 统 不 但 能 顺 利 将 分 子 量 较 大 的 蛋 白 质 转 移 出 来, 且 能 将 其 完 全 分 离, 说 明 我 们 的 转 移 系 统 具 有 普 适 性 3 结 论 我 们 在 大 管 电 泳 系 统 基 础 上, 设 计 制 作 了 大 管 电 泳 样 品 在 线 转 移 系 统, 并 分 别 以 有 机 酸 有 机 碱 及 蛋 白 质 作 为 负 电 荷 正 电 荷 及 生 物 大 分 子 样 品, 证 明 了 转 移 系 统 具 有 广 泛 的 转 移 分 离 能 力, 可 实 现 零 死 体 积 连 接 及 在 线 转 移, 不 会 引 入 样 品 区 带 展 宽 组 分 稀 释 柱 效 降 低 等 问 题, 为 将 来 临 床 药 物 筛 选, 药 物 作 用 靶 点 作 用 机 制 的 研 究 疾 病 生 物 靶 标 物 的 探 寻 等 带 来 新 的 希 望, 也 为 大 管 转 移 体 系 高 通 量 筛 选 平 台 的 建 立 和 实 际 应 用 奠 定 了 基 础 同 时, 有 机 酸 碱 和 蛋 白 质 在 药 物 研 发 食 品 安 全 临 床 疾 病 研 究 等 领 域 有 着 广 泛 的 应 用, 但 由 于 带 有 这 些 组 分 的 实 际 样 品 在 分 离 条 件 下 的 带 电 状 况, 即 使 在 传 统 的 毛 细 管 电 泳 体 系 中 实 现 彻 底 的 分 离 也 是 有 一 定 难 度 的 为 此 我 们 选 定 的 样 品 也 是 具 有 一 定 的 实 际 功 效 和 意 义 的 参 考 文 献 : [1] Burggraf N, Manz A, Verpoorte E, Effenhauser CS, Widmer HM, Rooij NF. [J]. Sens Actuators B, 1994, 20 (2-3): [2] Manz A, Verpoorte E, Effenhauser C S, Burggraf N, Raymond DE, Widmer HM. [J]. Fresenius J Anal Chem, 1994, 348: [3] Yuan R, Ding G, Guo Y, Liu D, Bao JJ. [J]. Electrophoresis, 2007, 28: [4] Guo Y, Liu D, Wang H, Yuan R, Bao JJ. [J]. Anal Sci, 2008, 24: The feasibility study on online sample transfer between wide-bore and capillary electrophoretic systems LI You-xin, FANG Xin, DAN Yongbo, BAO Jian-min (School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University, Tianjin , P. R. China) Abstract: This paper presents the results obtained from a novel multidimensional analysis platform established on the basis of wide bore electrophoresis (WBE) and capillary electrophoresis (CE). The WBE-CE system integrates the various steps involved in a typical multidimensional separation system ranging from sample injection, separation and transfer into one single system. A distinct three-electrode format was adopted to continuously transfer samples from WBE without the interruption of switching on and off the power suppliers. This continuous potential also could avoid the transfer failure because of the timing mismatching from WBE to CE. Samples representing mixtures of acids, bases and even proteins were analyzed on this system for evaluating its feasibility and applicability. better than either WBE or CE alone. Resolution achieved in this WBE-CE system was This WBE-CE system has proven to be an efficient platform for carrying out various tasks. It has large sample loading capacity, high separation efficiency and speed, zero dead volume connection between WBE and CE. Key words: Capillary electrophoresis; Wide-bore electrophoresis; Sample transfer. 16

22 一 种 新 型 紫 杉 醇 纳 米 制 剂 在 小 鼠 体 内 的 药 代 动 力 学 研 究 孟 素 蕊 * 2, 焦 建 杰, 高 洋, 李 芹, 韩 晓 文, 何 景 华, 牛 瑞 芳 (1. 天 津 医 科 大 学 药 理 教 研 室, 天 津 ;2. 天 津 医 科 大 学 附 属 肿 瘤 医 院, 天 津 ) 紫 杉 醇 (Paclitaxel) 是 由 红 豆 杉 属 植 物 中 提 取 的 一 种 天 然 抗 癌 药, 它 能 够 与 细 胞 微 管 蛋 白 结 合, 在 癌 细 胞 分 裂 时 诱 导 和 促 进 微 管 蛋 白 的 聚 合, 抑 制 其 解 聚, 使 细 胞 有 丝 分 裂 受 到 阻 断, 起 到 微 管 装 配 和 微 管 稳 定 作 用, 从 而 阻 止 肿 瘤 细 胞 的 生 长, 目 前 已 广 泛 用 于 卵 巢 癌, 乳 腺 癌, 非 小 细 胞 肺 癌 和 食 管 癌 等 的 治 疗 紫 杉 醇 虽 具 有 良 好 的 抗 肿 瘤 活 性, 但 在 水 中 的 溶 解 度 很 小, 故 临 床 使 用 时 需 在 注 射 剂 中 加 入 表 面 活 性 剂 聚 氧 乙 烯 蓖 麻 油 (Cremophor EL) 以 提 高 紫 杉 醇 在 水 中 的 溶 解 度, 但 是 聚 氧 乙 烯 蓖 麻 油 在 体 内 降 解 时 释 放 组 胺, 可 导 致 严 重 的 过 敏 反 应 ; 还 可 在 血 液 中 形 成 细 小 微 粒, 包 裹 紫 杉 醇 分 子, 从 而 干 扰 药 物 分 子 向 组 织 间 扩 散, 影 响 抗 肿 瘤 效 应 [1] 为 解 决 紫 杉 醇 的 水 溶 性 问 题, 许 多 研 究 在 探 索 其 构 效 关 系 的 同 时, 许 多 紫 杉 醇 的 新 剂 型 也 相 继 开 发 应 用, 例 如 紫 杉 醇 脂 质 体, 纳 米 紫 杉 醇, 紫 杉 醇 聚 合 物 胶 束 剂 型 等 本 实 验 对 一 种 新 型 紫 杉 醇 脂 质 体 的 药 代 动 力 学 进 行 研 究, 分 析 其 随 时 间 变 化 在 小 鼠 体 内 的 代 谢 特 点 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 与 试 剂 Agilent 1100 HPLC 工 作 系 统 ; AB 135 S 电 子 分 析 天 平 ; ORION 520ApH 计 ; K 550 GE 漩 涡 混 合 器 ;TGL 16G 离 心 机 ; 紫 杉 醇 标 准 品 ( 天 津 市 肿 瘤 医 院 提 供 ); 紫 杉 醇 注 射 液 ; 多 西 紫 杉 醇 ; 地 西 泮 原 料 药 ; 甲 醇, 乙 腈 为 色 谱 纯 ; 石 油 醚, 磷 酸 为 分 析 纯 1.2 动 物 : 小 鼠, 昆 明 种, 体 重 20-25g, 批 号 : 色 谱 条 件 色 谱 柱 :Intertex C18 柱 ; 流 动 相 : 磷 酸 水 溶 液 : 乙 腈 (50:50 V/V); 检 测 波 长 :227 nm; 柱 温 :25 ; 流 速 :1.0 ml min 血 清 样 品 采 集 取 昆 明 种 小 鼠 90 只, 随 机 分 为 6 组, 每 组 15 只, 称 重, 按 照 9.0mg/Kg 的 剂 量, 以 0.15ml/10g 的 标 准 给 小 鼠 尾 静 脉 注 射 紫 杉 醇 纳 米 制 剂, 取 血 时 间 为 : 给 药 前, 给 药 后 即 刻, 10s,20s,30s,45s,1min,2min,3min,5min,9min,20min,40min,60min,120min 各 时 间 点 摘 眼 球 取 血, 置 于 离 心 管 中,3000 r min 1 离 心 10 min, 分 离 血 清 1.5 血 清 样 品 的 预 处 理 依 次 加 入 2ml 甲 醇 和 2ml 水 重 力 滤 过 平 衡 萃 取 柱, 加 入 200μl 血 清,100μl 多 西 紫 杉 醇, 100μl 安 定 和 500μl 醋 酸 盐 缓 冲 液 混 匀 后 上 样, 用 2ml 水 重 力 滤 过 后, 加 入 1ml 石 油 醚 重 力 滤 过, 注 入 空 气, 换 收 集 管, 加 入 2ml 乙 腈 滤 过 后, 将 洗 脱 液 用 氮 气 吹 干, 残 留 物 用 200μl 流 动 相 复 溶 1 基 金 项 目 : 国 家 高 技 术 研 究 发 展 计 划 (863 计 划 ) 资 助 项 目 (2007AA021802) 作 者 简 介 : 孟 素 蕊 (1984-), 女, 河 北 人, 硕 士 研 究 生, mengsurui@163.com 17

23 通 讯 联 系 人 : 何 景 华, 女, 教 授, hejinghuatj@yahoo.com.cn 1.6 标 准 曲 线 的 建 立 精 密 称 取 1.0mg 紫 杉 醇 标 准 品, 用 甲 醇 溶 解, 置 于 10mL 容 量 瓶 中, 定 容, 配 制 成 μg ml 1 的 标 准 溶 液, 用 倍 半 稀 释 原 则 分 别 得 出 50.00,25.00,12.50,6.25,3.13,1.56, 0.78,0.39μg ml 1 的 储 备 液 加 入 200μL 标 准 储 备 液,200μL 小 鼠 空 白 血 清,100μL 安 定, 100μL 多 西 紫 杉 醇,500μL 醋 酸 盐 缓 冲 液 (ph=5) 混 匀 后 上 样, 按 照 血 清 样 品 预 处 理 的 方 案 进 行, 洗 脱 液 用 氮 气 吹 干,200μL 流 动 相 复 溶,20μL 进 样 1.7 准 确 度 与 精 密 度 按 血 清 标 准 曲 线 制 备 预 处 理 方 法 制 备 和 50.00μg ml 1 三 个 浓 度 的 紫 杉 醇 血 清 样 品, 进 行 测 定, 测 定 值 与 真 实 值 的 相 对 误 差 为 方 法 的 准 确 度 ; 相 同 条 件 下 5 次 测 定 结 果 的 符 合 程 度 为 精 密 度 1.8 稳 定 性 考 察 考 察 了 高 (50.00μg/mL) 中 (6.25μg/mL) 低 (0.78μg/mL) 三 个 浓 度 的 紫 杉 醇 血 清 样 品 -20 保 存 20 天, 反 复 冻 融 3 次 以 及 预 处 理 后 4 保 存 10 天 的 稳 定 性 2 结 果 和 讨 论 2.1 方 法 的 专 属 性 图 1 小 鼠 空 白 血 清 的 色 谱 图 图 2 三 者 混 合 的 标 准 溶 液 的 色 谱 图 (1 为 安 定,2 为 多 西 紫 杉 醇,3 为 紫 杉 醇 ) 图 3 小 鼠 尾 静 脉 注 射 紫 杉 醇 纳 米 制 剂 后 的 血 清 色 谱 图 2.2 标 准 曲 线 以 紫 杉 醇 标 准 溶 液 浓 度 为 横 坐 标, 药 品 测 定 峰 面 积 与 内 标 峰 面 积 比 值 为 纵 坐 标, 绘 制 标 准 曲 线 进 行 线 性 回 归, 在 μg/ml 浓 度 范 围 内, 药 物 浓 度 与 峰 面 积 比 值 呈 良 好 的 线 性 关 系 按 照 加 权 的 最 小 二 乘 法 得 出 紫 杉 醇 与 内 标 峰 面 积 比 值 与 紫 杉 醇 浓 度 的 线 性 关 系 式 为 :y=13.325x (r 2 =0.9993) 2.3 准 确 度 与 精 密 度 18

24 和 50.00μg ml 1 三 个 浓 度 的 准 确 度 均 在 85%-115% 之 间, 精 密 度 值 均 小 于 15% 2.4 稳 定 性 考 察 高 (50.00μg/mL) 中 (6.25μg/mL) 低 (0.78μg/mL) 三 个 浓 度 不 同 条 件 下 保 存 的 稳 定 性 见 下 表, 均 符 合 方 法 学 要 求 表 1 紫 杉 醇 血 清 样 品 保 存 的 稳 定 性 concentration /μg ml 1 RSD/% 4,10d -20,20d 冻 融 三 次 小 鼠 尾 静 脉 注 射 紫 杉 醇 纳 米 制 剂 后 的 血 药 浓 度 - 时 间 曲 线 及 药 代 参 数 C-t 浓 度 (mg/l) 时 间 (min) 图 4 小 鼠 静 脉 注 射 紫 杉 醇 纳 米 制 剂 (9.0mg/Kg) 后 均 值 血 药 浓 度 - 时 间 曲 线 表 2 小 鼠 静 脉 注 射 紫 杉 醇 纳 米 制 剂 (9.0mg/Kg) 后 均 值 药 代 参 数 参 数 单 位 数 值 Tmax min 0.30±0.19 Cmax mg /L 31.76±3.45 T1/2z min 94.50± CLz L/min/Kg 0.09±0.09 AUC(0- ) mg /L*min ± AUC(0-t) mg /L*min ±49.92 AUMC(0-t) ± AUMC(0- ) ± MRT(0- ) min ± MRT(0-t) min 20.18±16.34 VRT(0- ) min^ ± VRT(0-t) min^ ± 目 前, 紫 杉 醇 血 清 样 品 的 预 处 理 有 液 液 萃 取 和 固 相 萃 取 两 种, 国 内 较 常 采 用 液 液 萃 取 的 方 法, 但 是 萃 取 后 血 清 样 品 杂 质 较 多, 国 外 有 使 用 固 相 萃 取 的 方 法, 内 标 大 多 为 baccatin III 和 3 -p-hydroxypaclitaxel, 测 定 时 多 采 用 梯 度 洗 脱 的 方 式, 样 品 分 析 周 期 较 长, 本 实 验 采 取 [3-5] 以 安 定 和 多 西 紫 杉 醇 为 内 标 的 固 相 萃 取 的 方 案, 以 乙 腈 - 磷 酸 水 溶 液 为 流 动 相, 血 清 样 品 杂 质 较 少, 三 者 分 离 度 高 19

25 前 面 已 提 到, 本 实 验 以 安 定 和 多 西 紫 杉 醇 为 内 标, 可 以 推 出, 按 照 本 实 验 提 出 的 预 处 理 [7-9] 方 案 和 色 谱 条 件, 以 安 定 和 紫 杉 醇 为 内 标, 可 以 测 定 血 清 中 多 西 紫 杉 醇 的 含 量, 也 为 紫 杉 醇 和 多 西 紫 杉 醇 的 同 时 测 定 奠 定 基 础 [6] 根 据 不 同 时 间 点 小 鼠 血 清 中 的 药 物 浓 度 得 出 的 药 代 参 数 可 知, 这 种 新 型 紫 杉 醇 纳 米 制 剂 在 小 鼠 体 内 的 代 谢 符 合 二 房 室 模 型, 至 于 其 在 代 谢 与 组 织 分 布 方 面 的 优 点 还 需 与 紫 杉 醇 注 射 液 在 体 内 的 分 布 代 谢 做 进 一 步 比 较 参 考 文 献 : [1] Tije AJ, Verweij J, Loos WJ, et al. Pharmacological effects of formulation vehicles: implications for cancer chemo therapy [J]. Clin Pharmacokinet, 2003, 42 (7): 665. [2] Gelderblom H, Verweij J, Nooter K, et al. Cremophor EL: the drawbacks and advantages of vehicle selection for drug formulation [J]. Eur J Cancer, 2001, 37(13): [3] Mohammadi A, Esmaeili F, Dinarvand R, et al. Development and validation of a stability-indicating method for the quantitation of Paclitaxel in pharmaceutical dosage forms [J]. J Chromatogr Sci, 2009, 47(7): [4] Soma D, Kitayama J, Ishigami H, et al. Different tissue distribution of paclitaxel with intravenous and intraperitoneal administration [J]. J Surg Res, 2009, 155 (1): [5] Sharma A, Mayhew E, Bolcsak L, et al. Activity of paclitaxel liposome formulations against human ovarian tumor xenografts [J]. Int J Cancer, 1997, 71(1): [6] LIANG Yong-ju, WU Hai-ying, SU Xiao-dong, et al. Determination concentration of paclitaxel by RP-HPLC in mice plasma [J]. Chin J Clin pharmacol( 中 国 临 床 药 理 学 杂 志 ), 2008, 24(3): [7] Ze Lu, Max Tsai, Dan Lu, et al. Tumor-penetrating microparticles for intraperitoneal therapy of ovarian cancer [J]. J Pharmacol Ther, 2008, 327(3): [8] Koshkina NV, Waldrep JC, Roberts LE, et al. Paclitaxel liposome aerosol treatment induces inhibition of pulmonary metastases in murine renal carcinoma model [J]. Clin Cancer Res, 2001, 7(10): [9] Xinghe Wang,Gang Zhao, Sang Van, et al. Pharmacokinetics and tissue distribution of PGG-paclitaxel a nover macromolecular formulation of paclitaxel in nu/nu mice bearing NCI-460 lung cancer xenografts [J]. Cancer Chemother Pharmacol, 2010, 65: Studies on the pharmacokinetics of a new kind of paclitaxel preparation nanometer in mice MENG Su-rui 1, JIAO Jian-jie 1, NIU Rui-fang 2, GAO Yang 1, LI Qin 1, HAN Xiao-wen 1,HE Jing-hua 1* (1 Department of Pharmacology, Tinjin Medical University, Tianjin ; 2 Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, Tianjin ) Abstract: Objective: To establish an RP-HPLC method for the determination of paclitaxel in mice serum. Method: The C18 column was used, the detection was carried out at 227nm with UV detector, the solid phase extraction (SPE) was used to extract the sample, the mobile phase consisted of phosphoric acid: acetonitrile (50:50 V/V) delivered at a flow rate of 1mL min 1. Results: The calibration curves were linear in the rang of μg ml 1 for paclitaxel. Regression equation: Y=13.325X (R 2 =0.9993); the experimental data showed that the concentration-time curve of paclitaxel preparation nanometer in mice serum could be fitted to two-compartmentmodel (W=1). 20

26 Key words: paclitaxel; RP-HPLC; pharmacokinetics; paclitaxel preparation nanometer HPLC 法 对 甲 钴 胺 注 射 液 有 关 物 质 方 法 学 研 究 李 瑾, 于 润 芳 ( 天 津 金 耀 氨 基 酸 有 限 公 司 ) 在 本 实 验 中, 参 照 中 国 药 典 附 录 药 品 质 量 标 准 分 析 方 法 验 证 指 导 原 则 的 要 求, 用 HPLC 法 对 有 关 物 质 测 定 项 目 进 行 了 甲 钴 胺 注 射 液 检 验 方 法 的 方 法 学 验 证 1 仪 器 试 药 与 仪 器 设 备 1.1 试 剂 注 射 用 水 ( 天 津 金 耀 氨 基 酸 有 限 公 司 ) 甲 醇 ( 色 谱 纯,TEDIA COMPANY, INC) 1.2 仪 器 设 备 岛 津 LC-2010A 高 效 液 相 色 谱 仪 CLASS VP 工 作 站 METTLER AE240 电 子 天 平 ; 2 地 塞 米 松 磷 酸 钠 含 量 测 定 方 法 2.1 色 谱 条 件 : 色 谱 柱 : 艾 杰 尔 C8(4.6mm 200mm, 5μm) 流 动 相 : 甲 醇 - 水 (35:65) 溶 液 流 速 :1.0 ml/min 柱 温 :25 检 测 波 长 :266nm 在 中 国 药 典 2005 年 版 规 定 的 条 件 下, 甲 钴 胺 峰 与 相 邻 杂 质 峰 的 分 离 度 应 符 合 要 求 2.2 线 性 范 围 的 考 察 精 密 称 取 原 料 约 50mg, 置 50ml 量 瓶 中, 然 后 分 别 精 密 量 取 ml 置 10ml 量 瓶 中, 用 流 动 相 稀 释 至 刻 度, 摇 匀, 即 得 即 40% 60% 80% 100% 120% 供 试 品 溶 液 ( 见 表 1) 按 上 述 色 谱 条 件, 分 别 吸 取 供 试 品 溶 液 10μl 进 样, 测 定 峰 面 积 积 分 值 (y) ( 见 图 1), 结 果 见 表 1 用 峰 面 积 积 分 值 对 浓 度 (x) 进 行 回 归, 得 直 线 回 归 方 程 ( 见 式 (1 ) 和 标 准 曲 线 ( 见 图 1) 表 1 甲 钴 胺 线 性 范 围 考 察 组 号 浓 度 /(%) 峰 面 积 每 次 进 样 10μl, 对 峰 面 积 y 进 行 线 性 回 归, 得 回 归 方 程 : y = x (R = ) (1) 线 性 范 围 :40%~120% 范 围 内 成 良 好 的 线 性 关 系 21

27 甲 钴 胺 线 性 y = x R 2 = 峰 面 积 图 1 甲 钴 胺 标 准 曲 线 2.3 重 复 性 试 验 取 甲 钴 胺 注 射 液 10μl 进 样, 重 复 6 次, 记 录 所 测 定 甲 钴 胺 的 峰 面 积 积 分 值, 计 算 甲 钴 胺 的 RSD 为 0.03% 结 果 见 表 2 表 2 重 复 性 实 验 结 果 次 数 甲 钴 胺 峰 面 积 RSD/% 稳 定 性 试 验 取 甲 钴 胺 注 射 液, 按 0,2,4,8,12,24h 不 同 时 间 间 隔 10μl 进 样, 测 定 甲 钴 胺 的 峰 面 积 积 分 值, 计 算 RSD 为 0.11%, 结 果 表 明 样 品 测 定 液 中 甲 钴 胺 在 24h 内 稳 定 见 表 3 表 3 稳 定 性 试 验 结 果 测 定 时 间 /h 甲 钴 胺 峰 面 积 RSD/% 专 属 性 试 验 未 经 破 坏 的 供 试 品 取 甲 钴 胺 注 射 液 10μl 进 样 酸 破 坏 的 供 试 品 取 甲 钴 胺 注 射 液 10ml 加 入 0.1mol/L 的 盐 酸 溶 液 1.0ml, 放 置 30min 后 10μl 进 样 碱 破 坏 的 供 试 品 取 甲 钴 胺 注 射 液 10ml 加 入 0.1mol/L 的 氢 氧 化 钠 溶 液 1.0ml, 放 置 30min 后 10μl 进 样 氧 化 破 坏 的 供 试 品 取 甲 钴 胺 注 射 液 10ml 加 入 过 氧 化 氢 溶 液 1.0ml, 放 置 30min 后 10μl 22

28 进 样 光 照 破 坏 的 供 试 品 取 甲 钴 胺 注 射 液 10ml 于 4500±500LX 照 度 下, 放 置 4min 后 10μl 进 样 加 热 破 坏 的 供 试 品 取 甲 钴 胺 注 射 液 10ml 于 80 条 件 下 加 热 4 小 时, 放 置 4min 后 10μl 进 样 照 有 关 物 质 项 下 色 谱 条 件 分 析, 记 录 色 谱 图, 分 析 结 果 根 据 色 谱 图 分 析, 本 品 在 酸 碱 氧 化 加 热 条 件 下 稳 定, 在 光 照 条 件 下 极 不 稳 定, 应 避 光 操 作 2.6 样 品 有 关 物 质 测 定 取 3 批 甲 钴 胺 注 射 液 注 射 液 样 品,10μl 进 样, 按 有 关 物 质 方 法 测 定, 结 果 见 表 4 表 4 样 品 测 定 结 果. 批 号 单 一 杂 质 峰 <1.0% 各 杂 质 峰 面 积 的 和 <3.0% 结 果 符 合 药 典 规 定 图 2 甲 钴 胺 注 射 液 HPLC 图 谱 3 结 论 在 此 色 谱 条 件 下, 甲 钴 胺 的 最 小 检 测 浓 度 为 0.05μg/ml 并 且 经 验 证, 本 产 品 各 项 指 标 均 符 合 国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 局 标 准 参 考 文 献 : [1] 中 国 药 典 2005 版 [2] 国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 局 标 准 23

29 柱 前 衍 生 HPLC 法 测 定 生 物 样 品 中 甲 醛 的 浓 度 张 梦 晓 1, 董 伟 林 2 (1. 天 津 医 科 大 学 药 学 院, 天 津 ;2. 天 津 医 科 大 学 基 础 医 学 院, 天 津 ) 甲 醛 是 室 内 环 境 的 主 要 污 染 物 之 一, 其 污 染 来 源 多, 浓 度 也 较 高 [1] 甲 醛 对 人 体 有 较 大 毒 性, 已 被 世 卫 组 织 确 认 为 致 畸 致 癌 物 质 [2], 并 被 认 为 是 导 致 不 良 建 筑 物 综 合 症 的 主 要 因 素 之 一 [3] 发 展 和 建 立 快 速 准 确 测 定 微 量 甲 醛 的 方 法 日 益 显 得 重 要 目 前, 对 甲 醛 的 测 定 主 要 应 用 于 环 境 监 测 [4] 纺 织 品 [5] 皮 革 [6] 食 品 [7] 药 品 [8] 等 方 面, 而 对 于 生 物 样 品 中 甲 醛 的 测 定 鲜 有 报 道 因 此, 结 合 本 实 验 室 专 长, 采 用 HPLC 法 测 定 甲 醛 染 毒 SD 大 鼠 血 浆 及 脑 肾 脾 等 重 要 脏 器 中 甲 醛 的 浓 度, 旨 在 为 有 长 期 甲 醛 暴 露 人 群 体 内 甲 醛 浓 度 的 测 定 提 供 方 法 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 与 材 料 仪 器 美 国 科 美 特 高 效 液 相 色 谱 仪 ( 包 括 :6000LDI 精 密 恒 流 泵,6000PVW 紫 外 / 可 见 检 测 器, Rheodyne7725i 型 进 样 阀,Anastar 色 谱 工 作 站 );Kromasil C18 柱 (250 mm 4.6 mm, 5 μm, 天 津 市 色 谱 科 学 技 术 公 司 );MSB010.CX2.5 型 台 式 高 速 离 心 机 (SANYO); 三 环 牌 YKH-1 型 液 体 快 速 混 合 器 ( 江 西 医 疗 器 械 厂 );PB153-S 型 电 子 分 析 天 平 ( 瑞 典 梅 特 勒 - 托 利 多 ); 8302 型 恒 温 水 浴 ( 北 京 市 长 风 仪 器 仪 表 公 司 ); μl 微 量 加 样 器 ( 上 海 大 龙 医 疗 有 限 公 司 );100 μl 微 量 进 样 器 ( 上 海 高 鸽 工 贸 有 限 公 司 ) 药 品 与 试 剂 甲 醛 溶 液 (37%-40%, 天 津 威 晨 化 学 试 剂 科 贸 有 限 公 司, 批 号 : );2,4- 二 硝 基 苯 肼 (DNPH, 分 析 纯, 华 东 师 范 大 学 化 工 厂, 批 号 : , 用 乙 腈 配 制 成 3 mg ml -1 的 DNPH 溶 液 ); 乙 腈 ( 色 谱 纯, 天 津 市 协 和 昊 鹏 色 谱 科 技 有 限 公 司, 批 号 : ); 蒸 馏 水 ;85% 磷 酸 ; 空 白 血 浆 ( 天 津 市 血 液 中 心 提 供 ); 生 物 样 品 为 新 鲜 的 经 低 温 速 冻 的 甲 醛 染 毒 SD 大 鼠 的 血 浆 和 脑 肾 脾, 由 天 津 医 科 大 学 生 理 教 研 室 提 供 1.2 色 谱 条 件 色 谱 柱 :Kromasil C18 柱 (250 mm 4.6 mm, 5 μm); 流 动 相 : 乙 腈 - 水 (55:45); 流 速 :1 ml min -1 ; 紫 外 检 测 波 长 :350 nm; 柱 温 : 室 温 ; 进 样 量 :20 μl 1.3 衍 生 化 对 照 品 溶 液 的 衍 生 化 取 甲 醛 溶 液 1 ml, 加 入 乙 腈 1 ml DNPH 溶 液 0.5 ml 1% 磷 酸 3 滴, 涡 旋 混 匀, 置 50 水 浴 中 反 应 15 min, 取 出 后 迅 速 冷 却 至 室 温 血 样 的 衍 生 化 取 血 样 100 μl, 加 入 乙 腈 0.1 ml DNPH 溶 液 0.05 ml 0.5% 磷 酸 1 滴, 涡 旋 混 匀, 置 50 水 浴 中 反 应 15 min, 取 出 后 迅 速 冷 却 至 室 温,13000 r min -1 离 心 3 min, 取 上 清 液 进 样 器 官 样 品 的 衍 生 化 器 官 匀 浆 后 称 重, 加 蒸 馏 水 至 0.1 ml, 加 入 乙 腈 0.1 ml DNPH 溶 液 0.05 ml 0.5% 磷 24

30 作 者 简 介 : 张 梦 晓 (1988- ), 女, 天 津 医 科 大 学 药 学 院 2010 级 硕 士 研 究 生 ; 董 伟 林 (1954- ), 男, 天 津 医 科 大 学 基 础 医 学 院, 高 级 实 验 师, dongwl119@163.com 酸 1 滴, 涡 旋 混 匀,50 水 浴 中 反 应 15 min,13000 r min -1 离 心 3 min, 取 上 清 液 进 样 2 结 果 2.1 系 统 适 用 性 试 验 取 衍 生 后 的 空 白 溶 液 对 照 品 溶 液 血 样 溶 液 和 器 官 样 品 溶 液 分 别 进 样, 在 上 述 色 谱 条 件 下 进 行 测 定 结 果 见 图 1 各 图 中 所 标 示 峰 1 为 甲 醛 衍 生 物 色 谱 峰 A 空 白 溶 液 B 对 照 品 溶 液 C 血 样 D 脑 E 肾 F 脾 图 1 系 统 适 用 性 试 验 由 色 谱 图 可 以 看 出, 在 本 实 验 色 谱 条 件 下, 甲 醛 衍 生 物 峰 的 保 留 时 间 约 为 9.5 min, 且 峰 形 较 好 各 样 品 中 甲 醛 衍 生 物 峰 与 各 杂 质 峰 分 离 度 良 好 2.2 标 准 曲 线 的 绘 制 取 0.5 ml 甲 醛 溶 液 加 蒸 馏 水 至 200 ml, 得 甲 醛 储 备 液 取 0.5 ml 甲 醛 储 备 液, 加 蒸 馏 水 至 250 ml, 得 2 µg ml -1 的 甲 醛 标 准 工 作 液 取 甲 醛 标 准 工 作 液 50 μl 100 μl 0.25 ml 0.5 ml 1 ml 2.5 ml 5 ml 以 及 1 mg ml -1 甲 醛 储 备 液 50 μl, 分 别 置 于 10 ml 容 量 瓶 中, 用 蒸 馏 水 稀 释 并 定 容, 配 制 成 甲 醛 浓 度 为 的 系 列 标 准 溶 液 分 别 取 上 述 系 列 标 准 溶, 液 衍 生 后 精 密 进 样 20 μl, 在 上 述 色 谱 条 件 下 测 定 以 甲 醛 系 列 浓 度 衍 生 物 峰 面 积 为 纵 坐 标 甲 醛 系 列 溶 液 的 浓 度 为 横 坐 标 绘 制 标 准 工 作 曲 线, 得 出 线 性 回 归 方 程, 结 果 见 图 2 由 图 可 知, 甲 醛 衍 生 物 峰 面 积 与 甲 醛 浓 度 呈 线 性 关 系, 线 性 回 归 方 程 为 y = x , 相 关 系 数 r = , 二 者 线 性 关 系 良 好, 线 性 范 围 为 10~5000 ng ml 方 法 回 收 率 试 验 取 浓 度 为 20 ng ml ng ml ng ml -1 的 甲 醛 标 准 溶 液, 衍 生 后 进 样, 每 一 浓 度 测 定 3 次, 得 低 中 高 浓 度 的 方 法 回 收 率 分 别 为 101.3%,100.1% 和 101.2%, 且 RSD 均 小 于 5%, 方 法 准 确 度 满 足 分 析 要 求 2.4 精 密 度 试 验 取 浓 度 为 ng ml -1 的 甲 醛 标 准 溶 液, 衍 生 后 进 样, 于 同 一 天 内 每 一 浓 度 25

31 测 定 5 次, 得 平 均 日 内 RSD 为 1.40%; 连 续 5 天 同 法 操 作, 每 一 浓 度 每 天 进 样 3 次, 得 平 均 日 间 RSD 为 2.69% 2.5 萃 取 回 收 率 试 验 取 已 知 浓 度 血 浆 1 ml, 各 加 入 低 中 高 浓 度 甲 醛 标 准 溶 液 1 ml, 衍 生 后 进 样, 每 一 浓 度 测 定 3 次, 得 低 中 高 浓 度 萃 取 回 收 率 分 别 为 83.6%,95.7% 和 99.6%, 均 大 于 75%, 萃 取 回 收 率 满 足 生 物 样 品 分 析 要 求 2.6 定 量 限 按 S/N=10 计 算, 本 方 法 定 量 限 为 5 ng ml 样 品 的 测 定 血 样 的 测 定 血 样 测 定 结 果 见 表 1 表 1 血 样 测 定 结 果 编 号 峰 面 积 浓 度 (ng ml -1 ) 器 官 样 本 的 测 定 器 官 样 本 测 定 结 果 见 表 2 表 2 器 官 样 品 测 定 结 果 样 品 类 型 编 号 样 品 重 量 (mg) 峰 面 积 浓 度 (ng mg -1 ) 3 讨 论 脑 肾 脏 脾 脏 方 法 原 理 甲 醛 本 身 的 分 子 结 构 简 单, 在 紫 外 区 的 吸 收 较 低, 直 接 用 紫 外 检 测 器 检 测 灵 敏 度 低, 通 常 需 要 衍 生 后 才 能 用 于 色 谱 分 析 甲 醛 与 DNPH 在 酸 性 介 质 中 发 生 高 度 特 异 性 化 学 反 应, 生 成 衍 生 物 2,4- 二 硝 基 苯 腙 [8] 衍 生 产 物 性 质 较 稳 定, 且 引 入 了 共 轭 体 系, 色 谱 行 为 改 善 26

32 紫 外 吸 收 大 大 增 强, 可 直 接 用 HPLC 法 测 定 3.2 衍 生 条 件 的 选 择 衍 生 时 间 的 选 择 取 2000 ng ml -1 的 甲 醛 标 准 溶 液 1 ml, 加 入 1 ml 乙 腈 和 0.5 mldnph 溶 液, 加 入 1% 磷 酸 3 滴, 在 50 恒 温 水 浴 中 分 别 加 热 min 后, 迅 速 冷 却 至 室 温, 取 20 μl 进 样, 记 录 衍 生 物 峰 面 积 如 图 2 所 示, 甲 醛 溶 液 加 热 15 min 后, 衍 生 物 的 峰 面 积 不 再 增 加, 遂 采 用 15 min 作 为 本 实 验 的 衍 生 时 间 y = x R 2 = 衍 生 物 峰 面 积 衍 生 物 峰 面 积 甲 醛 浓 度 (ng/ml) 衍 生 时 间 (min) 图 2 甲 醛 标 准 曲 线 图 2 衍 生 时 间 对 衍 生 物 峰 面 积 的 影 响 衍 生 ph 的 选 择 取 2000 ng ml -1 的 甲 醛 标 准 溶 液 1 ml, 加 入 1 ml 乙 腈 和 0.5 mldnph 溶 液, 分 别 加 入 5% 2% 1% 0.5% 磷 酸 及 蒸 馏 水, 调 ph 为 , 在 50 恒 温 水 浴 中 加 热 15 min 后, 迅 速 冷 却 至 室 温, 取 20 μl 进 样, 如 图 3 所 示, 衍 生 ph 为 5 时, 衍 生 物 的 峰 面 积 最 大, 因 此 选 择 本 实 验 的 衍 生 ph 为 衍 生 温 度 的 选 择 取 2000 ng ml -1 的 甲 醛 标 准 溶 液 1 ml, 加 入 1 ml 乙 腈 和 0.5 mldnph 溶 液, 加 入 1% 磷 酸 3 滴, 在 室 温 (20 ) 下 分 别 衍 生 15 min 后, 迅 速 冷 却 至 室 温, 取 20 μl 进 样 如 图 4 所 示, 水 浴 温 度 超 过 50 时, 衍 生 物 峰 面 积 最 大, 因 此 选 择 50 作 为 本 实 验 的 衍 生 温 度 衍 生 物 峰 面 积 衍 生 ph 衍 生 物 峰 面 积 衍 生 温 度 图 3 衍 生 ph 对 衍 生 物 峰 面 积 的 影 响 图 4 衍 生 温 度 对 衍 生 物 峰 面 积 的 影 响 27

33 4 小 结 本 实 验 采 用 柱 前 衍 生 化 与 HPLC 相 结 合 的 方 法 检 测 了 甲 醛 染 毒 SD 大 鼠 血 浆 及 脑 肾 脾 等 器 官 中 甲 醛 的 浓 度 方 法 操 作 快 速 简 便 成 本 低 ; 方 法 专 属 性 强 准 确 度 高 精 密 度 良 好, 完 全 满 足 分 析 要 求, 对 于 血 浆 及 器 官 样 本 中 甲 醛 浓 度 可 准 确 测 定, 可 为 有 长 期 甲 醛 暴 露 人 群 体 内 甲 醛 浓 度 的 测 定 提 供 方 法 依 据 参 考 文 献 : [1] 俞 凌 云, 曹 凤 梅, 张 新 申. 甲 醛 测 定 方 法 研 究 [J]. 西 部 皮 革,2009,31(23): [2] 徐 婉. 微 量 甲 醛 测 试 方 法 及 研 究 进 展 [J]. 中 国 西 部 科 技,2009,8(29): [3] Donggeun Sul, Hyunsook Kim, Eunha Oh, et al.gene expression profiling in lung tissues from rats exposed to formaldehyde[j].arch Toxicol, 2007, 81 (8): [4] 罗 靖, 蒲 荣 登, 张 玉 美, 等. 酚 试 剂 - 示 波 极 谱 法 测 定 公 共 场 所 空 气 中 甲 醛 [J]. 预 防 医 学 情 报 杂 志,2010, 26(3): [5] 赵 婷, 赵 梅, 吴 德 清, 等. 柱 前 衍 生 /HPLC 法 测 定 纺 织 品 中 的 游 离 水 解 甲 醛 [J]. 印 染 助 剂,2009,26 (3): [6] 杨 春 梅, 王 瑞, 黄 彬, 等. 皮 革 中 甲 醛 含 量 的 HPLC 检 测 方 法 研 究 [J]. 计 量 与 测 试 技 术,2009,36(12): [7] 张 秀 尧, 陈 栋. 柱 前 衍 生 反 相 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 食 品 中 甲 醛 [J]. 中 国 卫 生 检 验 杂 志,2004,14(1): [8] 王 冕, 张 珉 娜. 反 相 HPLC 法 测 定 青 霉 素 V 钾 中 甲 醛 残 留 量 [J]. 河 北 医 药,2007,29(2): Determination of Formaldehyde in Bio-samples by Pre-column Derivation HPLC Abstract: Objectives: To establish and validate a high performance liquid chromatography (HPLC) method to determine the formaldehyde levels in bio-samples. Methods: 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) was used as derivating agent. Formaldehyde was mixed with derivating agent, and then derived under acid condition. Then the mixture was centrifuged and the supernatant was used for injection. Chromatographic conditions were as follows: Kromasil C18 column (250 mm 4.6 mm, 5 μm) was used with room temperature as column temperature. The mobile phase consisted of acetonitrile and distilled water (55:45) in a flow rate of 1 ml min -1. The ultraviolet detection wavelength was set at 350 nm and injection volume was 20 μl. Results: Under our chromatographic conditions, the peak of derivation product was well separated from peaks of impurities in all samples. The peak area of derivation product was plotted to the corresponding formaldehyde concentration to obtain the standard curve. The equation of linear regression was y = x (r = , n = 3), with linear range of 10~5000 ng ml -1. The method recovery was 100.1~101.3% and the extraction recovery was 83.6%~99.6%. The intraday and interday precisions and repeatability, expressed as relative standard deviation (RSD), were 1.40%, 2.69% and 1.54%, respectively. The detection limit was 5 ng ml -1 and the formaldehyde concentrations in all samples could be accurately measured. Conclusions: Our method is specific, accurate and precise, which perfectly met the analytical demand. The formaldehyde concentrations in all bio-samples could be well measured. 28

34 Key words: Formaldehyde; Pre-column derivation; HPLC; Bio-samples 灯 盏 花 素 对 细 胞 色 素 P4502D6 酶 活 性 影 响 李 芹, 韩 晓 文, 孟 素 蕊, 焦 建 杰, 娄 建 石 ( 天 津 医 科 大 学 基 础 医 学 院 药 理 教 研 室, 天 津 ) 细 胞 色 素 P450 2D6(CYP2D6) 是 人 体 中 重 要 的 药 物 代 谢 酶, 参 与 临 床 近 百 种 药 物 的 代 谢, 包 括 多 种 抗 心 律 失 常 药 β 受 体 阻 滞 剂 抗 高 血 压 药 抗 抑 郁 药 以 及 抗 精 神 病 药 等 [1] CYP2D6 是 最 具 有 基 因 多 态 性 的 药 物 代 谢 酶, 目 前 已 发 现 有 七 十 多 个 变 异 位 点 [2] 基 因 突 变 可 以 引 起 酶 活 性 及 数 量 的 差 异 [3], 从 而 造 成 人 类 对 药 物 反 应 的 显 著 个 体 差 异 CYP2D6 酶 的 活 性 可 影 响 药 物 的 代 谢 过 程, 从 而 影 响 药 物 的 疗 效 ; 而 且 药 物 对 CYP2D6 可 以 产 生 诱 导 或 抑 制 作 用, 从 而 影 响 其 他 经 此 酶 代 谢 的 药 物 而 发 生 药 物 相 互 作 用 和 不 良 反 应 [4] 因 此, 研 究 药 物 对 CYP2D6 活 性 的 影 响 具 有 重 要 意 义 中 药 的 成 分 比 较 复 杂, 中 西 药 联 合 应 用 时, 容 易 出 现 药 物 相 互 作 用, 因 此 研 究 中 草 药 对 CYP2D6 酶 活 性 的 影 响, 不 但 可 以 了 解 中 药 的 体 内 代 谢 过 程, 而 且 可 以 为 临 床 中 西 药 物 的 合 理 搭 配 使 用 提 供 依 据 [5] 灯 盏 花 素 粉 针 剂 由 菊 科 植 物 灯 盏 花 经 提 取 酚 酸 类 成 分 制 成 的 灭 菌 水 溶 液, 其 主 要 成 分 为 灯 盏 花 素 和 总 咖 啡 酸 酯 等, 具 有 活 血 化 瘀 通 络 止 痛 之 功 效 灯 盏 花 素 粉 针 剂 具 有 明 显 的 血 管 扩 张 作 用, 并 能 抑 制 血 小 板 红 细 胞 聚 集, 促 进 纤 溶 酶 活 性, 具 有 良 好 的 溶 栓 防 栓 作 用 和 清 除 自 由 基 对 抗 脂 质 过 度 氧 化 作 用 [6] 临 床 常 用 于 脑 梗 塞 冠 心 病 心 绞 痛 等 心 脑 血 管 疾 病 的 治 疗, 是 目 前 临 床 上 较 广 泛 使 用 的 治 疗 心 脑 血 管 疾 病 的 有 效 药 物 之 一 由 于 大 多 数 心 血 管 病 患 者 需 要 联 合 用 药, 因 此 造 成 心 血 管 病 患 者 用 药 过 程 中 容 易 出 现 明 显 的 个 体 差 异 和 药 物 相 互 作 用,. 本 研 究 拟 使 用 美 托 洛 尔 作 为 探 针 药 物 研 究 灯 盏 花 素 注 射 液 对 大 鼠 CYP2D6 体 内 代 谢 活 性 的 影 响, 为 预 测 药 物 相 互 作 用, 指 导 临 床 合 理 用 药 提 供 实 验 室 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 实 验 动 物 Wistar 大 鼠, 雌 雄 各 半, 体 重 200±20g, 由 中 国 人 民 解 放 军 军 事 医 学 科 学 院 放 射 研 究 所 实 验 动 物 中 心 提 供, 动 物 生 产 合 格 证 号 :ASCSK( 津 ) 药 品 与 试 剂 灯 盏 花 素 粉 针 剂 (25mg/ 支, 批 号 : , 昆 明 龙 津 药 业 股 份 有 限 公 司 生 产 ); 美 托 洛 尔 原 料 药 (metoprolol, 批 号 , 上 海 定 康 生 物 医 药 材 料 有 限 公 司 ); 地 西 泮 原 料 药 (diazepam, 批 号 , 大 同 制 药 厂 ); 无 水 乙 醇 磷 酸 氢 二 铵 磷 酸 氯 仿 均 为 市 售 分 析 纯, 甲 醇 为 色 谱 纯 1.3 实 验 仪 器 Agilent 1100 HPLC 工 作 系 统 (Agilent 公 司, 美 国 ),CAY-1 型 液 体 快 速 混 合 器 ( 北 京 长 安 仪 器 厂, 中 国 ),B600 型 低 速 自 动 平 衡 离 心 机 ( 白 洋 离 心 机 厂, 美 国 ),K-550-GE 漩 涡 混 合 器 (Scientific Industries Inc, 美 国 ),PB153-S 精 密 分 析 天 平 (METTLER TOLEDO, 瑞 士 ) 1.4 色 谱 条 件 色 谱 柱 :Agilent zorbax SB-C18 (250mm 4.6mm, 5μm)(Agilent 公 司, 美 国 ); 流 动 相 : 0.05mol/L 磷 酸 氢 二 铵 缓 冲 溶 液 ( 用 磷 酸 调 ph 至 3.4)- 甲 醇 (40:60, v:v); 流 速 :1.0 ml/min; 紫 外 检 测 波 长 :230nm; 柱 温 :30 ; 进 样 量 :20μl 29

35 基 金 项 目 : 天 津 市 自 然 科 学 基 金 重 点 项 目 (09JCZDJC21500); 高 等 学 校 博 士 学 科 点 专 项 科 研 基 金 ( 新 教 师 基 金 ) 资 助 课 题 ( ) 作 者 简 介 : 李 芹 (1971-), 女, 山 东 人, 副 教 授,TEL: , carolin1006@gmail.com 1.5 溶 液 配 制 磷 酸 氢 二 铵 缓 冲 液 的 配 制 : 称 取 磷 酸 氢 二 铵 2.64g, 以 400ml 双 蒸 水 溶 解, 加 85% 磷 酸 1.4ml, 调 节 ph 值 为 地 西 泮 内 标 溶 液 (IS) 的 配 制 : 精 密 称 取 地 西 泮 10mg, 以 无 水 甲 醇 溶 解 并 定 容 至 10ml 容 量 瓶 中, 得 1mg/ml 内 标 储 备 液 分 别 精 密 吸 取 适 量 内 标 储 备 液, 以 无 水 甲 醇 定 容 为 浓 度 100μg/ml 和 200μg/ml 的 内 标 工 作 液, 置 4 冰 箱 中 保 存 探 针 药 溶 液 配 置 : 以 甲 醇 作 为 溶 剂, 制 备 浓 度 为 1mg/ml 的 美 托 洛 尔 储 备 溶 液, 4 冷 藏, 用 时 加 水 稀 释 至 适 宜 浓 度 1.6 样 品 预 处 理 准 确 吸 取 空 白 血 浆 200μl, 加 入 含 浓 度 为 100μg/ml 的 地 西 泮 内 标 溶 液 20μl, 涡 旋 振 荡 30s, 加 入 2ml 提 取 溶 剂 氯 仿, 于 快 速 液 体 混 合 器 混 匀 2min 后 2200 g, 离 心 10min 取 下 层 有 机 相 置 玻 璃 离 心 管 中, 置 40 水 浴 中 以 氮 气 吹 干 残 渣 用 100μl 流 动 相 复 溶,20μl 进 样, 记 录 色 谱 图 1.7 给 药 方 法 及 样 本 采 集 实 验 分 组 及 给 药 方 法 将 Wistar 大 鼠 随 机 分 为 两 组, 对 照 组 和 实 验 组, 每 组 30 只 大 鼠 实 验 组 大 鼠 每 日 尾 静 脉 注 射 灯 盏 花 素 粉 针 剂 0.45mg/100g, 每 日 1 次, 共 10d; 第 11d 于 尾 静 脉 缓 慢 注 射 美 托 洛 尔 探 针 药 物 溶 液 1mg/100g 对 照 组 大 鼠 每 日 尾 静 脉 注 射 生 理 盐 水 0.5ml/100g, 每 日 1 次, 共 10d; 第 11d 于 尾 静 脉 缓 慢 注 射 美 托 洛 尔 探 针 药 物 溶 液 1mg/100g 血 浆 样 品 采 集 分 别 于 注 射 美 托 洛 尔 探 针 溶 液 前 及 给 药 后 min 和 h 股 静 脉 取 血 0.8ml 至 肝 素 化 离 心 管 中,3500rpm 离 心 10min, 分 离 血 浆, 按 文 中 样 品 预 处 理 程 序 操 作, 测 定 1.8 数 据 处 理 方 法 及 药 代 动 力 学 分 析 使 用 DAS2.0 软 件 的 非 房 室 模 型 计 算 美 托 洛 尔 的 主 要 药 代 动 力 学 参 数 1.9 统 计 学 处 理 结 果 以 均 值 ± 标 准 差 (Mean values±sd) 表 示, 应 用 DAS 软 件 进 行 统 计 分 析, 采 用 方 差 分 析 进 行 组 间 比 较,Dunnett s 检 验 进 行 两 两 比 较 P<0.05 表 示 有 显 著 差 异 2 结 果 2.1 HPLC 的 方 法 学 验 证 上 述 条 件 下, 美 托 洛 尔 内 标 峰 峰 形 良 好, 分 离 完 全, 无 杂 质 峰 干 扰 血 浆 色 谱 图 见 图 A B C 图 1 血 浆 色 谱 图 30

36 A: 空 白 血 浆 B: 空 白 血 浆 + 美 托 洛 尔 + 内 标 C: 血 浆 样 本 1. 美 托 洛 尔 2. 内 标 ( 地 西 泮 ) 以 美 托 洛 尔 与 内 标 峰 面 积 比 值 为 横 坐 标, 药 物 浓 度 为 纵 坐 标, 绘 制 标 准 曲 线, 得 标 准 曲 线 方 程 为 Y=44.421X ,r= 血 浆 中 低 中 高 三 种 浓 度 的 美 托 洛 尔 的 日 内 及 日 间 精 密 度 均 小 于 9%, 绝 对 回 收 率 均 大 于 80%, 相 对 回 收 率 为 91%-107% 血 浆 样 本 冷 冻 一 个 月 后 其 浓 度 变 化 均 在 ±8% 以 内 2.2 药 代 动 力 学 研 究 使 用 DAS2.0 软 件 的 非 房 室 模 型 计 算 美 托 洛 尔 的 主 要 药 代 动 力 学 参 数, 结 果 见 表 1, 对 照 组 和 实 验 组 的 血 药 浓 度 均 值 - 时 间 曲 线 见 图 对 照 组 实 验 组 C(ug/ml) T(h) 图 2 对 照 组 和 实 验 组 的 血 药 浓 度 均 值 - 时 间 曲 线 表 1 大 鼠 静 脉 注 射 美 托 洛 尔 (1mg/100g) 后 的 主 要 药 动 学 参 数 ( x ±SD,n=6) 药 代 参 数 对 照 组 实 验 组 AUC(0-t)(mg/L*h) 49.72± ±14.00* AUC(0- )(mg/l*h) 66.72± ±11.96* MRT(0-t)(h) 3.60± ±2.00 MRT(0- )(h) 8.28± ±4.82 t1/2(h) 5.31± ±2.07 CL(L/h/kg) 0.16± ±0.01* *P< 讨 论 美 托 洛 尔 (metoprolol) 为 选 择 性 β1 受 体 阻 滞 剂, 临 床 上 主 要 用 于 治 疗 抗 该 血 压 和 心 绞 痛, 具 有 良 好 的 抗 高 血 压 抗 心 肌 缺 血 及 保 护 心 脏 的 作 用 该 药 口 服 1.5h 达 峰 值, 消 除 半 衰 期 为 3 4h 口 服 剂 量 的 70% 80% 通 过 CYP2D6 代 谢 美 托 洛 尔 主 要 经 两 条 代 谢 途 径 : O- 去 甲 基 代 谢 和 α- 羟 基 化 代 谢 其 中 α- 羟 基 化 代 谢 生 成 α- 羟 基 美 托 洛 尔, 几 乎 是 由 CYP2D6 单 一 途 径 代 谢 而 成, 因 此 美 托 洛 尔 是 CYP2D6 的 特 异 性 底 物, 可 以 作 为 研 究 该 酶 活 性 的 探 [7-10] 针 药 物 表 1 数 据 表 明, 与 对 照 组 相 比, 实 验 组 美 托 洛 尔 的 AUC 明 显 升 高,CL 明 显 降 低 (P<0.05), 说 明 给 予 大 鼠 灯 盏 花 素 注 射 液 10d 后, 美 托 洛 尔 在 体 内 的 代 谢 减 慢, 提 示 使 用 灯 盏 花 素 注 射 液 后 大 鼠 体 内 CYP2D6 活 性 降 低 目 前 心 血 管 疾 病 已 经 成 为 危 害 人 类 健 康 的 第 一 大 疾 病, 其 发 病 率 死 亡 率 逐 年 上 升, 患 31

37 者 需 要 长 期 治 疗, 或 者 终 生 服 药 由 于 遗 传 和 个 体 差 异, 再 加 上 疾 病 本 身 引 起 的 生 理 变 化, 使 得 大 多 数 心 血 管 病 患 者 需 要 联 合 用 药, 造 成 心 血 管 病 患 者 用 药 过 程 中 出 现 明 显 的 个 体 差 异 和 药 物 相 互 作 用, 因 此, 研 究 联 合 用 药 时, 药 物 对 于 药 物 代 谢 酶 活 性 的 影 响, 可 以 估 计 传 统 用 药 剂 量 可 能 引 起 的 毒 性 反 应 以 及 联 合 用 药 时 产 生 的 药 物 相 互 作 用, 对 于 调 整 临 床 用 药 方 案, 提 高 治 疗 效 果, 减 少 药 物 不 良 反 应, 最 终 实 现 个 体 化 给 药, 具 有 极 其 重 要 的 意 义 参 考 文 献 [1] 李 芹, 王 睿. 细 胞 色 素 P4502D6 基 因 多 态 性 和 药 物 相 互 作 用 [J]. 中 国 临 床 药 理 学 与 治 疗 学,2006, 11(4): [2] Benny K., Adithan C. Genetic polymorphism of CYP2D6 [J]. Indian Journal of Pharmacology, 2001, 33: [3] Ulrich MZ, Joachim F, Sebastian R, Thomas S, Bernd OF, Matthias S, Michel E. Comprehensive analysis of the genetic factors determining expression and function of hepatic CYP2D6 [J]. Pharmacogenetics, 2001, 11: [4] Benny K.,Adithan C.Genetic polymorphism of CYP2D6[J]. Indian Journal of Pharmacology, 2001, 33: [5] 贾 晋 生, 李 芹, 王 睿. 细 胞 色 素 P4502D6 氧 化 酶 研 究 的 表 型 分 析 及 探 针 药 物 [J]. 中 国 新 药 杂 志,2006, 15(12): [6] 盛 净, 徐 济 民, 杨 菊 贤, 等. 灯 盏 花 素 对 急 性 心 肌 缺 血 时 血 小 板 聚 集 率 TXA2 和 6- 酮 PGF1 的 影 响. 中 华 心 血 管 病 杂 志,1995,23:53-55 [7] Kaila N,Straka RJ,Brundage RC. Mixture models and subpopulation classification: a pharmacokinetic simulation study and application to metoprolol CYP2D6 phenotype [J]. J Pharmacokinet Pharmacodyn, 2007,34(2): [8] Taguchi M,Nozawa T,Kameyama T,Inoue H,Takesono C,Mizukami A, et al. Effect of CYP2D6*10 on pharmacokinetic variability of routinely administered metoprolol in middle-aged and elderly Japanese patients[j]. Eur J Clin Pharmacol,2003,59: [9] Wang Y, Zhou L, Dutreix C, et al. Effects of imatinib ( Glivec ) on the pharmacokinetics of metoprolol, a CYP2D6 substrate, in Chinese patients with chronic myelogenous leukaemia [J]. Br J Clin Pharmacol, 2008,65(6) : [10] 李 芹, 王 睿, 郭 雅, 等. 中 国 人 群 CYP2D6 基 因 多 态 性 对 美 托 洛 尔 药 代 动 力 学 的 影 响. 中 国 临 床 药 理 学 与 治 疗 学,2008,13(7): Effect of Breviscapine on the activity of cytochrome P4502D6 LI Qin,HAN Xiao-wen,, MENG Su-rui, JIAO Jian-jie, LOU Jian-shi* (Department of Pharmacology, Tianjin Medical University, Tianjin, , China) Abstract: Objective: To investigate the effect of Breviscapine on the activity of cytochrome P4502D6(CYP2D6) by metoprolol as a probe. Methods: Wistar rats were divided into test group and control group randomly. The rats in the test group were injected breviscapine for 10 days and the rats in the control group were injected normal saline. On d11, all the rats were injected metoprolol. Blood sample were collected for different time and the concentrations of metoprolol were determined by HPLC. Results: Compared with control group, AUC was significantly higher and CL was significantly lower in test group. Conclusion: The activity of CYP2D6 can be inhibited by breviscapine. 32

38 Key Words: breviscapine, midazolam, CYP2D6, activity 跌 打 红 药 片 的 质 量 标 准 研 究 周 德 英 1, 刘 志 华 2 (1. 天 津 中 新 药 业 隆 顺 榕 制 药 厂, 天 津 ;2. 河 北 工 业 大 学 化 工 学 院, 天 津 ) 跌 打 红 药 片 是 由 三 七 白 芷 川 芎 和 当 归 等 6 味 中 药 组 成 的 复 方 制 剂, 具 有 活 血 止 痛, 去 瘀 生 新 的 功 效, 主 要 用 于 治 疗 跌 打 损 伤, 筋 骨 瘀 血 肿 痛, 风 湿 麻 木 等 症 方 中 三 七 为 君 药, 能 散 瘀 止 血, 消 肿 定 痛 ; 辅 以 活 血 化 瘀 的 川 芎 当 归 等 共 奏 活 血 止 痛 去 瘀 生 新 的 功 效 为 控 制 产 品 质 量, 确 保 临 床 疗 效, 建 立 了 三 七 白 芷 川 芎 和 当 归 的 薄 层 色 谱 鉴 别 方 法, 并 采 用 高 效 液 相 色 谱 法 对 三 七 的 有 效 成 分 人 参 皂 苷 Rg1 进 行 含 量 测 定 1 仪 器 与 试 剂 SP8800 高 效 液 相 色 谱 输 液 泵, 紫 外 FOCUS 检 测 器 数 据 处 理 : 分 析 之 星 色 谱 工 作 站 人 参 皂 苷 Rg1 对 照 品 购 自 中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所 样 品 由 天 津 中 新 药 业 隆 顺 榕 制 药 厂 提 供 乙 腈 为 色 谱 纯, 水 为 纯 净 水 2 人 参 皂 苷 Rg1 的 HPLC 法 测 定 2.1 色 谱 条 件 : 色 谱 柱 以 十 八 烷 基 硅 烷 键 合 硅 胶 为 填 充 剂 ; 乙 腈 - 水 (20 80) 为 流 动 相 ; 检 测 波 长 为 203nm; 流 速 :1.0ml/min; 柱 温 : 溶 液 的 制 备 : 对 照 品 溶 液 的 制 备 精 密 称 取 人 参 皂 苷 Rg1 对 照 品 适 量, 加 甲 醇 制 成 每 1ml 含 0.2mg 的 溶 液, 即 得 供 试 品 溶 液 的 制 备 : 取 本 品 20 片, 除 去 包 衣, 研 细, 取 0.5g, 精 密 称 定, 置 25ml 具 塞 锥 形 瓶 中, 精 密 加 入 25ml 甲 醇, 称 定 重 量, 超 声 处 理 40 分 钟, 放 冷, 再 称 定 重 量, 加 甲 醇 补 足 减 失 的 重 量, 用 微 孔 滤 膜 (0.45μm) 滤 过, 取 续 滤 液 即 得 2.3 标 准 曲 线 的 绘 制 : 取 人 参 皂 苷 Rg1 对 照 品 适 量, 精 密 称 定, 加 甲 醇 制 成 每 1ml 含 0.502mg 的 溶 液, 作 为 储 备 液, 分 别 精 密 量 取 0.5ml 1ml 2ml 3ml 4ml, 置 5ml 量 瓶 中, 加 甲 醇 稀 释 至 刻 度, 分 别 精 密 吸 取 上 述 5 种 浓 度 的 对 照 品 溶 液 各 10μl, 注 入 液 相 色 谱 仪, 测 定 色 谱 峰 面 积 以 对 照 品 浓 度 (ug/ml) 为 横 坐 标, 峰 面 积 为 纵 坐 标, 绘 制 标 准 曲 线, 得 回 归 方 程 Y=2939X , r= 结 果 表 明 人 参 皂 苷 Rg1 在 50.2~401.6μg/ ml 范 围 内 与 峰 面 积 呈 良 好 线 性 关 系 2.4 专 属 性 试 验 : 取 人 参 皂 苷 Rg1 对 照 品 溶 液 供 试 品 溶 液 和 三 七 阴 性 对 照 液 各 10μl, 注 入 高 效 液 相 色 谱 仪, 测 定 结 果 见 图 2 表 明 阴 性 对 照 没 有 任 何 干 扰 2.5 重 复 性 试 验 : 分 别 精 密 吸 取 同 一 份 供 试 品 溶 液 10μL, 重 复 进 样 6 次, 测 定 人 参 皂 苷 Rg1 峰 面 积, 其 RSD 为 0.73% 2.6 稳 定 性 试 验 : 精 密 吸 取 同 一 份 供 试 品 溶 液 10μL, 分 别 于 0,2,4,6,8,10 小 时 进 样, 测 定 色 谱 峰 面 积, 峰 面 积 值 的 RSD 为 1.40%, 表 明 溶 液 内 待 测 组 分 在 10 小 时 化 学 性 质 稳 定 2.7 重 现 性 试 验 : 取 本 品 共 6 份, 按 供 试 品 溶 液 制 备 操 作, 分 别 进 样 10μL, 按 前 述 色 谱 条 件 进 样, 测 定 每 份 样 品 中 人 参 皂 苷 Rg1 含 量, 结 果 RSD 为 1.58% 2.8 加 样 回 收 率 试 验 : 取 样 品 中 人 参 皂 苷 Rg1 含 量 为 mg/g 的 细 粉 0.25g, 精 密 称 定, 精 密 加 入 人 参 皂 苷 Rg1 对 照 品 溶 液 25ml(0.0921mg/ml), 按 供 试 品 溶 液 方 法 制 备, 按 上 述 色 谱 条 件 分 析, 计 算 回 收 率, 结 果 人 参 皂 苷 Rg1 平 均 回 收 率 为 98.28%,RSD 为 1.04% 33

39 作 者 简 介 : 周 德 英 (1974- ), 女, 天 津 人, 高 级 工 程 师,Tel: , zhoudeying7477@eyou.com 图 2 人 参 皂 苷 Rg1 对 照 品 (A) 供 试 品 (B) 和 三 七 空 白 对 照 (C) 的 HPLC 图 ( 从 上 往 下 依 次 为 图 A,B,C) 2.9 样 品 的 测 定 : 取 3 批 样 品, 分 别 制 备 供 试 品 溶 液 分 别 精 密 吸 取 对 照 品 溶 液 和 供 试 品 溶 液 各 10ul, 注 入 液 相 色 谱 仪, 测 定, 计 算 人 参 皂 苷 Rg1 含 量, 结 果 见 表 1 3 讨 论 表 1 跌 打 红 药 片 中 人 参 皂 苷 Rg1 的 测 定 结 果 (n=3) 批 号 人 参 皂 苷 Rg1 含 量 (mg/ 片 ) RSD/% 薄 层 色 谱 鉴 别 中 采 用 的 方 法 清 晰 准 确 重 现 性 好 人 参 皂 苷 Rg1 含 量 测 定 中 采 用 的 方 法 均 为 经 过 实 验 筛 选 的 最 佳 条 件, 且 色 谱 峰 分 离 度 好, 建 立 的 方 法 能 起 到 控 制 本 品 内 在 质 量 的 目 的 参 考 文 献 : 中 国 药 典 [S]. 一 部 Quality Standard Research of Dieda-Hongyao Tablet ZHOU De-ying 1, LIU Zhi-hua 2 (1.Tianjin Zhongxin Pharmaceutical Longshunrong Manufactory,Tianjin ,China; 2. School of Chemical Engineering,Hebei Industrial University,Tianjin ,China) Abstract: [Objective] To establish the quality standard of Dieda-Hongyao Tablet. [Method] Determin the quantity of ginsenoside Rg-1 in preparation with HPLC method. [Result] Ginsenoside Rg-1 have Good linear relationship with peak area between 50.2~401.6μg/ ml with average recovery 97.28% and RSD 1.04%.[Conclusion] The method is simple, accurate, reliable and reproducible enough to be the the formulation of quality standards. 34

40 Key words: Dieda-Hongyao tablet;hplc; ginsenoside Rg-1 高 效 液 相 色 谱 - 蒸 发 光 检 测 法 分 离 蚕 沙 中 的 生 物 碱 * 亓 晖, 张 业 云, 刘 新 来, 赵 辉, 王 鹏, 花 同, 朱 元 元 ( 南 开 大 学 药 学 院, 天 津 ) 蚕 沙 为 蚕 蛾 科 家 蚕 属 昆 虫 家 蚕 幼 虫 的 粪 便, 具 有 较 高 营 养 成 分, 药 用 价 值 很 高 近 年 来 研 究 发 现, 蚕 沙 生 物 碱 成 分 能 抑 制 α- 糖 苷 酶 活 性, 改 善 糖 尿 病 动 物 的 糖 脂 代 谢 异 常, 有 益 于 早 期 糖 尿 病 及 其 慢 性 并 发 症 的 防 治 [1-2] 对 蚕 沙 中 生 物 碱 成 分 做 HPLC 分 析, 实 验 数 据 显 示, 至 少 含 有 八 种 化 合 物, 周 元 雄 [3] 等 人 已 分 离 鉴 定 出 其 中 三 种 化 合 物, 而 另 外 至 少 五 种 化 合 物 还 未 见 报 道 因 此, 有 必 要 对 蚕 沙 生 物 碱 成 分 进 行 较 深 入 的 研 究 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 与 试 剂 SHIMADZU 系 列 高 效 液 相 色 谱 仪 ;Hypersil SCX 色 谱 柱 (250 mm 10.0 mm,5 μm) ; Varian-Mercury V 300 型 高 分 辨 核 磁 波 谱 仪 ;Thermofinnigan LCQ 质 谱 仪 ; 生 药 蚕 沙 由 天 津 市 中 新 药 业 提 供 ;HPLC 用 水 均 为 娃 哈 哈 纯 净 水 ; 其 它 试 剂 均 为 分 析 纯 1.2 HPLC 法 分 离 蚕 沙 中 生 物 碱 成 分 色 谱 条 件 色 谱 柱 :Hypersil SCX 柱 (250 mm 10.0 mm,5 μm); 流 动 相 : 水 - 冰 醋 酸 - 氨 水 (1000: 0.25:0.25;V/V/V); 流 速 :3.0ml/min; 检 测 器 : 蒸 发 光 检 测 器 (SC:30,DT:60, 气 体 压 力 :48.6psi); 柱 温 : 室 温 供 试 品 溶 液 的 制 备 2kg 蚕 沙 用 离 子 水 6L, 调 ph3.0,40~50 保 温 3 小 时, 过 滤 ; 滤 渣 同 法 再 提 取 两 次, 合 并 三 次 滤 液, 减 压 浓 缩 至 约 2.4L, 静 置 过 夜,10000rpm 离 心 20min, 保 留 上 清 液 取 上 清 液 过 阳 离 子 交 换 树 脂 柱, 以 50% 乙 醇 和 去 离 子 水 依 次 洗 尽 不 吸 附 的 杂 质, 再 采 用 0.5mol/L 氨 水 溶 液 洗 脱, 收 集 α- 糖 苷 酶 抑 制 活 性 检 测 阳 性 部 分, 减 压 蒸 去 氨 水, 得 到 9.7g 深 棕 色 浸 膏 取 9.3g 浸 膏 经 70g 硅 胶 吸 附 脱 色, 无 水 乙 醇 洗 脱, 减 压 蒸 干 后, 得 蚕 沙 总 生 物 碱 提 取 物 3.2g(0.30%), 将 其 溶 解, 做 制 备 用 蚕 沙 提 取 液 中 生 物 碱 成 分 的 HPLC 法 分 离 纯 化 将 上 述 供 试 品 溶 液 以 所 选 色 谱 条 件 进 行 分 离, 谱 图 如 图 1: 分 离 得 到 干 燥 固 体 物 质 : 化 合 物 A(119.5mg) 和 化 合 物 B(20mg) 图 1 供 试 品 溶 液 HPLC 图 谱 基 金 项 目 : 国 家 科 技 重 大 专 项 项 目 (2009zx09103) 作 者 简 介 : 亓 晖 (1985-), 女, 山 东 人, 硕 士 研 究 生, qihui1985@126.com 35

41 通 讯 联 系 人 : 朱 元 元, 女, 副 教 授, zhuyy@nankai.edu.cn 1.3 结 构 鉴 定 对 化 合 物 A 和 B 做 MS 1 H-NMR 和 13 C-NMR 分 析 : 化 合 物 A: 白 色 固 体 ;ESI-MSm/z [M+H] + ; 1 H-NMR(300MHz,D 2O) δ3.236(9h, s),3.877(2h,s); 13 C-NMR(75MHz,D 2O):δ (C=O),68.907(CH 2),55.077(CH 3 3) 碳 谱 及 氢 谱 数 据 与 文 献 报 道 的 甜 菜 碱 数 据 ) 一 致 [4], 故 确 定 结 构 为 1- 羧 基 -N,N,N- 三 甲 基 乙 内 酯, 亦 称 甜 菜 碱, 结 构 如 图 2 所 示 化 合 物 B: 白 色 晶 体,mp 178 ;ESI-MS m/z:164 [M+H] + ; 1 H-NMR (D2O, 300 MHz) δ: (3H, m, 2H-6; H-3), (3H, m, H-2;H-4;H-1e), 3.09 (1H, dd, H-1a), 2.86 (1H, t, H-5); 13 C-NMR (D2O, 75MHz) δ:76.2 (C-3), 67.7 (C-4), 66.9 (C-2), 59.9 (C-6), 57.7 (C-5), 45.8 [5] (C-1) 以 上 数 据 与 DNJ 标 准 品 及 其 文 献 值 相 符, 确 认 该 化 合 物 为 DNJ, 结 构 如 图 3 所 示 CH 3 O H 2 讨 论 CH 3 N + CH 2 COO - N H H O CH 3 H O O H 图 2 图 色 谱 柱 的 选 择 蚕 沙 生 物 碱 成 分 分 子 极 性 较 大, 采 用 常 规 的 反 相 C18 色 谱 柱 无 法 分 析 为 此 选 择 了 磺 酸 基 柱, 效 果 较 好, 且 有 合 理 的 保 留 时 间 (<15min) 2.2 色 谱 条 件 的 选 择 实 验 探 索 得 知 当 流 动 相 为 水 - 冰 醋 酸 - 三 乙 胺 (1000:1:1,V/V/V) 时, 分 离 效 果 较 好 且 峰 形 对 称, 但 三 乙 胺 的 后 处 理 困 难, 难 以 得 到 纯 净 化 合 物, 因 此 改 用 有 挥 发 性 的 氨 水 对 流 动 相 ( 水 - 冰 醋 酸 - 氨 水 ) 配 比 进 行 考 察, 发 现 配 比 为 水 - 冰 醋 酸 - 氨 水 (1000:0.25:0.25) 时 保 留 时 间 分 离 效 果 重 复 性 均 较 理 想 2.3 检 测 器 的 选 择 对 蚕 沙 生 物 碱 成 分 进 行 紫 外 扫 描, 发 现 紫 外 吸 收 很 弱, 同 时 考 虑 实 验 室 条 件, 采 用 通 用 型 检 测 器 - 蒸 发 光 光 检 测 器 (ELSD) 参 考 文 献 : [1] Bollen M,Vandebreck A,Stalmans W,etal. [J]. Biochem Pharmacol,1988,37(5) :905~909 [2] Arai M,Minatoguchi S,Takemure G,etal. [J]. Circulation, 1998, 97(13): [3] 周 光 雄, 阮 杰 武, 黄 关 燕 等.[J]. 中 药 材.2007,30(11): [4] 刘 新 亚, 马 龙, 堵 年 生 等.[J]. 西 北 药 学 杂 志.2004,19(2):63-64 [5] Asano N, Tomioka E, Kizu H, etal. [J]. Carbohydr Res, 1994, 253: Alkaloid Constituents from Silkworm Dropping by HPLC-ELSD Qi Hui, Zhang Ye-yun, Liu Xin-lai, Zhao Hui, Wang Peng, Hua Tong, ZhuYuan-yuan* (College of Pharmacy, Nankai University, Tianjin , China) Abstract: Objective: To extract and isolate chemical constituents from the total alkaloids of silkworm dropping(can Sha). Methods: Chemical constituents were isolated by HPLC-ELSD, ion-exchange resin. The structures of the isolated compounds were determined by spectral means. Results: Two compounds were isolated and identified as Betaine (A), DNJ (B). Key words: Silkworm dropping(can Sha); Alkaloid; Betaine; DNJ; HPLC-ELSD. 36

42 液 相 色 谱 测 定 食 品 中 的 七 种 添 加 剂 张 静 1, 于 洁 1, 高 秀 谦 1, 寇 登 民 2 (1. 天 津 市 北 辰 区 产 品 质 量 监 督 检 验 所, 天 津 南 开 大 学, 天 津 ) 建 立 了 七 种 食 品 添 加 剂 的 液 相 色 谱 检 测 方 法, 确 立 了 分 析 测 试 条 件, 确 定 了 每 种 添 加 剂 的 检 出 限 线 性 相 关 系 数 线 性 范 围 添 加 回 收 率 及 精 密 度 食 品 添 加 剂 作 为 食 品 工 业 中 不 可 或 缺 的 重 要 辅 料, 作 为 食 品 工 业 中 不 能 缺 少 的 重 要 部 分, 食 品 安 全 问 题 越 来 越 受 到 重 视, 但 影 响 人 们 健 康 问 题 的 食 品 事 件 频 发, 尤 其 是 食 品 添 加 剂 的 违 法 超 标 超 范 围 使 用 问 题 仍 很 突 出, 因 此 对 食 品 添 加 剂 进 行 定 性 定 量 检 测 便 显 得 尤 为 重 要 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 与 试 剂 高 效 液 相 色 谱 仪 ( 配 紫 外 检 测 器 ):LC-10A, 岛 津 ( 苏 州 ) 仪 器 有 限 公 司 电 子 分 析 天 平 :FA2004, 上 海 精 科 天 平 厂 酸 度 计 :PHS-3C, 上 海 精 密 科 学 仪 器 有 限 公 司 超 声 波 :HS3120, 天 津 恒 奥 科 技 有 限 公 司 组 织 捣 碎 匀 浆 机 :A-88, 江 苏 省 金 坛 市 医 疗 仪 器 厂 苯 甲 酸 山 梨 酸 糖 精 钠 柠 檬 黄 日 落 黄 胭 脂 红 苋 菜 红 标 准 物 质 均 购 于 国 家 标 准 物 质 中 心 ; 甲 醇 ( 色 谱 纯 ) 乙 酸 铵 ( 分 析 纯 ) 溴 化 四 丁 胺 ( 分 析 纯 ) 氨 水 ( 分 析 纯 ) 乙 酸 ( 分 析 纯 ) 1.2 分 析 条 件 色 谱 柱 :Luna C18(2),5µm, mm, 广 州 菲 罗 门 科 学 仪 器 有 限 公 司 流 动 相 : 甲 醇 : 乙 酸 铵 : 溴 化 四 丁 胺 =35:65:4; 流 速 :1ml/min 检 测 波 长 :230nm 柱 温 :30 进 样 体 积 :10µl 1.3 样 品 处 理 液 体 样 品 : 准 确 吸 取 摇 匀 后 的 样 品 10ml, 用 氨 水 或 乙 酸 调 PH 值 为 6, 用 PH 值 为 6 的 水 定 容 至 100ml( 必 要 时 进 行 离 心 分 离 ), 经 0.45µm 水 膜 过 滤, 滤 液 备 用 固 体 样 品 : 取 一 定 量 混 合 均 匀 后 的 样 品 在 组 织 捣 碎 匀 浆 机 中 捣 碎, 准 确 称 取 捣 碎 后 的 样 品 5g( 精 确 至 0.1mg), 用 PH 值 为 6 的 水 定 容 至 100ml, 超 声 提 取 5min, 经 0.45µm 水 膜 过 滤, 滤 液 备 用 1.4 标 准 溶 液 配 制 七 种 添 加 剂 分 别 准 确 称 取 g 标 准 品, 分 别 定 容 于 100ml 容 量 瓶 中 ( 山 梨 酸 用 20g/L 碳 酸 氢 钠 溶 液 5ml 加 热 溶 解 ), 加 水 定 容 至 刻 度, 配 成 1mg/ml 的 标 准 储 备 液 分 别 吸 取 各 标 准 储 备 液 1ml 2ml 3ml 4ml 5ml 于 100ml 容 量 瓶 中, 加 水 定 容 至 刻 度, 制 成 浓 度 为 mg/ml 系 列 混 合 标 准 溶 液 2 结 果 与 讨 论 2.1 工 作 曲 线 的 绘 制 线 性 范 围 和 检 出 限 本 方 法 采 用 外 标 法 进 行 定 量, 在 选 定 色 谱 条 件 下, 将 1.4 中 配 制 的 标 准 系 列 标 准 溶 液 分 别 进 样 10µl 于 液 相 色 谱 仪 中, 以 浓 度 (mg/ml) 为 横 坐 标, 以 其 相 应 的 峰 面 积 (µv s) 37

43 为 纵 坐 标, 作 标 准 工 作 曲 线 七 种 添 加 剂 谱 图 如 图 1 图 1 七 种 添 加 剂 分 离 色 谱 图 表 1 各 标 准 物 质 的 保 留 时 间 检 出 限 及 线 性 相 关 系 数 序 号 标 准 物 质 名 称 保 留 时 间 (min) 检 出 限 (mg/ml) 线 性 相 关 系 数 1 柠 檬 黄 苋 菜 红 糖 精 钠 苯 甲 酸 山 梨 酸 日 落 黄 胭 脂 红 注 : 检 出 限 为 信 噪 比 即 S:N=3:1 时 的 检 出 限 2.2 回 收 率 及 精 确 度 的 测 定 检 测 方 法 的 一 项 重 要 指 标 就 是 添 加 回 收 率 和 精 密 度 添 加 回 收 率 的 计 算 方 法 有 多 种, 本 文 采 用 的 计 算 方 法 是, 以 添 加 量 作 为 分 母, 以 添 加 后 检 测 到 的 量 减 去 空 白 样 品 检 测 到 的 量 为 分 子 其 计 算 公 式 如 下 :R=(Da-Db)/Ca R- 添 加 回 收 率 Da- 添 加 标 样 后 所 检 测 到 的 添 加 剂 的 量 Db- 样 品 本 底 检 测 到 的 添 加 剂 的 量 Ca- 添 加 标 样 的 量 38

44 表 2 样 品 添 加 回 收 率 及 精 确 度 序 号 标 准 物 质 名 称 回 收 率 (%) 平 均 回 收 率 (%) 精 密 度 (%) 1 柠 檬 黄 苋 菜 红 糖 精 钠 苯 甲 酸 山 梨 酸 日 落 黄 胭 脂 红 实 际 样 品 的 检 测 我 们 选 用 实 验 室 已 有 的 样 品 进 行 实 际 检 测, 主 要 选 择 食 醋 话 梅 火 腿 肠 桃 汁 饮 料 玉 米 糖 ( 凝 胶 糖 果 ) 五 种 样 品 进 行 了 检 测, 每 种 样 品 准 确 称 取 混 合 均 匀 的 样 品 5g, 样 品 处 理 方 法 参 照 1.3 表 3 实 际 样 品 的 检 测 结 果 ( 按 本 课 题 实 验 方 法 检 测 ) 样 品 名 柠 檬 黄 苋 菜 红 糖 精 钠 苯 甲 酸 山 梨 酸 日 落 黄 胭 脂 红 食 醋 未 检 出 未 检 出 未 检 出 0.45 未 检 出 未 检 出 未 检 出 话 梅 未 检 出 未 检 出 未 检 出 未 检 出 未 检 出 未 检 出 火 腿 肠 未 检 出 未 检 出 未 检 出 0.14 未 检 出 未 检 出 未 检 出 桃 汁 饮 料 未 检 出 未 检 出 未 检 出 未 检 出 未 检 出 未 检 出 玉 米 糖 未 检 出 未 检 出 未 检 出 未 检 出 未 检 出 未 检 出 3 结 论 本 实 验 利 用 高 效 液 相 色 谱 仪 测 定 了 食 品 中 添 加 剂, 主 要 包 括 柠 檬 黄 苋 菜 红 日 落 黄 胭 脂 红 糖 精 钠 苯 甲 酸 山 梨 酸 等 七 种 食 品 添 加 剂 通 过 实 验, 确 立 了 本 课 题 的 分 析 测 试 条 件 ; 确 定 了 每 种 添 加 剂 的 检 出 限 线 性 相 关 系 数 线 性 范 围 添 加 回 收 率 及 精 密 度 本 项 目 检 测 方 法 较 国 家 标 准 方 法, 在 检 测 时 间 上 节 省 了 60% 以 上, 有 机 溶 剂 的 使 用 量 也 节 省 了 大 约 60% 因 此, 这 种 检 测 方 法 不 但 提 高 了 检 测 效 率, 节 省 检 测 费 用 ; 另 一 方 面, 有 机 溶 剂 的 减 少 使 用, 减 低 了 废 液 处 理 的 压 力 和 费 用, 对 改 善 环 境 保 护 环 境 也 将 有 一 定 的 促 进 作 用 39

45 应 用 可 逆 加 成 - 链 转 移 聚 合 法 合 成 四 环 素 分 子 印 迹 聚 合 物 微 球 及 表 征 韩 建 坊 1 2, 董 襄 朝 (1. 西 安 电 子 科 技 大 学 理 学 院, 西 安 ;2. 南 开 大 学 化 学 学 院, 天 津 ) 1 引 言 [1] 四 环 素 类 ( tetracyclines, TCs) 为 广 谱 抗 菌 药, 在 促 进 畜 禽 生 长 疾 病 防 治 等 方 面 有 着 重 要 作 用, 因 此 被 广 泛 用 于 预 防 和 治 疗 畜 禽 疾 病 由 于 该 类 药 物 的 使 用 不 合 理 及 滥 用 容 易 导 致 在 食 品 中 存 在 四 环 素 类 药 物 的 残 留, 人 类 长 期 摄 入 含 四 环 素 类 抗 生 素 残 留 的 食 品 后, 会 对 健 康 构 成 潜 在 危 害, 对 于 其 在 食 品 中 的 残 留 进 行 检 测 及 控 制 非 常 必 要 分 子 印 迹 聚 合 物 (molecularly imprinted polymer, MIP) [2] 是 指 制 备 对 某 一 特 定 的 目 标 分 子 ( 也 称 模 板 分 子 或 印 迹 分 子 ) 具 有 特 异 预 定 选 择 性 的 高 分 子 化 合 物 分 子 印 迹 聚 合 物, 在 复 杂 体 系 固 相 分 离 提 取 中 显 示 了 巨 大 的 优 越 性 [3] 可 逆 加 成 - 链 转 移 (reversible addition-fragmentation chain transfer, RAFT) 聚 合 法 是 一 种 活 性 / 可 控 自 由 基 聚 合 法 应 用 这 种 方 法 可 以 对 于 聚 合 产 物 的 分 子 量 分 子 量 分 布 序 列 结 构 进 行 很 好 的 控 制, 另 外, 聚 合 链 具 有 活 性 末 端, 在 补 加 同 种 或 异 种 单 体 时 还 能 进 一 步 反 应, 因 而 能 够 制 备 嵌 段 接 技 星 形 或 超 技 化 聚 合 物 将 RAFT 聚 合 法 应 用 于 分 子 印 迹 微 球 的 制 备, 有 利 于 提 高 粒 径 均 匀 性, 也 有 利 于 微 球 表 面 的 进 一 步 修 饰 本 实 验 用 RAFT 方 法 合 成 了 以 四 环 素 为 模 板 分 子 的 分 子 印 迹 聚 合 物 微 球, 并 对 其 吸 附 性 及 选 择 性 进 行 了 研 究 2 实 验 部 分 [4] 链 转 移 试 剂 二 硫 代 苯 甲 酸 苯 乙 基 酯 (Cumyl dithiobenzoate,cdb) 的 合 成 : 先 用 格 氏 试 剂 与 二 硫 化 碳 在 四 氢 呋 喃 中 反 应, 产 物 酸 化 后 制 得 双 硫 代 羧 酸 ; 用 合 成 的 双 硫 代 羧 酸 与 α- 甲 基 苯 乙 烯 在 四 氯 化 碳 中 反 应, 产 物 经 多 次 提 纯 后 制 得 链 转 移 试 剂 CDB 四 环 素 分 子 印 迹 聚 合 物 微 球 合 成 : 称 取 0.2 mmol 的 四 环 素 溶 于 一 定 体 积 乙 腈 中, 定 量 加 入 功 能 单 体 甲 基 丙 烯 酸 (methacrylic acid, MAA) 超 声 震 荡 5 min, 定 量 加 入 交 联 剂 甲 基 丙 烯 酸 乙 二 醇 酯 (ethylene dimethacrylate, EDMA) 引 发 剂 AIBN 和 链 转 移 剂 CDB 氮 气 除 氧 后 接 在 旋 转 蒸 发 仪 上, 转 速 20 rpm,60 下 聚 合 24 h 用 乙 酸 / 甲 醇 溶 液 索 式 提 取 除 去 模 板 分 子, 再 用 甲 醇 提 取 后 真 空 干 燥, 得 到 TC-MIP 非 印 迹 聚 合 物 (non-imprinted polymer, NIP) 以 相 同 的 条 件 ( 除 了 不 加 模 板 分 子 ) 下 合 成 分 别 将 TC-MIP 和 NIP 以 干 法 填 装 入 液 相 色 谱 柱 ( mm) 中, 进 行 色 谱 测 定 流 动 相 : 甲 醇 ; 流 速 :1.0 ml/min; 检 测 波 长 :350 nm 以 丙 酮 测 定 死 时 间, 分 别 测 定 四 环 素 土 霉 素 金 霉 素 强 力 霉 素 的 保 留 因 子 3 结 果 与 讨 论 四 环 素 类 药 物 的 结 构 见 图 1 40

46 图 1 四 环 素 及 其 类 似 物 结 构 用 色 谱 法 测 得 的 保 留 因 子 和 印 迹 因 子 (IF) 列 于 表 1 表 1. 印 迹 聚 合 物 和 非 印 迹 聚 合 物 对 四 环 素 及 其 类 似 物 的 结 合 能 力 比 较 化 合 物 TC-MIP 保 留 因 子 (k) NIP IF (ktc-mip / knip) 四 环 素 土 霉 素 强 力 霉 素 金 霉 素 从 表 中 可 以 看 出, 相 对 于 非 印 迹 聚 合 物 (NIP), 印 迹 聚 合 物 (TC-MIP) 对 四 环 素 类 药 物 保 留 较 强, 模 板 分 子 的 印 迹 因 子 最 大, 说 明 印 迹 聚 合 物 有 明 显 印 迹 效 果 另 外, 在 TC-MIP 和 NIP 上, 强 力 霉 素 和 金 霉 素 的 保 留 都 强 于 四 环 素, 而 土 霉 素 的 保 留 较 弱, 这 种 趋 势 相 同 的 现 象 说 明 非 特 异 性 结 合 在 印 迹 聚 合 物 中 也 有 一 定 作 用, 而 非 特 异 性 结 合 的 强 弱 和 药 物 结 构 及 其 与 poly(maa-edma) 骨 架 作 用 力 有 关 参 考 文 献 : [1] 仉 文 升, 李 安 良. 药 物 化 学 ( 三 ) [M]. 高 等 教 育 出 版 社. 1999,pp [2] Mosbach K, Mayes A G. 213th ACS National Meeting & Exposition Programme. 1997, pp48-61 [3] Farmer S C, Patten T E. J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem., 2000(40): [4] Le T P, Moad G, Rizzardo E. PCT Int Appl[p]. WO: Al, 1998, pp

47 快 速 亲 和 毛 细 管 电 泳 法 测 定 普 罗 帕 酮 和 牛 血 清 白 蛋 白 之 结 合 常 数 张 勃, 包 建 民 ( 天 津 大 学 药 物 科 学 与 技 术 学 院, 天 津 ) 亲 和 毛 细 管 电 泳 法 (Affinity Capillary Electrophoresis,ACE) [1-3] 是 研 究 蛋 白 质 和 药 物 结 合 的 一 种 常 用 模 式 它 主 要 包 括 两 种 研 究 方 法 [4] : 一 种 称 为 LR 法, 是 以 蛋 白 为 缓 冲 液 添 加 剂, 以 药 物 为 进 样 样 品, 测 定 药 物 在 含 有 不 同 浓 度 蛋 白 的 缓 冲 液 中 的 迁 移 时 间 变 化 ; 另 一 种 称 为 RL 法, 是 以 药 物 为 缓 冲 液 添 加 剂, 以 蛋 白 为 进 样 样 品, 测 定 蛋 白 在 含 有 不 同 浓 度 药 物 的 缓 冲 液 中 的 迁 移 时 间 变 化 迁 移 时 间 的 变 化 是 判 断 药 物 与 蛋 白 是 否 发 生 结 合 作 用, 以 及 计 算 结 合 常 数 的 依 据 但 是 迁 移 时 间 往 往 受 到 毛 细 管 使 用 的 时 间 内 表 面 的 化 学 性 质 使 用 前 的 预 处 理 毛 细 管 柱 温 等 因 素 的 影 响 [5], 每 次 测 定 都 可 能 有 较 大 差 异 Williams 和 Vigh [6] 提 出 的 快 速 测 定 淌 度 法 可 以 减 少 这 些 影 响, 它 可 以 准 确 快 速 地 测 定 电 渗 淌 度 和 样 品 的 电 泳 淌 度 目 前 该 法 广 泛 用 于 涂 层 毛 细 管 电 泳 [7] 非 水 毛 细 管 电 泳 [8] 的 电 渗 流 测 定 pka 值 [9] 测 定 等 在 此, 我 们 把 这 种 快 速 测 定 淌 度 法 应 用 到 ACE 中 来, 并 以 抗 心 律 失 常 药 普 罗 帕 酮 和 牛 血 清 白 蛋 白 (BSA) 为 研 究 对 象, 分 别 采 用 LR 和 RL 法, 研 究 药 物 ( 蛋 白 ) 在 含 有 不 同 浓 度 蛋 白 ( 药 物 ) 中 电 泳 淌 度 的 变 化, 从 而 计 算 出 二 者 的 结 合 常 数 再 通 过 与 传 统 紫 外 分 光 光 度 法 的 测 定 结 果 作 对 比, 得 出 此 法 的 准 确 定 和 可 靠 性 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 与 试 剂 Beckman P/ACE 2050 型 毛 细 管 电 泳 仪 ( 美 国 Beckman 公 司 ), 配 置 紫 外 检 测 器,P/ACE Station 数 据 采 集 工 作 站, 未 涂 层 熔 融 石 英 毛 细 管 柱 ( 内 径 75 μm, 外 径 360 μm, 河 北 永 年 锐 沣 色 谱 器 件 有 限 公 司 ), 紫 外 分 光 光 度 计 ( 天 津 市 普 瑞 斯 仪 器 有 限 公 司 ); BSA( 长 沙 欧 迈 生 物 科 技 有 限 公 司 ), 普 罗 帕 酮 ( 常 州 制 药 厂 有 限 公 司 ) N,N- 二 甲 基 甲 酰 胺, 磷 酸 盐 氢 氧 化 钠 等 化 学 药 品 均 为 分 析 纯, 去 离 子 水 1.2 毛 细 管 电 泳 条 件 和 实 验 方 法 毛 细 管 柱 总 长 27 cm, 有 效 长 度 20 cm, 电 泳 缓 冲 液 为 20 mm 磷 酸 盐 缓 冲 液 (ph 7.4), 紫 外 检 测 波 长 为 214 nm, 采 用 气 压 进 样 方 式 测 定 电 泳 淌 度 时 以 LR 法 为 例, 以 含 不 同 浓 度 蛋 白 的 缓 冲 液 作 为 运 行 缓 冲 液, 先 进 样 含 DMF 的 药 物 样 品 3 s, 气 压 推 15 s, 加 8 KV 电 压 运 行 一 段 时 间, 最 后 再 进 样 0.1% DMF 3 s, 进 完 样 直 接 气 压 推 出 每 个 缓 冲 液 条 件 下 平 行 测 定 三 次 每 次 进 样 之 前 用 0.1 M NaOH 和 缓 冲 液 冲 洗 毛 细 管 各 2 min 2 结 果 与 讨 论 2.1 快 速 测 定 淌 度 法 的 重 现 性 我 们 对 比 了 快 速 测 定 淌 度 法 和 传 统 计 算 淌 度 的 方 法, 新 方 法 测 定 的 电 渗 淌 度 相 对 标 准 偏 差 (RSD%=0.46,n=4) 明 显 优 于 传 统 方 法 (RSD%=1.17,n=4) 普 罗 帕 酮 (RSD%=1.06, n=4) 和 BSA(RSD%=1.25,n=4) 的 电 泳 淌 度 值 也 有 较 高 的 重 现 性 基 金 项 目 : 天 津 市 科 技 发 展 计 划 项 目 (08CZKFSH00500) 通 讯 作 者 : 包 建 民, jbao007@gmail.com 42

48 2.2 快 速 测 定 淌 度 法 测 定 普 罗 帕 酮 和 BSA 结 合 常 数 (1) LR 法 普 罗 帕 酮 是 一 种 弱 碱 性 药 物, 在 ph 7.4 缓 冲 液 体 系 中 带 正 电 因 此, 在 正 电 场 中 电 泳 速 度 最 快, 第 一 个 出 峰 第 二 和 第 三 个 峰 均 是 DMF 当 缓 冲 液 中 加 入 BSA 后, 随 着 BSA 浓 度 的 增 加, 缓 冲 液 粘 度 增 加, 样 品 出 峰 时 间 推 后 由 于 药 物 本 身 与 结 合 物 的 电 泳 淌 度 不 一 样, 造 成 普 罗 帕 酮 峰 形 变 矮, 展 宽 根 据 每 组 三 个 峰 的 出 峰 时 间, 计 算 出 待 测 样 品 的 电 泳 淌 度, 由 Scatchard 方 程, 计 算 得 到 待 测 物 质 的 电 泳 淌 度 药 物 和 蛋 白 质 的 结 合 曲 线 y = x , 根 据 所 得 直 线 的 截 距 和 斜 率, 即 可 求 出 普 罗 帕 酮 与 BSA 的 结 合 常 数 K b 为 图 1 普 罗 帕 酮 和 BSA 结 合 图, 左 图 LR 法, 图 中 三 个 峰 1. 普 罗 帕 酮,2. 3. DMF; 右 图 RL 法, 图 中 3 个 峰 分 别 为 DMF,2. BSA (2) RL 法 类 似 的, RL 法 中 以 BSA 和 DMF 为 样 品, 也 出 现 三 个 峰 由 于 BSA 在 该 缓 冲 液 条 件 下 带 负 电, 因 此 出 峰 位 于 两 个 DMF 峰 之 间 随 着 缓 冲 液 中 普 罗 帕 酮 浓 度 增 加, 电 渗 流 减 小, 出 峰 时 间 延 长 但 是 BSA 受 到 缓 冲 液 中 普 罗 帕 酮 作 用, 出 峰 时 间 相 对 提 前, 与 峰 一 距 离 缩 短 由 于 和 结 合 物 淌 度 的 差 异,BSA 峰 高 变 低, 峰 变 宽 由 Scatchard 方 程, 得 到 药 物 和 蛋 白 质 的 结 合 曲 线 y = x , 普 罗 帕 酮 与 BSA 的 结 合 常 数 K 为 紫 外 光 谱 法 测 定 普 罗 帕 酮 和 BSA 的 结 合 常 数 b 图 2 普 罗 帕 酮 和 BSA 结 合 的 紫 外 光 谱 图, 样 品 为 BSA 与 不 同 浓 度 的 普 罗 帕 酮 的 混 合 溶 液, 从 a 到 f, 普 罗 帕 酮 浓 度 依 次 为 34.99,55.98,93.3,139.95,186.6 和 μm 43

49 为 了 验 证 新 方 法 的 测 试 结 果, 我 们 同 时 采 用 紫 外 分 光 光 度 法 考 察 了 药 物 对 BSA 主 要 特 征 吸 收 带 228 nm 处 吸 收 峰 的 影 响, 并 测 定 了 普 罗 帕 酮 与 BSA 的 结 合 常 数 当 固 定 BSA 浓 度 时, 加 入 一 系 列 不 同 浓 度 的 普 罗 帕 酮 溶 液,37 条 件 下 孵 育 半 小 时 BSA 在 228 nm 处 的 吸 收 峰 随 着 药 物 浓 度 的 增 加, 体 系 的 吸 收 光 谱 呈 现 明 显 的 减 色 效 应 普 罗 帕 酮 和 BSA 的 结 合 常 数 为 , 与 亲 和 毛 细 管 电 泳 法 测 定 的 结 合 常 数 非 常 吻 合, 充 分 验 证 了 新 方 法 3 结 论 快 速 测 定 淌 度 法 消 除 了 毛 细 管 内 温 度 不 均 一, 以 及 电 渗 流 变 化 对 淌 度 测 定 的 影 响, 可 以 准 确 的 精 确 的 测 定 电 渗 流 和 阳 离 子 阴 离 子 的 有 效 电 泳 淌 度 与 常 规 方 法 相 比, 大 大 缩 [6] 短 了 测 定 时 间 将 快 速 测 定 淌 度 法 应 用 在 亲 和 毛 细 管 电 泳 中, 不 仅 能 够 准 确 测 定 出 含 有 不 同 添 加 剂 浓 度 的 缓 冲 液 中 样 品 的 电 泳 淌 度, 分 析 时 间 也 大 大 缩 短 通 过 对 比 亲 和 毛 细 管 电 泳 的 两 种 方 法 ( LR 法 和 RL 法 ), 以 及 传 统 测 定 结 合 常 数 的 紫 外 光 谱 法, 三 种 方 法 下 测 定 的 普 罗 帕 酮 和 牛 血 清 白 蛋 白 结 合 常 数 非 常 接 近, 充 分 验 证 了 新 方 法 的 可 行 性 和 准 确 性 准 确 的 实 验 结 果 快 速 的 分 析 过 程, 使 得 快 速 测 定 淌 度 法 能 够 成 为 测 定 蛋 白 结 合 的 有 效 工 具 参 考 文 献 : [1] Gomez FA, Chen JK, Tanaka A, Schreiber SL, Whitesides GM. [J]. J Org Chem, 1994, 59(10): [2] Avila LZ, Chu Y, Whitesides GM. [J]. J Med Chem, 1993, 36(1) : [3] Chu Y, Avila LZ, Biebuyck HA, Whitesides GM. [J]. J Med Chem, 1992, 35(15): [4] Chu YH, Avila LZ, Biebuyck HA. [J]. J Med Chem, 1992, 35: [5] Xie Y, Lin M, Zhang ZX, An DK. [J]. Progress of China Pharmaceutical Sciences, 1999, 23(5): [6] Williams BA, Vigh G. [J]. Fast Anal Chem, 1996, 68: [7] Doherty E, Meagher RJ, Albarghouthi MN, Barron AE. [J]. Electrophoresis, 2003, 24(1-2): [8] Porras SP, Riekkola ML, Kenndler E. [J]. Journal of chromatography A, 2001, 905(1-2): [9] Cantu MD, Hillebrand S, Carrilho E. [J]. Journal of chromatography A, 2005, 1068: A Fast Means of Determining the Protein Binding Constant by Affinity Capillary Electrophoresis ZHANG Bo, BAO James J.* (School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University, Tianjin , China) Abstract: The fast means of mobility determination has been applied to affinity capillary electrophoresis (ACE) and used to determine protein-drug binding constant. Based on the principle of ACE, the binding constant between propafenone and bovine serum albumin (BSA) was determined by using a fast and accurate mobility determination method. The constants were 1.41*10 3 and 1.14*10 3 in the cases of LR and RL, respectively. By using the traditional ultraviolet absorption method as a comparison ( ), the feasibility and accuracy of this method is verified. It has resolved the inaccuracy problem in traditional ACE methods, in which the electrophoretic mobility was calculated by measuring the migration time directly. Key words: Affinity capillary electrophoresis; Fast and accurate mobility determination method; Binding constant; Propafenone; Bovine serum albumin. 44

50 无 机 - 有 机 聚 合 物 整 体 柱 的 制 备 及 其 在 蛋 白 分 离 方 面 的 应 用 杨 更 亮 1, 2, 程 佳 1, 2, 白 立 改 1, 2 (1. 河 北 省 药 物 质 量 研 究 与 控 制 重 点 实 验 室, 河 北, 保 定 ; 2. 河 北 大 学 药 学 院, 河 北, 保 定 ) 色 谱 分 析 是 目 前 最 为 活 跃 的 分 析 化 学 分 支 学 科 之 一, 无 论 从 技 术 到 理 论, 到 各 种 分 离 模 式, 还 是 在 各 个 科 学 领 域 内 的 应 用 都 得 到 了 突 飞 猛 进 的 进 展 高 效 液 相 色 谱 作 为 一 种 有 效 的 分 离 手 段, 在 生 物 技 术 产 品 的 制 备 中 发 挥 着 十 分 重 要 的 作 用 在 整 个 高 校 液 相 色 谱 分 析 体 系 中, 色 谱 柱 是 整 个 色 谱 系 统 的 核 心 而 聚 合 物 整 体 柱 制 备 方 法 简 单, 具 有 高 机 械 强 度, 高 渗 透 性, 可 以 对 生 物 大 分 子 进 行 快 速 高 效 高 通 量 分 离 分 析, 作 为 一 种 新 型 分 离 介 质, 正 朝 着 品 种 多 样 化 性 能 高 效 化 的 方 向 发 展 在 本 研 究 中, 一 个 基 于 原 子 转 移 自 由 基 聚 合 [1-2] 的 新 的 无 机 - 有 机 聚 合 物 整 体 柱 被 成 功 研 制, 并 且 成 功 用 于 蛋 清 中 卵 白 蛋 白 的 分 离 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 与 试 剂 高 效 液 相 色 谱 系 统 ( 美 国 Agilent 1100):UV-1100 紫 外 可 变 波 长 检 测 器, 真 空 在 线 脱 气 机, 四 元 泵, 进 样 器 ;Agilent 化 学 工 作 站 ;SZ-97 自 动 三 重 纯 水 蒸 馏 器 ( 上 海 亚 荣 生 化 仪 器 厂 );HH-601 超 级 恒 温 水 浴 ( 江 苏 荣 华 仪 器 制 造 有 限 公 司 ) FTIR-8400S 红 外 光 谱 仪 (SHIMADZU) 甲 基 丙 烯 酸 缩 水 甘 油 酯, 乙 二 醇 二 甲 基 丙 烯 酸 酯, 十 二 醇 甲 醇 氯 化 亚 铁 四 氯 化 碳 ( 天 津 市 科 密 欧 化 学 试 剂 有 限 公 司 ); 所 有 试 剂 均 为 分 析 纯, 实 验 中 所 用 水 均 为 三 次 蒸 馏 水 所 有 溶 液 及 流 动 相 进 入 色 谱 系 统 前 均 经 过 0.45 µm 微 孔 滤 膜 过 滤 1.2 聚 合 物 整 体 柱 的 制 备 将 甲 基 丙 烯 酸 缩 水 甘 油 酯 乙 二 醇 二 甲 基 丙 烯 酸 酯 四 氯 化 碳 十 二 醇 氯 化 亚 铁 按 一 定 比 例 加 入 试 管 中, 超 声 30 分 钟 使 之 混 匀, 装 入 不 锈 钢 空 色 谱 柱 管, 两 端 密 封, 于 60 的 超 级 恒 温 水 浴 中 加 热 24 h 反 应 结 束 后 除 去 密 封 端, 连 接 上 柱 头 将 其 接 于 高 效 液 相 色 谱 泵 上, 用 甲 醇 将 致 孔 剂 和 未 反 应 的 试 剂 冲 出 即 得 到 无 机 - 有 机 复 合 物 整 体 柱 1.3 样 品 的 制 备 标 准 品 的 制 备 精 密 称 取 1.0 mg 卵 白 蛋 白, 用 超 纯 水 溶 解 使 标 准 品 浓 度 达 到 1.0mg/ml 实 际 样 品 的 制 备 选 用 从 超 市 购 买 的 新 鲜 鸡 蛋, 从 中 得 到 鸡 卵 清 将 鸡 蛋 清 用 磷 酸 缓 冲 液 以 1:4 的 体 积 比 稀 释, 然 后 超 声 波 处 理, 并 不 断 加 入 氯 化 钠 至 其 浓 度 达 到 0.5 mol/l 最 后 将 该 溶 液 在 4 下 以 rpm 离 心 30 min, 上 清 液 冷 藏 保 存 备 用 1.4 整 体 柱 的 柱 效 色 谱 介 质 的 柱 效 和 柱 体 均 匀 性 可 以 用 理 论 塔 板 高 度 (HETP) 来 评 价 实 验 分 别 选 用 BSA(2 mg/ml) 作 为 探 针 分 子,10 mm Tris-HCl,pH=7.6 的 缓 冲 液 作 为 流 动 相, 将 色 谱 柱 平 衡 后, 用 20 μl 的 进 样 器 进 样 利 用 探 针 分 子 在 非 保 留 条 件 下 进 样, 通 过 积 分 法 计 算 得 到 HETP 值 理 论 塔 板 高 度 (HETP) 计 算 公 式 [3] : 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 ( , ) 作 者 简 介 : 杨 更 亮 (1963), 男, 河 北 人, 教 授, 博 士 生 导 师,tel: ; ygl@hbu.edu.cn 45

51 HETP = L σ µ (1) 其 中,HETP-- 色 谱 柱 的 板 高 (mm);l-- 色 谱 柱 长 (mm);σ 2 -- 二 阶 中 心 矩 ;μ1-- 一 阶 原 点 矩 σ 2 = 2 t c( t) dt c( t) dt (2) µ 1 = tc( t) dt c( t) dt (3) 其 中,t-- 时 间 (s);c(t)-- 色 谱 柱 出 口 端 洗 脱 液 浓 度 (mg/ml) 1.5 色 谱 条 件 的 确 定 通 过 实 验 来 确 定 分 离 卵 白 蛋 白 的 富 集 流 动 相 与 洗 脱 流 动 相, 然 后 在 通 过 改 变 洗 脱 流 动 相 的 浓 度 及 酸 碱 度 来 优 化 色 谱 条 件 2 结 果 2.1 聚 合 物 整 体 柱 制 备 条 件 的 优 化 以 甲 基 丙 烯 酸 缩 水 甘 油 酯 为 单 体, 乙 二 醇 二 甲 基 丙 烯 酸 酯 为 交 联 剂, 十 二 醇 为 制 孔 剂, 甲 醇 为 溶 剂, 通 过 自 由 基 聚 合 制 备 整 体 柱 控 制 合 适 的 聚 合 条 件, 如 交 联 剂 及 致 孔 剂 的 比 例 致 孔 剂 的 组 成 引 发 剂 及 催 化 剂 的 量 等, 可 以 得 到 较 理 想 的 孔 径 100 %T FTIR Measurement 4C /cm 图 1 无 机 - 有 机 聚 合 物 整 体 柱 的 扫 描 电 镜 图 图 2 无 机 - 有 机 聚 合 物 整 体 柱 的 红 外 扫 描 图 2.2 样 品 分 离 的 色 谱 图 用 所 制 备 的 聚 合 物 整 体 柱 (50 4.6mm i.d.), 在 检 测 波 长 :280nm; 流 速 :1.0mL/min, 的 条 件 对 标 准 进 行 分 析, 所 得 色 谱 图 如 图 3: 46

52 3 讨 论 图 3 标 准 品 的 色 谱 图 该 无 机 - 有 机 聚 合 物 整 体 柱 的 制 备 利 用 了 原 子 转 移 自 由 基 聚 合 的 原 理, 并 首 次 采 用 四 氯 化 碳 与 氯 化 亚 铁 为 联 合 引 发 剂 合, 改 善 了 传 统 的 原 位 自 由 基 聚 合 的 链 转 移 链 终 止 所 导 致 的 分 子 量 分 布 范 围 宽 聚 合 物 不 均 匀 等 缺 点, 所 得 到 得 柱 体 结 构 均 匀, 机 械 强 度 良 好, 经 浸 泡 与 高 温 干 燥 后 柱 体 没 有 膨 胀 与 收 缩 现 象, 且 该 聚 合 物 整 体 可 对 蛋 白 进 行 快 速 高 效 的 分 离 分 析 有 一 定 的 继 续 研 究 与 应 用 价 值 参 考 文 献 : [1] F. Svec, J. Chromatography A, 1217 (2010) 902 [2] L. F. Zhang, Z. P. Cheng, S. P. Shi, Q. H. Li, X. L. Zhu, Polymer 49, (2008) 3054 [3] K. F. Du, D. Yang, Y. Sun, J. Chromatography A, 1163 (2007) 212. Preparation of a novel organic inorganic hybrid monolithic column and application in the separating of proteins Yang Geng-Liang 1.2, Cheng Jia 1.2, Bai Li-Gai 1.2 (1. College of Pharmacy, Hebei University, Baoding , China 2. Hebei Province Key Laboratory of Pharmaceutical Quality Control, Baoding , China) Abstract: As one effective separation method, the high performance liquid chromatography is playing the very vital role in the preparation of biological product. In the entire analysis system of HPLC, the chromatographic column is the core of the system. The preparation method of polymeric monolithic column is simple, and it has the characteristic of high mechanical strength, high permeability and fast separation of biological macromolecules. As a new separation medium, the developing direction of the polymeric monolithic is variety diversification and performance highly effective. In this study, a novel organic inorganic rod-shape hydrophobic interaction monolithic column has been prepared by atom transfer radical polymerization. Meanwhile, Albumin egg was separated from egg white by the organic inorganic monolithic column. Keywords: organic inorganic; ATRP; monolithic column; HPLC; separation protein 47

53 柱 前 衍 生 RP-HPLC 法 检 测 血 浆 中 ADMA 浓 度 的 研 究 及 临 床 应 用 董 茜, 张 和 顺 ( 天 津 市 泌 尿 外 科 研 究 所, 天 津 ) 建 立 一 种 反 相 高 效 液 相 色 谱 法 (RP-HPLC) 检 测 血 浆 中 不 对 称 二 甲 基 精 氨 酸 的 浓 度 采 用 Kromail C18 (5 µ m,250mm 4.6mm), 流 动 相 A 液 为 50mmol/L 磷 酸 盐 缓 冲 液 (ph6.5, 含 11% 的 乙 腈 ),B 液 为 50% 的 乙 腈 的 柱 子, 邻 苯 二 甲 醛 柱 前 衍 生, 柱 温 40, 流 速 1 ml/min 荧 光 检 测 波 长 为 EX 340nm, EM 455nm 研 究 结 果 显 示 ADMA 在 0.1~8 µ mol/l 范 围 内 有 良 好 的 线 性 关 系, 高 中 低 浓 度 平 均 回 收 率 均 大 于 90%, 日 内 日 间 RSD 小 于 6% 本 方 法 准 确 灵 敏, 适 用 于 血 浆 及 其 他 生 物 样 本 中 ADMA 浓 度 的 检 测 不 对 称 性 二 甲 基 精 氨 酸 (asymmetric dimethyearginine, ADMA) 在 体 内 的 生 理 作 用 是 通 过 抑 制 内 源 性 一 氧 化 氮 合 酶 (NOS) 的 活 性, 阻 止 内 皮 细 胞 一 氧 化 氮 (NO) 的 合 成, 导 致 血 管 内 皮 功 能 降 低 血 浆 ADMA 浓 度 的 变 化 与 血 管 内 皮 功 能 损 害 动 脉 粥 样 硬 化 脑 梗 死 高 血 压 高 脂 蛋 白 异 常 糖 尿 病 肾 功 能 衰 竭 等 血 管 性 病 变 的 严 重 程 度 密 切 相 关, 是 目 前 临 床 研 究 的 重 点 课 题 之 一, 倍 受 重 视 检 测 血 浆 中 ADMA, 多 采 用 邻 苯 二 甲 醛 (OPA) 柱 前 衍 生 的 高 效 液 相 色 谱 法,LC-MS 和 ELISA 等 方 法 [1,2] LC-MS 法 成 本 过 高 不 适 用 于 临 床 广 泛 使 用, 而 ELISA 法 灵 敏 度 过 低, 因 此 我 们 选 用 了 OPA 柱 前 衍 生 HPLC 法, 并 改 进 原 有 色 谱 条 件, 建 立 了 一 种 操 作 简 便 灵 敏 度 高 重 复 性 好 的 检 测 人 血 浆 中 ADMA 浓 度 的 方 法 1 仪 器 与 试 药 1.1 仪 器 Waters-600E 型 高 效 液 相 色 谱 仪 (Waters 公 司, 美 国 ),CTO-2A 柱 温 箱,RF-10Axl 荧 光 检 测 器 ( 岛 津 公 司, 日 本 ),Anastar 色 谱 工 作 站,AL104 电 子 天 平 ( 上 海 梅 特 勒 - 托 利 多 仪 器 公 司 ) 等 1.2 试 剂 ADMA 标 准 品 OPA 衍 生 试 剂 购 自 Avocado 公 司 ; 阳 离 子 交 换 树 脂 (CT-20,75 µ m) 购 自 天 津 南 开 大 学 化 工 厂 ; 甲 醇 乙 腈 均 为 色 谱 纯 ; 硼 砂 硼 酸 磷 酸 二 氢 钠 磷 酸 氢 二 钠 氢 氧 化 铵 等 均 为 分 析 纯, 购 自 天 津 市 化 学 试 剂 公 司 ;Milli-Q50 制 无 离 子 水 2 方 法 和 结 果 2.1 溶 液 的 配 制 ADMA 标 准 液 的 配 制 : 称 取 ADMA 10mg 用 10mmol/L HCl 定 容 至 10ml, 置 棕 色 瓶 -20 保 存 作 为 贮 备 液 吸 取 ADMA 贮 液 25 µ l, 用 水 定 容 至 10ml, 置 棕 色 瓶 4 保 存 作 为 工 作 液 衍 生 试 剂 的 配 制 : 称 取 10 mg 邻 苯 二 甲 醛 至 棕 色 容 量 瓶 中, 加 入 甲 醇 0.2 ml 使 其 溶 解, 依 次 加 入 硼 酸 缓 冲 液 1.8 ml(200 mmol/l,ph=8.5) 和 3- 巯 基 丙 酸 10 µ l, 混 合 摇 匀, 置 4 下 作 为 贮 备 作 者 简 介 : 董 茜 (1983-), 女, 药 师,Tel: , dongqian_91@hotmail.com 48

54 液 可 保 存 48 h 将 贮 备 液 稀 释 5 倍 作 为 衍 生 工 作 液, 现 配 先 用 2.2 色 谱 分 析 条 件 色 谱 分 析 柱 :Kromail C18 (5 µ m,250mm 4.6mm) 流 动 相 A 液 为 50mmol/L 磷 酸 盐 缓 冲 液 (ph6.5, 含 11% 的 乙 腈 ),B 液 为 50% 的 乙 腈 ; 分 析 流 程 :0~25min 为 100%A,25~ 27min 为 50%B,27min 之 后 再 改 为 100%A 柱 温 40 流 速 1 ml/min 荧 光 检 测 波 长 :EX 340nm, EM 455nm 2.3 样 品 预 处 理 抽 取 空 腹 12 h 静 脉 血 (1ml) 置 肝 素 抗 凝 管, 混 匀 后 立 即 于 3000 r/min, 离 心 10min, 吸 取 上 清 置 -70 保 存 待 测 取 血 浆 样 品 200 µ l, 加 入 磷 酸 盐 缓 冲 液 (0.05mol/L,pH8.5)800 µ l, 漩 涡 混 匀 后, 过 阳 离 子 交 换 树 脂 富 集 柱 (CT-20,75 µ m,100mg), 依 次 用 磷 酸 缓 冲 液 1ml 0.1mmol/L HCl 1ml 甲 醇 1ml 冲 洗 富 集 柱 并 弃 掉 洗 脱 液, 最 后 用 氢 氧 化 铵 / 水 / 甲 醇 (10/40/50) 混 合 液 3ml 冲 洗 富 集 柱, 并 收 集 此 洗 脱 液 置 40 水 浴 下 N2 吹 干, 得 到 样 品 残 渣 2.4 样 品 柱 前 衍 生 将 上 述 残 渣 用 0.1ml 无 离 子 溶 解, 加 入 0.1ml OPA 衍 生 试 剂 工 作 液, 混 匀 后 置 50 水 浴 放 置 5min, 过 0.45 µ m 滤 膜 后 立 即 取 20 µ l 进 行 色 谱 分 析 HPLC 色 谱 图 见 图 1,ADMA 均 得 到 完 全 的 基 线 分 离 A B 图 1 ADMA 的 HPLC 分 离 谱 图 A ADMA 标 准 物 色 谱 分 离 谱 图 B 人 血 浆 样 品 色 谱 分 离 谱 图 2.5 标 准 曲 线 的 制 备 用 经 肝 素 抗 凝 的 血 浆 内 加 ADMA 标 准 液, 配 成 终 浓 度 依 为 0.1 µ mol/l 0.2 µ mol/l 0.5 µ mol/l 1.0 µ mol/l 2.0 µ mol/l 4.0 µ mol/l 8.0 µ mol/l 的 血 浆 标 准 品 溶 液 按 照 上 述 样 品 预 处 理 和 衍 生 的 方 法 处 理, 进 行 色 谱 分 析 结 果 以 峰 面 积 对 ADMA 浓 度 作 线 性 回 归, 所 得 标 准 曲 线 方 程 为 A = C , r = 0.997, 表 明 ADMA 浓 度 在 0.1~ 8 µ mol/l 范 围 内 有 良 好 的 线 性 关 系 ADMA 的 最 低 检 测 浓 度 为 0.01 µ mol/l 2.6 回 收 率 实 验 正 常 人 血 浆 中 分 别 加 入 已 知 不 同 浓 度 的 ADMA 标 准 液, 按 回 收 率 (%)= ( 血 浆 样 品 + 标 准 )- 血 浆 样 品 / 标 准 100% 计 算 回 收 率, 结 果 见 表 1 49

55 表 1 ADMA 的 回 收 率 实 验 结 果 加 入 ADMA 浓 度 ( µ mol/l) 0 测 定 ADMA 浓 度 ( µ mol/l, x ±S ) 0.46±0.03 回 收 率 (%) 平 均 回 收 率 (%) ± ± ± 精 密 度 实 验 取 同 一 血 浆 样 品 加 入 ADMA 标 准 溶 液 配 成 浓 度 为 µ mol/l 的 血 浆 标 准 溶 液, 一 天 内 重 复 测 定 6 次 和 分 别 在 不 同 的 6 天 检 测, 计 算 日 内 日 间 差 异 见 表 2 表 2 ADMA 的 精 密 度 实 验 结 果 加 入 ADMA 浓 日 内 日 间 度 ( µ mol/l) 测 定 ADMA 浓 度 ( µ mol/l, x ±S ) RSD(%) 测 定 ADMA 浓 度 ( µ mol/l, x ±S ) RSD(%) ± ± ± ± ± ± 样 品 含 量 测 定 利 用 中 的 方 法 对 收 集 的 样 本 进 行 检 测, 健 康 人 的 血 液 标 本 30 例 ( 年 龄 22~56 岁 ),ADMA 的 浓 度 为 0.43±0.08 µ mol/l; 高 血 压 患 者 42 例,ADMA 浓 度 为 0.72±0.16 µ mol/l; 肾 衰 竭 患 者 35 例,ADMA 浓 度 为 1.14±0.22 µ mol/l 利 用 此 种 富 集 和 衍 生 的 方 法, 我 们 还 检 测 了 腹 透 病 人 的 腹 透 液 15 例,ADMA 浓 度 为 0.54±0.12 µ mol/l 3 讨 论 3.1 衍 生 试 剂 的 选 择 以 3- 巯 基 丙 酸 代 替 β- 巯 基 乙 醇 与 OPA 反 应 能 生 成 稳 定 的 衍 生 剂 [3,4, 5 ] OPA 与 3- 巯 基 丙 酸 配 置 的 衍 生 试 剂 贮 备 液 可 连 续 使 用 48h, 衍 生 试 剂 工 作 液 在 l2 小 时 内 OPA 的 浓 度 下 降 约 10 %, 衍 生 试 剂 工 作 液 必 须 现 配 现 用 将 ADMA 标 准 品 按 照 分 析 步 骤 进 行 衍 生 后, 分 别 置 室 温 水 浴 中 反 应 5min 后 进 行 检 测 为 保 证 衍 生 化 反 应 的 完 全 和 稳 定 选 择 50 水 浴 反 应 5min 作 为 最 终 衍 生 条 件 见 图 2 荧 光 强 度 (mv) t( ) 图 2 温 度 对 衍 生 化 反 应 程 度 的 影 响 50

56 3.2 流 动 相 的 选 择 流 动 相 A 液 采 用 50mmol/L 磷 酸 盐 缓 冲 液 (ph6.5, 含 11% 的 乙 腈 ), 我 们 曾 试 用 含 乙 腈 8.7% 10% 12% 的 比 例 [3,4], 但 8.7% 和 10 比 例 % 时 ADMA 出 峰 晚 于 30min, 而 12% 时 ADMA 出 峰 与 杂 质 峰 过 于 紧 凑 由 此 最 终 确 定 乙 腈 含 量 为 11%, 使 ADMA 得 到 完 全 的 基 线 分 离, 合 适 的 保 留 时 间 并 能 够 准 确 地 定 性 定 量 分 析 3.3 样 品 预 处 理 的 改 进 我 们 曾 试 用 血 浆 样 品 经 磺 基 水 杨 酸 直 接 除 蛋 白 后 [6], 离 心 取 上 清 进 行 衍 生, 但 经 HPLC 分 析 后, 色 谱 图 中 ADMA 组 分 与 杂 质 峰 重 叠 无 法 完 全 分 离, 因 而 难 以 准 确 定 性 定 量 分 析 可 能 是 由 于 血 浆 样 品 中 ADMA 微 量 和 血 浆 内 源 性 物 质 干 扰 所 致, 因 此 我 们 选 用 阳 离 子 交 换 树 脂 富 集 柱 来 预 处 理 样 品, 以 排 除 血 浆 中 内 源 性 物 质 的 干 扰, ADMA 可 得 到 完 全 基 线 分 离, 定 性 定 量 分 析 结 果 可 靠 3.4 阳 离 子 交 换 树 脂 的 选 择 我 们 对 两 种 不 同 的 阳 离 子 富 集 柱 进 行 过 比 较 实 验, 将 同 一 浓 度 的 ADMA 标 准 品 分 为 两 份, 分 别 使 用 美 国 Waters 公 司 的 PRS 富 集 柱 与 CT-20 国 产 富 集 柱 进 行 样 品 预 处 理, 并 与 未 经 富 集 的 ADMA 标 准 品 检 测 结 果 相 比 较, 得 到 两 种 富 集 柱 对 ADMA 的 富 集 回 收 率 结 果 表 明, 国 产 CT-20 富 集 柱 回 收 率 (92.83%) 优 于 进 口 Waters 富 集 柱 回 收 率 (86.25%), 且 国 产 富 集 柱 价 格 低 廉 值 得 推 广 使 用 本 方 法 检 测 人 血 浆 及 其 他 生 物 样 本 中 ADMA 浓 度 操 作 简 便 快 速 灵 敏 准 确, 适 用 于 基 础 医 学 研 究 和 临 床 常 规 批 量 样 品 检 测 参 考 文 献 : [1] Schulze F, Wesemann R, Schwedhelm E, et al. Determination of asymmetric dimethylarginine(adma) using a novel ELISA assay[j]. Clin Chem Lab Med,2004,42: [2] Martens-Lobenhoffer J, Bode-Böger SM. Chromatographic-mass spectrometric methods for the quantification of l-arginine and its methylated metabolites in biological fluids. [J] J Chromatogr B, 2007,851: [3] Blackwell S, O'Reilly DS, Talwar DK. HPLC analysis of asymmetric dimethylarginine (ADMA) and related arginine metabolites in human plasma using a novel non-endogenous internal standard[j].clinica Chimica Acta, 2009,401:14-19 [4] Teerlink T, Nijveldt RJ, de Jong S, et al. Determination of arginine, asymmetric dimethylearginine, and asymmetric dimethylarginine in human plasma and other biological samples by high-performance liquid chromatography[j]. Anal Biochem, 2002, 303(2):131-7 [5] 江 丽, 杭 太 俊, 张 婷 婷 等. 柱 前 衍 生 化 HPLC 法 测 定 复 方 布 洛 芬 片 中 精 氨 酸 的 含 量 [J]. 实 验 与 研 究,2006,30(5): [6] 陈 本 美, 夏 令 伟, 梁 绍 先, 等. 尿 中 L- 精 氨 酸 及 其 甲 基 化 产 物 的 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 [J]. 分 析 化 学, 2002, 30(5):

57 高 效 液 相 色 谱 法 - 蒸 发 光 散 射 检 测 器 测 定 保 健 食 品 中 人 参 皂 甙 主 要 成 分 的 含 量 渠 志 华, 马 永 民, 李 建 平 ( 天 津 市 疾 病 预 防 控 制 中 心, 天 津 ) 随 着 保 健 食 品 发 展 迅 速, 含 有 人 参 的 保 健 食 品 种 类 很 多, 因 此 准 确 检 测 其 功 效 成 分 的 含 量 很 重 要 人 参 皂 甙 的 测 定 方 法 有 比 色 法, 高 效 液 相 色 谱 法 高 效 液 相 色 谱 - 质 谱 法 等 我 们 在 参 考 相 关 文 献 资 料 [1-15] 和 对 皂 甙 类 主 要 成 分 的 化 学 分 析 的 基 础 上, 采 用 高 效 液 相 色 谱 法 - 蒸 发 光 散 射 检 测 器 (HPLC-ELSD) 对 保 健 食 品 中 皂 甙 类 主 要 成 分 Rg1 Re Rb1 Rf Rc Rb2 Rd Rh2 进 行 了 含 量 测 定 的 研 究, 对 方 法 的 线 性 范 围 精 密 度 准 确 度 及 检 出 限 等 方 法 指 标 进 行 了 试 验, 该 方 法 可 同 时 测 定 保 健 食 品 中 主 要 皂 甙 元 成 分, 并 且 对 八 种 主 要 皂 甙 成 分 达 到 良 好 分 离, 准 确 检 测 1 实 验 部 分 1.1 试 剂 与 材 料 乙 腈 甲 醇, 乙 醇, 水,D-101 大 孔 吸 附 树 脂,Rg1 Re Rb1 Rf Rb2 Rh2 Rc Rd 标 准 储 备 液 : 制 备 Rg1 Re Rb1 Rf Rc Rb2 Rd Rh2 浓 度 分 别 为 mg/ml 分 析 天 平 (LIBROR AEL-160), 水 浴 锅 ( 天 津 市 中 环 实 验 电 炉 有 限 公 司 ) Waters 600 高 效 液 相 色 谱 仪 ( 美 国 Waters), 蒸 发 光 散 射 检 测 器 (ALLTECH),KQ3200E 超 声 波 萃 取 仪 ( 昆 山 市 超 声 仪 器 有 限 公 司 ),5mL 层 析 管,0.45μm 有 机 滤 膜 1.2 样 品 前 处 理 : 称 取 研 磨 过 后 的 样 品 m(g), 加 水 适 量 于 超 声 波 萃 取 仪 中 超 声 提 取 30min, 取 出 放 置 室 温 后, 用 水 定 容 至 25mL 精 密 吸 取 1.00 ml 样 品 液 经 内 装 D-101 大 孔 树 脂 的 层 析 管 过 柱, 用 70% 乙 醇 30mL 洗 脱, 收 集 洗 脱 液 于 蒸 发 皿 中,75 水 浴 烘 干, 用 色 谱 甲 醇 溶 解 残 渣 并 定 容 至 2.00mL 样 品 处 理 液 经 0.45μm 滤 膜 过 滤 后 待 测 根 据 保 留 时 间 定 性, 峰 面 积 定 量 1.3 仪 器 条 件 色 谱 柱 :C18,5μm,4.6mm 250mm 不 锈 钢 柱 ; 流 动 相 : 水 和 乙 腈 按 照 一 定 比 例 梯 度 洗 脱 ; 流 速 :1.0mL/min; 蒸 发 光 散 射 检 测 器 ; 柱 温 :35 ; 载 气 流 量 :2.9L/min; 漂 移 管 温 度 :106 ; 进 样 量 :20μL 1.4 计 算 公 式 : Xi= (C )/ (m ) X= X i 其 中 X i 为 待 测 样 品 Rg1 Re Rb1 Rf Rc Rb2 Rd 或 Rh2 含 量, 2 结 果 与 讨 论 X 为 各 种 皂 甙 含 量 之 和 即 为 待 测 样 品 中 总 皂 甙 含 量, C 为 由 标 准 曲 线 方 程 计 算 得 到 的 样 品 中 各 种 皂 甙 的 含 量, V 1 为 样 品 处 理 总 体 积,V 2 为 样 品 溶 液 过 柱 净 化 后 定 容 体 积, 2.1 流 动 相 选 择 选 择 使 用 纯 水 和 乙 腈 梯 度 洗 脱 作 为 该 试 验 的 流 动 相 体 系 八 种 皂 甙 在 该 洗 脱 程 序 下 在 55min 内 得 到 良 好 分 离 乙 腈 在 梯 度 洗 脱 过 程 中 的 比 例 直 接 影 响 皂 甙 类 的 分 离 效 果, 故 可 根 52

58 据 选 择 的 不 同 色 谱 柱 适 当 对 乙 腈 的 比 例 进 行 微 调, 可 达 到 良 好 的 分 离 效 果 梯 度 洗 脱 比 例 参 见 表 1, 分 离 色 谱 图 参 见 图 2 表 1 梯 度 洗 脱 程 序 时 间 (min) 流 速 (ml/min) 乙 腈 水 曲 线 检 测 器 选 择 文 献 中 多 以 紫 外 检 测 器 作 为 测 定 皂 甙 类 功 能 因 子 的 检 测 器, 测 定 波 长 为 203nm, 而 人 参 皂 甙 显 色 基 团 不 活 泼, 该 波 长 接 近 紫 外 线 的 极 限, 容 易 造 成 测 定 不 稳 定, 影 响 测 定 结 果, 并 且 高 效 液 相 色 谱 - 紫 外 检 测 器 (HPLC-UV) 梯 度 洗 脱 困 难, 在 实 验 过 程 中, 当 洗 脱 程 序 结 束 时, 有 大 量 的 干 扰 峰 产 生 ( 参 见 图 1), 而 众 多 类 型 的 皂 甙 在 一 次 洗 脱 分 离 时, 靠 常 规 检 测 方 法 是 困 难 的 而 蒸 发 光 散 射 检 测 器 (ELSD) 是 一 种 质 量 型 检 测 器, 通 过 将 样 品 蒸 发 后 粒 子 雾 化 的 原 理 进 行 检 测, 并 且 ELSD 的 响 应 取 决 于 被 分 析 质 粒 的 数 量 和 大 小, 仅 对 不 挥 发 被 分 析 物 产 生 响 应, 即 使 在 梯 度 洗 脱 时 也 能 提 供 平 衡 的 基 线 ( 参 见 图 2) 图 1 高 效 液 相 色 谱 - 紫 外 检 测 器 (HPLC-UV) 梯 度 洗 脱 色 谱 图 图 2 高 效 液 相 色 谱 - 蒸 发 光 散 射 检 测 器 (HPLC- ELSD) 梯 度 洗 脱 八 种 皂 甙 分 离 色 谱 图 53

59 2.3 样 品 过 柱 净 化 中 洗 脱 液 的 选 择 : 参 考 文 献 中 对 于 样 品 净 化 大 多 采 用 过 D-101 净 化 柱, 但 是 洗 脱 液 有 采 用 70% 甲 醇 和 70% 乙 醇 的 区 别, 我 们 根 据 自 己 购 买 的 D-101 净 化 柱 分 别 采 用 这 两 种 洗 脱 液 对 标 准 混 合 溶 液 进 行 了 吸 附 洗 脱 的 试 验, 试 验 证 明 采 用 70% 乙 醇 洗 脱 效 果 较 理 想 2.4 标 准 曲 线 吸 取 各 种 皂 甙 标 准 储 备 溶 液, 配 制 成 混 合 标 准 溶 液, 配 制 标 准 系 列, 制 备 标 准 曲 线 蒸 发 光 散 射 检 测 器 定 量 时 采 用 浓 度 和 峰 面 积 成 正 比 时 则 可 以 使 用 浓 度 和 峰 面 积 直 接 计 算 标 准 曲 线 方 程, 不 成 正 比 时 则 以 以 含 量 的 对 数 和 峰 面 积 的 对 数 计 算 标 准 曲 线 方 程 在 高 效 液 相 色 谱 - 蒸 发 光 散 射 检 测 器 (HPLC- ELSD) 测 定 各 种 皂 甙 中, 基 于 各 种 皂 甙 浓 度 和 峰 面 积 的 线 性 良 好 和 计 算 简 便 的 基 础, 我 们 采 用 参 浓 度 和 峰 面 积 直 接 计 算 标 准 曲 线 方 程, 各 种 皂 甙 在 0.06 mg/ml mg/ml 浓 度 范 围 内 线 性 良 好 结 果 见 表 2 表 2 八 种 人 参 皂 甙 测 定 标 准 曲 线 名 称 标 准 曲 线 方 程 相 关 系 数 r Rg1 y= x Re y= x Rb1 y= x Rf y= x Rc y= x Rb2 y= x Rd y= x Rh2 y= x 精 密 度 试 验 对 混 合 标 准 溶 液 重 复 操 作 测 定 6 次 测 定 结 果 见 表 3 在 重 复 性 条 件 下 获 得 的 测 定 结 果 的 标 准 相 对 相 差 小 于 10% 表 3 精 密 度 试 验 名 称 Rg1 Re Rb1 Rf Rc Rb2 Rd Rh2 浓 度 (mg/ml) 峰 面 积 峰 面 积 峰 面 积 峰 面 积 峰 面 积 峰 面 积 平 均 值 RSD(%) 检 出 浓 度 当 取 样 量 为 5.0g, 进 样 量 为 20μL 时,Rg1 Re Rb1 Rf Rc Rb2 Rd Rh2 最 低 检 出 浓 度 分 别 为 :1.5μg/mL 1.5μg/mL 0.15μg/mL 0.15μg/mL,0.15μg/mL 0.15μg/mL 0.15μg/mL 1.5μg/mL, 最 低 定 量 浓 度 分 别 为 4.5mg/kg,4.5mg/kg,0.45 mg/kg,0.45 mg/kg, 0.45 mg/kg,0.45 mg/kg,0.45 mg/kg,4.5mg/kg 2.7 测 定 样 品 : 利 用 HPLC-ELSD 分 别 准 确 测 定 保 健 食 品 中 单 个 皂 甙 成 分 的 含 量, 然 后 计 算 总 含 量 的 测 定 结 果 则 相 对 较 准 确, 并 且 还 有 利 于 区 分 不 同 的 人 参 制 品 测 定 结 果 参 见 表 4 54

60 表 4 两 种 测 定 方 法 测 定 样 品 进 行 比 较 样 品 名 称 提 取 方 法 比 色 法 测 定 结 果 平 均 值 HPLC-ELSD 测 定 结 果 平 均 值 南 山 雪 保 健 饮 品 直 接 0.806mg/mL 0.093mg/mL 华 药 神 草 红 五 参 胶 囊 水 超 声 30min 7.63g/100g 2.28g/100g 天 狮 参 原 蜂 胶 片 水 60 40min mg/100g 387mg/100g 天 狮 降 脂 茶 甲 醇 浸 提 4h 267mg/100g 59.0mg/100g 3 小 结 本 试 验 对 利 用 HPLC-ELSD 对 保 健 食 品 中 八 种 皂 甙 类 因 子 进 行 测 定 的 方 法 进 行 了 研 究, 并 在 流 动 相 选 择 检 测 器 选 择 样 品 前 处 理 等 方 面 进 行 了 一 些 探 索, 充 分 发 挥 HPLC-ELSD 这 种 特 殊 的 通 用 型 质 量 检 测 器 在 检 测 工 作 中 的 作 用 参 考 文 献 : [1] 保 健 食 品 中 人 参 皂 甙 的 高 效 液 相 色 谱 测 定. 保 健 食 品 检 验 与 评 价 技 术 规 范. 中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部.2003: [2] 保 健 食 品 中 总 皂 甙 的 测 定. 保 健 食 品 检 验 与 评 价 技 术 规 范. 中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部.2003: [3] 韩 宏 伟, 王 竹 天, 杨 祖 英 等. 人 参 皂 甙 和 褪 黑 素 分 析 的 质 量 控 制. 中 国 食 品 卫 生 杂 志.2001,13(3): [4] 江 英 桥, 王 强, 魏 国 等. 高 效 液 相 色 谱 蒸 发 激 光 散 射 检 测 器 分 析 西 洋 参 中 的 人 参 皂 甙. 中 国 药 科 大 学 学 报.2001, 32(1):41~43. [5] 杨 祖 英., 马 兰, 苏 菊. 人 参 皂 甙 的 测 定 方 法. 中 国 食 品 卫 生 杂 志.1999,11(1):14~15. [6] 陈 薇, 胡 广 林, 王 翊 如 等. 高 效 液 相 色 谱 法 分 离 测 定 人 参 中 的 6 种 人 参 皂 甙. 色 谱,2000, 18(5):429~441. [7] 陈 波, 潘 振 球, 赖 天 兵. 人 参 类 保 健 食 品 中 人 参 皂 甙 的 高 效 液 相 色 谱 分 析. 中 华 预 防 医 学 杂 志,1996, 30(5): [8] Zhiguo Yu, Xiaoxia Gao, Yunli Zhao.eta.Determination of Safflor Yellow A, Puerarin, Ferulic Acid, Ginsenoside Rg1, and Rb1 in the Traditional Chinese Medicinal Preparation Naodesheng Injection by High-Performance Liquid Chromatography. Journal of Chromatographic Science.2006,44: [9] Chunhua Xia, Guangji Wang, Jianguo Suna. eta. Simultaneous determination of ginsenoside Rg1, Re, Rd, Rb1 and ophiopogonin D in rat plasma by liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometric method and its application to pharmacokinetic study of SHENMAI injection. Journal of Chromat-ography B.2008,862: [10] Gui-feng Deng, Ding-liWang, Ming-xin Meng.eta. Simultaneous determination of notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1, Re, Rb1and icariin in rat plasma by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B.2009,877: [11] Han TW, But PP, Cheng SW.eta. Differentiation and authentication of Panax ginseng. Panax quinquefolius and ginseng products by using HPLC/MS. Anal Chem, 2000,72(6): [12] 沈 向 红, 任 一 平, 陈 翊.HPLC 法 与 香 草 醛 比 色 法 测 定 保 健 品 中 的 人 参 皂 甙. 中 国 卫 生 检 验 杂 志.2004,,14 (6): [13] 王 占 良, 王 弘, 陈 世 忠. 高 效 液 相 色 谱 - 二 极 管 阵 列 检 测 / 质 谱 法 分 生 脉 饮 煎 剂 中 的 人 参 皂 甙 类 成 分.2006,24(4): [14] 赖 天 兵, 陈 波, 潘 振 球 等. 高 效 液 相 色 谱 法 用 于 保 健 食 品 中 人 参 原 料 鉴 定. 实 用 预 防 医 学.2004,11(5): [15] 徐 智 秀, 肖 红 斌, 王 加 宁 等. 高 效 液 相 色 谱 - 质 谱 - 质 谱 法 分 析 人 参 皂 甙.2000,18(6):

61 灯 盏 花 素 对 细 胞 色 素 P4503A4 酶 活 性 的 影 响 韩 晓 文, 李 芹 *, 焦 建 杰, 高 思 楠, 孟 素 蕊, 刘 艳 霞, 娄 建 石 ( 天 津 医 科 大 学 基 础 医 学 院 药 理 教 研 室, 天 津 ) 细 胞 色 素 P450 3A 亚 家 族 在 肝 脏 和 小 肠 中 含 量 丰 富, 对 临 床 药 物 有 广 泛 的 代 谢 作 用, 是 细 胞 色 素 P450 超 家 族 中 最 重 要 的 亚 家 族 成 员 细 胞 色 素 P450 3A4(CYP3A4) 是 人 体 中 重 要 的 药 物 代 谢 酶, 参 与 临 床 150 多 种 药 物 的 代 谢 [1] CYP3A4 具 有 基 因 多 态 性, 基 因 突 变 可 以 引 起 酶 活 性 及 数 量 的 差 异, 从 而 造 成 人 类 对 药 物 反 应 的 显 著 个 体 差 异 CYP3A4 的 活 性 可 影 响 药 物 的 代 谢 过 程, 从 而 影 响 药 物 的 疗 效 ; 而 且 药 物 对 CYP3A4 可 以 产 生 诱 导 或 抑 制 作 用, 从 而 影 响 其 他 经 此 酶 代 谢 的 药 物 而 发 生 药 物 相 互 作 用 和 不 良 反 应 [2] 因 此, 研 究 药 物 对 CYP3A4 活 性 的 影 响 具 有 重 要 意 义 中 药 的 成 分 比 较 复 杂, 中 西 药 联 合 应 用 时, 容 易 出 现 药 物 相 互 作 用, 因 此 研 究 中 草 药 对 CYP3A4 活 性 的 影 响, 不 但 可 以 了 解 中 药 的 体 内 代 谢 过 程, 而 且 可 以 为 临 床 中 西 药 物 的 合 理 搭 配 使 用 提 供 依 据 灯 盏 花 素 粉 针 剂 由 中 药 灯 盏 花 提 取 物 总 黄 酮 精 制 而 成, 主 要 成 分 为 灯 盏 花 乙 素 (4- 羟 基 -7-O- 葡 萄 糖 醛 酸 苷 ), 另 含 少 量 灯 盏 甲 素 ( 芹 菜 素 -7-O- 葡 萄 糖 醛 酸 苷 ) 其 具 有 明 显 的 血 管 扩 张 作 用, 并 能 抑 制 血 小 板 红 细 胞 聚 集, 促 进 纤 溶 酶 活 性, 具 有 良 好 的 溶 栓 防 栓 作 用 和 清 除 自 由 基 对 抗 脂 质 过 度 氧 化 作 用, 研 究 表 明 灯 盏 花 素 注 射 液 还 具 有 改 善 糖 尿 病 患 者 左 心 室 舒 张 功 能 的 作 用 [3] 临 床 常 用 于 脑 梗 塞 冠 心 病 心 绞 痛 等 心 脑 血 管 疾 病 的 治 疗, 是 目 前 临 床 上 较 广 泛 使 用 的 治 疗 心 脑 血 管 疾 病 的 有 效 药 物 之 一 研 究 其 对 CYP3A4 酶 活 性 的 影 响, 对 于 优 化 临 床 给 药 方 案, 提 高 临 床 用 药 的 安 全 性 和 有 效 性 具 有 重 要 的 意 义 本 研 究 以 咪 达 唑 仑 作 为 CYP3A4 的 探 针 药 物, 通 过 研 究 给 予 灯 盏 花 素 粉 针 剂 前 后, 咪 达 唑 仑 药 代 动 力 学 的 差 异, 探 讨 灯 盏 花 素 对 大 鼠 体 内 CYP3A4 活 性 的 影 响 1 材 料 与 方 法 1.1 药 品 与 试 剂 灯 盏 花 素 粉 针 剂 (25mg/ 支, 批 号 : , 昆 明 龙 津 药 业 股 份 有 限 公 司 生 产 ), 咪 达 唑 仑 注 射 剂 (10mg/2ml/ 支, 批 号 , 江 苏 恩 华 药 业 股 份 有 限 公 司 生 产 ), 地 西 泮 原 料 药 ( 大 同 制 药 厂, 批 号 ),, 磷 酸 氢 二 铵, 磷 酸 及 氯 仿 均 为 分 析 纯 甲 醇 为 色 谱 纯 1.2 实 验 仪 器 Agilent 1100 HPLC 工 作 系 统 (Agilent 公 司, 美 国 ),CAY-1 型 液 体 快 速 混 合 器 ( 北 京 长 安 仪 器 厂, 中 国 ),B600 型 低 速 自 动 平 衡 离 心 机 ( 白 洋 离 心 机 厂, 美 国 ),K-550-GE 漩 涡 混 合 器 (Scientific Industries Inc, 美 国 ),PB153-S 精 密 分 析 天 平 (METTLER TOLEDO, 瑞 士 ) 1.3 色 谱 条 件 色 谱 柱 :Agilent zorbax SB-C18 (250mm 4.6mm, 5μm)(Agilent 公 司, 美 国 ); 流 动 相 : 0.05mol/L 磷 酸 氢 二 铵 缓 冲 溶 液 ( 用 磷 酸 调 ph 至 3.4)- 甲 醇 (28:72, v:v); 流 速 :1.0 ml/min; 紫 外 检 测 波 长 :230nm; 柱 温 :30 ; 进 样 量 :20μl 基 金 项 目 : 天 津 市 自 然 科 学 基 金 重 点 项 目 (09JCZDJC21500); 高 等 学 校 博 士 学 科 点 专 项 科 研 基 金 ( 新 教 师 基 金 ) 资 助 课 题 ( ) 作 者 简 介 : 韩 晓 文, 女, 硕 士 研 究 生 通 讯 作 者 : 李 芹, 副 教 授, 主 要 研 究 方 向 : 临 床 药 理 学 与 药 物 代 谢 动 力 学 carolin1006@gmail.com 56

62 1.4 实 验 动 物 Wistar 大 鼠, 雌 雄 各 半, 体 重 200±20g, 由 中 国 人 民 解 放 军 军 事 医 学 科 学 院 放 射 研 究 所 实 验 动 物 中 心 提 供, 动 物 生 产 合 格 证 号 :ASCSK( 津 ) 给 药 方 法 及 样 本 采 集 实 验 分 组 及 给 药 将 Wistar 大 鼠 随 机 分 为 两 组, 对 照 组 和 实 验 组, 每 组 30 只 大 鼠 实 验 组 大 鼠 每 日 尾 静 脉 注 射 灯 盏 花 素 粉 针 剂 0.45mg/100g, 每 日 1 次, 共 10d; 第 11d 于 尾 静 脉 缓 慢 注 射 美 托 洛 尔 探 针 药 物 溶 液 1mg/100g 对 照 组 大 鼠 每 日 尾 静 脉 注 射 生 理 盐 水 0.5ml/100g, 每 日 1 次, 共 10d; 第 11d 各 组 大 鼠 均 于 尾 静 脉 缓 慢 注 射 咪 达 唑 仑 溶 液 5mg/kg (0.1ml/100g) 血 浆 样 品 采 集 分 别 于 注 射 咪 达 唑 仑 溶 液 前 及 给 药 后 min 和 h 眼 内 眦 静 脉 取 血 0.8ml 至 肝 素 化 离 心 管 中, 离 心 3500rpm 10min, 分 离 血 浆, 按 文 中 样 品 预 处 理 程 序 操 作, 测 定 1.6 样 品 预 处 理 准 确 吸 取 血 浆 样 本 200μl, 加 入 4μg/ml 的 地 西 泮 内 标 溶 液 100μl, 涡 旋 振 荡 30s, 加 入 2ml 提 取 溶 剂 氯 仿, 于 快 速 液 体 混 合 器 混 匀 5min 后 3500rpm 离 心 10min 取 下 层 有 机 相 置 玻 璃 离 心 管 中, 于 40 水 浴 中 以 氮 气 吹 干 残 渣 用 100μl 流 动 相 复 溶,20μl 进 样, 记 录 色 谱 图 [4] 1.7 数 据 处 理 方 法 及 药 代 动 力 学 分 析 使 用 DAS2.0 软 件 的 非 房 室 模 型 计 算 咪 达 唑 仑 的 主 要 药 代 动 力 学 参 数 1.8 统 计 学 处 理 结 果 以 x ±SD (Mean values±sd) 表 示, 应 用 SPSS13.0 软 件 进 行 统 计 分 析, 采 用 方 差 分 析 进 行 组 间 比 较,Dunnett s 检 验 进 行 两 两 比 较 P<0.05 表 示 有 显 著 差 异 2 结 果 2.1 HPLC 的 方 法 学 验 证 在 上 述 分 析 条 件 下, 咪 达 唑 仑 与 内 标 峰 峰 形 良 好, 分 离 完 全, 无 杂 质 峰 干 扰 血 浆 色 谱 图 见 图 1 图 1 色 谱 图 A- 空 白 血 浆 ;B- 空 白 血 浆 + 咪 达 唑 仑 + 内 标 ;C- 血 浆 样 本 + 内 标 ; 1- 咪 达 唑 仑 ;2- 安 定 ( 内 标 ) 以 咪 达 唑 仑 与 内 标 峰 面 积 比 值 为 横 坐 标, 咪 达 唑 仑 浓 度 为 纵 坐 标, 绘 制 标 准 曲 线, 求 得 直 线 回 归 方 程 为 Y=2.0225X , r=0.9998, 线 性 范 围 :0.19~100μg/ml 血 浆 中 低 中 高 三 种 浓 度 的 咪 达 唑 仑 绝 对 回 收 率 均 大 于 77%, 相 对 回 收 率 为 96%~ 99%, 日 内 日 间 精 密 度 均 <9% 血 浆 样 本 冷 冻 一 个 月 后 其 浓 度 变 化 均 在 ±8% 以 内 2.2 咪 达 唑 仑 的 药 代 动 力 学 研 究 使 用 DAS2.0 软 件 的 非 房 室 模 型 计 算 对 照 组 和 实 验 组 组 中 咪 达 唑 仑 的 主 要 药 代 动 力 学 参 57

63 数, 结 果 见 表 1 对 照 组 和 实 验 组 大 鼠 静 脉 注 射 咪 达 唑 仑 5mg/kg 后 咪 达 唑 仑 的 血 药 浓 度 均 值 - 时 间 曲 线 见 图 对 照 组 实 验 组 C (ug/ml) t(h) 图 2 对 照 组 和 实 验 组 咪 达 唑 仑 的 血 药 浓 度 均 值 - 时 间 曲 线 表 1 大 鼠 静 脉 注 射 咪 达 唑 仑 (5mg/kg) 后 咪 达 唑 仑 的 主 要 药 动 学 参 数 ( x ±SD,n=6) 药 代 参 数 对 照 组 高 剂 量 组 AUC(0-t)(mg/L*h) 8.95± ±2.35* AUC(0- )(mg/l*h) 11.57± ±4.90* MRT(0-t)(h) 3.13± ±0.82* MRT(0- )(h) 7.93± ±4.08* t1/2(h) 4.11± ±3.03* CL(L/h/kg) 0.43± ±0.09* * P< 讨 论 CYP3A4 是 人 体 含 量 最 丰 富 的 P450 酶, 大 约 占 人 肝 CYP450 总 含 量 的 30%, 占 肠 道 [5,6] CYP450 总 含 量 的 70%, 参 与 市 场 上 50% 以 上 的 药 物 代 谢 咪 哒 唑 仑 具 有 T1/2 短, 既 可 静 脉 用 药, 也 可 口 服 给 药, 吸 收 快 速 且 完 全, 不 良 反 应 轻 微, 并 已 明 确 不 经 转 运 等 特 点, 满 足 安 全 快 速 特 异 性 强 等 检 测 要 求, 而 且 与 众 多 的 CYP3A4 底 物 有 着 良 好 的 相 关 性, 从 而 成 [7] 为 评 价 CYP3A4 代 谢 活 性 的 常 用 探 针 药 物 目 前, 已 有 很 多 研 究 使 用 咪 达 唑 仑 作 为 探 针 药 [8-10] 物 评 价 药 物 对 于 CYP3A4 的 作 用 表 1 数 据 表 明 静 脉 给 予 大 鼠 灯 盏 花 素 粉 针 剂 10d 后, 与 对 照 组 相 比, 实 验 组 咪 达 唑 仑 的 AUC MRT 和 t1/2 均 显 著 高 于 对 照 组, 其 中 AUC(0-t) 提 高 41.6%; AUC(0- ) 提 高 61.9; 而 MRT(0-t) 提 高 32.3%; MRT(0- ) 提 高 了 49.2%; t1/2 延 长 了 74.0%; 但 是 CL 显 著 低 于 对 照 组 (P<0.05), 说 明 静 脉 给 予 大 鼠 灯 盏 花 素 粉 针 剂 10d 后, 咪 达 唑 仑 在 体 内 的 代 谢 明 显 减 慢, 提 示 使 用 灯 盏 花 素 粉 针 剂 可 明 显 降 低 大 鼠 体 内 CYP3A4 的 活 性 目 前 心 血 管 疾 病 已 经 成 为 危 害 人 类 健 康 的 第 一 大 疾 病, 其 发 病 率 死 亡 率 逐 年 上 升, 患 者 需 要 长 期 治 疗, 或 者 终 生 服 药 由 于 遗 传 和 个 体 差 异, 再 加 上 疾 病 本 身 引 起 的 生 理 变 化, 58

64 使 得 大 多 数 心 血 管 病 患 者 需 要 联 合 用 药, 造 成 心 血 管 病 患 者 用 药 过 程 中 出 现 明 显 的 个 体 差 异 和 药 物 相 互 作 用, 因 此, 研 究 联 合 用 药 时, 药 物 对 于 药 物 代 谢 酶 活 性 的 影 响, 可 以 估 计 传 统 用 药 剂 量 可 能 引 起 的 毒 性 反 应 以 及 联 合 用 药 时 产 生 的 药 物 相 互 作 用, 对 于 调 整 临 床 用 药 方 案, 提 高 治 疗 效 果, 减 少 药 物 不 良 反 应, 最 终 实 现 个 体 化 给 药, 具 有 极 其 重 要 的 意 义 参 考 文 献 : [1] 朱 学 慧, 娄 建 石. 细 胞 色 素 P450 3A 选 择 性 探 针 药 物 的 评 价 [J]. 综 述 与 讲 座,2004,9(4): [2] 王 安.CYP3A4 CYP2C9 酶 和 HMG-CoA 还 原 酶 遗 传 多 态 性 及 其 对 simvasatin 降 脂 疗 效 的 影 响 [D]. 湖 南 : 中 南 大 学,2005 [3] 赵 何 汉. 灯 盏 花 素 注 射 液 对 糖 尿 病 患 者 左 心 室 舒 张 功 能 的 影 响 [J], 实 用 心 脑 肺 血 管 病 杂 志,2010, 18(1):31-2 [4] Ying Liu,Jianjie Jiao,Caili Zhang, Jianshi Lou. A Simplified Method to Determine Five Cytochrome P450 Probe Drugs by HPLC in a Single Run [J]. Bio Pharm, 2009,32(4): [5] Liu Y T, Hao H P, Liu C X, et al. Drugs as CYP3A probes, inducers,and inhibitors[j].drug Metab Rev,2007,39(4): [6] Michalets E L.Update: clinically significantly cytochrome P450 drug interactions[j]. Pharmacotherpy, 1998, 18(1): [7] DU Y, ZHU R H, SU F L. Effect of oleanolic acid on CYP1A2, CYP2E1 and CYP3A4 activity in healthy subjects[j]. Chin Pharm, 2008, 43 (14): [8] Takanohashi T, Isaka M, Ubukata K, Mihara R, Bernard BK.. Studies of the toxicological potential of capsinoids, XIII: inhibitory effects of capsaicin and capsinoids on cytochrome P450 3A4 in human liver microsomes[j]. Int J Toxicol. 2010, 29(2 Suppl):22S-6S. [9] Qiu F, Wang G, Zhang R, Sun J, Jiang J, Ma Y. Effect of danshen extract on the activity of CYP3A4 in healthy volunteers[j], Br J Clin Pharmacol. 2010, 69(6): [10] Chang SY, Fancher RM, Zhang H, Gan J. Mechanism-based inhibition of human cytochrome P4503A4 by domperidone[j], Xenobiotica. 2010, 40(2): Effect of Breviscapine on the activity of cytochrome P4503A4 HAN Xiao-wen, LI Qin, JIAO Jian-jie, GAO Si-nan, MENG Su-rui, LIU Yan-xia, LOU Jian-shi (Department of Pharmacology, Tianjin Medical University, Tianjin, , China) Abstract: Objective: To investigate the effect of Breviscapine on the activity of cytochrome P4503A4(CYP3A4) by Midazolam as a probe. Methods: Wistar rats were divided into test group and control group randomly. The rats in the test group were injected breviscapine for 10 days and the rats in the control group were injected normal saline. On d11, all the rats were injected midazolam. Blood sample were collected for different time and the concentrations of midazolam were determined by HPLC. Results: Compared with control group, AUC, MRT and t1/2 were significantly higher and CL was significantly lower in test group. Conclusion: The activity of CYP3A4 can be inhibited by breviscapine. Key Words: breviscapine; midazolam; CYP3A4; activity 59

65 快 速 响 应 温 敏 性 PNIPAAm 整 体 柱 的 制 备 及 其 应 用 杨 更 亮, 刘 名 权, 刘 海 燕 ( 河 北 大 学 药 学 院, 河 北 省 药 物 质 量 研 究 与 控 制 重 点 实 验 室, 河 北 保 定 ) 整 体 柱 具 有 通 透 性 能 良 好 和 传 质 速 度 快 等 特 点, 可 实 现 快 速 高 效 高 通 量 的 分 离, 近 年 来 已 引 起 高 效 液 相 色 谱 和 毛 细 管 电 色 谱 研 究 者 们 的 热 切 关 注 聚 合 物 整 体 柱 是 其 中 应 用 最 为 广 泛 的 一 种, 它 是 由 单 体 交 联 剂 致 孔 剂 和 引 发 剂 等 通 过 原 位 聚 合 得 到 的 连 续 均 一 的 棒 状 聚 合 物, 具 有 使 用 ph 范 围 较 宽, 生 物 兼 容 性 好 等 特 点 [1-3] N- 异 丙 基 丙 烯 酰 胺 (NIPAAm) 是 一 种 研 究 颇 为 广 泛 的 典 型 温 敏 性 高 分 子, 其 温 敏 特 性 得 到 了 广 大 研 究 者 的 青 睐 [4-6] 本 文 以 N- 异 丙 基 丙 烯 酰 胺 (NIPAAm) 为 单 体, 采 用 自 由 基 氧 化 还 原 冰 冻 聚 合 的 方 法, 制 备 了 快 速 响 应 温 敏 性 聚 N- 异 丙 基 丙 烯 酰 胺 (PNIPAAm) 整 体 柱, 并 将 其 应 用 于 类 固 醇 类 药 物 的 分 离 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 和 试 剂 PU-1586 高 液 相 色 谱 仪 ( 日 本,JASCO 公 司 ),UV-1575 紫 外 可 变 波 长 检 测 器 ( 日 本, JASCO 公 司 ),HW-2000 色 谱 工 作 站 ( 南 京 千 谱 软 件 有 限 公 司 );Waters 柱 温 箱 ( 美 国,Waters 公 司 );N- 异 丙 基 丙 烯 酰 胺 (NIPAAm) ( 东 京,TCI 公 司 );N,N- 亚 甲 基 双 丙 烯 酰 胺 (BIS) 甲 醇 ( 天 津 市 科 密 欧 化 学 试 剂 开 发 中 心 ); 过 硫 酸 铵 (APS) ( 天 津 市 天 大 化 工 实 验 厂 ); 四 甲 基 已 二 胺 (TEMED)( 北 京 市 兴 福 精 细 化 工 研 究 所 ); 聚 乙 二 醇 (PEG-20000)( 国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司 ); 以 上 试 剂 均 为 分 析 纯, 实 验 中 所 用 水 均 为 超 纯 水 ; 类 固 醇 类 药 物 ( 氢 化 可 的 松 醋 酸 可 的 松 醋 酸 氢 化 泼 尼 松 氟 轻 松 醋 酸 倍 他 米 松 丙 酸 倍 氯 米 松 ) 均 购 自 中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所 ; 所 有 溶 液 及 流 动 相 在 进 入 液 相 色 谱 仪 前 经 0.45 µm 微 孔 滤 膜 过 滤 1.2 PNIPAAm 整 体 柱 的 制 备 将 N- 异 丙 基 丙 烯 酰 胺 (NIPAAm) N,N- 亚 甲 基 双 丙 烯 酰 胺 (BIS) 过 硫 酸 铵 (APS) 聚 乙 二 醇 (PEG-20000) 四 甲 基 已 二 胺 (TEMED) 和 水 按 一 定 比 例 分 别 加 入 试 管 中, 超 声 混 匀 后, 将 其 倾 入 不 锈 钢 色 谱 柱 管 中 ( mm i.d.), 于 -12 C 下 反 应 24 小 时, 反 应 完 全 后, 将 其 连 接 于 高 效 液 相 色 谱 仪 上, 以 超 纯 水 在 线 冲 洗 24 小 时 以 除 去 致 孔 剂 PEG 和 其 他 未 反 应 完 全 的 可 溶 物 即 得 所 需 聚 合 物 整 体 柱 1.3 PNIPAAm 整 体 柱 的 吸 水 率 将 1.2 项 下 制 备 的 PNIPAAm 整 体 柱 烘 干 至 恒 重 并 精 密 称 重 后 置 于 25 的 水 中, 每 隔 一 段 时 间 取 出 并 用 滤 纸 擦 干 表 面 水 分, 称 重, 计 算 其 吸 水 率 (WU) 计 算 公 式 为 : WU=(Wt-Wd)/W 100 % 其 中,Wd 为 干 燥 PNIPAAm 整 体 柱 的 质 量,Wt 为 某 时 刻 PNIPAAm 整 体 柱 溶 胀 后 的 质 量 W 为 25 时 达 溶 胀 平 衡 时 PNIPAAm 整 体 柱 中 水 的 质 量 1.4 PNIPAAm 整 体 柱 对 类 固 醇 类 类 药 物 的 分 离 本 实 验 采 用 PNIPAAm 整 体 柱 作 为 HPLC 固 定 相, 在 不 同 柱 温 下 对 类 固 醇 类 药 物 进 行 了 分 离, 以 考 察 该 固 定 相 的 温 敏 特 性 色 谱 条 件 为 : 自 制 整 体 柱 : mm i.d.; 流 动 相 : 水 ; 检 测 波 长 :254 nm; 流 速 :1.0 ml/min; 进 样 量 :1 μl 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 ( , ) 作 者 简 介 : 杨 更 亮 (1963- ), 男, 河 北 人, 教 授, 博 士 生 导 师,Ttel: ; ygl@hbu.edu.cn 60

66 2010 年 9 月 环渤海第一届暨天津市第十九届色谱学术报告会-仪器展览会文集 2 结果 2.1 PNIPAAm 整体柱制备条件的优化 通过改变单体 交联剂 致孔剂和引发剂的比例 制得一系列不同条件下的聚合物整体 柱 并分别利用傅里叶变换红外光谱和扫描电子显微镜对上述聚合物进行了官能团的确定及 聚合物微观形态结构的表征 红外吸收谱图如图 1 所示 结果表明 改变单体 交联剂 致 孔剂和引发剂的比例对聚合物的官能团基本无影响 且在 cm-1 处出现了异丙基的耦 合分裂峰 在 cm-1 处出现了酰胺的羰基收缩振动峰 在 cm-1 处出现了甲基 的碳氢键振动峰 80 %T FTIR Measurement 4C /cm 图 1 聚合物整体柱的红外光谱图 然而 所得一系列不同条件下的聚合物整体柱的扫描电子显微镜结果则表明 改变单体 交联剂 致孔剂和引发剂的比例对聚合物的形态结构则影响较大 按照经大量前期单因素实 验优化所得最佳工艺条件而聚合制备的整体柱扫描电镜图如图 2 所示 从电镜图中可见 按 照最佳工艺条件而聚合制备的整体柱 成孔性较好 具有较好的渗透性和亚微米骨架结构 图 2 聚合物整体柱的 SEM 微观结构表征图 2.2 PNIPAAm 整体柱的吸水率 致孔剂PEG-20000对PNIPAAm 整体柱不同时间下吸水率的影响如图3所示 由图中可看 出 相对于未加入致孔剂的小孔整体柱 在致孔剂PEG-20000的成孔作用下得到的大孔整体 61

67 柱 因 为 有 孔 结 构 的 存 在, 水 分 子 较 快 地 进 入 了 整 体 柱 的 网 络 结 构, 从 而 使 聚 集 的 高 分 子 链 松 弛 松 散, 最 后 使 网 络 舒 展, 从 而 表 现 出 了 比 较 快 的 吸 水 速 率 和 快 速 响 应 的 温 敏 性 能 100 NO PEG PEG WU/% T/min 图 3 致 孔 剂 PEG 对 PNIPAAm 整 体 柱 不 同 时 间 下 吸 水 率 的 影 响 2.3 PNIPAAm 整 体 柱 对 类 固 醇 类 药 物 分 离 本 实 验 选 用 六 种 不 同 疏 水 性 的 类 固 醇 类 药 物 为 探 针 药 物, 其 疏 水 性 分 别 以 log P 表 示, 且 疏 水 性 由 强 到 弱 的 顺 序 依 次 为 : 氢 化 可 的 松 (log P=1.61) 醋 酸 可 的 松 (log P=2.10) 醋 酸 氢 化 泼 尼 松 (log P=2.40) 氟 轻 松 (log P=2.50) 醋 酸 倍 他 米 松 (log P=2.80) 丙 酸 倍 氯 米 松 (log P=3.10) 将 整 体 柱 置 于 柱 温 箱 中, 并 在 不 同 的 温 度 (15 C 和 55 C) 下, 分 别 将 1 μl 标 准 品 混 合 溶 液 注 入 高 液 相 色 谱 仪 中, 不 同 柱 温 下 探 针 药 物 在 PNIPAAm 整 体 柱 上 的 分 离 色 谱 图 如 图 4 所 示 图 4 不 同 温 度 下 整 体 柱 对 六 种 类 固 醇 类 药 物 的 分 离 色 谱 图 1 氢 化 可 的 松 2 醋 酸 可 的 松 3 醋 酸 氢 化 泼 尼 松 4 氟 轻 松 5 醋 酸 倍 他 米 松 6 丙 酸 倍 氯 米 松 从 图 中 可 以 看 出, 探 针 药 物 在 该 整 体 柱 上 的 保 留 行 为 与 通 常 的 反 相 色 谱 柱 恰 好 相 反 : 保 留 组 分 在 反 相 色 谱 柱 上 的 保 留 时 间 随 温 度 的 增 加 而 减 小, 而 类 固 醇 类 药 物 在 本 实 验 制 备 的 PNIPAAm 整 体 柱 上 的 保 留 时 间 却 随 温 度 的 升 高 而 延 长 由 图 中 可 以 看 出 : 当 柱 温 为 15 C 时, 探 针 药 物 不 能 完 全 分 离 ; 而 当 柱 温 升 至 55 C 时, 类 固 醇 类 药 物 实 现 较 好 分 离 这 主 要 源 于 PNIPAAm 整 体 柱 表 面 的 疏 水 性 会 因 温 度 变 化 导 致 的 柱 体 表 面 PNIPAAm 分 子 链 的 构 象 转 变 而 随 之 发 生 变 化 在 PNIPAAm 体 系 中,-NHCO- 为 亲 水 性 基 团, 而 -CH(CH3)2 为 疏 水 性 基 团, 在 临 界 相 变 温 度 LCST(32 C) 以 下 时,PNIPAAm 分 子 链 成 伸 展 状 态, 高 分 子 链 中 的 亲 水 基 团 通 过 氢 键 与 水 分 子 结 合, 使 柱 体 表 面 呈 亲 水 性 因 而 对 药 物 分 子 保 留 较 弱 ; 当 温 度 升 高 时, 分 子 链 卷 曲, 这 种 氢 键 作 用 减 弱, 而 高 分 子 链 中 的 疏 水 基 团 间 的 相 互 作 用 增 强, 使 柱 62

68 体 表 面 的 疏 水 性 增 强, 转 而, 疏 水 作 用 取 代 亲 水 作 用 成 为 主 要 作 用 力, 整 体 柱 固 定 相 与 被 分 离 药 物 分 子 疏 水 基 团 间 的 疏 水 相 互 作 用 加 强, 使 其 对 类 固 醇 类 药 物 的 保 留 时 间 增 大 因 此, 基 于 PNIPAAm 柱 体 的 温 敏 特 性, 以 纯 水 为 流 动 相, 仅 仅 依 靠 调 节 柱 温 便 实 现 了 六 种 类 固 醇 类 药 物 的 良 好 分 离 3 讨 论 本 文 以 具 有 温 敏 特 性 的 N- 异 丙 基 丙 烯 酰 胺 (NIPAAm) 为 单 体, 采 用 自 由 基 氧 化 还 原 冰 冻 聚 合 的 方 法 (-12 C), 制 备 了 聚 N- 异 丙 基 丙 烯 酰 胺 (PNIPAAm) 整 体 柱, 其 快 速 响 应 温 敏 性 通 过 较 高 的 吸 水 速 率 及 其 不 同 温 度 下 对 类 固 醇 类 药 物 的 分 离 应 用 得 以 充 分 验 证 值 得 一 提 的 是, 本 实 验 在 利 用 自 制 整 体 柱 对 探 针 药 物 进 行 色 谱 分 离 过 程 中, 仅 使 用 超 纯 水 作 为 流 动 相, 避 免 了 色 谱 分 离 领 域 乙 腈 甲 醇 等 有 机 溶 剂 的 使 用, 有 利 于 对 自 然 资 源 和 生 态 环 境 的 保 护 参 考 文 献 [1] Wang. Q. C, F. Svec, Frechetj. M. J. Anal Chem, 1995, 67: [2] 刘 海 燕, 白 立 改, 杨 更 亮, 杨 冠 群, 封 晓 娟. [J]. 河 北 大 学 学 报, 2009, 29: [3] G. L. Yang, H. Y. Liu, L. G. Bai etc. Microporous Mesoporous Mater, 2008, 112: [4] 秦 爱 香, 吕 满 庚, 刘 群 峰, 张 平. [J]. 应 用 化 学, 2006, 23: [5] 宋 江 莉, 王 秀 芬. [J]. 化 工 学 报, 2003, 54: [6] 秦 爱 香, 刘 群 峰, 张 平, 兰 延 勋, 吕 满 庚. [J]. 化 学 通 报, 2006, 9: The Preparation and Application of Fast Response Temperature Sensitive PNIPAAm Monolithic Column YANG Geng-liang, LIU Ming-quan, LIU Hai-yan (Pharmaceutical Sciences college of Hebei University, Key Laboratory of Pharmaceutical Quality Control of Hebei Province, Baoding, Hebei, , China) Abstract: One of the recent major improvements of HPLC was the introduction of monolithic columns, which have the advantages of faster separation and lower back pressure as compared to traditional packed columns. Here, we investigated temperature responsive polymer, poly(n-isopropylacrylamide) (PNIPAAm), which was the basis of an HPLC stationary phase. In this study, a novel PNIPAAm polymer monolith was polymerized via a free-radical polymerization technique using an aqueous redox initiator in solution. Furthermore, the new PNIPAAm monolith was prepared by decreasing the temperature of polymerization reaction below the freezing point (-12 C). A temperature-dependent resolution of steroids was achieved using only water as a mobile phase on the ultimately optimal PNIPAAm monolithic column. A good separation performance could be achieved with a single aqueous mobile phase just by changing the temperature during chromatographic runs, instead of changing the mobile phase composition. This system should be highly useful to control the function and property of the stationary phase for HPLC only by changing the temperature with an aqueous mobile phase. Key words: Monolithic column; Temperature sensitivity; NIPAAm; HPLC 63

69 固 相 萃 取 盘 - 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 自 来 水 中 丙 烯 酰 胺 张 勃, 祁 悦, 高 赫 男, 包 建 民 ( 天 津 大 学 药 物 科 学 与 技 术 学 院, 天 津,300072) 聚 丙 烯 酰 胺 是 一 种 应 用 广 泛 的 水 处 理 絮 凝 剂, 其 合 成 过 程 中 常 常 会 残 留 一 定 量 的 丙 烯 酰 胺 单 体 [1] 丙 烯 酰 胺 是 公 认 的 致 癌 物 质 和 神 经 性 致 毒 剂, 人 体 通 过 饮 水 会 接 触 到 这 种 有 毒 物 质 世 界 卫 生 组 织 (WHO) 对 聚 丙 烯 酰 胺 使 用 时 的 投 加 量 做 出 了 严 格 限 制, 经 絮 凝 沉 淀 处 理 后 水 体 中 的 丙 烯 酰 胺 的 含 量 应 低 于 0.5 μg/l [2] 测 定 水 中 微 量 的 丙 烯 酰 胺 较 困 难, 往 往 需 要 采 用 昂 贵 的 仪 器 设 备 [3-5], 或 者 较 为 繁 琐 的 操 作 步 骤 [6,7] 固 相 萃 取 盘 是 90 年 代 发 展 起 来 的 一 种 新 型 的 固 相 萃 取 (SPE,Solid Phase Extraction) 技 术 对 于 相 同 质 量 的 填 料, 固 相 萃 取 盘 的 横 截 面 积 约 是 固 相 萃 取 柱 的 10 倍, 可 以 采 用 很 高 的 流 量, 从 而 缩 短 了 样 品 前 处 理 时 间, 提 高 了 效 率 这 种 新 型 的 固 相 萃 取 技 术 广 泛 用 于 较 大 体 积 的 环 境 水 样 中 有 机 污 染 物 的 萃 取 和 检 测 [8-10] 本 文 采 用 固 相 萃 取 盘 技 术, 无 需 样 品 衍 生 步 骤, 实 现 了 对 自 来 水 中 微 量 丙 烯 酰 胺 的 快 速 富 集, 减 少 了 样 品 处 理 时 间, 同 时 采 用 高 效 液 相 色 谱 - 紫 外 检 测 法, 对 自 来 水 中 的 富 集 的 丙 烯 酰 胺 进 行 定 量 分 析, 建 立 起 一 种 简 便 快 速 的 测 定 自 来 水 中 丙 烯 酰 胺 单 体 浓 度 的 方 法 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 和 试 剂 ConstaMetric 3000 高 效 液 相 色 谱 泵 ( 美 国 Milton Roy 公 司 ), 紫 外 检 测 器 ( 美 国 waters 公 司 ),Baulo ODS 色 谱 柱 ( mm,5 μm)( 天 津 奥 秘 科 技 有 限 公 司 ) 循 环 水 式 真 空 泵 ( 美 国 Cole Parmer 公 司 ), 真 空 过 滤 系 统 ( 上 海 申 东 仪 器 有 限 公 司 ), 空 气 泵 ( 天 津 HSENG 公 司 ),0.45 μm 微 孔 有 机 滤 膜 ( 北 洋 膜 技 术 公 司 ) 固 相 萃 取 柱 和 固 相 萃 取 盘 由 天 津 奥 秘 科 技 有 限 公 司 提 供 丙 烯 酰 胺 (99%) 浓 盐 酸 (36-38%) 甲 醇 乙 醇 ( 天 津 大 学 科 威 公 司 ), 水 为 去 离 子 水 1.2 实 验 方 法 溶 液 的 配 制 配 制 1 mg/ml 丙 烯 酰 胺 储 备 液,500 ml 0.5 μg/l 丙 烯 酰 胺 溶 液, 以 及 加 入 0.25 μg 丙 烯 酰 胺 标 准 品 的 500 ml 自 来 水 加 标 溶 液 所 有 溶 液 经 过 0.45 μm 滤 膜 过 滤 固 相 萃 取 柱 对 丙 烯 酰 胺 的 吸 附 用 2 ml 甲 醇 2 ml 水 对 SPE 小 柱 (100 mg 规 格 ) 进 行 活 化 上 样 1 ml 1 μg/ml 的 丙 烯 酰 胺 溶 液, 收 集 流 出 液 加 入 1 ml 洗 脱 剂, 对 固 相 萃 取 小 柱 进 行 洗 脱, 收 集 洗 脱 液 固 相 萃 取 盘 对 丙 烯 酰 胺 的 吸 附 将 直 径 为 47 mm, 重 0.5 g 左 右 的 固 相 萃 取 盘 安 装 在 真 空 抽 滤 装 置 上, 依 次 用 10 ml 甲 醇 10 ml 水 进 行 活 化 上 样 10 ml 或 500 ml 样 品 溶 液, 收 集 流 出 液 用 10 ml 甲 醇 洗 脱, 收 集 洗 脱 液 对 于 500 ml 的 样 品, 将 洗 脱 液 吹 干, 然 后 用 1 ml 甲 醇 复 溶 基 金 项 目 : 天 津 市 科 技 发 展 计 划 项 目 (08CAKFSH00500) 通 讯 作 者 : 包 建 民, jbao007@gmail.com 64

70 2 结 果 与 讨 论 2.1 萃 取 条 件 的 考 察 丙 烯 酰 胺 是 一 种 极 性 化 合 物, 文 献 中 提 到 有 很 多 种 填 料 都 可 以 用 于 食 品 中 的 丙 烯 酰 胺 的 萃 取, 因 此 我 们 考 察 了 几 种 常 见 填 料 对 丙 烯 酰 胺 的 吸 附 情 况 图 1 显 示 了 C18 石 墨 化 炭 活 性 炭 硅 胶 苯 乙 烯 聚 乙 烯 基 苯 五 种 填 料 对 丙 烯 酰 胺 的 吸 附 能 力 活 性 炭 的 多 孔 结 构 使 其 具 有 很 大 的 比 表 面 积, 对 丙 烯 酰 胺 的 吸 附 能 力 明 显 强 于 其 他 几 种 填 料, 是 丙 烯 酰 胺 的 理 想 吸 附 剂 图 1 不 同 填 料 对 丙 烯 酰 胺 吸 附 情 况 丙 烯 酰 胺 极 性 较 强, 一 般 采 用 水 或 者 极 性 强 的 有 机 物 进 行 洗 脱 通 过 比 较 甲 醇 甲 醇 / 水 (50:50) 水 乙 醇 几 种 溶 剂 对 丙 烯 酰 胺 的 洗 脱 效 果, 发 现 水 和 乙 醇 无 法 将 吸 附 在 活 性 炭 中 的 丙 烯 酰 胺 洗 脱 下 来, 甲 醇 对 丙 烯 酰 胺 的 洗 脱 效 果 最 好, 回 收 率 可 以 达 到 100%,50% 甲 醇 洗 脱 能 力 介 于 水 和 甲 醇 之 间 故 选 择 甲 醇 作 为 最 佳 洗 脱 溶 剂 2.2 色 谱 条 件 的 选 择 自 来 水 中 成 分 复 杂, 经 过 固 相 萃 取 盘 萃 取 后, 较 多 杂 质 被 富 集 在 膜 上, 并 由 甲 醇 洗 脱 下 来 因 此 需 要 选 择 一 种 合 适 的 色 谱 条 件, 使 得 丙 烯 酰 胺 与 杂 质 有 效 分 离, 不 影 响 对 丙 烯 酰 胺 的 定 性 和 定 量 实 验 中 考 察 了 流 动 相 的 比 例 和 流 速 对 分 离 的 影 响, 最 终 选 择 5% 甲 醇,0.5 ml/min 流 速 的 色 谱 条 件 为 分 离 检 测 丙 烯 酰 胺 的 最 佳 色 谱 条 件 2.3 标 准 曲 线 和 最 低 检 测 限 将 1 mg/ml 的 丙 烯 酰 胺 储 备 液 稀 释 成 0.05 μg/ml 0.1 μg/ml 0.2 μg/ml 0.3 μg/ml 0.4 μg/ml 的 丙 烯 酰 胺 溶 液,HPLC 液 相 色 谱 检 测 以 质 量 浓 度 (μg/ml) 为 横 坐 标, 以 峰 面 积 为 纵 坐 标 绘 制 标 准 曲 线 峰 面 积 与 质 量 浓 度 成 良 好 的 线 性 关 系, 由 标 准 曲 线 可 以 得 到 线 性 关 系 y = x ,R 2 = , 方 法 最 低 检 测 限 为 0.01 μg/ml 65

71 图 2 自 来 水 加 标 样 品 的 液 相 色 谱 图 色 谱 条 件, 流 动 相 甲 醇 / 水 (5:95), 流 速 0.5 ml/min, 检 测 波 长 :210 nm, 进 样 量 :20 μl, 箭 头 所 示 位 置 为 丙 烯 酰 胺 峰 图 3 丙 烯 酰 胺 标 准 曲 线 图 2.4 固 相 萃 取 盘 技 术 方 法 回 收 率 和 精 密 度 将 10 ml 0.4 μg/ml 丙 烯 酰 胺 溶 液 ( 小 体 积 ) 和 500 ml 0.5 μg/l 丙 烯 酰 胺 模 拟 水 样 ( 大 体 积 ) 作 为 样 品, 按 照 方 法 处 理, 平 行 测 定 三 组 结 果 表 明 不 同 体 积 的 样 品 经 过 萃 取 盘 富 集, 均 可 达 到 较 高 的 回 收 率, 具 有 较 好 的 重 现 性 和 可 靠 性 小 体 积 样 品 的 回 收 率 为 101.6%(RSD% = 0.95), 大 体 积 样 品 的 回 收 率 为 102.2%(RSD% = 2.09) 当 丙 烯 酰 胺 加 标 浓 度 为 0.5 μg/l, 自 来 水 样 体 积 为 500 ml 时, 加 标 回 收 率 达 到 79.96% 2.5 自 来 水 中 丙 烯 酰 胺 的 测 定 取 某 地 方 的 自 来 水 500 ml, 经 过 0.45 μm 滤 膜 过 滤 后 上 样, 测 定 该 水 中 丙 烯 酰 胺 的 含 量, 平 行 测 定 三 次 三 次 取 样 测 定 的 自 来 水 中 丙 烯 酰 胺 浓 度 均 小 于 WHO 标 准 中 的 0.5 μg/l, 66

72 其 平 均 值 为 μg/l, 说 明 自 来 水 中 丙 烯 酰 胺 的 含 量 能 够 达 标 表 1 自 来 水 中 丙 烯 酰 胺 含 量 测 定 编 号 峰 面 积 洗 脱 液 浓 度 (μg/ml) 水 样 浓 度 (μg/l) 平 均 值 RSD(%) 参 考 文 献 : [1] 张 瑾, 张 书 香, 李 春 生, 顾 尧.[J]. 化 学 世 界, 1999, 12: [2] World Health Organization (WHO). Guidelines for drinking water quality, Vol. 1: Recommendations, 2 nd ed.; WHO: Geneva, 1993; p72. [3] Marín JM, Pozo OJ, Sancho JV, Pitarch E, López FJ, Hernández F. [J]. Journal of mass spectrometry, 2006, 41: [4] Kawata K, Ibaraki T, Tanabe A, Yagoh H, Shinoda A, Suzuki H, Yasuhara A. [J]. Chromatography A, 2001, 911: [5] Cavalli S, Polesello S, Saccani G. [J]. Chromatography A, 2004, 1039: [6] 傅 永 霖, 杨 文 君.[J]. 环 境 与 健 康 杂 志, 1985, 2(4): [7] Alpmann A, Morlock G. [J]. Journal of Separation Science, 2007, 31(1): [8] 于 红 霞, 林 志 芬, 杨 怡, 徐 铁 莲, 冯 建 芳, 王 连 生.[J]. 膜 科 学 与 技 术, 2002, 22(3): [9] 汤 颋, 汪 霄, 汪 浩, 鲁 宝 权.[J]. 环 境 与 预 警, 2009, 1(2): [10] Nordhaus RS, Nair LM, Anderson JM. [J]. Journal of Chromatography A, 1994, 671(1-2): Solid Phase Extraction Disk-High Performance Liquid Chromatography Determination of Acrylamide in Tap Water ZHANG Bo, QI Yue, GAO He-nan, BAO James J.* (School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University, Tianjin , China) Abstract: Acrylamide is recognized as a carcinogen. According to the rules of WHO, the concentration of acrylamide in the tap water should under the 0.5 μg/l. In this paper, using SPE disk, HPLC and UV-Vis, we established a method of rapid enrichment and determination of the residual acrylamide in tap water. Compared with the absorption rate and recovery rate, we chose activated carbon as the adsorbent and pure methanol as the eluant. Under the chromatographic conditions of 5% methanol, flow rate: 0.5 ml/min, we realized the separation between acrylamide and other impurities. We enriched the acrylamide rapidly in 500 ml tap water via activated carbon-spe disk, and the recovery rate of water sample is 100.2%, recoveries of spiked samples is 79.96%, the concentration of acrylamide in one tap water sample is μg/l, which is corresponded with the WHO s standard. Keywords: Acrylamid; Solid Phase Extraction disk; Activated carbon; Tap water; High performance liquid chromatography. 67

73 中 空 纤 维 膜 液 液 微 萃 取 法 测 定 盐 酸 普 罗 帕 酮 - 蛋 白 质 结 合 率 宝 贵 荣 *, 梁 清 刚, 闫 晨, 包 建 民 2 ( 天 津 市 南 开 区 卫 津 路 92 号 天 津 大 学 药 物 科 学 与 技 术 学 院, 邮 编 ) 血 清 是 血 浆 中 除 去 纤 维 蛋 白 后 分 离 出 的 淡 黄 色 透 明 液 体, 即 纤 维 蛋 白 已 被 除 去 的 血 浆 其 主 要 作 用 是 提 供 基 本 营 养 物 质 提 供 激 素 和 各 种 生 长 因 子 提 供 结 合 蛋 白 盐 酸 普 罗 帕 酮 化 学 名 为 3- 苯 基 -1-[2-[3-( 丙 氨 基 )-2- 羟 基 丙 氧 基 ] 苯 基 ]-1- 丙 酮 盐 酸 盐, 是 一 种 临 床 常 用 的 预 防 和 治 疗 室 上 性 心 律 的 Ⅰ 类 抗 心 律 失 常 药 物 [1], 为 达 到 抗 心 律 失 常 效 果, 有 时 服 药 剂 量 较 大, 这 样 有 可 能 会 引 起 相 关 临 床 不 良 反 应 [2] 因 此 研 究 盐 酸 普 罗 帕 酮 与 牛 血 清 (BSA) 之 间 的 相 互 作 用, 对 于 提 高 用 药 的 科 学 性, 了 解 药 物 分 子 在 体 内 的 转 运 和 代 谢 等 具 有 重 要 意 义 1 实 验 部 分 1.1 计 算 公 式 如 下 : C [3] 蛋 白 结 合 率 的 计 算 公 式 : r = C b p = n k c m i i f i= 1 1+ kic f Cb 为 结 合 药 物 的 浓 度 Cp 为 蛋 白 的 总 浓 度 Cf 为 有 利 药 物 浓 度 ni 为 每 个 蛋 白 分 子 结 合 的 药 物 分 子 数 Ki 为 平 衡 常 数 m 为 蛋 白 分 子 上 结 合 位 点 的 数 富 集 倍 数 计 算 公 式 [4] 如 下 : C E = C a. final s. initial 式 中 Ca.final 为 萃 取 后 有 机 相 中 药 物 的 浓 度 ;Cs.initial 为 样 品 中 初 始 药 物 浓 度 logp 的 计 算 公 式 [5] : C p = C o w 式 中 CO 为 有 机 相 中 的 药 物 浓 度 Cw 为 水 相 中 药 物 浓 度 1.2 仪 器 与 试 剂 高 效 液 相 色 谱 仪 ( 岛 津 ) 紫 外 检 测 器 486 泵 紫 外 分 光 光 度 计 ( 岛 津 ) 偏 氟 乙 烯 中 空 纤 维 膜 (PT101207D Porosity:62% O.D:1.82 mm ID : 1.50mm Markel corporation USA) 震 荡 器 ( 太 仓 市 教 科 器 材 厂 HZ-9212S 恒 温 振 荡 器 ) 牛 血 清 ( 天 津 市 灏 洋 生 物 制 品 科 技 有 限 责 任 公 司 ) 盐 酸 普 罗 帕 酮 ( 山 东 省 平 原 制 药 厂 ) 水 浴 锅 实 验 用 水 Milli-Q 系 统 ( 美 国 Millipore 公 司 ) ph 计 ( 雷 磁 PHS-3C); 甲 醇 乙 腈 为 色 谱 纯 其 他 试 剂 均 为 分 析 纯 : 三 乙 胺 正 辛 醇 碳 酸 氢 钠 碳 酸 钠 乙 醇 磷 酸 1.3 色 谱 条 件 与 溶 液 的 配 制 及 萃 取 方 法 按 照 药 典 (2005) 的 方 法 提 取 盐 酸 普 罗 帕 酮 溶 液 0.1M 碳 酸 钠 和 碳 酸 氢 钠 溶 液 按 不 同 体 积 比 来 配 置 不 同 ph 溶 液 液 相 条 件 : C18 HPLC 柱 子 ODS Hypersil Thermo Dim ( mm,5µm) 流 动 相 : 甲 醇 : 乙 腈 :1% 三 乙 胺 的 体 积 比 为 50:7.5:42.5 ph 为 3, 用 磷 酸 调 节 ; 流 速 :0.8mL/min; 进 样 量 为 20µL; 检 测 波 长 :240nm; 柱 温 :37 2 通 讯 联 系 人 : 包 建 民, 男, 天 津 大 学 特 聘 教 授, 长 江 学 者, 从 事 药 物 分 析 研 究, Tel : (022) 天 津 市 科 技 发 展 计 划 项 目 编 号 :08CZKFSH00500 和 05YFGHHZ01600 * 第 一 作 者 : 宝 贵 荣, 女, 博 士 研 究 生 baoguirong32@yahoo.com.cn 68

74 中 空 纤 维 膜 截 成 约 3 cm 的 小 段, 用 甲 醇 超 声 清 洗 15min, 以 除 去 表 面 杂 质, 晾 干 中 空 纤 维 膜 的 一 段 封 死, 注 入 25μL 的 正 辛 醇 在 室 温 下 将 装 有 正 辛 醇 的 中 空 纤 维 膜 置 于 盐 酸 普 罗 帕 酮 溶 液 中, 在 振 荡 器 上 震 荡 3 小 时, 震 荡 速 度 为 120rpm/ min 把 萃 取 液 用 高 效 液 相 色 谱 进 行 分 析 1.4 蛋 白 结 合 率 在 2mL 的 瓶 子 中 加 入 0.5mL BSA 和 一 定 体 积 的 盐 酸 普 罗 帕 酮 的 储 备 液, 在 37 的 水 浴 锅 中 恒 温 2 小 时, 然 后 加 入 ph=10 的 碳 酸 钠 和 碳 酸 氢 钠 缓 冲 液 加 入 正 辛 醇 的 中 空 纤 维 膜 放 入 此 溶 液 当 中 进 行 萃 取 振 动 3 小 时 后 用 高 效 液 相 色 谱 测 定 正 辛 醇 和 样 品 溶 液 中 的 游 离 药 物 浓 度, 进 一 步 计 算 蛋 白 结 合 率 2 结 果 2.1 膜 之 间 的 对 比 本 实 验 选 择 :Porosity:23% 50% 62% 三 种 偏 氟 乙 烯 中 空 纤 维 作 为 液 膜 载 体, 考 查 其 对 萃 取 效 率 随 时 间 变 化 的 效 应 实 验 结 果 表 明, 萃 取 时 间 相 同 时,62% 的 富 集 倍 数 最 好, 因 此 在 以 后 的 实 验 中 选 择 62% 中 空 纤 维 膜 为 液 膜 载 体 2.2 ph 值 的 选 择 中 空 纤 维 膜 萃 取 中, 水 溶 液 的 ph 值 对 富 集 倍 数 影 响 极 大, 因 此 在 萃 取 前 样 品 溶 液 通 常 被 调 节 到 合 适 的 ph 值, 以 减 少 分 析 物 的 离 解 并 保 持 中 性 分 子 的 状 态, 增 大 分 析 物 在 萃 取 剂 中 的 溶 解 度, 从 而 增 大 萃 取 效 率 [9] 盐 酸 普 罗 帕 酮 的 pka 值 为 9.62, 水 溶 液 ph 值 高 于 pka 值 时, 盐 酸 普 罗 帕 酮 以 中 性 分 子 的 形 式 被 萃 取 到 萃 取 剂 中, 如 果 水 溶 液 ph 值 比 10 大 就 在 高 效 液 相 中 检 测 不 出 来 图 (1) 和 综 合 考 虑, 在 后 续 实 验 中 样 品 溶 的 ph 值 调 节 到 盐 效 应 的 影 响 加 入 无 机 盐 类 ( 如 NaCl 等 ) 的 目 的 是 利 用 盐 析 作 用 降 低 药 物 在 水 溶 液 中 的 溶 解 度, 提 高 萃 取 效 率 实 际 上, 盐 析 作 用 与 药 物 的 性 质 有 关, 对 某 些 药 物 不 起 作 用 甚 至 有 抑 制 作 用 [6], 原 因 为 电 解 质 的 存 在 改 变 了 萃 取 膜 的 物 理 特 性, 从 而 改 变 了 分 析 物 在 有 机 溶 剂 中 的 扩 散 速 率 [6] 在 本 实 验 中, 通 过 向 样 品 溶 液 中 加 入 0 20%(w/v) 的 氯 化 钠 来 研 究 离 子 强 度 对 盐 酸 普 罗 帕 酮 的 萃 取 效 果 影 响 从 图 (2) 我 们 可 以 看 出 盐 酸 普 罗 帕 酮 的 萃 取 效 果 随 氯 化 钠 浓 度 的 增 加 而 明 显 曾 强 因 此, 萃 取 过 程 中 样 品 溶 液 中 添 加 20% 氯 化 钠 最 佳 萃 取 条 件 ph 的 影 响 盐 效 应 峰 面 积 峰 面 积 % 10% 20% ph 值 氯 化 钠 浓 度 图 1 ph 对 萃 取 效 率 影 响 图 2 盐 对 萃 取 效 率 影 响 2.4 体 积 的 选 择 69

75 实 验 中 样 品 体 积 也 会 对 分 析 物 的 富 集 倍 数 产 生 影 响 本 文 考 察 了 ml 样 品 体 积 体 积 对 萃 取 效 率 的 影 响 实 验 结 果 如 表 1, 萃 取 样 品 体 积 的 增 加 而 富 集 倍 数 增 加 表 1 样 品 体 积 对 萃 取 效 率 的 影 响 4 ml 溶 液 用 25µL 装 正 辛 醇 中 空 纤 维 膜 萃 取 1.8 ml 溶 液 用 25µL 装 正 辛 醇 中 空 纤 维 膜 萃 取 浓 度 µg/ml 膜 内 峰 面 积 膜 外 峰 面 积 LogP 最 大 富 集 倍 数 工 作 曲 线 盐 酸 普 罗 帕 酮 的 乙 醇 提 取 液, 稀 释 成 一 系 列 不 同 浓 度 的 溶 液 以 峰 面 积 对 相 应 的 盐 酸 普 罗 帕 酮 浓 度 做 工 作 曲 线 工 作 曲 线 的 线 性 回 归 方 程 为 :Y= 935X+829,R 2 = 其 中 Y 为 峰 面 积,X 为 浓 度 (µg/ml) 结 果 表 明, 在 µg/mL 范 围 内, 盐 酸 普 罗 帕 酮 浓 度 与 峰 面 积 呈 良 好 的 线 性 关 系 2.6 精 密 度 试 验 精 密 取 0.5 ml 样 品 溶 液, 用 碳 酸 缓 冲 溶 液 (0.1mol/L) 定 溶 于 100 ml 容 量 瓶 中, 取 于 1.8mL 分 别 装 入 小 瓶 中, 分 别 放 入 25µL 正 辛 醇 的 中 空 纤 维 膜 萃 取 3 小 时, 萃 取 后 取 10µL 样 品 稀 释 50 倍 后 直 接 进 液 相 分 析,RSD 为 2.3% 从 该 结 果 可 以 看 出 良 好 的 精 密 度 2.7 重 复 性 试 验 取 一 份 盐 酸 普 罗 帕 酮 的 溶 液, 稀 释 至 25 ml, 重 复 进 样 5 次, 测 得 峰 面 积 值 的 RSD 为 0.28% 说 明 该 色 谱 方 法 具 有 良 好 的 重 现 性 3 讨 论 随 着 社 会 的 不 断 发 展 进 步, 绿 色 低 碳 环 保 的 样 品 前 处 理 工 作 得 到 了 很 多 分 析 研 究 者 的 关 注 分 析 化 学 发 展 方 的 主 要 方 向 是 少 量 或 不 用 溶 剂 的 样 品 处 理 方 法 液 相 微 萃 取 技 术 以 其 自 身 独 特 的 优 点 备 受 关 注, 中 空 纤 维 膜 液 - 液 微 萃 取 与 高 效 液 相 色 谱 (HPLC) 联 用 直 接 测 定 盐 酸 普 罗 帕 酮 与 蛋 白 质 结 合 率 新 方 法, 对 影 响 微 萃 取 的 各 种 因 素 进 行 了 优 化 该 方 法 操 作 简 单 快 速 成 本 低, 而 且 克 服 了 传 统 方 法 的 很 多 缺 点 这 种 微 萃 取 技 术 在 生 物 样 品 分 析 应 用 中 具 有 很 大 潜 力 参 考 文 献 [1] 周 大 炜, 李 发 美. [J]. 色 谱, 2003, 21(2): [2] 倪 宏 刚, 宁 满 霞, 郑 建 斌 [J]. 分 析 测 试 学 报,2004,23(2): [3] 傅 献 彩. 物 理 化 学 [M]. 高 等 教 育 出 版 社 [4] Anett Bjørhovde, Trine Grønhaug Halvorsen et all [J].Analytica Chimica Acta 2003 (491 ) [5] 付 华 峰, 关 继 禹, 等. [J]. 色 谱. 2006,24(6): [6] 陶 俑. 博 士 论 文 [M]. 中 国 科 学 技 术 大 学 ( 下 转 第 73 页 ) 70

76 HPLC 法 初 探 酶 解 对 黄 芪 总 皂 苷 组 成 的 影 响 钟 丹 丹, 张 金 红 ( 天 津 医 科 大 学 药 学 院, 天 津 ) 已 报 道 的 黄 芪 中 有 效 成 分 的 常 规 提 取 工 艺 大 多 采 用 水 提 法 和 醇 提 法 等 [1], 伴 随 现 代 工 业 工 程 技 术 的 迅 猛 发 展, 一 些 现 代 高 新 技 术 不 断 被 应 用 到 中 药 生 产 中, 但 这 些 方 法 对 仪 器 设 备 有 特 殊 要 求, 有 的 仅 限 于 实 验 室 使 用, 目 前 还 没 有 广 泛 推 广 到 工 业 生 产 中, 而 酶 解 辅 助 提 取 法 不 需 要 特 殊 设 备, 易 操 作 但 酶 解 是 否 会 破 坏 中 药 有 效 成 分 的 组 成 仍 有 争 议 [2] 本 研 究 用 HPLC 对 酶 解 和 非 酶 解 提 取 的 黄 芪 总 皂 苷 进 行 比 较 1 实 验 部 分 1.1 材 料 与 方 法 仪 器 Agilent 1100 高 效 液 相 色 谱 仪 ;Alltech 2000ES 型 蒸 发 光 散 射 检 测 器 ;XWK-3A 空 气 泵 ( 天 津 市 华 生 分 析 仪 器 厂 );AT-330 柱 温 箱 ( 天 津 奥 特 赛 恩 斯 仪 器 有 限 公 司 );SZ-93 自 动 双 重 纯 水 蒸 馏 水 器 ( 上 海 强 运 科 技 有 限 公 司 );W2-100 旋 转 蒸 发 仪 ( 上 海 申 生 科 技 有 限 公 司 ); SHB-Ⅲ 循 环 水 式 多 用 真 空 泵 ( 郑 州 长 城 科 工 贸 有 限 公 司 ); 电 热 恒 温 水 浴 锅 ( 北 京 科 伟 永 鑫 实 验 仪 器 设 备 厂 );KS-600D 超 声 清 洗 机 ( 宁 波 科 生 仪 器 厂 );BP-211D 电 子 分 析 天 平 ( 德 国 赛 多 利 斯 公 司 );HITACHI 生 物 技 术 发 展 公 司 ) 药 品 与 试 剂 UV-3310 紫 外 可 见 分 光 光 度 计 ;HQ-60 涡 旋 混 合 器 ( 北 京 同 正 黄 芪 ( 购 自 天 津 市 药 材 公 司, 批 号 :Y Y Y ); 硫 酸 ( 固 安 县 清 远 化 工 厂, 分 析 纯 ); 无 水 乙 醇 ( 天 津 市 康 科 德 科 技 有 限 公 司, 分 析 纯 );75% 乙 醇 ( 天 津 基 准 化 学 试 剂 有 限 公 司, 分 析 纯 ); 正 丁 醇 ( 天 津 基 准 化 学 试 剂 有 限 公 司, 分 析 纯 ); 甲 醇 ( 天 津 康 科 德 科 技 有 限 公 司, 色 谱 纯 ); 流 动 相 用 水 为 重 蒸 水 1.2 黄 芪 总 皂 苷 的 提 取 酶 法 辅 助 提 取 称 取 干 燥 黄 芪 药 材 (1~2cm) 各 约 10g 于 10mL 圆 底 烧 瓶 中, 每 份 中 加 入 纤 维 素 酶 0.10g ( 占 药 材 干 重 0.7 %), 并 分 别 加 入 经 0.3% H2SO4 调 至 的 ph 为 5.0 的 蒸 馏 水 30mL, 于 50 水 浴 中 酶 解 2.5h, 过 滤, 酶 解 液 用 NaOH 溶 液 调 至 中 性, 备 用 于 药 材 中 加 入 70% 乙 醇 溶 液 80mL, 于 90 水 浴 中 回 流 1h, 过 滤, 滤 液 与 上 述 酶 解 液 合 并, 浓 缩 至 近 干, 用 10mL 蒸 馏 水 溶 解, 再 用 30mL 水 饱 和 正 丁 醇 溶 液 萃 取 4 次, 正 丁 醇 液 减 压 浓 缩 至 近 干, 减 压 真 空 干 燥, 得 黄 芪 粗 皂 苷 常 规 提 取 称 取 干 燥 黄 芪 药 材 (1~2cm) 各 约 10g 于 10mL 圆 底 烧 瓶 中, 加 入 经 0.3% H2SO4 调 至 的 ph 为 5.0 的 蒸 馏 水 30mL, 于 50 水 浴 中 酶 解 2.5h, 过 滤, 酶 解 液 用 NaOH 溶 液 调 至 中 性, 备 用 以 下 操 作 同 样 品 溶 液 的 配 制 称 取 适 量 粗 皂 苷, 用 无 水 乙 醇 超 声 溶 解 并 定 容 于 25 ml 容 量 瓶 中, 摇 匀, 滤 过, 取 续 滤 液, 即 得 黄 芪 总 皂 苷 供 试 品 液 1.4 黄 芪 甲 苷 标 品 溶 液 的 配 制 精 密 称 取 真 空 干 燥 至 恒 重 的 黄 芪 甲 苷 对 照 品 mg, 置 于 干 燥 的 25 ml 容 量 瓶 中, 加 无 水 乙 醇 超 声 溶 解 并 定 容 至 刻 度, 摇 匀, 得 黄 芪 甲 苷 对 照 品 溶 液 (0.501 mg/ml) 71

77 1.5 色 谱 条 件 Diamonsil C18(250mm 4.6mm,5μm) 色 谱 柱 ; 流 动 相 乙 腈 - 水 (32:68); 体 积 流 量 1.0 ml min -1 ; 进 样 量 20 μl; 检 测 器 漂 移 管 温 度 105 ; 载 气 流 速 为 2.5 L min -1 ; 柱 温 35 2 结 果 取 黄 芪 甲 苷 标 准 品 溶 液 常 规 法 提 取 的 黄 芪 总 皂 苷 溶 液 和 酶 法 辅 助 提 取 的 黄 芪 总 皂 苷 溶 液 分 别 进 样, 在 以 上 色 谱 条 件 下 进 行 测 定 结 果 如 下 : 图 3-15 黄 芪 甲 苷 对 照 品 的 HPLC 图 图 3-16 常 规 法 提 取 黄 芪 皂 苷 的 HPLC 图 图 3-17 纤 维 素 酶 法 提 取 黄 芪 皂 苷 的 HPLC 图 由 图 3-15~3-17 可 知, 酶 对 照 法 提 取 及 酶 解 提 取 的 黄 芪 总 皂 苷,HPLC 图 谱 的 峰 位 及 峰 数 基 本 一 致, 说 明 酶 法 提 取 黄 芪 总 皂 苷 并 不 会 破 坏 其 原 来 的 组 成 成 分 3 讨 论 文 献 已 报 道 的 黄 芪 皂 苷 测 定 方 法 有 : 比 色 法 薄 层 扫 描 法 HPLC 法 ( 反 相 紫 外 ) HPLC- 示 差 折 光 检 测 器 法 HPLC-ELSD 法 [3] 由 于 中 药 组 分 复 杂, 干 扰 严 重, 采 用 比 色 法 只 能 检 测 总 皂 苷 的 含 量, 无 法 反 映 各 种 皂 苷 的 变 化 ; 薄 层 扫 描 法 具 有 分 离 快 速 操 作 方 便, 但 重 现 性 较 差 HPLC- 紫 外 检 测 器 测 定, 溶 剂 背 景 难 以 消 除, 且 杂 质 噪 音 大, 皂 苷 仅 有 末 端 吸 收, 检 测 灵 敏 度 低, 误 差 较 大 HPLC- 示 差 折 光 检 测 法 受 流 动 相 组 成 温 度 压 力 变 化 的 影 响 较 大, 应 用 受 到 一 定 限 制 HPLC-ELSD 法 为 通 用 型 质 量 检 测 器, 其 信 号 响 应 与 被 测 物 72

78 的 质 量 成 正 比, 不 依 赖 于 被 测 物 的 光 学 特 性 及 官 能 团, 理 论 上 可 用 于 挥 发 性 低 于 流 动 相 的 任 何 组 分 的 检 测, 对 无 紫 外 吸 收 或 紫 外 末 端 吸 收 的 物 质 有 较 好 的 响 应 该 法 灵 敏 度 高, 干 扰 少, 所 以 对 酶 辅 助 提 取 后 黄 芪 皂 苷 的 分 析 采 用 HPLC-ELSD 法 4 结 论 本 文 考 察 了 酶 解 法 提 取 的 黄 芪 中 有 效 组 分 的 结 构 是 否 发 生 变 化, 对 酶 解 与 未 经 酶 解 提 取 的 黄 芪 总 皂 苷 进 行 比 较 分 析, 两 组 皂 苷 样 品 的 HPLC 色 谱 图 的 峰 位 及 峰 数 基 本 一 致 说 明 酶 法 提 取 不 会 对 黄 芪 中 主 要 药 效 组 分 黄 芪 总 皂 苷 成 分 的 结 构 造 成 影 响 参 考 文 献 : [1] Lin L Z,He X G,Lindenmaier M,et al.liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry study of the flavonoids of the roots of Astragalus mongholicus and A,membranaceus[J].J Chromatogr A,2000,876(1/2): [2] 韩 颂, 朱 飞, 李 晓 晖. 纤 维 素 酶 在 黄 芩 提 取 工 艺 中 应 用 的 初 步 探 索 [J]. 黑 龙 江 医 药 学 报.1997,10 (6): [3] 李 翔, 娄 子 洋, 柴 逸 峰. 黄 芪 药 材 中 有 效 成 分 定 量 分 析 方 法 研 究 进 展 [J]. 药 物 分 析 杂 志,2005,25: ( 上 接 第 70 页 ) Determination of protein- propafenone hydrochloride bingding by Hollow Fiber Membrane Liquid-Liquid Microextraction Guirong.Bao James J.Bao School of pharmaceutical science and technology, Tianjin University, 92 Weijin Road, Tianjin Abstract: To correctly and efficiently analyze propafenone hydrochloride, a new method has been created using hollow fiber solvent micro extraction. This method is able to determine the partition coefficient of an organic compound between the water phase and the n-octanol phase. Some advantages to this method include increased speed, easier maneuvering, and a lack of large volume sample consuming. Several factors effecting the extraction enrichment factor are greatly optimized, such as the salt out effect and the ph value of the aqueous. Overall, this method is an improvement over previous techniques because it has enhanced the speed, simplified the process, and lessened the negative impact on the environment. Key words:hollow fiber membrane ; high performance liquid chromatography ( HPLC) ; propafenone hydrochloride; Bovine Serum Albumin(BSA). 73

79 柱 前 衍 生 - 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 饮 用 水 中 草 甘 膦 残 留 量 的 研 究 夏 义 平 1, 李 建 平 2, 马 永 民 3 ( 天 津 市 疾 病 预 防 控 制 中 心,300011) 草 甘 膦 (glyphosate), 化 学 名 为 N-( 膦 酰 基 甲 基 ) 甘 氨 酸, 属 于 弱 有 机 酸, 是 一 种 常 用 的 水 溶 性 除 草 剂 近 年 来, 随 着 转 基 因 抗 草 甘 膦 作 物 的 发 展, 草 甘 膦 用 量 逐 年 增 加, 已 成 为 世 界 上 应 用 最 广 产 量 最 大 的 农 药 品 种 [1] GB 生 活 饮 用 水 卫 生 标 准 规 定, 草 甘 膦 在 饮 用 水 中 的 含 量 不 得 超 过 0.700mg/L [2] 目 前, 水 中 草 甘 膦 的 检 测 方 法 主 要 有 液 相 色 谱 法 [3] 离 子 色 谱 法 [4] 和 气 相 色 质 谱 联 用 法 [5], 采 用 质 谱 检 测, 仪 器 设 备 昂 贵, 不 易 推 广 GB 生 活 饮 用 水 标 准 检 验 方 法 [6] 中 草 甘 膦 的 检 测 采 用 的 是 柱 后 衍 生 离 子 交 换 色 谱 法, 在 色 谱 柱 后 增 加 自 动 衍 生 设 备, 操 作 繁 琐 且 不 易 掌 握 本 实 验 采 用 柱 前 衍 生 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 饮 用 水 中 草 甘 膦 含 量, 试 验 结 果 表 明, 该 法 简 便 快 速, 稳 定 可 靠 1 材 料 与 方 法 1.1 仪 器 与 试 剂 1200 型 高 效 液 相 色 谱 仪 ( 美 国 安 捷 伦 公 司, 配 荧 光 检 测 器 ),200uL 微 量 加 样 器 试 剂 除 另 有 说 明 外, 均 为 分 析 纯 甲 醇 ( 色 谱 纯 ), 膦 酸 二 氢 钾, 硼 酸, 氯 化 钠, 氢 氧 化 钠, 次 氯 酸 钠 溶 液 ( 有 效 氯 10.9), 草 甘 膦 标 准 溶 液 [ρ( 草 甘 膦 )=10.0μg/mL]( 农 业 部 环 境 保 护 科 研 检 测 所 ) 氧 化 剂 配 制 : 取 次 氯 酸 钠 溶 液 (2.1.6)3.5mL 加 水 稀 释 定 容 至 50mL, 取 2.0mL 该 溶 液, 0.348gKH2PO4,2.32gNaCl,0.08gNaOH, 加 100mL 水 溶 解 混 匀 衍 生 剂 配 制 : 称 取 邻 苯 二 甲 醛 100mg, 加 2mL 甲 醇 溶 解, 加 硼 酸 缓 冲 液 (PH=9.6)20mL, 再 加 入 2- 巯 基 乙 醇 0.16mL, 混 匀 1.2 标 准 系 列 溶 液 的 配 制 准 确 移 取 草 甘 膦 标 准 溶 液 1mL 于 10mL 容 量 瓶 中, 加 水 定 容 至 刻 度, 配 制 成 浓 度 为 1.0μg/mL 的 草 甘 膦 标 准 使 用 溶 液, 分 别 移 取 mL 标 准 使 用 液 至 10mL 容 量 瓶 中, 加 水 定 容 至 刻 度, 配 制 成 浓 度 为 μg/mL 标 准 系 列 溶 液 依 次 从 标 准 系 列 溶 液 中 取 200μL, 氧 化 衍 生 后 注 入 高 效 液 相 色 谱 仪, 记 录 各 次 色 谱 峰 面 积, 并 绘 制 峰 面 积 浓 度 (μg/ml) 曲 线 1.3 实 验 方 法 色 谱 条 件 色 谱 柱 :DIMA C18 柱,250mm 4.6mm,5um; 流 动 相 : 甲 醇 +0.05mol/L 膦 酸 二 氢 钾 (PH=6.0)+ 四 氢 呋 喃 = ; 流 速 :1.0mL/min; 柱 温 :25 ; 进 样 量 :50μL; 检 测 器 : 荧 光 检 测 器,Ex:230nm,Em:450nm 标 准 曲 线 绘 制 分 别 准 确 吸 取 μg/mL 的 草 甘 膦 标 准 系 列 各 200μL, 氧 化 衍 生 后 注 入 高 效 液 相 色 谱 仪, 记 录 各 次 色 谱 峰 面 积, 并 绘 制 峰 面 积 浓 度 (μg/ml) 曲 线 样 品 测 定 氧 化 74

80 取 水 样 200μL 于 自 动 进 样 瓶 中, 加 入 200 氧 化 剂, 振 摇 混 匀 衍 生 氧 化 后, 样 品 瓶 中 加 入 200uL 衍 生 剂, 混 匀, 迅 速 进 样, 测 定 其 峰 面 积 定 量 分 析 注 入 同 体 积 的 标 准 溶 液 和 水 样, 分 别 测 定 峰 面 积 响 应 值, 以 草 甘 膦 的 保 留 时 间 定 性, 根 据 峰 面 积, 通 过 标 准 曲 线 的 回 归 分 析 计 算 水 样 中 草 甘 膦 的 浓 度 2 结 果 与 讨 论 2.1 流 动 相 选 择 本 实 验 以 甲 醇 - 磷 酸 盐 缓 冲 液 为 流 动 相, 以 甲 醇 与 磷 酸 盐 缓 冲 液 混 合 溶 液 的 不 同 体 积 比 ( 分 别 为 ) 为 条 件 进 行 测 试, 结 果 表 明 甲 醇 - 磷 酸 盐 缓 冲 液 体 积 比 为 时, 样 品 的 出 峰 时 间 灵 敏 度 较 适 宜 流 动 相 中 加 入 少 量 四 氢 呋 喃 后 峰 形 较 好 2.2 检 测 波 长 选 择 本 实 验 采 用 检 测 器 的 光 源 为 氘 灯, 依 据 GB 生 活 饮 用 水 标 准 检 验 方 法 [6] 规 定, 选 择 激 发 波 长 为 230nm, 发 射 波 长 选 择 450nm, 测 定 灵 敏 度 好 图 1 为 草 甘 膦 标 准 色 谱 图 图 1 草 甘 膦 标 准 色 谱 图 2.3 标 准 曲 线 及 检 出 限 配 制 0.025~1.0μg/mL 的 标 准 系 列 溶 液, 分 别 取 200μL, 氧 化 衍 生 后 进 样 分 析, 以 浓 度 为 横 坐 标, 峰 面 积 为 纵 坐 标 绘 制 标 准 曲 线, 其 线 性 方 程 为 y= x , 相 关 系 数 r= 方 法 最 小 检 测 浓 度 为 25μg/L, 满 足 GB 生 活 饮 用 水 标 准 检 验 方 法 [6] 要 求 2.4 方 法 准 确 度 及 精 密 度 实 验 取 6 份 水 样 添 加 不 同 量 的 草 甘 膦 标 准 溶 液, 按 上 述 氧 化 衍 生 步 骤 进 行 实 验, 计 算 回 收 率 和 标 准 偏 差, 水 样 中 草 甘 膦 添 加 浓 度 分 别 0.05μg/mL 0.5μg/mL 结 果 见 表 1 表 1 草 甘 膦 准 确 度 与 精 密 度 实 验 结 果 (n=6) 加 入 量 (μg/ml) 测 定 值 (μg/ml) 回 收 率 (%) RSD(%) ~ ~ 样 品 测 定 采 用 本 方 法 检 测 出 厂 水 共 40 余 份 样 品, 均 未 检 出 草 甘 膦 ( 下 转 第 79 页 ) 75

81 大 管 区 带 电 泳 - 在 线 紫 外 检 测 技 术 对 有 机 酸 分 析 方 法 的 建 立 孙 小 春, 包 建 民 ( 天 津 大 学 药 物 科 学 与 技 术 学 院, 天 津 ) 有 机 酸 按 结 构 可 分 为 3 大 类, 即 脂 肪 族 类 芳 香 族 类 和 萜 类, 中 草 药 的 叶 根 特 别 是 果 实 中 广 泛 分 布 着 大 量 的 有 机 酸 近 年 来 发 现 许 多 有 机 酸 都 具 有 生 理 活 性, 如 抗 癌 抑 菌 止 血 镇 咳 和 祛 痰 等 作 用, 所 以 对 有 机 酸 类 化 合 物 的 分 离 分 析 显 得 尤 为 重 要 [1] 毛 细 管 电 泳 技 术 因 其 具 有 高 效 快 速 分 离 模 式 多 样 化 等 一 系 列 的 优 势 在 分 离 分 析 领 域 发 挥 着 重 要 作 用, 目 前 毛 细 管 区 带 电 泳 在 有 机 酸 的 分 离 分 析 研 究 中 得 到 广 泛 应 用 [2-5] 传 统 的 毛 细 管 电 泳 技 术, 由 于 细 内 径 毛 细 管 的 采 用 ( 常 用 50 μm 和 75 μm), 使 得 该 技 术 存 在 载 样 量 少 检 测 灵 敏 度 相 对 较 小 的 问 题, 本 实 验 中, 采 用 内 径 为 1000 μm 的 石 英 管 来 作 为 分 离 通 道, 同 时 为 了 及 时 有 效 的 消 除 焦 耳 热 的 影 响, 以 外 径 为 690 μm 的 毛 细 管 来 作 为 内 制 冷 通 道, 实 验 中 将 毛 细 管 区 带 电 泳 模 式 转 移 至 大 管 电 泳 系 统 中, 通 过 实 验 条 件 的 摸 索 和 优 化, 建 立 了 大 管 区 带 电 泳 技 术 对 有 机 酸 的 分 离 方 法, 成 功 分 离 了 六 种 有 机 酸, 并 将 该 方 法 应 用 于 市 售 酱 油 中 防 腐 剂 的 检 测, 进 一 步 证 明 了 大 管 区 带 电 泳 可 作 为 一 种 新 型 的 分 离 分 析 技 术 应 用 于 有 机 酸 化 合 物 的 研 究 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 与 试 剂 大 管 电 泳 系 统 ( 实 验 室 自 组 装 ),DL-180A 超 声 波 清 洗 仪 ( 上 海 之 信 仪 器 有 限 公 司 ); 未 涂 层 熔 融 石 英 毛 细 管 柱 ( 河 北 永 年 锐 沣 色 谱 器 件 有 限 公 司 );AL 104 电 子 天 平 Delta-320-S ph 计 ( 梅 特 勒 - 托 利 多 仪 器 ( 上 海 ) 有 限 公 司 ),S21-2 恒 温 磁 力 搅 拌 器 ( 上 海 司 乐 仪 器 有 限 公 司 ) 对 甲 苯 磺 酸 苯 甲 酸 邻 碘 苯 甲 酸 苯 乙 酸 肉 桂 酸 烟 酸 ( 天 津 大 学 科 威 公 司 ); 羟 乙 基 纤 维 素 (HEC, 郑 州 诚 信 化 工 有 限 公 司 ), 醋 酸 (36%) 无 水 乙 酸 钠 ( 天 津 大 学 科 威 公 司 ), 以 上 所 有 试 剂 均 为 分 析 纯 1.2 实 验 方 法 实 验 条 件 : 分 离 通 道 总 长 度 :15 cm; 有 效 长 度 :8 cm; 检 测 波 长 :214 nm; 进 样 量 : 200 nl; 进 样 方 式 : 负 极 压 力 进 样 ;20 mmol/l ph=4.0 醋 酸 缓 冲 溶 液 ( 含 0.6% HEC); 内 制 冷 水 流 速 :15 ml/min; 约 实 验 装 置 示 意 图 图 1 cartridge 示 意 图 3 8 1,2- 缓 冲 液 进 口,3- 进 样 毛 细 管,4,5- 中 空 纤 维 膜,6,7- 缓 冲 槽,8- 内 制 冷 毛 细 管,9- 石 英 管,10- 检 测 窗 口 通 讯 作 者 : 包 建 民, jbao007@gmail.com TeL:

82 2 结 果 2.1 缓 冲 液 ph 的 考 察 缓 冲 溶 液 的 ph 值 直 接 影 响 到 分 离 物 质 的 解 离 程 度, 从 而 会 对 分 离 效 果 产 生 不 同 程 度 的 影 响, 实 验 中 分 别 配 制 了 ph=3.6 ph=4.0 ph=4.5 和 ph=5.0 的 醋 酸 缓 冲 溶 液 (20 mmol/l), 对 这 一 因 素 进 行 了 考 察, 由 图 2 可 知, 当 ph 值 为 4.0 时 可 以 得 到 最 好 的 分 离 效 果 V o lta g e ( m V ) ( 4 ) ( 3 ) ( 1 ) p H = 3.6 ( 2 ) p H = 4.0 ( 3 ) p H = 4.5 ( 4 ) p H = 5.0 ( 2 ) ( 1 ) R e te n tio n T im e (m in ) 图 2 缓 冲 液 ph 对 结 果 的 影 响 2.2 缓 冲 液 浓 度 的 考 察 缓 冲 溶 液 浓 度 的 变 化 也 是 影 响 分 离 结 果 的 因 素 之 一, 溶 液 浓 度 过 低, 其 缓 冲 能 力 较 小, 不 易 维 持 缓 冲 液 ph 值 的 稳 定, 而 当 浓 度 过 高 时, 会 导 致 体 系 中 产 生 大 量 的 焦 耳 热, 两 种 情 况 下 均 会 影 响 柱 效 实 验 中 配 制 了 10 mmol/l 20 mmol/l 和 30 mmol/l 三 个 浓 度 的 缓 冲 液, 考 察 了 浓 度 的 变 化 对 有 机 酸 混 合 物 分 离 结 果 的 影 响, 由 图 3 可 以 看 出 在 20 mmol/l 醋 酸 盐 缓 冲 液 体 系 中 可 以 得 到 较 为 满 意 的 分 离 结 果, 所 以 选 择 缓 冲 液 最 佳 浓 度 为 20 mmol/l ( a ) m m o l/l ( b ) m m o l/l ( c ) m m o l/l A b s o r b a n c e ( m V ) ( a ) ( b ) 0 ( c ) R e te n tio n T im e (m in ) 图 3 缓 冲 液 浓 度 对 结 果 的 影 响 77

83 2.3 分 离 电 压 的 考 察 一 般 而 言 在 毛 细 管 电 泳 时, 若 电 泳 时 产 生 的 焦 耳 热 可 以 忽 略, 目 标 组 分 的 柱 效 和 分 离 度 是 随 着 外 加 电 压 的 升 高 而 增 加 的, 但 是 如 果 分 离 电 压 过 分 增 大, 会 在 电 泳 过 程 中 产 生 较 大 的 焦 耳 热 从 而 降 低 分 离 效 率, 在 本 实 验 中, 分 别 选 取 1500 V, 2000 V, 2500 V, 3000V, 3500 V, 4000 V 作 为 分 离 电 压 来 考 察 其 对 分 离 效 果 的 影 响, 从 而 选 取 适 宜 的 施 加 电 压 范 围, 实 验 结 果 见 图 4 根 据 图 4 中 的 数 据, 依 次 求 算 每 个 分 离 电 压 下 六 种 组 分 的 平 均 理 论 塔 板 数, 然 后 以 平 均 理 论 塔 板 数 对 电 压 作 图, 结 果 如 图 5 所 示, 在 3000 V 电 压 时, 体 系 的 分 离 效 率 最 高, 原 因 在 于 高 电 压 时 导 致 焦 耳 热 的 积 累, 导 致 分 离 效 率 下 降 Absorbance(mV) Time(min) D 5 C A V B V C V D V 6 B A Theoretical plate number( n/m ) 7.2x x x x x x x x x x x x x x x x x V oltage( V ) 图 4 分 离 电 压 对 结 果 的 影 响 图 5 不 同 电 压 下 柱 效 计 算 2.5 酱 油 中 防 腐 剂 的 检 测 苯 甲 酸 作 为 防 腐 剂 广 泛 应 用 于 酱 油 水 果 汁 果 酱 等 食 品 中, 国 家 有 关 标 准 规 定 酱 油 中 苯 甲 酸 的 量 不 得 超 过 1 g/kg 本 实 验 中 利 用 大 管 区 带 电 泳 模 式 对 市 售 某 一 品 牌 酱 油 中 防 腐 剂 的 种 类 及 含 量 做 了 研 究 酱 油 中 苯 甲 酸 的 测 定 原 理 苯 甲 酸 不 易 溶 于 水, 一 般 以 盐 的 形 式 存 在 于 食 品 中, 本 实 验 中 将 样 品 酸 化 后, 用 乙 醚 提 取 纯 化 苯 甲 酸, 利 用 大 管 区 带 电 泳 对 提 取 样 品 进 行 分 离 测 定 标 准 曲 线 的 建 立 将 1.0 mg/ml 的 苯 甲 酸 储 备 液 稀 释 成 浓 度 分 别 为 0.04 mg/ml 0.08 mg/ml 0.12 mg/ml 0.16 mg/ml 0.20 mg/ml 0.24 mg/ml 的 标 准 使 用 液, 取 各 浓 度 溶 液 200 nl 依 次 进 行 分 析, 每 个 浓 度 平 行 测 定 三 次, 以 质 量 浓 度 (mg/ml) 为 横 坐 标, 峰 面 积 为 纵 坐 标 求 出 回 归 方 程 和 相 关 系 数, 其 线 性 方 程 为 y = x ,R 2 = , 结 果 表 明 在 0.04~0.24 mg/ml 范 围 内 浓 度 与 其 相 应 的 峰 面 积 成 良 好 的 线 性 关 系 酱 油 中 苯 甲 酸 浓 度 的 测 定 进 样 酱 油 提 取 液 样 品, 每 次 进 样 200 nl, 连 续 进 样 三 次, 求 取 平 均 峰 面 积, 计 算 酱 油 中 苯 甲 酸 浓 度 表 1 酱 油 样 品 进 样 峰 面 积 编 号 平 均 峰 面 积 通 过 计 算, 本 实 验 测 得 所 选 用 的 酱 油 样 品 中 苯 甲 酸 添 加 量 为 g/kg, 防 腐 剂 含 量 符 合 国 家 标 准 规 定 3 讨 论 78

84 本 研 究 利 用 大 管 区 带 电 泳 技 术 同 时 分 离 了 对 甲 苯 磺 酸 苯 甲 酸 苯 乙 酸 邻 碘 苯 甲 酸 肉 桂 酸 和 烟 酸 六 种 有 机 酸, 在 优 化 的 实 验 条 件 下,10 min 内 即 可 完 成 分 离, 实 验 操 作 简 单, 分 离 快 速, 最 后 又 将 建 立 的 分 析 方 法 应 用 于 实 际 样 品 中 有 机 酸 的 分 析, 结 果 表 明 该 方 法 可 作 为 一 种 新 型 的 常 规 的 分 析 技 术 用 于 有 机 酸 的 分 离 研 究 中 参 考 文 献 [1] 马 海 乐, 杨 恒 星, 代 春 华.[J]. 食 品 科 学, 2005, 26(2): [2] Rivasseau C, Boisson AM. [J]. Journal of Chromatography A, 2006, 1129(2): [3] He J, Chen SW, Yu ZN. [J]. Journal of Chromatography A, 2002, 973(1-2): [4] Li W, Gong SX, Wen DW. [J]. Journal of Chromatography A, 2004, 1049(1-2): [5] Mardones C, Hitschfeld A, Contreras A. [J]. Journal of Chromatography A, 2005, 1085(2): Analysis of Organic Acids by Wide-bore Zone Elctrophoresis with UV Detection SUN Xiao-chun, James J. Bao* School of pharmaceutical science and technology, Tianjin University, 92 Weijin Road, Tianjin Abstract: Biological activity of many organic acids have been found in recent years, and capillary electrophoresis plays an important role in the analysis of organic acids. In this paper, we established a method to analyze organic acids using wide-bore zone electrophoresis (WBZE) with UV Detection. Six kinds of organic acids are separated successfully under the optimized conditions, and the process can be completed within 10 min. Then, the established method was used to analyze real samples. The results show that this new method can be used to analyze organic acids. Key words: Capillary zone electrophoresis; Wide-bore zone elctrophoresis; Organic Acid. ( 上 接 第 75 页 ) 3 结 论 采 用 柱 前 衍 生, 高 效 液 相 色 谱 - 荧 光 检 测 器 测 定 水 中 草 甘 膦, 方 法 简 便 快 速 准 确, 检 出 限 符 合 要 求 无 需 特 殊 设 备, 适 于 基 层 检 测 机 构 普 及 开 展 相 关 检 测 项 目 该 方 法 适 用 于 饮 用 水 中 草 甘 膦 残 留 量 的 检 测 参 考 文 献 : [1] 顾 友 多, 范 宾, 董 学 胜, 等. 草 甘 膦 的 危 险 性 分 类 研 究. 职 业 卫 生 与 应 急 救 援,2008,26(2): [2] GB 生 活 饮 用 水 卫 生 标 准. [3] 侯 占 伟, 王 朝 虹. 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 水 中 草 甘 膦. 刑 事 技 术,2003(6):9-10. [4] 方 黎, 苏 宇 亮, 吴 杰, 等. 离 子 色 谱 法 测 定 饮 用 水 中 的 草 甘 膦. 现 代 科 学 仪 器,2008(2): [5] 程 雪 梅, 周 敏. 气 相 色 谱 法 - 质 谱 法 测 定 香 蕉 和 灌 溉 水 中 的 草 甘 膦 及 其 代 谢 物 的 残 留 量. 色 谱,2004, 22(3) : [6] GB/T 生 活 饮 用 水 标 准 检 验 方 法. 79

85 酒 石 酸 托 特 罗 定 有 关 物 质 检 查 方 法 研 究 靳 朝 东, 许 瑞 征, 薛 津 ( 天 津 药 物 研 究 院 分 析 测 试 中 心, 天 津 ) 酒 石 酸 托 特 罗 定 为 一 种 毒 蕈 碱 受 体 拮 抗 剂 新 药, 目 前 已 在 包 括 美 国 英 德 国 在 内 的 多 个 国 家 上 市, 临 床 上 用 于 治 疗 膀 胱 活 动 过 度 引 起 的 的 尿 急 尿 频 急 迫 性 尿 失 禁 等 症 状 为 控 制 药 品 的 内 在 质 量, 建 立 有 关 物 质 检 查 方 法 很 有 必 要 本 文 采 用 反 相 高 效 液 相 色 谱 法, 建 立 了 酒 石 酸 托 特 罗 定 原 料 药 的 有 关 物 质 检 查 方 法, 获 得 了 良 好 的 分 离 效 果, 可 达 到 有 效 控 制 药 品 质 量 的 目 的 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 与 试 剂 高 效 液 相 色 谱 系 统 :Rainin SD-200 泵,Rainin UV-C 紫 外 检 测 器,SP-4600 积 分 仪, HP1100 液 相 系 统 磷 酸 氢 二 铵 分 析 纯, 甲 醇 色 谱 纯, 去 离 子 水 酒 石 酸 托 特 罗 定 原 料 药 六 批, 均 为 本 院 合 成 室 合 成 并 制 备 1.2 溶 液 制 备 供 试 品 溶 液 的 制 备 取 酒 石 酸 托 特 罗 定 样 品, 加 流 动 相 适 量, 振 摇 使 溶 解, 加 流 动 相 制 成 每 1mL 中 约 含 0.4mg 的 酒 石 酸 托 特 罗 定 溶 液, 摇 匀, 作 为 供 试 品 溶 液 对 照 溶 液 的 制 备 精 密 量 取 酒 石 酸 托 特 罗 定 溶 液 供 试 品 溶 液 1mL, 置 100mL 量 瓶 中, 加 流 动 相 稀 释 至 刻 度, 摇 匀 即 得 1.3 测 定 方 法 取 本 品, 加 流 动 相 适 量, 振 摇 使 溶 解, 加 流 动 相 制 成 每 1mL 中 约 含 0.4mg 的 酒 石 酸 托 特 罗 定 溶 液, 作 为 供 试 品 溶 液, 精 密 量 取 供 试 品 溶 液 1mL, 置 100mL 量 瓶 中, 加 流 动 相 稀 释 至 刻 度, 作 为 对 照 溶 液 量 取 对 照 溶 液 20uL, 注 入 液 相 色 谱 仪, 调 节 检 测 器 灵 敏 度, 使 主 成 分 峰 为 满 量 程 的 10~20%, 量 取 供 试 品 溶 液 20μL, 注 入 液 相 色 谱 仪, 记 录 色 谱 图 至 主 成 分 峰 保 留 时 间 的 2 倍, 供 试 品 溶 液 的 色 谱 图 中 如 有 杂 质 峰, 各 杂 质 峰 的 峰 面 积 不 得 大 于 对 照 液 主 峰 的 峰 面 积 的 一 半 (0.5%); 各 杂 质 峰 峰 面 积 的 和, 不 得 大 于 对 照 溶 液 主 峰 的 峰 面 积 (1.0%) 2 结 果 2.1 色 谱 条 件 的 选 定 色 谱 柱 为 Kromasil C18(5μm) 200mm 4.6mm I.D. 不 锈 钢 柱 ( 天 津 市 三 维 色 谱 仪 器 配 件 厂 ) 流 动 相 为 甲 醇 mol/L 磷 酸 氢 二 铵 溶 液 (ph3.0±0.1) 52:48; 检 测 波 长 220nm; 流 速 为 1mL/min; 进 样 量 20μL; 柱 温 30 ; 检 测 器 灵 敏 度 0.2AUFS 在 选 定 的 色 谱 条 件 下, 酒 石 酸 约 在 2 分 钟 出 峰, 托 特 罗 定 约 在 15 分 左 右 出 峰, 在 托 特 罗 定 主 峰 前 有 两 个 未 知 杂 质 峰 托 特 罗 定 与 杂 质 峰 可 达 到 基 线 分 离 2.2 方 法 专 属 性 试 验 检 测 波 长 的 选 择 作 者 简 介 : 靳 朝 东 (1962-), 男, 河 北 人, 研 究 员, Tel: , jincd@tjipr.com 80

86 以 流 动 相 为 溶 剂, 制 成 含 酒 石 酸 托 特 罗 定 0.02mg/mL 的 溶 液, 测 定 其 紫 外 吸 收 光 谱 图, 测 得 酒 石 酸 托 特 罗 定 在 283nm 有 一 紫 外 吸 收 峰, 但 吸 收 值 较 小, 而 本 品 在 末 端 的 吸 收 值 比 较 高, 所 以 选 择 220nm 为 测 定 波 长 破 坏 性 试 验 对 酒 石 酸 托 特 罗 定 进 行 了 酸 性 碱 性 氧 化 光 照 以 及 加 热 破 坏 性 实 验, 结 果 表 明 : 本 品 经 苛 性 破 坏 性 试 验 后, 杂 质 含 量 均 有 所 增 加, 但 托 特 罗 定 主 峰 与 杂 质 峰 能 很 好 的 分 离, 说 明 该 色 谱 条 件 对 样 品 的 降 解 产 物 能 够 很 好 的 检 出 2.3 线 性 关 系 取 本 品 约 25mg, 精 密 称 定, 置 25mL 量 瓶 中, 加 流 动 相 配 制 成 每 1mL 约 含 酒 石 酸 托 特 罗 定 1.0mg 的 溶 液, 分 别 精 密 吸 取 和 7.5mL 置 10mL 量 瓶 中, 分 别 加 流 动 相 稀 释 至 刻 度, 相 应 的 浓 度 为 和 0.968mg/mL, 分 别 取 20μL 注 入 液 相 色 谱 仪, 以 酒 石 酸 托 特 罗 定 浓 度 为 纵 坐 标, 以 相 应 的 峰 面 积 为 横 坐 标 (A) 进 行 线 性 回 归, 其 回 归 方 程 为 Y(mg/mL)= A , r= (n=7), 线 性 范 围 为 ~0.968mg/mL, 线 性 关 系 良 好 2.4 精 密 度 试 验 取 项 下 供 试 品 溶 液 照 上 述 色 谱 条 件 连 续 进 样 测 定 6 次, 结 果 酒 石 酸 托 特 罗 定 有 关 物 质 含 量 为 0.083%, 相 对 标 准 偏 差 (RSD) 为 1.90%(n=6) 2.5 最 小 检 出 限 取 对 照 溶 液 稀 释 至 不 同 浓 度, 分 别 注 入 液 相 色 谱 仪, 记 录 色 谱 图, 以 能 准 确 积 分 的 浓 度 作 为 最 小 检 出 限, 最 小 检 出 限 为 0.061ng(0.076%), 峰 面 积 为 稳 定 性 试 验 取 供 试 品 溶 液, 在 室 温 下 放 置 24 小 时 后 测 定, 结 果 表 明 样 品 的 有 关 物 质 含 量 没 有 变 化, 表 明 样 品 溶 液 在 室 温 下 24 小 时 内 稳 定 2.7 样 品 测 定 取 酒 石 酸 托 特 罗 定 样 品, 照 项 下 溶 液 制 备 方 法 制 备 供 试 品 溶 液, 照 1.3 项 下 方 法 测 定, 结 果 见 表 1, 色 谱 图 见 图 1 表 1 酒 石 酸 托 特 罗 定 6 批 样 品 有 关 物 质 检 查 结 果 批 号 有 关 物 质 含 量 (%) 未 检 出 0.51 未 检 出 讨 论 酒 石 酸 托 特 罗 定 在 283nm 处 有 一 小 的 吸 收 峰, 但 吸 收 系 数 较 小, 所 以 未 选 用 选 用 波 长 220nm 测 定, 灵 敏 度 约 为 283nm 的 4 倍, 但 当 加 大 进 样 量 时, 用 283nm 检 测 有 关 物 质 结 果 与 用 220nm 检 测 的 结 果 一 致 另 外, 在 220nm 检 测, 酒 石 酸 有 一 定 的 吸 收, 所 以 可 以 用 来 同 时 做 本 品 中 的 酒 石 酸 和 托 特 罗 定 的 鉴 别, 而 在 高 波 长 情 况 下, 酒 石 酸 几 乎 无 吸 收, 无 法 做 鉴 别 图 1 酒 石 酸 托 特 罗 定 有 关 物 质 HPLC 图 (220nm) 对 流 动 相 的 选 择, 分 别 试 验 了 甲 醇 -0.05mol/L 醋 酸 铵, 甲 醇 mol/L 磷 酸 二 氢 铵, 甲 醇 -0.01~0.05mol/L 磷 酸 氢 二 铵 等 流 动 相 系 统, 均 可 分 离 酒 石 酸 托 特 罗 定 及 其 有 关 物 质, 但 醋 酸 铵 在 220nm 的 吸 收 较 大 ;0.025mol/L 磷 酸 二 氢 铵 和 0.01mol/L 磷 酸 氢 二 铵 稍 有 拖 尾 现 象 ( 下 转 第 85 页 ) 81

87 基 质 固 相 分 散 - 分 子 印 迹 固 相 萃 取 联 用 测 定 土 壤 和 葡 萄 中 三 唑 类 杀 菌 剂 * 刘 维 娟, 张 玲, 郭 亚 萍, 张 智 超 ( 南 开 大 学 元 素 有 机 化 学 国 家 重 点 实 验 室, 南 开 大 学 天 津 市 农 药 科 学 重 点 实 验 室, 天 津 ) 基 质 固 相 分 散 (MSPD) 集 提 取 和 净 化 于 一 个 简 单 的 步 骤 中 完 成, 不 需 要 昂 贵 的 仪 器, 具 有 操 作 简 单 耗 时 少 等 诸 多 优 点, 但 由 于 所 用 的 分 散 剂 不 具 有 选 择 性, 因 而 在 色 谱 分 析 之 前 常 需 对 MSPD 提 取 液 作 进 一 步 净 化 [1] 本 研 究 利 用 分 子 印 迹 固 相 萃 取 (MISPE) 具 有 高 选 择 性 的 特 点, 运 用 MISPE 对 MSPD 提 取 液 进 行 净 化, 建 立 了 复 杂 基 质 ( 土 壤 和 葡 萄 ) 中 7 种 三 唑 类 农 药 的 多 残 留 分 析 方 法 该 方 法 将 MSPD 的 快 速 提 取 的 特 点 和 MISPE 的 高 选 择 性 的 特 点 结 合 起 来 目 前, 三 唑 类 杀 菌 剂 分 子 印 迹 聚 合 物 用 于 固 相 萃 取 的 研 究 尚 未 见 报 道, MSPD/MISPE 联 用 的 研 究 仅 有 2 篇 报 道 [2,3] 1 实 验 部 分 1.1 土 壤 和 葡 萄 3 种 类 型 的 农 田 土 壤 (A,B 和 C) 的 主 要 物 理 化 学 参 数 见 表 1, 其 中 土 壤 A 采 自 天 津, 土 壤 B 和 C 采 自 湖 南, 风 干 后 过 20 目 筛 葡 萄 购 自 本 地 菜 市 场 上 述 土 壤 和 葡 萄 用 本 研 究 建 立 的 方 法 均 未 检 出 分 析 物 表 1 三 种 土 壤 的 性 质 土 壤 ph 有 机 质 (%) 砂 粒 (%) 粉 粒 (%) 粘 粒 (%) A B C 分 子 印 迹 聚 合 物 (MIP) 的 合 成 准 确 称 取 g 三 唑 醇, 加 0.4 mmol MAA 和 0.6 ml 甲 苯, 将 混 合 液 放 在 冰 水 中 超 声, 然 后 放 在 冰 箱 中 冷 藏 一 夜 ; 将 2 mmol EGDMA 和 40 mg AIBN 加 入 上 述 混 合 液 后 超 声, 通 氮 气 5 min, 密 封, 于 60 水 浴 中 加 热 24 h 研 磨, 过 100 ~ 400 目 筛 ( µm), 用 甲 醇 / 乙 酸 (9/1 v/v) 溶 液 索 氏 提 取 除 去 模 板 后, 用 丙 酮 沉 降 一 夜 后, 用 红 外 灯 烘 干, 备 用 1.3 MSPD-MISPE 联 用 MSPD: 称 取 20.0 g 样 品 壤 置 于 研 钵 中, 加 入 1.00 ml 上 述 七 种 三 唑 类 杀 菌 剂 的 甲 醇 混 合 标 准 溶 液, 混 合 均 匀 置 于 通 风 橱 中, 至 溶 剂 挥 发 干 加 入 16 g 硅 胶,8 ml 水, 研 磨 均 匀 在 层 析 柱 下 端 放 小 块 脱 脂 棉, 依 次 填 入 5 g 无 水 硫 酸 钠 上 述 研 磨 混 合 物, 加 盖 滤 纸, 敲 实 用 30 ml 乙 酸 乙 酯 加 压 淋 洗 层 析 柱, 收 集 洗 脱 液, 旋 蒸 浓 缩 至 近 干 后 用 氮 气 吹 干, 用 5 ml 甲 苯 超 声 溶 解, 待 MISPE 净 化 MISPE: 依 次 用 甲 醇 / 乙 酸 (4/1 v/v) 二 氯 甲 烷 甲 醇 甲 苯 各 5 ml 将 MISPE 柱 ( mm, 具 有 C 筛 板 的 玻 璃 柱, 湿 法 装 填 250 mg MIP) 条 件 化 后, 将 上 述 MSPD 提 取 液 上 样, 用 6 ml 甲 苯 淋 洗 用 8 ml 乙 酸 乙 酯 洗 脱, 收 集 洗 脱 液, 用 氮 气 吹 干 洗 脱 液, 加 入 1.00 ml 甲 苯 超 声 溶 解, 待 GC-ECD 检 测 2 结 果 与 讨 论 2.1 MISPE 条 件 的 优 化 82

88 通 过 考 察 功 能 单 体 ( 甲 基 丙 烯 酸 丙 烯 酰 胺 苯 乙 烯 4- 乙 烯 基 吡 啶 ) 模 板 / 功 能 单 体 / 交 联 剂 的 比 例 致 孔 剂 ( 甲 苯 CH2Cl2 CHCl3 乙 腈 二 甲 基 甲 酰 胺 异 丙 醇 乙 酸 乙 酯 ) 及 用 量 等 聚 合 条 件 对 MIP 选 择 性 吸 附 能 力 的 影 响, 确 定 了 MIP 合 成 条 件 (1.2 节 ) 对 MISPE, 优 化 了 淋 洗 溶 剂 的 类 型 ( 甲 苯 和 CH2Cl2), 结 果 表 明, 用 致 孔 剂 甲 苯 淋 洗 时, 不 仅 能 破 坏 MIP 对 分 析 物 的 非 特 异 性 吸 附, 而 且 不 影 响 MIP 的 特 异 性 吸 附, 而 CH2Cl2 破 坏 MIP 的 特 异 性 吸 附, 故 确 定 甲 苯 为 淋 洗 溶 剂 进 一 步 优 化 了 洗 脱 溶 剂 的 类 型 ( 二 氯 甲 烷 乙 酸 乙 酯 丙 酮 和 甲 醇 ), 结 果 表 明 这 4 种 溶 剂 均 能 将 分 析 物 从 MISPE 柱 上 洗 脱 下 来, 考 虑 到 乙 酸 乙 酯 毒 性 最 小, 故 确 定 乙 酸 乙 酯 为 洗 脱 溶 剂 2.2 MSPD-MISPE 用 于 土 壤 样 品 的 前 处 理 制 备 3 种 土 壤 的 添 加 样 品, 设 置 3 个 添 加 水 平 : mg/kg 和 各 种 分 析 物 最 低 定 量 限 浓 度 ( 三 唑 酮 0.01 mg/kg, 三 唑 醇 多 效 唑 mg/kg, 烯 效 唑 0.02 mg/kg, 烯 唑 醇 0.01 mg/kg, 戊 唑 醇 双 苯 三 唑 醇 0.04 mg/kg) 经 过 MSPD 一 步 前 处 理 后 的 3 种 土 壤 样 品 中 各 分 析 物 的 回 收 率 和 相 对 标 准 偏 差 分 别 为 104 ~ 524% 和 6 ~ 16%, 杂 质 干 扰 特 别 严 重, 但 经 MISPE 进 一 步 净 化 后, 各 分 析 物 的 回 收 率 和 相 对 标 准 偏 差 分 别 为 79 ~ 113% 和 1 ~ 5% 典 型 色 谱 图 见 图 1, 从 图 中 可 看 出 MISPE 的 净 化 效 果 十 分 明 显, 并 且 在 样 品 出 峰 处 没 有 杂 质 峰 干 扰 Hz Hz Hz Hz I J K 5 L 对 空 白 土 壤 C 添 加 7 种 三 唑 类 分 析 物 ( 每 种 分 析 物 的 添 加 水 平 均 为 0.05 mg/kg), 在 添 加 分 析 物 后 不 同 的 时 间 考 察 方 法 的 准 确 度 和 精 密 度, 结 果 见 表 2 将 添 加 样 品 进 行 老 化 4 的 目 8000 ECD1 A, (LWJ\LWJ \096F0801.D) 的 是 让 分 析 物 与 土 壤 基 质 之 间 充 分 相 互 作 用, 以 模 拟 实 际 样 品 表 2 表 明 分 析 方 法 对 2 不 同 老 化 2000 时 间 的 样 品 的 分 析 结 果 没 有 显 著 性 差 异 ECD1 A, (D:\ \DATA\LWJ\LWJ \099F0201.D) ECD1 A, (LWJ\LWJ \095F0201.D) 8000 ECD1 A, (LWJ\LWJ \094F0401.D) min min min min Fig. 1 GC- ECD chromatograms of (I) MSPD extraction and (J) MSPD-MISPE extraction from blank soil C sample, (K) MSPD extraction and (L) MSPD-MISPE extraction from soil C sample spiked at 0.05 mg/kg. Peak identification: 1-triadimefon, 2-triadimenol, 3-paclobutrazol, 4-uniconazole, 5-diniconazole, 6-tebuconazole, 7-bitertanol. 考 虑 到 新 鲜 的 添 加 样 品 中 分 析 物 和 土 壤 基 质 没 有 充 分 作 用, 将 土 壤 A 样 品 进 行 老 化, 在 不 同 的 老 化 时 间 时, 取 样 分 析, 测 定 结 果 见 表 2 不 同 老 化 时 间 时 各 分 析 物 的 回 收 率 没 有 显 著 性 的 差 异, 这 说 明 所 建 立 的 分 析 方 法 可 用 于 实 际 样 品 的 测 定 表 2 土 壤 A 添 加 样 品 (0.05 mg/kg) 不 同 老 化 时 间 是 分 析 方 法 对 三 唑 类 分 析 物 的 回 收 率 (%)±RSD(%) 分 析 物 老 化 时 间 1h 7 天 14 天 21 天 28 天 三 唑 酮 88.9± ± ± ± ±1.7 三 唑 醇 89.4± ± ± ± ±1.9 多 效 唑 93.6± ± ± ± ±1.4 烯 效 唑 92.2± ± ± ± ±2.5 烯 唑 醇 81.6± ± ±4.2 77± ±1.3 戊 唑 醇 113.7± ± ± ± ±3.6 双 苯 三 唑 醇 81.2± ± ±2.9 80±3.9 78±4.7 83

89 ECD1 A, (GUO-GC \095F0701.D) ECD1 A, (D:\ \DATA\LWJ\LWJ \093F1501.D) ECD1 A, (GUO-GC \094F0901.D) ECD1 A, (LWJ\LWJ \087F1201.D) Hz T Hz S Hz R Hz N Fig. 2 GC-ECD chromatograms of (I) MSPD extraction and (J) MSPD-MISPE extraction from the blank grape sample, (K) MSPD extraction and (L) MSPD-MISPE extraction from the grape sample spiked at 0.05 mg/kg. Peak identification as in Fig MSPD-MISPE 用 于 葡 萄 样 品 的 前 处 理 制 备 葡 萄 的 添 加 样 品, 设 置 3 个 添 加 水 平 : mg/kg 和 各 种 分 析 物 最 低 定 量 限 ( 三 唑 酮 0.01 mg/kg, 三 唑 醇 多 效 唑 mg/kg, 烯 效 唑 0.02 mg/kg, 烯 唑 醇 0.01 mg/kg, 戊 唑 醇 双 苯 三 唑 醇 0.04 mg/kg) 经 过 MSPD 一 步 前 处 理 后 的 葡 萄 样 品 中 各 分 析 物 的 回 收 率 和 相 对 标 准 偏 差 分 别 为 85 ~ 825% 和 4 ~ 25%, 杂 质 干 扰 特 别 严 重, 但 经 MISPE 进 一 步 净 化 后, 各 分 析 物 的 回 收 率 和 相 对 标 准 偏 差 分 别 为 83 ~ 100% 和 1 ~ 6%, 符 合 农 药 残 留 分 析 的 要 求 典 型 色 谱 图 见 图 2, 从 图 中 可 看 出 MISPE 的 净 化 效 果 十 分 明 显, 并 且 在 样 品 出 峰 处 没 有 杂 质 峰 干 扰 7 种 三 唑 类 杀 菌 剂 的 定 量 限 均 低 于 欧 盟 规 定 的 最 大 残 留 量 [4], 因 此 该 方 法 可 用 于 葡 萄 中 这 7 种 杀 菌 剂 的 残 留 量 的 监 测 表 3 min min 不 同 添 加 水 平 下 葡 萄 中 MSPD 和 MSPS-MISPE 的 提 取 液 中 三 唑 类 分 析 物 的 回 收 率 (%) 和 RSD(%) 添 加 水 平 (mg/kg) min min 分 析 物 LOQ* MSPD MSPD-MISPE MSPD MSPD-MISPE MSPD MSPD-MISPE 三 唑 酮 85.7± ± ± ± ± ±1.1 三 唑 醇 342.5± ± ± ± ± ±3.7 多 效 唑 133.1± ± ± ± ± ±1.9 烯 效 唑 150.5± ± ± ± ± ±2.9 烯 唑 醇 163.5± ± ± ±2 98.3± ±1.3 戊 唑 醇 238.6± ± ± ± ± ±3.5 双 苯 三 唑 醇 166.1± ± ± ± ± ±2.1 * 三 唑 酮 0.01 mg/kg, 三 唑 醇 mg/kg, 多 效 唑 mg/kg, 烯 效 唑 0.02 mg/kg, 烯 唑 醇 0.01 mg/kg, 戊 唑 醇 0.04 mg/kg, 双 苯 三 唑 醇 0.04 mg/kg 参 考 文 献 [1] Yan H., Qiao F., Row H. R. Anal. Chem.[J], 2007, 79: [2] Crescenzi C., Bayoudh S., Cormack P. A. G. et al.. Anal. Chem.[J], 2001, 73: [3] 彭 畅, 刘 维 娟, 张 春 涛, 张 玲, 张 春 涛. 高 等 学 校 化 学 学 报 [J], 2009, 30(11): [4] EU Pesticides database, 84

90 Determination of Triazole Fungicides in Soil and Grape by Matrix Solid-Phase Dispersion and Molecularly Imprinted Solid-Phase Extraction LIU Wei-juan, ZHANG Ling, GUO Ya-ping, ZHANG Zhi-chao (State Key Laboratory of Elemento-organic Chemistry, Tianjin Key Laboratory of Pesticide Science, Nankai University, Tianjin , China) Abstract : A novel and simple strategy for determination of seven triazole fungicides (triadimefon, triadimenol, paclobutrazol, uniconazole, diniconazole, tebuconazole and bitertanol) in soil and grape using matrix solid-phase dispersion (MSPD) and molecularly imprinted solid-phase extraction (MISPE) followed by gas chromatography with electron capture detection was developed and validated. Synthesis conditions of the molecularly imprinted polymer were investigated. The MIP, which had the best ability to recognize the seven triazole fungicides, was employed as the sorbent of solid-phase extraction to clean up the MSPD extracts. Under the optimized MISPE conditions, all analytes in MSPD extracts were selectively isolated while matrix interferences were eliminated simultaneously. The proposed method was validated using spiking recovery tests. Recoveries of the seven analytes from 3 soils and grape spiked at 3 levels of 0.05, 0.25 mg/kg and the concentrations corresponding to the limits of quantification (LOQ) for each analyte ranged from 79 ~ 113% with relative standard deviations of 1 ~ 6%. For grape, LOQs of all analytes were lower than maximum residue limits established by European Union. The method also was further validated using aged soil A samples. This study highlights the potential of the novel method combining the simplicity of MSPD with the high selectivity of MISPE for extraction of trace compounds from complex matrices. Key words: Matrix Solid-Phase Dispersion (MSPD); Molecularly Imprinted Solid-Phase Extraction (MISPE); triazole fungicides ( 上 接 第 81 页 ) HPLC simultaneous determination of antitussive Tolterodine Tartrate JIN Chao-dong, XU Rui-zheng, XUE Jin (Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin ) Abstract : Objective The HPLC for determination of tolterodine tartrate was established. Method Kromasil C18 Column and the UV detector were used, with the mobile phase of methanol-0.025mol/l di-ammonium hydrogen phosphate(ph3.0±0.1)(52:48), the detective wavelength was 220nm. Results There was a good linear relationship in the range of ~0.968mg/mL with this method, r= Conclusion The method was founded to eliminate interference of compound and validated for repeatability and respectively. Key words: Tolterodine Tartrate ; Impurities; RP-HPLC 85

91 拉 莫 三 嗪 片 有 关 物 质 测 定 方 法 研 究 夏 锦 辉 1 2, 王 琳 (1. 天 津 药 物 研 究 院 分 析 测 试 中 心, 天 津 ;2. 河 南 大 学 药 学 院, 开 封 ) 拉 莫 三 嗪 是 一 种 电 压 性 的 钠 离 子 通 道 阻 滞 剂, 可 抑 制 戊 四 氮 和 电 刺 激 所 致 的 惊 厥, 缩 短 病 灶 皮 层 和 海 马 区 兴 奋 后 的 放 电 时 间, 对 抗 部 分 和 全 身 性 癫 痫 发 作 由 于 在 其 合 成 过 程 中 可 能 带 进 原 料 中 间 体 副 产 物 等 杂 质, 因 此 其 质 量 需 要 加 以 控 制 本 文 采 用 高 效 液 相 色 谱 法, 对 本 品 的 有 关 物 质 进 行 了 测 定 方 法 研 究 1 实 验 材 料 甲 醇 为 色 谱 纯, 三 乙 胺 磷 酸 均 为 分 析 纯 拉 莫 三 嗪 片 样 品 由 天 津 药 物 研 究 院 提 供 2 色 谱 条 件 仪 器 :Angilent HP1100; 色 谱 柱 :ODS 柱 (Kromasil C18 5μ4.6mm 200mm); 流 动 相 : 0.5% 三 乙 胺 ( 稀 磷 酸 调 PH4): 甲 醇 =55 45; 流 速 :1.0ml/min; 柱 温 :25 ; 检 测 波 长 : 265nm 3 实 验 方 法 与 结 果 3.1 方 法 研 究 空 白 辅 料 的 测 定 取 空 白 辅 料 适 量 用 流 动 相 溶 解, 滤 过 后 按 上 述 色 谱 条 件 测 定 试 验 结 果 表 明, 空 白 辅 料 不 干 扰 样 品 测 定 色 谱 图 见 图 检 测 限 试 验 图 1 空 白 辅 料 色 谱 图 取 拉 莫 三 嗪 片 粉 适 量 滤 过, 加 流 动 相 稀 释 成 低 浓 度, 按 上 述 色 谱 条 件 测 定 试 验 结 果 : 拉 莫 三 嗪 最 小 检 出 限 量 :0.2μg, 峰 面 积 线 性 关 系 试 验 精 密 量 取 供 试 品 溶 液 ( 同 3.2.1) 适 量, 加 流 动 相 稀 释 成 μg/ml 的 溶 液 分 别 取 此 液 20μl 进 样, 测 定 峰 面 积 A, 作 C-A 线 性 方 程, 试 验 结 果 见 表 1 表 1 拉 莫 三 嗪 峰 面 积 A 和 浓 度 C 的 线 性 关 系 浓 度 C(μg/ml) 峰 面 积 A 试 验 结 果 表 明 : 在 265nm 波 长 处, 拉 莫 三 嗪 溶 液 在 1.0~5.0μg/ml 范 围 内, 峰 面 积 A 与 浓 度 C 成 线 性 关 系, 线 性 方 程 为 A= *C, 相 关 系 数 拉 莫 三 嗪 片 酸 碱 氧 化 破 坏 性 试 验 取 空 白 辅 料 和 本 品 适 量, 研 磨 成 细 粉 ; 取 细 粉 适 量, 分 别 加 入 0.1mol/L 盐 酸 溶 液 0.1mol/L 氢 氧 化 钠 溶 液 过 氧 化 氢 溶 液, 加 热 煮 沸 2 小 时, 放 冷 至 室 温, 调 PH 至 中 性, 滤 过 后 按 上 述 色 谱 条 件 进 样 测 定 试 验 结 果 表 明 : 空 白 辅 料 和 样 品 溶 液 均 有 分 ( 降 ) 解 产 物 生 成, 在 此 色 谱 条 件 下 能 与 主 成 份 色 谱 峰 分 开 供 试 品 溶 液 重 现 性 试 验 取 批 供 试 品 溶 液 ( 制 备 同 3.2.1), 连 续 进 样 5 次, 依 法 进 行 杂 质 含 量 检 查, 试 验 结 果 见 表 2 86

92 表 2 供 试 品 溶 液 的 重 现 性 试 验 (n=5) 平 均 杂 质 含 量 % RSD% 供 试 品 溶 液 稳 定 性 试 验 取 批 供 试 品 溶 液 ( 制 备 同 3.2.1), 在 不 同 时 间 进 样 测 定, 试 验 结 果 见 表 3 表 3 供 试 品 溶 液 的 稳 定 性 试 验 放 置 时 间 ( 小 时 ) 杂 质 含 量 % 试 验 结 果 表 明 : 样 品 溶 液 在 24 小 时 内 稳 定 3.2 拉 莫 三 嗪 的 有 关 物 质 测 定 供 试 品 溶 液 的 制 备 取 本 品 适 量, 置 乳 钵 中, 研 细 称 取 片 粉 适 量, 加 流 动 相, 超 声 溶 解, 并 制 成 1ml 中 含 拉 莫 三 嗪 0.2mg 的 样 品 溶 液, 用 0.45μm 的 微 孔 滤 膜 滤 过, 弃 去 初 滤 液, 取 续 滤 液 作 为 供 试 品 溶 液 对 照 溶 液 的 制 备 精 密 量 取 供 试 品 溶 液 适 量, 加 流 动 相 释 释 成 0.003mg/ml 的 溶 液 作 为 对 照 溶 液 (1.5%) 样 品 测 定 取 对 照 溶 液 20μl, 注 入 液 相 色 谱 仪, 调 节 检 测 器 灵 敏 度, 使 主 成 分 色 谱 峰 约 为 记 录 仪 满 量 程 的 10~20% 再 取 供 试 品 溶 液 20μl 进 样, 记 录 色 谱 图 至 主 成 分 色 谱 峰 保 留 时 间 的 3 倍, 按 自 身 对 照 法 计 算, 各 杂 质 峰 面 积 之 和 不 得 大 于 对 照 溶 液 主 成 分 峰 面 积 试 验 结 果 见 表 4,1.5% 对 照 溶 液 色 谱 图 见 图 2, 供 试 品 溶 液 色 谱 图 见 图 3 表 4 拉 莫 三 嗪 片 有 关 物 质 检 查 批 号 有 关 物 质 % 讨 论 : 图 2 1.5% 对 照 溶 液 色 谱 图 图 3 供 试 品 溶 液 色 谱 图 4.1 片 剂 测 定 时 所 取 片 粉 含 辅 料 所 以 片 粉 需 要 过 滤 通 过 对 滤 过 方 式 的 考 察, 选 用 0.8μm 滤 膜,0.45μm 滤 膜, 以 及 离 心 10min 结 果 表 明,0.45μm 滤 膜 滤 过 效 果 较 好, 其 他 滤 过 方 式 有 干 扰 4.2 比 较 本 品 在 酸 碱 氧 化 破 坏 前 后 空 白 辅 料 和 供 试 品 溶 液 均 有 分 ( 降 ) 解 产 物 生 成, 在 此 色 谱 条 件 下 能 与 主 成 份 色 谱 峰 分 开 参 考 文 献 : [1] 国 家 药 典 委 员 会 编.[S]. 中 国 药 典 二 部, 北 京 : 化 学 工 业 出 版 社,2005, 附 录 :28 [2] R.Macrae.[J]. 现 代 实 用 高 效 液 相 色 谱 分 析 法, 天 则 出 版 社,1992 [3] 孙 毓 庆, 王 延 琮.[M]. 现 代 色 谱 法 及 其 在 药 物 分 析 中 的 应 用, 科 学 出 版 社,2005. ( 下 转 第 90 页 ) 87

93 离 子 交 换 树 脂 固 相 萃 取 离 子 对 色 谱 法 检 测 稻 田 水 样 中 的 春 雷 霉 素 张 春 涛, 郭 亚 萍, 张 玲, 张 智 超 ( 南 开 大 学 元 素 有 机 化 学 国 家 重 点 实 验 室, 南 开 大 学 天 津 市 农 药 科 学 重 点 实 验 室, 天 津 ) 春 雷 霉 素 是 一 种 农 用 抗 菌 素 类 杀 菌 剂, 它 属 于 微 生 物 农 药, 是 以 生 物 体 如 细 菌 真 菌 病 毒 等 微 生 物 为 原 料 制 成 的, 是 当 前 农 作 物 病 虫 害 防 治 中 具 有 广 阔 发 展 前 景 的 一 种 农 药 春 雷 霉 素 具 有 很 强 的 内 吸 渗 透 性, 同 时 具 有 预 防 和 治 疗 作 用, 其 作 用 机 理 是 干 扰 病 原 菌 氨 基 酸 代 谢 的 酯 酶 系 统, 破 坏 病 原 菌 蛋 白 质 的 生 物 合 成, 抑 制 菌 丝 的 生 长 并 造 成 细 胞 颗 粒 化, 使 病 原 菌 失 去 繁 殖 和 侵 染 能 力, 从 而 达 到 杀 菌 防 害 的 目 的 [1] 春 雷 霉 素 在 农 业 生 产 中 得 到 了 广 泛 的 应 用, 但 目 前 尚 未 见 关 于 春 雷 霉 素 残 留 的 仪 器 分 析 方 法 的 报 道 春 雷 霉 素 是 碱 性 物 质, 极 性 大, 易 溶 于 水, 微 溶 于 甲 醇, 不 溶 于 有 机 溶 剂, 无 特 征 紫 外 吸 收, 这 些 特 点 使 得 该 物 质 的 分 离 分 析 十 分 困 难 本 研 究 建 立 了 混 合 型 阳 离 子 交 换 树 脂 为 吸 附 剂 的 固 相 萃 取 前 处 理 (MCX-SPE) 和 以 庚 烷 磺 酸 钠 为 离 子 对 试 剂 的 离 子 对 液 相 色 谱 法 (IP-HPLC) 检 测 环 境 水 样 中 的 春 雷 霉 素 的 分 析 方 法, 方 法 具 有 简 单 快 速 准 确 可 靠 等 优 点 1. 实 验 部 分 1.1 仪 器 与 试 剂 Agilent 1100 高 效 液 相 色 谱 仪, 配 二 极 管 阵 列 检 测 器 ; 固 相 萃 取 柱 ( mm, 具 有 C 筛 板 的 玻 璃 柱 ) 春 雷 霉 素 标 样, 纯 度 81.1%; 庚 烷 磺 酸 钠 为 色 谱 纯 ; 混 合 型 阳 离 子 交 换 树 脂 (MCX),waters 产 品, 以 聚 乙 烯 吡 咯 烷 酮 / 二 乙 烯 基 苯 为 基 质, 粒 度 µm, 交 换 强 度 1.0 meq/g 冰 醋 酸 为 分 析 纯 ; 氨 水 和 磷 酸 为 优 级 纯 ; 甲 醇 和 乙 睛 均 为 色 谱 纯 ; 二 次 蒸 馏 水 等 1.2 色 谱 条 件 色 谱 柱 :Diamonsil C18,5 µm,250 mm 4.6 mm i.d.( 迪 马 科 技 有 限 公 司 ); 保 护 柱 :HP C18(20 mm 4 mm i.d.,5 µm); 流 动 相 : 乙 腈 - 缓 冲 溶 液 (5 mmol/l 庚 烷 磺 酸 钠 水 溶 液,H3PO4 调 节 ph=3) (15:85,v/v); 流 速 :0.5 ml/min; 检 测 波 长 230 nm; 进 样 量 20 µl 1.3 样 品 前 处 理 100 ml 稻 田 水 经 0.45 µm 滤 膜 过 滤, 取 10.0 ml, 用 CH3COOH 调 节 ph 至 1.5 后, 用 MCX-SPE 净 化 对 于 添 加 样 品, 在 调 节 ph 值 前 往 空 白 水 样 中 加 入 1.00 ml 春 雷 霉 素 标 准 溶 液 称 取 0.30 g MCX 填 料 置 于 约 5 ml 甲 醇 中, 湿 法 装 入 固 相 萃 取 柱, 上 面 加 上 垫 片, 用 空 气 加 压 泵 吹 干 甲 醇, 压 紧 依 次 用 10 ml 甲 醇 10 ml 水 活 化 固 相 萃 取 柱 后, 将 样 品 上 样, 依 次 用 5 ml ph1.5 的 醋 酸 水 溶 液 5 ml 甲 醇 预 淋 洗, 最 后 用 10 ml 氨 水 / 水 / 甲 醇 (1/4/15,v/v/v) 混 合 液 洗 脱, 收 集 洗 脱 液 上 述 过 程 中 通 过 空 气 泵 加 压 控 制 流 速 约 为 2 ml/min 洗 脱 液 用 氮 气 吹 扫 浓 缩, 定 容 至 1.00 ml, 经 0.45 µm 滤 膜 过 滤, 保 存 于 4 冰 箱 中, 待 HPLC 分 析 2. 结 果 与 讨 论 2.1 HPLC 模 式 的 选 择 春 雷 霉 素 是 碱 性 化 合 物 ( 春 雷 霉 素 盐 酸 盐 的 pka1=3.23), 在 C18 柱 上 没 有 保 留, 因 此 本 研 究 采 用 以 庚 烷 磺 酸 钠 为 离 子 对 试 剂 的 离 子 对 液 相 色 谱 法 在 1.2 节 所 述 的 色 谱 条 件 下, 可 很 好 地 将 春 雷 霉 素 和 杂 质 分 离 开 2.2 MCX-SPE 条 件 的 优 化 文 献 报 道 [2] 中 通 常 用 酸 性 水 溶 液 和 甲 醇 依 次 预 淋 洗 ion-exchange SPE 柱, 以 除 去 一 些 非 极 性 和 弱 极 性 杂 质 的 干 扰 本 研 究 考 察 了 ph=1.5 的 醋 酸 水 溶 液 和 甲 醇 这 两 种 预 淋 洗 剂 的 体 积 对 春 雷 霉 素 回 收 率 的 影 响 将 10.0 ml 空 白 稻 田 水 的 添 加 样 品 (0.4µg/g) 上 样 后, 用 ph=1.5 的 醋 酸 水 溶 液 预 淋 洗 SPE 柱, 以 每 2 ml 为 一 段 分 段 收 集 淋 洗 液, 共 收 集 5 段 ( 总 体 积 为 10 ml), 用 HPLC 对 每 段 淋 洗 液 进 行 检 测 检 测 结 果 表 明, 每 段 收 集 液 中 均 未 检 出 春 雷 霉 素, 表 明 10 ml ph=1.5 的 醋 酸 水 溶 液 不 会 将 春 雷 霉 素 从 SPE 柱 上 洗 脱 下 来 另 外, 第 3 5 段 收 集 液 的 HPLC 88

94 谱 图 中 没 有 明 显 的 色 谱 峰 因 此, 后 面 的 实 验 中 用 5 ml ph=1.5 的 醋 酸 水 溶 液 预 淋 洗 继 续 考 察 甲 醇 体 积 对 春 雷 霉 素 回 收 率 的 影 响 将 10.0 ml 空 白 稻 田 水 添 加 样 品 (0.4µg/g) 上 样, 用 5 ml ph=1.5 的 醋 酸 水 溶 液 预 淋 洗 SPE 柱 后, 用 甲 醇 继 续 预 淋 洗, 以 每 2 ml 为 一 段 分 段 收 集 甲 醇 淋 洗 液, 共 收 集 5 段 ( 总 体 积 为 10 ml), 用 HPLC 对 每 段 淋 洗 液 进 行 检 测 检 测 结 果 表 明, 每 段 收 集 液 中 均 未 检 出 春 雷 霉 素 另 外, 第 3 5 段 收 集 液 的 HPLC 谱 图 中 没 有 明 显 的 色 谱 峰 ; 另 从 感 官 看, 第 3 5 段 收 集 液 为 透 明 无 色 因 此, 后 面 的 实 验 中 选 用 5 ml 甲 醇 作 为 第 二 布 预 淋 洗 液 最 后 考 察 洗 脱 液 条 件 在 酸 性 条 件 下, 春 雷 霉 素 与 强 阳 离 子 交 换 吸 附 剂 之 间 存 在 很 强 的 离 子 相 互 作 用, 欲 将 春 雷 霉 素 洗 脱 下 来, 洗 脱 液 必 须 满 足 三 个 条 件 : 一 是 足 够 的 碱 性, 以 中 和 被 分 析 物 的 电 荷 ; 二 是 良 好 的 洗 脱 能 力 ; 三 是 对 春 雷 霉 素 良 好 的 溶 解 能 力 氨 水 甲 醇 和 水 是 三 个 不 可 或 缺 的 重 要 因 素 在 优 化 洗 脱 液 组 成 和 体 积 的 实 验 中, 按 照 前 面 确 定 的 实 验 条 件, 上 样 和 预 淋 洗 后, 分 别 研 究 了 氨 水 / 甲 醇 (1/19, v/v) 和 氨 水 / 水 / 甲 醇 (1/4/15, v/v/v) 两 种 混 合 溶 液 作 洗 脱 液 时 对 春 雷 霉 素 回 收 率 的 影 响, 实 验 结 果 如 图 1 所 示 适 当 增 加 氨 水 / 甲 醇 (1/19, v/v) 洗 脱 溶 液 中 水 的 含 量, 对 春 雷 霉 素 起 到 了 良 好 的 洗 脱 效 果, 这 应 归 因 于 春 雷 霉 素 易 溶 于 水 洗 脱 夜 体 积 为 6 ml 时 回 收 率 达 到 78.8%,9 ml 时 回 收 率 (82.9%) 接 近 于 最 大 值 (84.7%), 继 续 增 加 洗 脱 剂 体 积, 回 收 率 提 高 很 小, 并 且 会 增 加 洗 脱 液 浓 缩 难 度 因 此, 确 定 以 10 ml 氨 水 / 水 / 甲 醇 (1/4/15) 作 洗 脱 溶 剂 100 春 雷 霉 素 累 积 回 收 率 /% 洗 脱 液 体 积 /ml 氨 水 / 水 / 甲 醇 (1/4/15) 氨 水 / 甲 醇 (1/19) 2.3 方 法 评 价 图 1 MCX-SPE 洗 脱 条 件 的 优 化 表 1 稻 田 水 中 春 雷 霉 素 在 三 个 添 加 水 平 下 的 平 均 回 收 率 和 相 对 标 准 偏 差 (n=5) 基 质 添 加 水 平 (µg/g) 回 收 率 (%) RSD (%) 湖 北 稻 田 水 天 津 稻 田 水 以 湖 北 天 津 两 地 稻 田 水 分 别 制 备 3 种 浓 度 ( 和 4 µg/g) 的 添 加 样 品, 考 察 分 析 方 法 的 准 确 度 和 精 密 度, 结 果 见 表 1 所 建 立 的 分 析 方 法 对 春 雷 霉 素 的 回 收 率 为 %, 相 对 标 准 偏 差 (n=5) 分 别 为 % 方 法 的 检 出 限 (S/N=3) 为 0.01 µg/g 实 验 结 果 表 明 所 建 立 的 方 法 符 合 残 留 分 析 的 要 求 典 型 色 谱 图 如 图 2 所 示 该 方 法 已 成 功 用 于 实 际 样 89

95 品 的 测 定 mau mau mau mau mau a kasugamycin b kasugamycin c d e kasugamycin min min min min min 图 2 春 雷 霉 素 的 HPLC 色 谱 图 :(a) 春 雷 霉 素 标 样 (4.0 µg/ml);(b) 湖 北 稻 田 水 空 白 样 ;(c) 湖 北 稻 田 水 添 加 样 (0.40 µg/g);(d) 天 津 稻 田 水 空 白 样 ;(e) 天 津 稻 田 水 添 加 样 (0.40 µg/g) 参 考 文 献 [1] 单 正 军, 石 利 利, 朱 忠 林 等. 农 药 残 留 量 实 用 检 测 方 法 手 册, 第 三 卷. 北 京 : 中 国 农 业 出 版 社, 2005: [2] Lavéna M., Alsberga T., Yu Y., et al.. J. Chromatogr. A, 2009, 1216: Determination of Kasugamycin in Paddy Field Water Using Ion-Exchange Solid Phase Extraction Followed by Ion-Pair High Performance Liquid Chromatography ZHANG Chun-tao, GUO Ya-ping, ZHANG Ling, ZHANG Zhichao * (State Key Laboratory of Elemento-organic Chemistry, Tianjin Key Laboratory of Pesticide Science, Nankai University, Tianjin , China) A new method using MCX-based ion-exchange solid phase extraction followed by ion-pair high performance liquid chromatography has been developed for determination of kasugamycin in paddy water. SPE conditions including washing and eluting conditions were optimized. The proposed method was validated. Recoveries of kasugamycin for paddy field water samples fortified at three levels ( µg/g) ranged from 80.0% to 93.3%, with relative standard deviations of %. The lowest detection limit (S/N=3) was 0.01 µg/g. The method is simple, rapid, sensitive, accurate and applicable. ( 上 接 第 87 页 ) HPLC Determination of Relater Substances in Lamotrigine XIA Jin-hui 1, WANG Lin 2 (1.Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin Pharmaceutical College of Henan University, Kaifeng China) Abstract: OBJECTIVE: To establish the HPLC method for the determination of related substances in Lamotrigine. METHOD: The HPLC system consisted of a Kromasil C18 column(5μ,4.6mm 200mm). The mobile phase was 0.5% TEA(PH4): Methanol=55 45 The flow rate was 1.0mL min -1 with detection wave length at 265nm. RESULT: Lamotrigine could be completely separated from other impurities. The lowest detectable of Lamotrigine is 0.2 µ g /ml. CONCLUSION:The method is simple, accurate, convenience.it can be well the quality control Lamotrigine. Key words: Lamotrigine.;related substances ;HPLC 90

96 高 效 毛 细 管 电 泳 法 用 于 沃 尼 妙 林 的 药 代 动 力 学 研 究 李 志 伟, 赵 云 超, 齐 建 敏 ( 河 北 科 技 大 学 化 学 与 制 药 工 程 学 院 河 北 石 家 庄 ) 沃 尼 妙 林 (Valnemulin) 是 新 一 代 截 短 侧 耳 素 类 抗 生 素, 国 外 主 要 用 于 防 治 猪 牛 羊 及 家 禽 的 支 原 体 病 和 革 兰 氏 阳 性 菌 感 染, 具 有 广 谱 抗 菌 活 性 强 药 动 学 特 征 优 良 残 留 低 安 全 等 特 点 目 前 该 药 在 国 内 尚 未 上 市, 研 究 其 药 代 动 力 学, 获 取 药 代 动 力 学 参 数 对 于 国 内 该 制 剂 的 生 产 及 应 用 具 有 重 要 意 义 C H 3 O O H 3 C N H 2 N H S H 3 C C H 3 H 3 C O H 3 C C H 3 H O H 2 C H O C H 3 图 1 沃 尼 妙 林 的 结 构 A / ( mv*s) C / ( ug/ml) 图 2 线 性 关 系 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 及 试 剂 毛 细 管 电 泳 仪 ( 北 京 彩 陆 科 学 仪 器 有 限 公 司 ), CL102 型 紫 外 检 测 器,HW-2000 型 色 谱 工 作 站, 石 英 毛 细 管 ( 河 北 永 年 锐 沣 色 谱 器 件 公 司 ) 四 硼 酸 钠, 磷 酸 二 氢 钠, 磷 酸 氢 二 钠, 磷 酸 均 为 分 析 纯, 水 为 重 蒸 水, 所 有 样 品 及 缓 冲 91

97 液 均 经 0.45μm 滤 膜 过 滤 沃 尼 妙 林 样 品 ( 批 号 ) 为 实 验 室 自 制 毛 细 管 柱 为 未 涂 层 石 英 毛 细 管 柱 (75μm 70cm), 电 泳 介 质 为 30mmol/L 的 硼 砂 缓 冲 液 (ph=6.0), 高 度 差 进 样 5s, 分 离 电 压 15kV, 检 测 波 长 210nm, 室 温 下 操 作 1.2 实 验 方 案 采 用 随 机 交 叉 试 验,6 只 大 鼠 分 别 编 号, 随 机 分 成 2 组, 每 组 3 只, 禁 食 24 小 时 后, 统 一 灌 胃 给 药 采 用 大 鼠 尾 部 取 血 约 0.5mL, 置 1.5mL 离 心 管 中, 静 置 1h, 挑 / 出 血 饼 后, 处 理 后, 立 即 于 5000r/min 条 件 下 离 心 10min, 吸 取 上 清 液, 于 -20 下 保 存, 待 分 析 1.3 线 性 范 围 取 空 白 血 清 0.2mL, 准 确 加 入 沃 尼 妙 林 溶 液, 配 制 成 系 列 浓 度 溶 液, 考 察 其 线 性 关 系 以 浓 度 为 横 坐 标, 峰 面 积 为 纵 坐 标, 进 行 线 性 回 归, 回 归 方 程 为 A= C, R= 沃 尼 妙 林 在 0.1μg/mL~2.8μg/mL 浓 度 范 围 内 线 性 关 系 良 好, 标 准 曲 线 如 图 2 示 U / m V t / m in 图 3 定 量 限 电 泳 图 C / (u g /m L ) t / h 图 4 沃 尼 妙 林 的 药 时 曲 线 1.4 定 量 限 在 实 验 条 件 下, 稀 释 加 药 血 样 至 0.1μg/mL, 得 到 电 泳 图 谱 如 3 所 示, 信 噪 比 为 10:1, 表 明 在 实 验 条 件 下, 能 够 定 量 检 测 出 血 清 中 沃 尼 妙 林 的 浓 度 为 0.1μg/mL 2 结 果 与 讨 论 2.1 药 时 曲 线 2.2 药 代 动 力 学 参 数 的 计 算 92

98 利 用 用 3P97 实 验 药 代 动 力 学 计 算 机 程 序 及 Excel 函 数, 对 沃 尼 妙 林 的 药 时 曲 线 数 据 进 行 双 室 模 型 计 算, 结 果 见 表 1 表 1 沃 尼 妙 林 的 药 动 学 参 数 表 参 数 X SD Cmax /(μg/ml) Tmax / h t1/2 / h AUC0 12 /(μg h/ml) AUMC0 12 /(μg h 2 /ml) MRT / h Vd / (L/kg) 结 论 通 过 条 件 优 化 确 定 了 较 优 的 条 件 检 测 波 长 为 210nm 工 作 电 压 为 15kV, 缓 冲 体 系 为 30mmol/L 硼 砂 缓 冲 盐 (ph=6.0); 经 方 法 学 验 证 表 明, 在 选 定 的 色 谱 条 件 下, 血 液 中 内 源 性 物 质 几 乎 不 干 扰 沃 尼 妙 林 的 含 量 测 定 将 实 验 建 立 的 分 析 方 法 用 于 SD 大 鼠 的 药 代 动 力 学 研 究, 得 到 其 药 代 动 力 学 参 数, 半 衰 期 为 2.97h, 达 峰 时 间 3h, 达 峰 浓 度 2.53μg/mL, 药 时 曲 线 下 面 积 9.81μg h/ml, 平 均 滞 留 时 间 3.37h, 一 阶 距 - 时 间 曲 线 下 面 积 为 μg h 2 /ml, 表 观 分 布 容 积 L/kg 参 考 文 献 : [1] 何 凤 艳, 王 德 忠, 刘 国 斌,. 新 兽 药 沃 泥 妙 林 的 研 究 进 展 及 应 用 [J]. 中 国 畜 牧 兽 医, 2009, 36(4): [2] Jordan F, Forrester C, Rip ley P H, et al. In V itro and V ivo Comparisons of Valnemulin, Tiamulin, Tylosin, Enrofloxacin and Lincomycin / spectinomycin againstmycoplasm a gallisepticum [ J ].Avian Dis, 1998, 42 (4) : [3] KarlssonM, Gunnarsson A, Franklin A. Suscep tibility to Pleuromutilins in B rachyspira ( serpulina ) hyodysenteriae [ J ]. Anim Health Rev, 2001, 2 (1) : [4] KarlssonM, Oxberry S, Hamp son D. Antimicrobiol Suscep tibility Testing of Australian Isolates of B rachyspira hyodysenteriae Usinga New Broth Dilution Method [ J ]. Vet Microbiol, 2002, 84(1/2) : The pharmacokineic study of Valnemulin with High Performance capillary Electrophoresis LI Zhi-wei, ZHAO Yun-chao, Qi Jian-min ( College of Chemical and Pharmaceutical Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang China) ABSTRACT: An HPCE method for determination of Valnemulin in mouse plasma was established to study the pharmacokineics of Valnemulin after oral administration of one dose. The optimized conditions were fused silca capillary tube(75cm 75μm), 30mmol/L sodium phosphate buffer(ph=6.0), voltage(15kv). Then, the parameters of pharmacokinetics of Valnemulin in SD-mouse were studied. The elimination half life was 2.97h. The time to peak (t max) was 3h. The mean residence time(mrt) in mice was 3.37h. The apparant volume of distribution (Vd) was L/kg. Key Words: Valnemulin; HPCE; pharmacokineics 93

99 CH8 培 养 液 中 球 毛 壳 甲 素 的 检 测 和 分 离 陈 煌, 郝 晓 冉, 牛 学 良, 毕 建 男, 吕 宪 禹, 朱 旭 东 ( 南 开 大 学 生 命 科 学 院 分 子 真 菌 学 实 验 室, 天 津 ) 当 今 世 界 癌 症 是 威 胁 人 类 健 康 的 最 大 敌 人, 对 于 抗 癌 药 物 的 研 究 对 于 人 类 健 康 有 着 重 要 [1-2] 的 意 义 球 毛 壳 甲 素 是 Sekita 等 于 1983 年 新 发 现 的 抗 癌 化 合 物, 为 细 胞 分 裂 抑 制 剂, 影 响 细 胞 中 的 收 缩 蛋 白 并 能 阻 止 细 胞 骨 架 中 球 肌 动 蛋 白 的 盐 诱 导 聚 合 利 用 发 酵 方 法 生 产 球 毛 壳 甲 素 具 有 很 高 的 经 济 价 值 和 社 会 价 值 本 文 就 是 利 用 高 效 液 相 色 谱 法 从 环 境 中 筛 选 出 一 株 产 球 毛 壳 甲 素 的 真 菌 本 文 对 CH8 培 养 液 中 球 毛 壳 甲 素 的 高 效 液 相 色 谱 检 测 和 分 离 方 法 进 行 了 探 讨, 并 就 实 验 结 果 进 行 讨 论 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 菌 种 :CH8 菌 种 ( 自 主 分 离 得 到 ) 在 南 开 大 学 校 园 采 集 的 菌 种 主 要 的 仪 器 设 备 :Spectra-physics 高 效 液 相 色 谱 仪 ; 采 用 C-18 ODS 分 析 型 色 谱 柱 ( mm, Kromasil); 旋 转 蒸 发 仪 ( 上 海 亚 荣 生 化 仪 器 厂 ); 甲 醇 ( 色 谱 纯 ); 氯 仿 ( 色 谱 纯 ) 球 毛 壳 甲 素 (Alexis 公 司 ) 1.2 方 法 液 体 发 酵 培 养 基 : 马 铃 薯 200g, 蔗 糖 20g, 水 1000mL,pH 自 然, 每 个 500mL 的 锥 形 瓶 中 分 装 200mL 培 养 基,121,20min 高 压 灭 菌, 冷 却 后 接 入 CH8,28 培 养 9 天 发 酵 液 的 预 处 理 : 发 酵 液 先 经 过 抽 滤 除 去 菌 体, 然 后 通 过 旋 蒸 将 200mL 滤 液 浓 缩 到 20-30mL 然 后 用 氯 仿 或 乙 酸 乙 酯 萃 取 浓 缩 液 三 次, 每 次 萃 取 取 其 下 层 液 体, 上 层 液 体 继 续 用 来 萃 取, 直 到 萃 取 三 次 后 弃 掉 将 收 集 的 下 层 液 体 再 次 进 行 旋 蒸, 将 体 积 浓 缩 到 2mL 左 右 然 后 加 等 体 积 的 甲 醇 混 匀 以 后 离 心, 上 清 液 通 过 有 机 膜 过 滤 高 效 液 相 色 谱 检 测 : 柱 温 调 节 为 室 温, 流 动 相 ( 甲 醇 : 水 =7:3) 流 速 为 1 ml/min, 检 测 波 长 为 227 nm 处 检 测, 进 样 量 20 µl 流 动 相 使 用 之 前 先 进 行 膜 过 滤, 再 用 超 声 除 气 泡 用 流 动 相 冲 洗 分 析 柱 30 分 钟 左 右, 基 线 平 稳 后, 进 标 准 品 球 毛 壳 甲 素 ( 甲 醇 溶 解 浓 度 为 0.1mg/mL) 14 分 钟 左 右 会 出 现 一 个 明 显 的 大 峰 然 后 进 样 品, 在 同 一 时 间 附 近 也 出 现 一 个 峰 ( 图 1) 标 准 品 和 样 品 按 1:1 比 例 混 合, 进 混 合 样, 在 14 分 钟 的 位 置 出 现 的 是 一 个 峰, 不 是 两 个 峰, 说 明 这 是 同 一 个 物 质 高 效 液 相 色 谱 分 离 : 柱 温 调 节 为 室 温, 流 动 相 ( 甲 醇 : 水 =7:3) 流 速 为 3mL/min, 检 测 波 长 为 227 nm 处 检 测, 进 样 量 500 µl 流 动 相 使 用 之 前 先 进 行 膜 过 滤, 再 用 超 声 除 气 泡 用 流 动 相 冲 洗 制 备 柱 30 分 钟 左 右, 等 基 线 走 平 然 后 进 标 准 品, 知 道 出 峰 时 间 以 后, 再 进 样 品, 对 同 一 出 峰 时 间 的 物 质 进 行 收 集 2 实 验 结 果 与 讨 论 2.1 实 验 结 果 94

100 图 1 样 品 液 相 色 谱 图 谱 (0.1c 代 表 球 毛 壳 甲 素 标 准 品 ;CH8 代 表 样 品 ) 2.2 讨 论 由 图 1 可 知 标 样 出 峰 的 时 间,14 分 钟 左 右 会 出 现 一 个 明 显 的 大 峰 然 后 进 样 品, 在 同 一 时 间 附 近 也 出 现 一 个 峰 ( 图 1) 标 准 品 和 样 品 按 1:1 比 例 混 合, 进 混 合 样, 在 14 分 钟 的 位 置 未 出 现 另 外 的 峰, 说 明 两 者 为 同 一 个 物 质 峰 形 很 好, 周 围 没 有 明 显 的 干 扰, 说 明 样 品 的 前 处 理 方 法 和 流 动 相 的 配 比 选 择 是 恰 当 的 这 也 为 后 期 收 集 样 品 奠 定 了 基 础 参 考 文 献 : [1] Sektia S, Yoshihira K, Natori S, et al, Cheatoglobosis, cytotoxic 10-(Indo-3-yl)-[13]cytochalasans from Chaetomium spp. I production, isolation and some cytological effects of chaetoglobosins A-J[J]. Chem Pharm Bull, 1982, 30(5):1609. [2] Sektia S, Yoshihira K, Natori S, et al, Cheatoglobosis, cytotoxic 10-(Indo-3-yl)-[13]cytochalasans from Chaetomium spp.iv 13 C-nuclear magnetic resonance spectra and their application to a biosynthetic study[j]. Chem Pharm Bull, 1983,31(2):490. Detection and Separation of ChaetoglobosinA from CH8 Culture Medium Chen Huang Hao Xiao-ran Niu Xue-liang Lv Xian-yu Zhu Xu-dong (Nankai University, College of life science, Tianjin , China) Abstract:In this paper thethod of detecting and separating of chaetoglobosina from CH8 culture medium using HPLC is established and the experiment results are discussed. Key words: CH8; ChaetoglobosinA; HPLC 95

101 HPLC 法 测 定 镇 咳 药 TY 的 含 量 薛 津, 许 瑞 征, 靳 朝 东 ( 天 津 药 物 研 究 院 分 析 测 试 中 心, 天 津 ) 镇 咳 药 TY 是 一 个 化 学 结 构 与 以 往 任 何 一 类 镇 咳 药 均 不 相 同 的 化 合 物, 主 要 用 于 治 疗 由 于 感 染 刺 激 炎 症 及 肿 瘤 引 起 的 急 慢 性 呼 吸 系 统 疾 病 所 致 的 咳 嗽 本 文 采 用 HPLC 法, 以 甲 醇 作 为 有 机 调 节 剂 建 立 了 镇 咳 药 TY 的 含 量 测 定 方 法 本 方 法 色 谱 分 离 效 果 好 分 析 时 间 短 定 量 准 确 可 靠, 可 控 制 镇 咳 药 TY 的 质 量 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 与 试 剂 高 效 液 相 色 谱 系 统 : 安 捷 伦 HP1100 液 相 系 统 紫 外 检 测 器 :G1314A, 自 动 进 样 器 : G1313A, 超 声 仪 :AS3120; 甲 醇 色 谱 纯, 去 离 子 水 色 谱 柱 为 Diamonsil TM C18(5μm), 250mm 4.6mm I.D. 不 锈 钢 柱 ( 迪 马 公 司 ); 流 动 相 为 色 谱 纯 甲 醇 - 水 (70:30); 检 测 波 长 275nm; 柱 温 :30 ; 流 速 为 1ml/min 样 品 由 天 津 药 物 研 究 院 提 供, 批 号 为 结 果 2.1 色 谱 条 件 以 十 八 烷 基 硅 烷 键 合 硅 胶 为 填 充 剂, 以 甲 醇 - 水 溶 液 (70:30) 为 流 动 相, 检 测 波 长 275nm, 理 论 板 数 按 TY 峰 计 算 应 不 低 于 线 性 试 验 精 密 量 取 TY 标 准 溶 液 (1.5226mg/ml)0.01ml 0.1ml 0.2ml 0.5ml 1.0ml 2.0ml 5.0ml 置 10ml 量 瓶 中, 用 流 动 相 稀 释 至 刻 度, 摇 匀, 精 密 量 取 20μl 注 入 液 相 色 谱 仪, 记 录 色 谱 图, 测 定 TY 的 峰 面 积, 计 算 进 样 量 和 峰 面 积 之 间 的 线 性 关 系, 结 果 表 明 : TY 进 样 量 在 0.030~15.226μg 范 围 内 和 峰 面 积 之 间 的 线 性 关 系 良 好 2.3 精 密 度 试 验 取 供 试 品 溶 液 连 续 进 样 6 针, 按 峰 面 积 计 算, 莫 吉 司 坦 峰 面 积 的 RSD 为 0.07%, 结 果 表 明, 本 法 具 有 良 好 的 精 密 度 2.4 重 现 性 试 验 取 本 品 ( 批 ) 按 含 量 测 定 方 法, 精 密 称 取 9 份 样 品, 平 行 测 定 其 相 应 的 含 量, 结 果 表 明 :TY 含 量 测 定 的 精 密 度 良 好 2.5 测 定 溶 液 的 稳 定 性 试 验 取 供 试 品 溶 液 ( 批 ), 每 隔 一 定 时 间 进 样 一 次, 考 察 测 定 溶 液 的 稳 定 性, 测 定 结 果 表 明 : 含 量 测 定 溶 液 24 小 时 内 稳 定 2.6 定 量 限 测 定 试 验 精 密 称 取 供 试 品 ( 批 ) 适 量, 加 流 动 相 溶 解 制 成 每 1ml 中 含 TY μg/ml 的 溶 液, 精 密 吸 取 20μl 注 入 液 相 色 谱 仪, 连 续 进 样 6 次, 结 果 表 明 : TY 在 浓 度 较 低 的 情 况 下 测 定, 精 密 度 良 好 2.7 含 量 测 定 分 别 精 密 称 取 三 批 本 品 75mg, 精 密 称 定, 置 50ml 量 瓶 中, 加 流 动 相 适 量, 超 声 震 荡 作 者 简 介 : 薛 津 (1957-), 男, 天 津 人, 副 研 究 员, Tel: , xuej@tjipr.com 96

102 约 10 分 钟, 以 流 动 相 稀 释 至 刻 度, 摇 匀, 作 为 供 试 品 溶 液 另 取 减 压 干 燥 至 恒 重 的 TY 对 照 品 适 量, 加 流 动 相 制 成 每 1ml 含 TY 1.5mg 的 溶 液, 作 为 对 照 品 溶 液 精 密 量 取 供 试 品 溶 液 和 对 照 品 溶 液 各 5ml, 分 别 置 50ml 量 瓶 中, 加 流 动 相 稀 释 至 刻 度, 摇 匀, 分 别 精 密 吸 取 各 20μl 注 入 液 相 色 谱 仪, 记 录 色 谱 图 按 外 标 法 计 算 TY 的 含 量 含 量 限 度 为 98.0%~102.0%, 三 批 样 品 的 测 定 结 果 见 表 1 对 照 品 溶 液 供 试 品 溶 液 图 1 对 照 品 溶 液 和 供 试 品 溶 液 的 HPLC 色 谱 图 表 1 TY 三 批 样 品 含 量 测 定 结 果 批 号 含 量 (%) 平 均 值 (%) 讨 论 对 流 动 相 的 选 择, 分 别 试 验 了 甲 醇 - 水, 甲 醇 -0.01% 磷 酸 水, 甲 醇 -0.01M 磷 酸 氢 二 铵 (ph 分 别 为 和 7) 等 流 动 相 系 统,TY 峰 以 甲 醇 - 水 流 动 相 最 好, 所 以 选 用 分 析 时 短, 结 果 精 确 可 靠 在 选 定 的 流 动 相 条 件 下, 主 峰 的 保 留 时 间 约 为 8 分 HPLC simultaneous determination of antitussive TY XUE Jin, XU Riu-zheng, JIN Chao-dong ( 1 Tianjin Institute of Pharmaceutical Research,Tianjin ) Abstract:Objective The HPLC for determination of TY was established.method C18 Column and the UV detector were used,with the mobile phase of methanol-water (70:30),the detective wavelength was 275nm. Results There was a good linear relationship in the range of ~ μg with this method, r= Conclusion The method was founded to eliminate interference of compound and validated for repeatability and respectively. Key words: antitussive TY; HPLC; determination. 97

103 HPLC 法 筛 选 10- Deacetyl BaccatinⅢ 产 生 菌 及 其 萃 取 方 法 的 选 择 牛 学 良, 毕 建 男, 郝 晓 冉, 吕 宪 禹, 朱 旭 东 ( 南 开 大 学 生 命 科 学 学 院 分 子 真 菌 学 实 验 室, 天 津 ) 建 立 了 HPLC 筛 选 10- Deacetyl BaccatinⅢ 产 生 菌 的 方 法 并 考 察 了 三 种 不 同 萃 取 系 统 对 发 酵 液 中 10- Deacetyl BaccatinⅢ 回 收 的 影 响 紫 杉 醇 (Paclitaxel, 商 品 名 Taxol) 是 从 红 豆 杉 属 植 物 中 提 取 的 一 种 重 要 的 次 生 代 谢 产 物, 最 早 由 Wani 等 人 从 太 平 洋 短 叶 红 豆 杉 (Taxus brevifolia nuttall) 的 树 皮 中 提 取 得 到 [1] 目 前 已 从 红 豆 杉 属 植 物 中 分 离 出 350 多 种 紫 杉 烷 类 化 合 物 [2], 紫 杉 醇 是 紫 杉 烷 类 中 一 种 四 环 二 萜 类 化 合 物 由 于 紫 杉 醇 独 特 的 抗 癌 机 理 和 很 高 的 抗 癌 活 性, 它 已 成 为 应 用 最 广 泛 的 天 然 抗 癌 药 物 之 一, 应 用 于 耐 药 性 卵 巢 癌 乳 腺 癌 以 及 其 他 癌 症 目 前, 国 内 外 学 者 在 人 工 栽 培 红 豆 杉 树 红 豆 杉 细 胞 培 养 及 紫 杉 醇 的 化 学 全 合 成 等 方 面 进 行 了 大 量 研 究 但 由 于 上 述 方 法 生 产 的 紫 杉 醇 成 本 昂 贵, 目 前 还 没 有 被 广 泛 应 用 10-Deacetyl Baccatin Ⅲ(10-DAB), 是 紫 杉 醇 半 合 成 [3] 的 前 体, 分 子 式 :C29H36O10, 分 子 量 : , 纯 品 为 白 色 粉 末 结 晶, 熔 点 : , 溶 于 乙 醇 二 氯 甲 烷 等, 微 溶 于 乙 腈 目 前 最 有 前 途 的 生 产 紫 杉 醇 的 方 法 就 是 以 10-DAB 为 原 料 进 行 紫 杉 醇 的 半 合 成, 因 为 10-DAB 在 多 种 红 豆 杉 中 含 量 较 紫 杉 醇 要 高 的 多 作 者 以 产 紫 杉 醇 的 内 生 真 菌 作 为 研 究 对 象, 对 菌 株 的 培 养 10-DAB 的 提 取 及 检 验 等 方 法 进 行 了 探 索 1 材 料 与 方 法 1.1 仪 器 与 材 料 旋 转 蒸 发 器 ( 上 海 亚 荣 生 化 仪 器 厂 ),Spectra-physics 高 效 液 相 色 谱 仪,Beckman 质 谱 仪 ;10- 脱 乙 酰 巴 卡 亭 Ⅲ(0.1 mg/ml,sigma 公 司 ), 甲 醇 ( 色 谱 级 ), 氯 仿 ( 色 谱 级 ); 土 豆 培 养 基 :200g 土 豆 煮 沸 30 分 钟, 三 层 纱 布 过 滤 后 加 入 20g 乳 糖, 蒸 馏 水 定 容 至 1L,pH 自 然 1.2 样 品 制 备 实 验 室 所 筛 选 的 菌 株 摇 瓶 培 养 7 天, 减 压 抽 滤, 分 离 菌 丝 和 发 酵 液 弃 菌 丝, 发 酵 液 分 别 用 等 体 积 氯 仿 : 甲 醇 (v/v,10:1) 等 体 积 氯 仿 等 体 积 乙 酸 乙 酯 萃 取 过 夜 随 后 分 别 收 集 氯 仿 相 和 乙 酸 乙 酯 相, 进 行 35 减 压 旋 蒸, 旋 干 后 加 入 甲 醇 重 溶 数 次 后, 再 次 进 行 减 压 旋 蒸, 体 积 减 至 1mL 左 右 取 出, 离 心 去 除 杂 质, 上 清 液 用 有 机 微 孔 滤 膜 (0.22µm) 过 滤 后 进 行 HPLC 分 析 1.3 样 品 分 析 方 法 HPLC 条 件 : 色 谱 柱 为 Kromasil C-18 5μm 250mm 4.6mm, 流 动 相 为 : 甲 醇 : 水 溶 液 =70:30 (v/v), 流 速 为 1 ml/min, 进 样 量 :20μL, 柱 温 :30, 检 测 波 长 λ=227 nm, 重 复 3 次 2 结 果 与 讨 论 2.1 HPLC 法 鉴 定 发 酵 液 中 的 10-DAB 分 别 对 10-DAB 标 样, 发 酵 液 进 行 HPLC 检 测, 然 后 进 行 两 者 的 混 合 上 样, 结 果 如 图 1, 图 2 所 示 : 98

104 图 1 10-DAB(0.1 mg/ml) 标 准 品 与 经 氯 仿 萃 取 的 发 酵 液 的 HPLC 重 叠 图 ( 红 线 为 发 酵 液, 绿 线 为 10-DAB) 图 2 10-DAB(0.1 mg/ml) 标 准 品 与 经 氯 仿 萃 取 的 发 酵 液 混 合 样 HPLC 图 由 图 1 可 以 看 出,10-DAB 标 准 品 与 发 酵 液 中 物 质 的 保 留 时 间 相 近, 均 在 4.7min 附 近, 由 图 2 中 可 以 看 出, 二 者 的 混 合 样 在 4.7min 处 为 单 一 的 峰, 进 一 步 证 明 样 品 中 可 能 含 有 10-DAB 2.2 HPLC 法 选 择 发 酵 液 的 萃 取 方 法 通 过 萃 取, 可 以 有 效 去 除 发 酵 液 中 的 色 素, 但 考 虑 到 萃 取 效 率, 溶 剂 毒 性 等 因 素, 作 者 在 用 氯 仿 萃 取 发 酵 液 后, 又 分 别 尝 试 用 等 体 积 氯 仿 : 甲 醇 (v/v,10:1) 等 体 积 乙 酸 乙 酯 萃 取 发 酵 液 过 夜, 实 验 结 果 如 下 : 图 DAB(0.1 mg/ml) 标 准 品 HPLC 图 99

105 图 4 未 经 萃 取 处 理 的 发 酵 液 HPLC 图 图 5 经 氯 仿 萃 取 的 发 酵 液 HPLC 图 图 6 经 氯 仿 : 甲 醇 (v/v,10:1) 萃 取 的 发 酵 液 HPLC 图 100

106 图 7 经 乙 酸 乙 酯 萃 取 的 发 酵 液 HPLC 图 由 图 3 图 6 可 知, 三 种 萃 取 方 法 都 可 以 把 发 酵 液 中 大 部 分 的 色 素 物 质 ( 色 谱 图 中 保 留 时 间 小 于 4 分 钟 左 右 ), 三 者 相 比, 氯 仿 或 氯 仿 : 甲 醇 系 统 的 去 色 素 效 果 比 乙 酸 乙 酯 好, 但 10-DAB 的 丢 失 率 较 高 ( 前 两 者 的 10-DAB 峰 面 积 比 乙 酸 乙 酯 的 10-DAB 峰 面 积 要 小 ), 值 得 注 意 的 是, 氯 仿 : 甲 醇 系 统 在 萃 取 时 会 产 生 严 重 的 乳 化 现 象, 且 氯 仿 与 乙 酸 乙 酯 相 比, 对 人 体 毒 性 较 大 由 此 可 知, 用 乙 酸 乙 酯 萃 取 发 酵 液 中 的 10-DAB 比 较 合 适 参 考 文 献 [1] Wani M.C.,Taylor H.L.,Wall M.E.,et al.the isolation and structure of taxol,a novel antileukemic and antitumor agent from taxus brevifolia[j]. Journal of American Chemistry,1971,27(7): [2] Jennewein S., Rithner C.D., Williams R.M., et al. Taxol biosynthesis: Taxane 13-alpha-hydroxylase is a cytochrome P450-dependent monooxygenase[j].proc Natl Acad Sci,2001,98: [3] Patel RN.Tour De Paclitaxel: biosynthesis for semisynthesis. Annu. Rev.Microbiol, 1998, 98:361~395. Screening Fungi that Produce 10- Deacetyl BaccatinⅢ by HPLC and the choice of extraction methods NIU Xue-liang, HAO Xiao-ran, BI Jian-nan, LV Xian-yu, ZHU Xu-dong (Nankai University College of Life Science Molecular Mycology Laboratory, Tianjin , China) Abstract: Established a method screening fungi which produce 10- Deacetyl BaccatinⅢ by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). And three different extraction systems was investigated in the separation of 10- Deacetyl BaccatinⅢ from the fermentation liquor. Key words: HPLC; 10-Deacetyl Baccatin Ⅲ; Extraction 101

107 反 相 高 效 液 相 色 谱 法 检 测 辛 伐 他 汀 的 血 药 浓 度 毕 丹 1, 董 伟 林 2 (1. 天 津 中 医 药 大 学 中 药 学 院 2010 届 临 床 药 学 本 科 毕 业 生 ;2. 天 津 医 科 大 学 ) 辛 伐 他 汀 片 是 由 美 国 默 克 公 司 研 发 的 他 汀 类 降 血 脂 药, 国 内 商 品 名 为 舒 降 之, 剂 型 为 片 剂, 规 格 有 mg 辛 伐 他 汀 能 抑 制 内 源 性 胆 固 醇 的 合 成 而 降 低 低 密 度 脂 蛋 白 (LDL) 和 极 低 密 度 脂 蛋 白 (VLDL) 胆 固 醇 的 血 清 浓 度, 中 等 程 度 地 升 高 高 密 度 脂 蛋 白 (HD-C) 水 平 和 降 低 甘 油 三 酯 的 水 平, 从 而 降 低 胆 固 醇 对 高 胆 固 醇 冠 心 病 等 有 明 显 的 疗 效, 具 有 降 脂 作 用 且 效 果 显 著 安 全 副 作 用 少, 是 治 疗 高 血 脂 首 选 药 物 之 一 目 前 已 有 用 高 效 液 相 色 谱 - 质 谱 联 用 测 定 血 浆 中 辛 伐 他 汀 的 浓 度 和 高 效 液 相 色 谱 测 定 辛 伐 他 汀 的 含 量 [1] 但 对 于 血 浆 中 辛 伐 他 汀 的 浓 度 的 测 定 研 究 较 少 本 实 验 致 力 于 建 立 一 种 易 于 推 广 的 简 便 准 确 敏 感 的 检 测 方 法, 以 检 测 辛 伐 他 汀 在 血 浆 中 的 浓 度 以 便 进 一 步 用 于 遗 传 药 理 学 研 究 和 日 常 用 药 监 测 1 实 验 部 分 1.1 实 验 材 料 仪 器 日 本 岛 津 LC-6A 高 效 液 相 色 谱 仪 ( 包 括 SPD-6AV 紫 外 检 测 器,LC-6A 输 液 泵,SCL-6A 色 谱 系 统 控 制 器,ANSTAR 色 谱 工 作 站 ); 色 谱 分 析 柱 Inertex.C18.(5 μm mm, 天 津 市 琛 航 科 学 仪 器 有 限 公 司 );GM-50 型 隔 膜 真 空 泵 ( 天 津 市 腾 达 过 滤 器 器 件 厂, 抽 气 速 度 30 L min -1 ); 微 量 进 样 器 ( 上 海 高 鸽 工 贸 有 限 公 司 );PB153-S 型 电 子 分 析 天 平 ( 梅 特 勒 - 托 利 多 公 司 );C-9860A 超 声 波 清 洗 器 ( 天 津 市 科 贝 尔 光 电 技 术 有 限 责 任 公 司 );YKH-1 型 液 体 快 速 混 合 器 ( 江 西 医 疗 器 械 厂 ) 试 剂 人 体 血 液 样 品 ( 天 津 第 一 中 心 医 院 ) 空 白 血 浆 ( 中 心 血 站 提 供 ) 辛 伐 他 汀 对 照 品 ( 中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所, 产 品 批 号 : ) 内 标 洛 伐 他 汀 ( 杨 子 江 药 业 集 团 有 限 公 司, 产 品 批 号 : ) 乙 腈 ( 色 谱 纯, 天 津 市 协 和 昊 鹏 色 谱 科 技 有 限 公 司, 产 品 批 号 :091230) 甲 醇 ( 色 谱 纯, 天 津 市 协 和 昊 鹏 色 谱 科 技 有 限 公 司, 产 品 批 号 :090812) 无 水 甲 醇 ( 分 析 纯, 天 津 市 风 船 化 学 试 剂 科 技 有 限 公 司, 产 品 批 号 : ) 水 ( 二 次 蒸 馏 水 ) 2 结 果 2.1 方 法 色 谱 条 件 色 谱 柱 为 Inertex.C18.5μm mm; 内 标 物 为 洛 伐 他 汀 ; 流 动 相 为 乙 腈 - 甲 醇 - 水 ( ); 紫 外 检 测 波 长 238 nm; 流 速 1ml min -1 ; 进 样 量 20μl; 柱 温 室 温 对 照 品 溶 液 及 内 标 液 的 配 制 精 密 称 取 辛 伐 他 汀 10mg, 用 流 动 相 ( 乙 腈 - 甲 醇 - 水 ( ) 稀 释 至 10ml 的 容 量 瓶, 作 者 简 介 : 毕 丹 (1987- ), 女, 天 津 中 医 药 大 学 中 药 学 院 2010 届 本 科 毕 业 生 董 伟 林 (1954- ), 男, 天 津 医 科 大 学, 高 级 实 验 师,Tel: , dongwl119@163.com 102

108 摇 匀, 即 得 1.0mg ml -1 浓 度 的 对 照 品 溶 液, 以 此 储 备 液 为 母 液 配 制 系 列 浓 度 的 对 照 品 溶 液 精 密 称 取 内 标 洛 伐 他 汀 10mg, 用 流 动 相 溶 解, 超 声 10min 助 溶, 再 定 容 于 10ml 的 容 量 瓶, 为 内 标 液 (1.0mg ml -1 ) 血 浆 样 品 的 处 理 冷 冻 保 存 的 血 浆 样 品 在 暗 处 自 然 熔 融, 混 匀 后 取 200μl 于 带 盖 离 心 管 中, 准 确 加 入 200μl, 含 洛 法 他 汀 浓 度 为 700 ng ml -1 乙 腈 溶 液 充 分 混 匀, 静 置 5 min, 再 次 充 分 混 匀, 离 心,13000 r min -1,10 min 将 上 清 液 移 于 一 带 盖 离 心 管 中,60 水 浴 上 氮 气 吹 干 再 用 200μl 流 动 相 复 溶, 离 心 13000r min -1,3min, 取 上 清 液 20μl 进 样 2.2 结 果 血 浆 标 准 曲 线 的 制 备 取 空 白 血 浆 200μl 于 带 盖 离 心 管 中, 加 入 项 下 溶 液 适 量, 使 之 成 为 含 辛 伐 他 汀 ng ml -1 系 列 浓 度 再 按 项 下 方 法 操 作 进 样 记 录 色 谱, 计 算 辛 伐 他 汀 峰 面 积 (As) 和 内 标 峰 面 积 (Ai) 的 比 值, 并 以 峰 面 积 比 值 (F) 对 血 药 浓 度 (C) 进 行 线 性 回 归, 绘 制 标 准 曲 线 ( 略 去 ) 血 浆 中 辛 伐 他 汀 在 5 ~ 1000 ng ml -1 有 良 好 的 线 性 回 归 方 程 为 y=0.001x ,r= 由 图 1 可 知, 内 标 洛 伐 他 汀 在 7 分 左 右 出 峰, 辛 伐 他 汀 在 9 分 左 右 出 峰, 分 离 良 好 血 浆 中 的 杂 质 对 其 没 有 干 扰 回 收 率 试 验 取 空 白 血 浆 200μl 于 带 盖 离 心 管 中, 加 入 项 下 溶 液 适 量, 使 之 成 为 含 辛 伐 他 汀 ng ml -1 再 按 项 下 方 法 操 作 进 样 测 得 峰 面 积 之 比 代 入 回 归 方 程, 计 算 相 对 平 均 回 收 率 回 收 率 在 90%-102% 之 间, 符 合 中 国 药 典 2010 版 要 求 精 密 度 试 验 取 空 白 血 浆 200μl 于 带 盖 离 心 管 中, 加 入 项 下 溶 液 适 量, 使 之 成 为 含 辛 伐 他 汀 ng ml -1 再 按 项 下 方 法 操 分 别 进 低 中 高 3 个 浓 度 的 辛 伐 他 汀 标 准 品 供 试 液 各 浓 度 一 日 内 重 复 测 定 3 次, 得 日 内 精 密 度 各 浓 度 三 日 测 定 1 次, 连 续 7 天, 测 得 日 间 精 密 度 RSD(n=3)<5%, 符 合 要 求 重 复 性 试 验 24 小 时 内 连 续 进 同 一 浓 度 标 准 品 6 针, 计 算 相 对 标 准 偏 差 RSD(n=6)<5%, 符 合 要 求 样 品 测 定 冷 冻 保 存 的 血 浆 样 品 按 项 下 处 理, 取 上 清 液 20μl 进 样 测 得 峰 面 积, 代 入 回 归 方 程, 结 果 ( 略 去 ) 3 讨 论 103

109 3.1 标 准 品 的 储 存 辛 伐 他 汀 遇 光 易 分 解, 在 临 床 应 用 中, 辛 伐 他 汀 的 分 析 应 及 时 完 成, 对 不 能 及 时 测 定 的 样 品, 应 置 于 冰 箱 里 避 光 保 存 3.2 流 动 相 的 确 定 本 文 曾 参 考 有 关 文 献 选 用 乙 腈 - 水 (55 45), 但 未 达 到 完 全 分 离 改 为 乙 腈 - 水 (45 55) 出 峰 时 间 : 洛 tr =24.523; 辛 tr = 二 者 间 分 离 度 尚 可, 但 保 留 时 间 过 长, 为 了 缩 短 样 品 分 析 时 间, 故 又 加 入 适 量 甲 醇, 对 流 动 相 进 行 了 微 调, 采 用 乙 腈 - 甲 醇 - 水 ( ), 出 峰 时 间 : 洛 tr =7.133; 辛 tr = 最 佳 检 测 波 长 的 选 择 采 用 紫 外 检 测 器 进 行 检 测, 需 要 寻 找 一 个 最 佳 的 检 测 波 长, 经 过 紫 外 全 波 长 扫 描 238nm 时 为 辛 伐 他 汀 的 最 大 吸 收 波 长, 且 洛 伐 他 汀 也 为 最 大 吸 收 波 长, 同 时 信 噪 比 S/N 3 [2], 不 会 对 样 品 的 检 测 产 生 干 扰 3.4 样 品 提 取 方 法 的 确 定 1 萃 取 法 :( 略 去 ) 2 乙 腈 沉 淀 法 :( 略 去 ) 3( 略 去 ) 通 过 实 验 和 综 合 考 虑, 发 现 乙 腈 沉 淀 法 经 济 适 用 简 便, 且 进 样 后 发 现 沉 淀 较 完 全, 回 收 率 高, 而 且 除 杂 质 峰 能 力 较 好, 药 峰 得 到 良 好 的 分 离 最 后 选 用 这 种 方 法 作 为 样 品 提 取 的 方 法 4 结 论 本 实 验 是 运 用 反 相 高 效 液 相 色 谱 测 定 人 体 血 浆 中 辛 伐 他 汀 的 浓 度, 该 方 法 简 便 快 速 线 性 范 围 宽 重 现 性 好 精 密 度 高 准 确 度 好 对 样 品 的 测 定 与 众 多 文 献 基 本 相 符 结 果 表 明 : 此 分 析 方 法 可 行 性 好, 可 作 为 临 床 人 体 血 浆 中 辛 伐 他 汀 浓 度 的 测 定 方 法 参 考 文 献 : [1] 王 菁, 刘 史 佳, 居 文 政. 高 效 液 相 色 谱 - 质 谱 联 用 测 定 人 血 浆 中 辛 伐 他 汀 浓 度 [J]. 中 国 药 房,2007, 18(5): [2] 刘 文 英 主 编. 药 物 分 析 [M]. 北 京 : 人 民 卫 生 出 版 社 2007,6(5):83. Determination of Human Plasma Simvastatin by Reversed-phase High-performance Liquid Chromatography Bi Dan 1, Dong Wei-lin 2 (1.University gratuator in 2010, college of herbal pharmacy, Tianjin Chinese Medical University 2.college of basic medicine, Tianjin Medical University, Tianjin , China) Abstract: Objective: To determination of simvastatin in human plasma by RP-HPLC. Method: Chromatography column was Inertex.C18.5μm mm with UV detector Internal standard was lovastatin. The mobile phase was composed of CH3CN-H2O-CH3OH ( ). UV detection wavelength was 238nm. The flow rate was 1.0ml min -1. Results: The calibration curve of simvastatin was liner between ng ml -1 (r=0.9997). Absolute recovery was more than 95%, within-day and between-day RSD were less than 5%. Conclusion: The method is simple, rapid, highly accurate and preci- sion. It can be used for the quantitative determination of simvastatin. Key words: RP-HPLC; simvastatin; lovastatin 104

110 发 酵 液 中 紫 杉 醇 的 高 效 液 相 色 谱 分 离 条 件 的 优 化 毕 建 男, 牛 学 良, 郝 晓 冉, 陈 煌, 潘 皎, 吕 宪 禹, 朱 旭 东 ( 南 开 大 学 生 命 科 学 学 院, 天 津 ) 紫 杉 醇 是 一 类 高 效 抗 肿 瘤 药 物, 为 了 满 足 日 益 增 长 的 癌 症 患 者 需 求, 真 菌 发 酵 法 生 产 紫 杉 醇 已 经 引 起 科 学 界 广 泛 关 注, 本 文 对 紫 杉 醇 的 色 谱 分 离 条 件 进 行 了 优 化, 具 有 重 要 意 义 紫 杉 醇 是 一 种 二 萜 生 物 碱, 为 细 胞 抑 制 剂 类 抗 肿 瘤 药 物, 它 对 大 多 数 实 体 瘤 有 强 力 抑 制 作 用, 尤 其 对 晚 期 卵 巢 癌 乳 腺 癌 非 小 细 胞 肺 癌 和 卡 波 济 氏 肉 瘤 的 疗 效 确 切 副 作 用 较 小 同 时, 紫 杉 醇 还 能 克 服 细 胞 的 耐 药 性, 在 临 床 上 可 以 长 期 使 用, 是 近 年 来 新 抗 肿 瘤 药 物 中 受 到 广 泛 重 视 的 一 类 它 也 用 于 风 湿 性 关 节 炎 皮 肤 病 症 的 治 疗 目 前, 紫 杉 醇 已 被 广 泛 应 用, 成 为 抗 肿 瘤 的 一 线 药 物 但 是 由 于 原 料 和 生 产 技 术 的 限 制, 全 球 紫 杉 醇 产 量 严 重 不 足, 远 远 不 能 满 足 市 场 需 求, 因 此 价 格 昂 贵 1993 年,Stierle 等 从 太 平 洋 红 豆 杉 的 韧 皮 部 分 离 到 一 株 内 生 真 菌 - 安 德 烈 紫 杉 菌 [1, 2] (Taxomyce sandreanae), 经 过 各 种 实 验 证 实 该 菌 的 发 酵 液 中 存 在 紫 杉 醇 这 一 发 现, 为 紫 [3] 杉 醇 的 工 业 生 产 提 供 了 一 条 新 的 思 路 利 用 真 菌 发 酵 生 产 紫 杉 醇 然 而, 真 菌 发 酵 产 物 成 分 复 杂, 尤 其 是 某 些 与 紫 杉 醇 极 性 相 似 的 化 合 物, 保 留 时 间 相 近, 给 后 续 提 取 纯 化 带 来 很 大 困 难 本 文 对 发 酵 产 物 中 紫 杉 醇 的 提 取 纯 化 方 法 进 行 了 初 步 研 究 1 材 料 与 方 法 土 豆 培 养 基 :200g 土 豆 煮 沸 30 分 钟, 三 层 纱 布 过 滤 后 加 入 20g 蔗 糖, 蒸 馏 水 定 容 至 1L, ph 自 然 将 实 验 室 自 主 分 离 得 到 的 产 紫 杉 醇 菌 株 接 种 到 土 豆 培 养 基 中 进 行 培 养,6 天 后 取 出, 加 入 等 体 积 甲 醇, 过 滤 掉 菌 丝 及 其 他 不 溶 物 后 进 行 55 减 压 旋 蒸, 悬 干 后 加 入 甲 醇 重 溶 数 次 后, 再 次 进 行 减 压 旋 蒸, 体 积 减 至 1mL 左 右 取 出 待 测 高 效 液 相 色 谱 检 测 样 品 中 紫 杉 醇 含 量, 流 动 相 为 甲 醇 :NH4H2PO4 水 溶 液 =7:3,pH7.0, 流 速 1mL/min, 检 测 波 长 227nm, 使 用 C-18 ODS 分 析 型 色 谱 柱 ( mm, Kromasil) 进 行 检 测, 进 样 量 20µl, 重 复 3 次 2 结 果 与 讨 论 实 验 结 果 如 图 1 所 示, 通 过 同 标 准 品 比 较, 发 现 样 品 中 紫 杉 醇 疑 似 物 与 紫 杉 醇 具 有 相 同 的 保 留 时 间, 两 者 可 能 为 同 一 物 质 此 外, 根 据 上 述 实 验 结 果 我 们 发 现, 通 过 本 实 验 流 程 及 色 谱 条 件, 样 品 中 紫 杉 醇 出 峰 时 间 前 后 不 存 在 其 他 杂 质, 为 后 续 紫 杉 醇 的 分 离 纯 化 提 供 了 便 利, 极 大 程 度 上 降 低 了 成 本, 具 有 重 要 的 应 用 价 值 105

111 A B 图 1 高 效 液 相 色 谱 (HPLC) 分 析 方 法 鉴 定 发 酵 液 中 所 含 紫 杉 醇 A. 紫 杉 醇 标 准 品 ( 出 峰 时 间 为 min, B. 待 测 样 品 ( 出 峰 时 间 为 min) 图 A 和 B 中 可 以 看 出, 二 者 的 出 峰 时 间 在 允 许 误 差 范 围 内 可 视 为 相 同 参 考 文 献 : [1] Wall ME, Wani MC, Taylor HL. Isolation and chemical characterization of antitumor agents from plants[j]. Cancer Treat Rep. 1976, 60: [2] Strobel GA, Stierle A, Stierle D, et al. Taxomyces andreanae, a proposed new taxon for a bulbilliferous hyphomycete associated with Pacific yew. Mycotaxon[J], 1993, 47: [3] Yuan, J.I., Bi, J. N., Yan, B. and Zhu, X.D. Taxol-producing Fungi: A New Approach to Industrial Production of Taxol[J]. Chin J Biotech. 2006,22: 1-6. The optimization of detecting Taxol from fermented liquor by HPLC BI Jian-nan, NIU Xue-liang, HAO Xiao-ran, CHEN Huang, PAN Jiao, LV Xian-yu, ZHU XU-Dong (College of Life Science, Nankai University, Tianjin 30071, China) Abstract: Taxol is a kind of efficient anticancer drug.to meet the growing demands of this drug for the cancer patients, producting Taxol by fermentation has attracted more and more scientific attentions. In this paper, the chromatographic separation of taxol conditions were optimized. Key words: Taxol; HPLC 106

112 蚕 沙 中 1- 脱 氧 野 尻 霉 素 三 种 含 量 测 定 方 法 的 比 较 * 亓 晖, 赵 辉, 朱 元 元 ( 南 开 大 学 药 学 院, 天 津 ) 蚕 沙 是 一 味 传 统 的 中 药, 其 味 甘 辛, 性 温, 无 毒 [1] 主 治 肠 鸣 热 中 消 渴 风 痹 瘾 疹 等 症 具 有 补 肾 生 血 活 血 通 络 清 热 祛 风 利 湿 化 浊 镇 静 安 神 等 功 效 [2] 近 年 有 研 究 表 明, 蚕 沙 提 取 物 [3] 和 蚕 沙 总 生 物 碱 [4] 具 有 抗 糖 尿 病 作 用, 且 HPLC 分 析 表 明 其 含 1- 脱 氧 野 尻 霉 素 [5] 1- 脱 氧 野 尻 霉 素 (1-deoxynojirimycin,DNJ), 化 学 名 为 (2R,3R,4R,5S)-2-( 羟 甲 基 )-3,4,5- 三 羟 基 哌 啶, 是 一 种 天 然 糖 的 结 构 类 似 物, 该 化 合 物 及 其 衍 生 物 具 有 竞 争 性 抑 制 a 一 葡 萄 糖 苷 酶 的 活 性, 可 用 于 治 疗 糖 尿 病 肥 胖 症 病 毒 感 染 等 疾 病 [6] 因 此, 寻 找 一 种 简 便, 准 确 的 DNJ 含 量 测 定 方 法 显 的 尤 为 重 要 Toshiyuki Kimura 等 人 [7], 利 用 蒸 发 光 检 测 法 对 桑 叶 中 的 DNJ 进 行 含 量 测 定, 检 测 限 达 100ng, 使 DNJ 与 其 他 成 分 得 到 很 好 的 分 离 ;Jin-won Kim 等 人 [8] 用 FOMC-Cl 对 生 物 碱 DNJ 进 行 了 结 构 衍 生, 并 用 高 效 液 相 色 谱 荧 光 检 测 法 对 桑 叶 提 取 物 中 的 DNJ 进 行 了 含 量 和 稳 定 性 测 定, 取 得 了 良 好 的 效 果 本 文 采 用 蒸 发 光 荧 光 和 二 极 管 阵 列 三 种 检 测 器, 分 别 对 测 定 蚕 沙 中 DNJ 的 含 量 测 定 方 法 进 行 比 较, 以 确 定 一 种 效 果 更 好 的 方 法 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 和 试 剂 Waters 系 列 检 测 器 ; 色 谱 柱 :Hypersil SCX 柱 (250 mm 10.0 mm,5 μm);ymc-pack ODS-A 色 谱 柱 (4.6mm 250mm,5μm);YMC-Pack ODS-A 色 谱 柱 (4.6mm 250mm,5μm) 乙 腈 ( 色 谱 纯 ); 冰 醋 酸, 氨 水 均 为 分 析 纯 ; 娃 哈 哈 纯 净 水 1.2 色 谱 条 件 对 比 蒸 发 光 检 测 法 荧 光 检 测 法 二 极 管 阵 列 检 测 法 色 谱 柱 :Hypersil SCX 柱 (250 mm 10.0 mm,5 μm); 流 动 相 : 水 - 冰 醋 酸 - 氨 水 (1000:0.25:0.25;V/V/V); 流 速 : 1ml/min; 蒸 发 光 检 测 器 ( 漂 移 管 50, 自 动 增 益, 气 体 压 力 :25psi); 进 样 量 20µL 1.3 样 品 处 理 色 谱 柱 : YMC-Pack ODS-A (4.6mm 250mm,5μm); 流 动 相 : 乙 腈 -0.1% 冰 醋 酸 (40 60); 流 速 :1.0ml/min; 荧 光 激 发 光 波 长 为 254nm, 检 测 波 长 : 322nm; 进 样 量 :20µL 色 谱 柱 : YMC-Pack ODS-A 色 谱 柱 (4.6mm 250mm,5μm); 流 动 相 : 乙 腈 -0.1% 冰 醋 酸 ( ); 流 速 : 1.0ml/min; 检 测 波 长 :265.4nm; 进 样 量 :20µL 取 一 定 量 样 品, 加 一 定 量 0.05MHCl, 加 热 回 流 提 取, 即 得 供 试 品 溶 液, 根 据 不 同 的 检 测 条 件, 对 供 试 品 溶 液 进 行 一 定 处 理, 即 可 进 样 蒸 发 光 检 测 法 荧 光 检 测 法 二 极 管 阵 列 检 测 法 供 试 品 溶 液 过 液 相 滤 膜 后 直 接 进 样 供 试 品 溶 液 : 硼 酸 钾 缓 冲 液 FMOC-Cl 衍 生 试 剂 甘 氨 酸 试 液 ( ) 进 行 衍 生 后, 进 样 供 试 品 溶 液 : 硼 酸 钾 缓 冲 液 FMOC-Cl 衍 生 试 剂 甘 氨 酸 试 液 ( ) 进 行 衍 生 后, 进 样 107

113 1.4 标 准 曲 线 及 线 性 范 围 蒸 发 光 检 测 法 荧 光 检 测 法 二 极 管 阵 列 检 测 法 以 对 照 品 进 样 量 的 log 值 为 横 坐 标, 峰 面 积 的 log 值 为 纵 坐 标, 作 标 准 曲 线, 得 回 归 方 程 为 Y= X(r=0.9995), DNJ 对 照 品 浓 度 在 5ug~50ug 范 围 内 线 性 关 系 良 好 以 对 照 品 浓 度 的 数 值 为 横 坐 标, 峰 面 积 的 数 值 为 纵 坐 标, 作 标 准 曲 线, 得 回 归 方 程 Y= X(r=0.9999), DN 对 照 品 浓 度 在 0.008mg/ml~0.08mg/ml 范 围 内 线 性 关 系 良 好 以 对 照 品 浓 度 的 数 值 为 横 坐 标, 峰 面 积 的 数 值 为 纵 坐 标, 作 标 准 曲 线, 得 回 归 方 程 为 Y= E+06X(r=0.9996),DNJ 对 照 品 浓 度 在 0.01mg/ml~0.10mg/ml 范 围 内 线 性 关 系 良 好 1.5 稳 定 性, 重 复 性, 重 现 性, 加 样 回 收 率 和 同 一 批 样 品 含 量 测 定 对 比 蒸 发 光 检 测 法 荧 光 检 测 法 二 极 管 阵 列 检 测 法 稳 定 性 (RSD) 2.01% 1.89% 1.90% 重 复 性 (RSD) 1.92% 1.66% 1.68% 重 现 性 (RSD) 1.81% 1.70% 1.65% 加 样 回 收 率 (RSD) 3.11% 2.94% 2.88% 样 品 含 量 测 定 1.59% 1.65% 1.61% 2 结 果 与 讨 论 三 种 方 法 经 过 方 法 学 考 察, 结 果 表 明 荧 光 检 测 法 和 二 极 管 阵 列 检 测 法 稍 好 于 蒸 发 光 检 测 法, 但 都 能 比 较 可 靠 地 测 定 药 材 含 量, 总 体 看 来 都 可 作 为 蚕 沙 药 材 的 质 量 控 制 方 法, 可 根 据 自 己 的 研 究 条 件 确 定 测 定 方 法 参 考 文 献 [1] 江 苏 新 医 学 院. 中 药 大 辞 典. 上 海 : 上 海 科 学 技 术 出 版 社,1995: [2] 刘 朝 胜, 陈 云 亮, 金 进 忠, 等. 治 疗 缺 铁 性 贫 血 新 药 生 血 宁 片. 中 国 新 药 杂 志,2001,10(1): [3] 谢 明 智, 申 竹 芳, 陈 若 芸, 等. 蚕 沙 提 取 方 法 提 取 物 及 其 用 途. 中 国 专 利 :CN [4] 白 钢, 杨 文 博, 耿 鹏 等. 一 种 蚕 沙 总 生 物 碱 及 其 制 备 方 法, 中 国 专 利 :CNI557824A. [5] 陈 智 毅, 肖 更 生 等. 蚕 沙 及 蚕 沙 冲 剂 中 1 一 脱 氧 野 尻 霉 素 的 离 子 色 谱 法. 中 国 蚕 业,2003,21(1): [6] Yoshiaki A, Hivonu M. Nippon Nogei Kagaku Kaishi, 1976, 50 (11): [7] Toshiyuki Kimura,Kiyotaka Nakagawa,etal.BioFactors,2004,22: [8] Jin-WonKim,Soo-UnKim, etal. J Chromatogr.A,2003,1002: Comparison of three determination methods of 1-deoxynojirinycin in silkworm Qi Hui, Zhao Hui, ZhuYuan-yuan* (College of Pharmacy,Nankai University,Tianjin ,China) Abstract: AIM: To develop and compare three HPLC methods for determination of 1-deoxynojirinycin in Silkworm. RESULTS: Three methods are of good reproducibility and sensitivity, and can be used for the quality control of DNJ in silkworm. Key words: HPLC; 1-deoxynojirinycin; methods. 108

114 分 子 印 迹 固 相 萃 取 - 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 火 腿 肠 制 品 中 的 四 种 苏 丹 红 含 量 乔 晋 东, 闫 宏 远, 王 慧, 杨 更 亮 ( 河 北 省 药 物 质 量 分 析 控 制 重 点 实 验 室, 河 北 大 学 药 学 院, 保 定 ) 苏 丹 红 是 非 生 物 类 合 成 色 素, 主 要 分 为 苏 丹 红 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 四 种 由 于 其 对 人 体 的 肝 肾 器 官 有 明 显 的 毒 性 作 用 且 具 有 潜 在 的 致 癌 性, 各 国 均 严 禁 苏 丹 红 作 为 食 品 添 加 剂 加 入 到 食 品 当 中 目 前 苏 丹 红 的 检 测 方 法 以 HPLC [1],HPLC-MS/MS [2] 和 GC-MS/MS [3] 为 主 在 实 际 样 品 分 析 过 程 中 由 于 组 分 复 杂 且 目 标 物 含 量 低, 样 品 的 前 处 理 技 术 是 整 个 分 析 过 程 的 瓶 颈, 影 响 整 个 过 程 的 精 确 度 和 准 确 度 本 文 通 过 选 择 合 适 的 苏 丹 红 结 构 类 似 物 作 为 虚 拟 模 板, 以 甲 基 丙 烯 酸 (MAA) 为 单 体, 乙 二 醇 二 甲 基 丙 烯 酸 酯 (EDMA) 为 交 联 剂, 聚 乙 烯 吡 咯 烷 酮 (PVP) 为 分 散 剂, 采 用 悬 浮 聚 合 法 制 备 具 有 较 高 选 择 性 的 分 子 印 迹 聚 合 物 微 球, 并 以 此 作 为 固 相 萃 取 填 料, 结 合 高 效 液 相 色 谱 法 对 不 同 品 牌 的 火 腿 肠 制 品 中 四 种 苏 丹 红 残 留 量 进 行 检 测 结 果 表 明, 此 法 比 国 标 有 着 更 高 的 选 择 性 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 和 试 剂 LC-20A 高 效 液 相 色 谱 仪 ( 岛 津 公 司 ); 色 谱 柱 :Optomapak-C18 (4.6mm 150mm;C18, 5μm) ;N2000 色 谱 工 作 站 ( 浙 大 智 达 公 司 );MAA EDMA AIBN AM( 美 国 ACROS 公 司 ); 偶 氮 二 异 丁 腈 (AIBN, 上 海 天 莲 精 细 化 工 有 限 公 司 ); 苏 丹 红 Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ( 天 津 福 晨 化 学 试 剂 厂 ); 流 动 相 :0.3% 甲 酸 - 甲 醇 溶 液 ; 流 速 :1.0mL/min; 检 测 波 长 :475nm 1.2 分 子 印 迹 聚 合 物 的 制 备 准 确 称 取 适 量 苏 丹 红 结 构 类 似 物 和 MAA 溶 于 氯 仿 中, 充 分 混 匀,30mim 后, 加 入 EDMA 和 AIBN, 超 声 脱 气 5min 将 适 量 的 PVP 溶 于 超 纯 水 中, 在 600 转 / 分 钟 的 转 速 下 将 氯 仿 溶 液 逐 滴 加 入 溶 有 PVP 的 水 中, 水 浴 温 度 控 制 在 60, 反 应 24 小 时 1.3 分 子 印 迹 固 相 萃 取 取 10 根 自 制 层 析 柱 管 1cm( 内 径 ) 6cm( 高 ), 底 部 有 砂 芯 隔 板, 干 法 装 入 500mg 的 自 制 聚 合 物 轻 敲 实 后 加 一 砂 芯 隔 板, 分 别 用 5mL 氯 仿 和 10mL 甲 醇 预 淋 洗 分 别 对 上 样 液 淋 洗 液 洗 脱 液 的 种 类 及 用 量 进 行 了 优 化 首 先 确 定 上 样 液 为 2ug/mL 的 苏 丹 红 混 标 溶 液 3mL, 分 别 考 察 了 甲 醇 50% 甲 醇 水 20% 甲 醇 水 乙 腈 二 氯 甲 烷 超 纯 水 作 为 淋 洗 液 的 效 果 ; 然 后 考 察 了 5% 乙 酸 的 甲 醇, 二 氯 甲 烷,5% 乙 酸 的 二 氯 甲 烷,5% 乙 酸 的 乙 腈,5% 丙 酮 的 正 己 烷, 氯 仿,5% 乙 酸 的 氯 仿, 乙 酸 乙 酯 作 为 洗 脱 液 的 效 果 和 用 量 2 结 果 与 讨 论 2.1 聚 合 物 的 制 备 与 表 征 本 文 采 用 苯 胺 和 萘 酚 为 虚 拟 模 板 采 用 悬 浮 聚 合 法 制 备 出 粒 径 均 一, 机 械 性 能 良 好, 选 择 性 高, 吸 附 性 好 的 分 子 印 迹 聚 合 物 微 球 吸 附 性 实 验 与 C18 进 行 了 对 比 如 图 1 所 示, 结 果 显 示 自 制 印 迹 材 料 比 C18 有 更 好 的 吸 附 性 和 选 择 性, 并 且 重 现 性 良 好 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( ) 河 北 省 自 然 科 学 基 金 (B ) 教 育 部 留 学 回 国 基 金 河 北 省 留 学 人 员 科 技 活 动 择 优 资 助 项 目 河 北 省 高 校 百 名 优 秀 创 新 人 才 支 持 计 划 资 助 项 目 作 者 简 介 : 杨 更 亮 (1963- ), 男, 河 北 人, 教 授, Tel: , ygl@hbu.edu.cn 109

115 聚 合 物 柱 子 C18 柱 子 吸 附 质 量 (ug) 上 样 体 积 (ml) Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 吸 附 量 (ug) 上 样 体 积 (ml) Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 图 1 材 料 吸 附 性 和 选 择 性 对 照 表 2.2 分 子 印 迹 固 相 萃 取 条 件 的 优 化 实 验 结 果 表 明, 采 用 3.0mL 的 20% 甲 醇 水 作 淋 洗 液 可 以 有 效 的 除 去 样 品 中 的 大 部 分 杂 质, 用 5.0mL 的 5% 乙 酸 的 氯 仿 作 洗 脱 液 的 加 标 样 品 中 无 杂 质 影 响, 能 够 较 好 的 净 化, 富 集 苏 丹 红 Ⅰ-Ⅳ 一 方 面 保 证 较 高 的 回 收 率, 另 一 方 面 达 到 了 去 除 杂 质, 富 集 目 标 物 的 目 的 不 同 品 牌 火 腿 肠 样 品 经 粉 粹 后 用 一 定 量 的 正 己 烷 提 取 三 次, 合 并 提 取 液 后 上 自 制 印 迹 萃 取 柱 在 最 优 条 件 下 进 行 固 相 萃 取 过 程, 收 集 上 样 流 出 液 淋 洗 液 洗 脱 液 挥 干 后 用 0.5mL 流 动 相 溶 解, 进 行 HPLC 分 析 在 三 个 不 同 的 加 标 浓 度 ( μg/g) 下, 如 图 2 示, 四 种 苏 丹 红 的 平 均 回 收 率 在 % 之 间 日 内 精 密 度 均 小 于 1.7%, 日 间 精 密 度 小 于 4.0% 图 2 火 腿 肠 样 品 加 标 洗 脱 色 谱 图 参 考 文 献 : [1] Zhang Z, Zhang H, Hu Y, et a1. [J]. Anal Chim Acta, 2010, 661: [2] Calbiani F, Careri M, Elviri L, et a1. [J]. J Chromatogr A, 2004, 1042: [3] He L, Su Y, fang B, et a1. [J]. Anal Chim Acta, 2007, 594: Molecularly Imprinted Solid-phase Extraction for the Determination of Four Sudans in Sausage Products QIAO Jin-dong, YAN Hong-yuan, WANG Hui, YANG Geng-liang* (College of Pharmacy, Hebei University, Baoding, , China) Abstract: A simple molecularly imprinted solid-phase extraction coupled with liquid chromatography was developed for the simultaneous determination of four Sudans from sausage samples. The molecularly imprinted polymers were synthesized by suspension polymerization using aniline and naphthol as dummy template, which reveal high affinity to Sudans in aqueous solution. Comparing with alumina oxide and C18, considerable diferences in the interaction with Sudans were observed using MIPs as SPE sorbent. Key words: Molecularly imprinted polymer; Solid-phase extraction; Sudans; Sausage products 110

116 原 子 转 移 自 由 基 聚 合 (ATRP) 法 制 备 聚 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 苯 高 分 子 包 覆 硅 胶 固 定 相 徐 丹, 张 海 燕, 董 襄 朝 ( 南 开 大 学 化 学 学 院, 天 津 ) 应 用 表 面 引 发 活 性 自 由 基 接 枝 聚 合 的 方 法 可 以 在 载 体 表 面 形 成 多 层 结 构, 避 免 聚 合 溶 液 中 产 生 非 理 想 聚 合 物 的 问 题, 同 时, 交 联 聚 合 物 包 覆 固 定 相 具 有 较 宽 的 ph 使 用 范 围, 因 此, 活 性 自 由 基 接 枝 聚 合 在 多 功 能 固 定 相 的 合 成 中 具 有 很 好 的 应 用 潜 力 原 子 转 移 自 由 基 聚 合 (ATRP) 技 术 [1,2] 是 活 性 自 由 基 聚 合 发 展 史 上 最 简 便 的 一 种 合 成 技 术, 具 有 巨 大 的 潜 在 工 业 前 景 ATRP 集 普 通 自 由 基 聚 合 和 活 性 可 控 聚 合 的 优 点 于 一 体, 可 以 采 用 多 种 聚 合 方 式, 在 较 温 和 的 条 件 下 经 过 较 简 单 的 合 成 路 线 合 成 指 定 分 子 结 构 窄 分 子 量 分 布 的 聚 合 物 ; 并 且 与 其 它 活 性 可 控 聚 合 相 比, ATRP 能 够 较 容 易 地 合 成 星 形 梳 形 以 及 超 支 化 聚 合 物 我 们 采 用 可 控 的 ATRP 在 硅 胶 微 球 ( 孔 径 :100Å, 粒 径 :10 m m) 表 面 均 匀 包 覆 聚 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 基 苯, 得 到 表 面 修 饰 硅 球. 将 修 饰 后 的 硅 球 装 入 不 锈 钢 色 谱 柱 ( mm), 进 行 了 苯 类 样 品 的 色 谱 实 验 从 图 1 可 以 看 出 该 填 料 对 苯 的 同 系 物 有 较 好 的 分 离 效 果, 对 苯 的 柱 效 达 到 图 2 为 酚 类 样 品 的 色 谱 图, 说 明 该 填 料 对 酚 类 化 合 物 具 有 很 好 的 色 谱 分 离 能 力 retention time(min) 图 1. 烷 基 苯 色 谱 分 离 图 色 谱 条 件 : 流 动 相 : ACN/H2O(55/45, v/v); 流 速 :1 ml min -1 ; 检 测 波 长 :254 nm 化 合 物 : 1. 苯, 2. 甲 苯, 3. 乙 苯, 4. 丙 苯 retention time(min) 图 2. 酚 类 化 合 物 色 谱 分 离 图 色 谱 条 件 : 流 动 相 :ACN/ H2O ( ACN: 0-25min, 25% -90%, v/v); 流 速 : 1 ml min -1 ; 检 测 波 长 : 254 nm 化 合 物 : 1. 对 苯 二 酚, 2. 间 苯 二 酚, 3. 邻 苯 二 酚, 4. 苯 酚, 5. 对 羟 基 苯 甲 酸 甲 酯, 6. 对 羟 基 苯 甲 酸 乙 酯, 7. 对 羟 基 苯 甲 酸 丙 酯 实 验 通 过 ATRP 法, 成 功 的 对 二 氧 化 硅 微 球 表 面 进 行 化 学 修 饰, 并 将 其 应 用 于 苯 类 化 合 物 的 分 离 分 析, 从 色 谱 结 果 可 知 该 固 定 相 柱 效 高, 对 烷 基 苯 及 酚 类 化 合 物 有 较 好 选 择 性 我 们 将 继 续 优 化 固 定 相 的 合 成 方 法, 以 便 用 于 实 际 样 品 的 分 析 参 考 文 献 : [1] Wang J S, Matyjaszewski K. J. Am Chem Soc, 1995, 117: 5614~5615 [2] Kato M, Kamigaito M, Sawamoto M, et al. Macromolecules, 1995, 28: 1721~

117 毛 细 管 电 泳 分 离 手 性 类 氨 基 酸 药 物 李 保 会 1, 田 宝 娟 2 (1. 华 北 电 力 大 学 环 境 科 学 与 工 程 学 院, 河 北 保 定 ;2. 保 定 学 院 理 学 院, 河 北 保 定 ) 近 年 来 毛 细 管 电 泳 (CE) 成 功 应 用 于 药 物 的 手 性 分 离, 构 筑 手 性 环 境 使 对 映 异 构 体 间 呈 现 物 理 特 征 的 差 异 是 分 离 手 性 药 物 的 前 提 条 件 目 前 手 性 环 境 的 构 筑 呈 现 多 样 性 的 趋 势, 比 如 手 性 衍 生 化 试 剂 法 手 性 缓 冲 液 添 加 剂 法 和 手 性 固 定 相 法 等 其 中 在 缓 冲 液 中 添 加 手 性 拆 分 试 剂 是 一 种 经 济 而 又 简 单 的 方 法 β- 环 糊 精 (β-cd) 是 一 类 由 7 个 葡 萄 糖 分 子 通 过 糖 苷 键 结 合 而 成 的 环 状 中 空 园 筒 型 化 合 物, 其 手 性 识 别 功 能 主 要 来 自 环 内 腔 对 芳 烃 或 脂 肪 烃 类 侧 链 的 包 容 作 用, 以 及 环 外 壳 上 的 羟 基 与 药 物 对 映 体 分 子 发 生 氢 键 作 用 而 β- 环 糊 精 对 形 成 包 合 物 有 最 佳 大 小 的 内 腔, 适 用 于 大 多 数 药 物 对 映 体 的 位 阻 和 电 子 特 征, 因 此 使 用 最 为 广 泛 通 过 化 学 反 应 可 以 方 便 地 引 入 不 同 的 取 代 基 而 使 其 对 不 同 的 手 性 药 物 具 有 识 别 功 能, 提 高 了 β-cd 的 手 性 识 别 能 力 高 光 学 纯 度 的 类 氨 基 酸 是 合 成 某 些 医 疗 药 物 的 前 体, 分 离 类 氨 基 酸 具 有 重 要 的 意 义 本 文 以 不 同 的 β-cd 衍 生 物 配 合 作 为 手 性 拆 分 试 剂, 通 过 改 变 缓 冲 液 中 β-cd 衍 生 物 种 类 组 合 以 及 浓 度 分 离 了 多 种 类 氨 基 酸 药 物 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 与 试 剂 TH-2000 毛 细 管 电 泳 系 统 ( 保 定 天 惠 分 离 科 学 研 究 所 ) 45 cm 75 μm 石 英 熔 硅 毛 细 管 ( 永 年 锐 沣 色 谱 器 件 有 限 公 司 ) 用 于 电 泳 分 离 新 毛 细 管 首 先 用 甲 醇 冲 洗 30 min, 然 后 分 别 用 0.5 mol L -1 HCl 高 纯 水 0.5 mol L -1 NaOH 硼 酸 缓 冲 液 分 别 冲 洗 和 10 min 每 天 试 验 开 始 前 用 0.5 mol L -1 NaOH 和 高 纯 水 分 别 冲 洗 20 min 每 次 进 样 之 前, 毛 细 管 分 别 用 0.5 mol L -1 NaOH 和 缓 冲 溶 液 冲 洗 3 min 压 力 进 样, 在 12 kpa 压 力 下 进 样 6 s 1.2 试 剂 所 用 试 剂 至 少 是 分 析 纯 二 次 蒸 馏 水 用 于 所 有 溶 液 配 制 β-cd 购 自 北 京 双 旋 微 生 物 培 养 基 试 剂 厂, 使 用 前 经 重 结 晶 纯 化 ; 甲 基 化 β-cd 和 羟 丙 基 β-cd 购 自 百 灵 威 ; 羧 甲 基 β-cd 为 实 验 室 合 成 用 于 手 性 分 离 的 缓 冲 溶 液 由 15 mm NaH2O4( 天 津 泰 兴 化 工 厂 ) 添 加 一 定 量 的 β-cd 配 制, 并 用 0.1~1 mol L -1 NaOH( 天 津 泰 兴 化 工 厂 ) 调 整 其 ph 值, 最 后 用 0.45 μm 微 孔 滤 膜 过 滤 待 用 2 结 果 与 讨 论 2.1 不 同 拆 分 试 剂 的 影 响 以 同 系 列 的 类 氨 基 酸 药 物 3-(N- 甲 基 ) 甲 胺 - 对 氟 苯 乙 酰 胺 3-(N- 甲 基 ) 甲 胺 - 对 溴 苯 乙 酰 胺 和 3-(N- 甲 基 ) 甲 胺 - 对 甲 氧 基 苯 乙 酰 胺 为 分 析 对 象, 实 验 了 β-cd 甲 基 化 β-cd 羟 丙 基 β -CD 羧 甲 基 β-cd 对 三 种 手 性 药 物 的 拆 分 效 果 结 果 表 明 除 却 羟 丙 基 β-cd 外, 其 它 拆 分 试 剂 对 三 种 手 性 药 物 没 有 任 何 分 离 效 果 2.2 分 离 效 果 的 优 化 以 羟 丙 基 β-cd 为 手 性 拆 分 试 剂, 分 别 测 试 了 ph 值 羟 丙 基 β-cd 浓 度 分 离 电 压 有 机 添 加 剂 等 因 素 对 分 离 效 果 的 影 响 实 验 得 到 的 最 优 化 条 件 为 : 缓 冲 溶 液 50 mmol L -1 羟 基 金 项 目 : 中 央 高 校 基 金 (No.09QL53) 作 者 简 介 : 李 保 会, 男, 汉 族,1975 年 生, 讲 师 bhlli@mail.nankai.edu.cn 112

118 丙 基 β-cd + 10 mmol/l NaH2O4(pH=7), 分 离 电 压 18 kv Fig. 1 The structure of several pseudo-amino acids. Fig. 2 Electrophoregram of different pseudo-amino acids. A, 4-(N-methyl) methylamine -p- F phenylacetamide; B, 4-(N-methyl) methylamine -p- Br phenylacetamide; C, 4-(N-methyl) methylamine -p- methyl phenylacetamide. 参 考 文 献 [1] Kuwabe S. I., Torraca K. E., Buchwald S. L. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, [2] Gubitz G., Schmid M. G. Electrophoresis, 2004, 25: [3] Natishan T. K. J. Liq. Chromatogr. Related Technol. 2005, 28: Chiral Separation of Pseudo- Amino Acid Enantiomers by Capillary Electrophoresis with CD Derivations as Chiral Selector LI Bao-hui 1, TIAN Bao-juan 2 (1 School of Environmental Science & Engineering, North China Electric Power University, Hebei Province, Department of Chemistry, Baoding University, Hebei Province, ) Abstract: A capillary electrophoresis (CE) method for the separation of pseudo- amino acid enantiomers was built. Several different dyclodextrin (CD) derivatives were tested for the chiral separation of three different pseudo- amino acids, and it was proved that hydroxypropyl -β-cd showed better chiral selectivity for all three pseudo- amino acids than the neutral CDs. The baseline separation was obtained by CE in a 75-μm i.d. 60 cm (effective length 45 cm) fused-silica capillary at 18 kv voltage, while 10 mm phosphate (ph=7.0) acted as running buffer and a 50mM hydroxypropyl-β-cd served as chiral selector. The detective wavelength was set at 254 nm. Keywords: Capillary electrophoresis, chiral separation, enantiomers, pseudo- amino acids 大 田 软 海 绵 酸 的 高 效 液 相 色 谱 113

119 荧 光 检 测 方 法 王 丽, 王 向 红, 桑 亚 新, 周 群 标, 吉 爽 爽, 叶 婧 ( 河 北 省 农 产 品 加 工 工 程 技 术 研 究 中 心 河 北 农 业 大 学 食 品 科 技 学 院, 保 定 ) 腹 泻 性 贝 类 毒 素 (DSP) 是 一 种 肿 瘤 促 进 剂, 具 有 较 强 的 致 癌 作 用 [1], 大 田 软 海 绵 酸 是 主 要 致 病 因 子 之 一, 其 毒 素 分 子 中 没 有 生 色 集 团, 但 是 在 紫 外 区 有 吸 收, 被 贝 类 滤 食 后 在 其 体 内 性 质 非 常 稳 定, 一 般 的 烹 调 加 热 不 能 使 其 破 坏 [2] 常 用 的 OA 和 DTX-1 的 检 测 方 法 为 小 白 鼠 生 物 学 检 测 法, 该 方 法 重 现 性 差 灵 敏 度 低 而 又 易 受 脂 肪 酸 等 内 源 性 化 合 物 的 干 扰 [3] 随 后, 酶 联 免 疫 (ELISA) 学 方 法 发 展 起 来 [4-5], 但 这 种 方 法 由 于 抗 原 抗 体 的 交 叉 反 应 不 能 对 混 合 毒 素 进 行 精 确 分 析, 且 易 出 现 假 阳 性 目 前 最 为 常 用 的 化 学 分 析 方 法 主 要 是 高 效 液 相 色 谱 法, 荧 光 检 测 和 质 谱 检 测 [6-9] 由 于 OA 和 DTX-1 的 紫 外 吸 收 较 弱, 必 须 经 过 荧 光 剂 衍 生 处 理 之 后 方 可 检 测, 常 用 的 衍 生 试 剂 为 9- 蒽 醌 (9-ADAM), 它 具 有 高 度 的 专 一 性 和 灵 敏 度, 但 由 于 它 价 格 昂 贵 且 需 在 -80 条 件 下 保 存 从 而 使 它 的 应 用 受 到 一 定 的 限 制 [10] Jin 等 [10] 用 4- 溴 甲 基 -7- 甲 氧 基 香 豆 素 作 为 衍 生 试 剂, 可 通 过 OA 中 的 羧 基 和 衍 生 剂 的 溴 甲 基 的 酯 化 反 应 生 成 荧 光 酯, 从 而 完 成 了 对 OA 的 分 析 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 与 试 剂 旋 转 蒸 发 仪 ( 上 海 绿 叶 ); 电 热 恒 温 培 养 箱 ( 泰 斯 特 ); 荧 光 分 光 光 度 计 (Jasco); 高 效 液 相 色 谱 仪 ( 日 本 岛 津 ), 配 备 二 元 泵, 脱 气 装 置, 自 动 进 样 器, 荧 光 检 测 器 甲 醇, 乙 腈 均 为 色 谱 纯 ( 上 海 科 密 欧 化 学 试 剂 有 限 公 司 ); 正 己 烷 丙 酮 氯 仿 ( 分 析 纯 上 海 科 密 欧 化 学 试 剂 有 限 公 司 ); 双 蒸 水 由 纯 水 系 统 制 备 ; 大 田 软 海 绵 酸 (OA)(Zen-U Biotechnology,HPLC>95%);4- 溴 甲 基 7- 甲 氧 基 香 豆 素 (BrMmc)( 百 灵 威 科 技 有 限 公 司 ); N,N- 二 异 丙 基 乙 胺 ( 纯 度 99% 以 上 百 灵 威 科 技 有 限 公 司 ) 2 试 验 方 法 2.1 衍 生 条 件 香 豆 素 和 N,N- 二 异 丙 基 乙 胺 在 使 用 之 前 都 需 用 干 丙 酮 分 别 溶 解 至 0.1% 和 0.3% 2.2 激 发 波 长 和 发 射 波 长 的 测 定 用 荧 光 分 光 光 度 计 分 别 对 一 定 浓 度 的 香 豆 素 (BrMmc) 和 大 田 软 海 绵 酸 (OA) 的 衍 生 物 进 行 全 波 长 扫 描, 根 据 所 得 的 荧 光 吸 收 光 谱, 分 别 记 录 其 在 最 大 特 征 吸 收 峰 处 的 最 大 吸 收 波 长, 从 而 确 定 荧 光 检 测 器 的 激 发 波 长 和 发 射 波 长 2.3 色 谱 条 件 色 谱 柱 :Hypersil BDS-C18 色 谱 柱 (E ,250mm 4.6mm,5μm); 柱 温 :30 ; 流 速 :1.2ml/min; 流 动 相 : 乙 腈 / 甲 醇 / 水 (58/4.5/37.5); 进 样 量 :10μl 2.4 标 准 曲 线 的 制 备 将 标 准 品 稀 释 为 梯 度 浓 度 分 别 为 ppb 的 标 准 溶 液 以 OA 衍 生 物 标 准 品 浓 度 (μg/l) 为 x 轴, 以 峰 面 积 为 y 轴, 自 动 定 量 绘 制 标 准 曲 线 基 金 项 目 : 国 家 海 洋 公 益 性 行 业 科 研 专 项 基 金 (NO ) 作 者 简 介 : 王 丽 (1985 ), 女, 在 读 硕 士 研 究 生, 研 究 方 向 为 食 品 安 全 wlily851123@163.com 通 讯 作 者 : 王 向 红 (1973 ), 女, 副 教 授, 硕 士 研 究 生 导 师, 主 要 从 事 食 品 安 全 与 检 测 方 面 的 研 究 3 样 品 处 理 114

120 [2] 3.1 方 案 一 提 取 取 适 量 样 品 用 组 织 捣 碎 机 捣 碎 混 匀 取 2g 样 品, 加 入 10ml 甲 醇 / 水 (8:2) 抽 提, 用 超 声 仪 超 声 30min 后, 以 3000rpm 离 心 10min, 静 置 一 段 时 间, 各 取 上 层 清 液 1ml 至 另 一 50ml 的 离 心 管 加 入 5ml 正 己 烷 脱 脂 提 纯, 混 合 物 在 涡 旋 混 匀 器 混 匀 1min 待 静 置 一 段 时 间 分 层 后, 弃 上 层 正 己 烷 加 入 5ml 水 和 10ml 氯 仿, 涡 旋 混 匀 器 混 匀 1min, 静 置 分 层 后, 将 下 层 氯 仿 移 至 另 一 50ml 离 心 管 水 层 用 氯 仿 抽 提 两 次 之 后 合 并 氯 仿 层 用 旋 转 蒸 发 仪 依 次 蒸 发 至 干 用 正 己 烷 / 丙 酮 (2:8) 定 容 至 5ml 过 柱 纯 化 用 5ml 丙 酮,5ml 甲 醇 和 10ml 正 己 烷 / 丙 酮 (2:8) 润 洗 硅 胶 柱, 取 1ml 定 容 后 的 样 品 加 入 柱 子 中, 用 1ml 正 己 烷 / 丙 酮 (2:8) 和 10ml 甲 醇 / 丙 酮 (3:97) 先 后 进 行 淋 洗 然 后 用 10ml 甲 醇 / 丙 酮 (4:6) 洗 脱 DSP 毒 素 衍 生 收 集 洗 脱 液, 蒸 发 至 干, 加 入 0.5ml 的 甲 醇 丙 酮 (4:6), 过 有 机 滤 膜, 转 移 到 棕 色 的 小 瓶 中, 并 用 氮 气 吹 干 然 后 在 残 留 物 中 分 别 加 入 50μl BrMmc(0.1%) 和 50μl N,N- 二 异 丙 基 乙 胺 (0.3%), 在 50 下 暗 反 应 2 小 时 [11] 3.2 方 案 二 提 取 取 1.0g 贝 样, 加 入 2.0ml 丙 酮 匀 浆, 以 3000rpm 离 心 10min 待 静 置 一 段 时 间, 取 上 层 清 液 1.0ml, 并 加 入 25ml 水, 混 合 物 在 涡 旋 混 匀 器 混 匀 1min 待 静 置 分 层 后, 将 下 层 转 移 至 另 一 离 心 管, 将 上 层 再 用 10ml 的 二 氯 甲 烷 抽 提 两 次, 之 后 合 并 二 氯 甲 烷 层 将 所 得 溶 液 用 旋 转 蒸 发 仪 蒸 发 至 干 干 燥 后 的 提 取 液 以 少 量 二 氯 甲 烷 溶 解 定 容 至 5ml 过 柱 纯 化 填 装 两 只 串 联 的 固 相 萃 取 柱, 上 层 柱 为 2g 无 水 硫 酸 钠, 下 层 柱 为 0.5g 二 氧 化 硅 用 5ml 丙 酮 / 甲 醇 (95:5) 和 5ml 二 氯 甲 烷 先 后 润 洗 柱 子 取 1ml 样 品 溶 液 上 样, 用 10ml 二 氯 甲 烷 淋 洗 然 后 去 除 硫 酸 钠 柱, 依 次 以 5ml 二 氯 甲 烷 / 丙 酮 (1:1) 5ml 丙 酮 5ml 丙 酮 / 甲 醇 (95:5) 淋 洗 最 后 用 10ml 丙 酮 / 甲 醇 (75:25) 洗 脱 毒 素 衍 生 收 集 洗 脱 液, 转 移 到 棕 色 的 小 瓶 中, 并 用 氮 气 吹 干 然 后 在 残 留 物 中 分 别 加 入 50μl BrMmc(0.1%) 和 50 μl N,N- 二 异 丙 基 乙 胺 (0.3%), 在 50 下 暗 反 应 2 小 时 3.3 检 测 在 DSP 的 衍 生 反 应 完 成 后, 尽 快 用 高 效 液 相 色 谱 仪 荧 光 检 测 器 分 别 进 行 分 析 检 测 4 加 标 回 收 实 验 及 样 品 检 测 取 两 份 匀 浆 贝 类 样 品, 其 中 一 份 加 入 0.2ppm 的 标 准 品 溶 液 分 别 按 两 种 不 同 的 方 案 处 理 加 标 和 不 加 标 贝 类 样 品, 各 重 复 三 次, 根 据 测 定 的 结 果 计 算 样 品 回 收 率 本 实 验 选 取 海 湾 扇 贝 虾 夷 扇 贝 牡 蛎 杂 色 蛤 4 种 产 于 渤 海 地 区 的 贝 类 进 行 样 品 测 定, 并 将 海 湾 扇 贝 分 为 贝 柱 裙 边 卵 黄 内 脏 四 部 分 选 择 较 优 方 案 进 行 样 品 检 测, 比 较 不 同 贝 类 组 织 中 腹 泻 性 贝 毒 的 含 量 5 结 果 与 讨 论 5.1 激 发 波 长 和 发 射 波 长 的 结 果 分 析 115

121 吸 光 值 吸 光 值 吸 收 波 长 吸 收 波 长 图 1 香 豆 素 激 发 光 谱 图 2 香 豆 素 发 射 光 谱 根 据 图 1 和 图 2 中 最 大 吸 收 峰 所 对 应 的 吸 收 波 长 可 判 定 BrMmc 的 激 发 波 长 为 347nm, 发 射 波 长 为 445nm 吸 光 值 吸 光 值 吸 收 波 长 吸 收 波 长 图 3 OA 衍 生 物 激 发 光 谱 图 4 0A 衍 生 物 发 射 波 长 根 据 图 3 和 图 4 可 知 OA 衍 生 物 的 激 发 波 长 为 337nm, 发 射 波 长 为 405nm 由 先 后 测 得 的 BrMmc 和 OA 衍 生 物 激 发 和 发 射 波 长 的 明 显 有 所 不 同, 可 以 得 知 OA 和 香 豆 素 的 衍 生 反 应 已 经 完 成, 因 此 荧 光 检 测 器 设 定 的 激 发 波 长 为 337nm, 发 射 波 长 为 405nm 5.2 标 准 曲 线 结 果 分 析 峰 面 积 浓 度 (ppb) 图 5 不 同 浓 度 OA 衍 生 物 标 准 曲 线 所 得 线 性 回 归 方 程 为 y=1705.4x 良 好 的 线 性 关 系 5.3 色 谱 图 结 果 分 析 图 6 OA 标 准 品 衍 生 物 色 谱 图 (R 2 =0.9997), 由 此 推 断 OA 经 衍 生 化 反 应 后 具 有 116

122 由 标 准 样 品 色 谱 图 可 以 看 出 OA 保 留 时 间 为 min, 避 免 了 衍 生 剂 的 干 扰 5.4 加 标 回 收 实 验 结 果 分 析 经 两 种 实 验 结 果 表 明, 方 案 一 平 均 回 收 率 为 56.25%, 前 处 理 效 果 较 差, 初 步 推 断 为 正 己 烷 脱 脂 造 成 标 品 损 失, 而 方 案 二 的 处 理 方 法 所 得 的 平 均 回 收 率 为 115%, 回 收 率 高 重 现 性 好, 但 两 种 前 处 理 方 法 均 操 作 步 骤 复 杂 繁 琐, 需 进 一 步 考 察 研 究, 使 消 除 干 扰 物 质 的 前 提 下, 简 化 处 理 步 骤 通 常 接 受 的 腹 泻 性 贝 类 毒 素 的 使 用 安 全 标 准 为 20μgOA 当 量 /100g 样 重, 即 0.2ppm, 在 所 处 理 的 6 个 样 品 中, 有 5 个 检 测 到 OA 组 分, 检 出 率 约 为 83%, 阳 性 样 品 为 牡 蛎 虾 夷 杂 色 蛤 扇 贝 裙 边 扇 贝 卵 黄, 样 品 毒 素 含 量 大 小 为 扇 贝 内 脏 > 牡 蛎 > 扇 贝 裙 边 > 扇 贝 卵 黄 > 杂 色 蛤 > 虾 夷 6 结 果 与 讨 论 大 田 软 海 绵 酸 经 BrMmc 衍 生 后, 经 液 相 荧 光 检 测 具 有 良 好 的 线 性 关 系, 且 衍 生 物 激 发 和 发 射 波 长 不 同 于 衍 生 剂 的 激 发 和 发 射 波 长, 说 明 衍 生 反 应 生 成 新 物 质, 衍 生 条 件 满 足 反 应 的 充 分 进 行 经 两 种 加 标 回 收 试 验 的 比 较, 探 索 较 优 前 处 理 方 法, 根 据 其 性 质 选 择 提 取 剂 和 洗 脱 剂 对 样 品 的 检 测 具 有 重 大 意 义 我 们 发 现 渤 海 贝 类 受 污 染 的 程 度 较 高 同 时 有 关 部 门 应 定 期 检 测, 及 早 防 范, 尽 量 降 低 贝 类 毒 素 所 带 来 的 损 害 参 考 文 献 : [1] Yasumoto T., Murata M., Oshima M., Matsumoto G.L., Seafood Toxins American Chemical Society, 1984, [2] 中 国 沿 海 贝 类 中 的 生 物 毒 素 研 究 [D]. 中 国 科 学 院 研 究 生 院 ( 海 洋 研 究 所 ),2005. [3] Takagi,T.,Hayashi,K.,Itabashi,Y.,Bull.Jpn.Soc.Sci.Fish 1984,50, [4] Shestowsky,S.,Quilliam,M.A.,Sikorska,H.M.,Toxicon 1992,30, [5] Pamela,E.,Nú?ez,Anne,C.,International Journal of food Microbiology 1997,36, [6] Lawrence.J.F.,Scott,P.M.,Elsevier 1993, [7] Kazuaki,A.,Hiroshi,O.,Yasumoto.T.,J.Chromatogra A.1996,729, [8] Kevin,J.J.,Eoin,P.C.,Marion,G.,Sean,S.K.,Rosa,D.,Lucentini,L.,Luigi,G.,Toxicon,1997,6, [9] Kevin,J.J.,Alan,B.G.,Yasumoto,T.,J.Chromatogra A 1999,844, [10] Jin,L.S.,Christian,H.,Bernd,L.,Anal.Chem 1997,357, [11] 卢 士 英. 海 产 品 中 大 田 软 海 绵 酸 快 速 检 测 方 法 研 究 [D]. 吉 林 大 学,2007. The HPLC-fluorometric methods of the okadaic acid Wang Li, Wang Xiang-hong, SANG Ya-xin, ZHOU Qun-biao, JI Shuang-shuang, YE Jing ( Engineering Research Center of agricultural products processing in Hebei Province, College of Food Science & Technical, Agricultural University of HeBei, Baoding ) Abstract:The fluorescence derivation was reacted with BrMmc and Okadaic acid(oa),and preliminary exploration was made for the conditions of derivative reaction, excitation and emission wavelength of ester derivatives. The results show that the largest fluorescence absorption appeared on Ex=337nm,Em=405nm.After separated with C18 column by HPLC,a good linear was obtained: Y=1705.4x (R 2 =0.9997). Two sample pretreatment methods were used in standard-addition experiment to prove the accuracy of the schemes. Key words: Okadaic acid; HPLC;fluorometric derivation 117

123 对 硫 磷 分 子 印 迹 聚 合 物 固 相 萃 取 材 料 的 合 成 及 其 应 用 * 苏 晓 倩, 高 瑞 霞, 孙 祥 丽, 林 冬, 陈 朗 星 ( 南 开 大 学 化 学 学 院, 天 津 ) 对 硫 磷 (Parathion) 是 一 种 广 谱 性 杀 虫 杀 螨 剂, 对 害 虫 具 有 强 烈 的 触 杀 和 胃 毒 作 用, 为 胆 碱 酯 酶 抑 制 剂 在 密 闭 场 所 也 有 一 定 的 熏 蒸 作 用, 尤 其 在 30 以 上 时, 熏 蒸 作 用 更 加 明 显, 对 硫 磷 的 杀 虫 效 果 与 气 温 有 密 切 关 系, 在 18 以 上 时, 熏 蒸 作 用 更 加 明 显 在 18 以 下 效 果 较 差 在 18 以 上 杀 虫 效 果 随 温 度 提 高 而 增 加, 但 药 效 期 相 应 缩 短 对 硫 磷 无 内 吸 杀 虫 作 用, 但 有 较 强 的 渗 透 力, 施 于 植 物 叶 表 面 的 药 液 能 渗 透 进 入 叶 内, 杀 死 在 叶 背 取 食 的 蚜 叶 蝉 和 螨 施 于 稻 田 水 中 的 药 剂, 能 渗 透 进 入 叶 鞘 内 或 水 稻 心 叶 部 位, 杀 死 已 侵 入 叶 鞘 或 心 叶 部 位 的 螟 虫 一 龄 幼 虫 在 叶 上 的 残 效 期 一 般 为 4-5 天, 主 要 存 在 于 大 米, 鸡 肉, 猪 肉, 牛 肉, 大 蒜, 洋 葱, 苹 果 等 作 物 中 本 文 以 对 硫 磷 为 模 板,3- 氨 丙 基 三 乙 氧 基 硅 烷 (3-aminopropyltriethoxysilane,APTES), 苯 基 三 甲 氧 基 硅 烷 (Phenyltrimethoxysilane,PTMOS) 为 功 能 单 体, 采 用 分 子 印 迹 溶 胶 - 凝 胶 (sol-gel) 方 法, 以 硅 球 (45-75µm) 为 载 体, 制 备 了 可 用 作 固 相 萃 取 材 料 的 对 硫 磷 分 子 印 迹 聚 合 物 (MIP) 和 非 印 迹 聚 合 物 (NIP), 并 对 该 印 迹 聚 合 物 的 吸 附 特 性 进 行 了 研 究 如 图 1 所 示, 该 印 迹 聚 合 物 1min 左 右 即 可 达 到 吸 附 平 衡, 可 达 到 快 速 分 离 的 效 果 3.5 MIP NIP 吸 附 量 (mg/g) 时 间 ( min) 图 1 MIP,NIP 对 10mg/L 对 硫 磷 溶 液 进 行 吸 附 参 考 文 献 : [1] Sharon Marx, Amalya Zaltsman, Iva Turyan,Daniel Mandler,Anal. Chem. 2004, 76, [2] Xiaoman Jiang, Wei Tian, Chuande Zhao, Haixia Zhang*, Mancang Liu, Talanta 72(2007) [3] Raquel Gomes da Costa Silva, Fabio Augusto*, J. Chromatogr. A, 1114(2006) 基 金 项 目 : 国 家 863 计 划 : 有 机 磷 磺 酰 脲 类 农 药 高 效 分 子 印 迹 材 料 的 制 备 技 术 及 其 检 测 应 用 ( 批 准 号 2007AA10Z432) 118

124 HPLC 法 在 PDS 靶 标 酶 除 草 剂 筛 选 中 的 应 用 戎 清 清, 马 荣, 朱 晔 荣, 吕 宪 禹, 王 勇 ( 南 开 大 学 生 命 科 学 院, 天 津 ) 1 前 言 八 氢 番 茄 红 素 脱 氢 酶 (PDS) 是 类 胡 萝 卜 素 生 物 合 成 途 径 中 的 关 键 酶 众 所 周 知, 类 胡 萝 卜 素 是 一 种 很 重 要 的 天 然 色 素, 对 于 保 护 植 物 叶 绿 体 防 止 光 合 系 统 的 光 灭 活 和 光 破 坏 发 [1] 挥 着 重 要 的 作 用, 以 八 氢 番 茄 红 素 脱 氢 酶 为 主 要 靶 标 设 计 的 化 合 物, 通 过 抑 制 类 胡 萝 卜 素 的 [2] 生 物 合 成, 从 而 阻 碍 植 物 光 合 作 用 的 正 常 进 行, 可 以 有 效 发 挥 杀 草 的 作 用 由 于 该 类 除 草 剂 同 时 破 坏 植 物 体 内 的 叶 绿 素, 因 此 它 们 兼 具 有 漂 白 作 用 同 时 由 于 PDS 酶 不 存 在 于 动 物 体 内, 故 PDS 靶 标 类 除 草 剂 对 人 与 动 物 的 毒 性 很 低, 因 此, 该 类 除 草 剂 被 认 为 是 高 效 低 毒 环 境 友 好 型 的 除 草 剂, 具 有 很 好 的 应 用 前 景 这 也 进 一 步 促 进 了 该 类 新 型 除 草 剂 的 研 究 与 开 发 加 上 组 合 化 学 的 迅 速 发 展, 使 得 针 对 PDS 靶 标 设 计 合 成 的 化 合 物 增 加 很 快, 因 此 该 类 的 除 草 剂 的 筛 选 尤 为 重 要 2 PDS 靶 标 类 除 草 剂 的 筛 选 方 法 [3] [3] 国 内 外 对 于 PDS 靶 标 类 除 草 剂 的 筛 选 方 法 有 多 种, 如 常 规 的 油 菜 平 皿 法 浮 萍 及 藻 [4] [5-7] [4,8-9] 类 生 测 法 体 外 酶 活 检 测 法 和 同 位 素 示 踪 法 等 本 实 验 室 也 在 致 力 于 筛 选 以 八 氢 番 [3] 茄 红 素 脱 氢 酶 为 靶 标 的 除 草 剂 我 们 主 要 是 采 用 浮 萍 生 测 法 和 酶 活 抑 制 作 用 的 研 究 如 果 对 以 上 不 同 方 法 进 行 归 类, 可 以 分 为 生 物 活 性 测 定 和 酶 活 抑 制 分 析 法 其 中 油 菜 平 皿 浮 萍 和 藻 类 生 测 法 等 都 是 将 待 测 化 合 物 加 入 植 物 培 养 体 系, 通 过 检 测 其 对 植 物 生 长 的 抑 [3,4] 制 作 用 或 对 叶 绿 素 合 成 的 影 响 来 初 步 筛 选 出 有 效 的 化 合 物 而 对 于 活 体 的 同 位 素 示 踪 和 体 外 PDS 酶 活 抑 制 作 用 分 析 都 是 检 测 待 测 化 合 物 对 八 氢 番 茄 红 素 代 谢 过 程 的 影 响, 主 要 分 析 其 对 δ- 类 胡 萝 卜 素 的 合 成 是 否 有 抑 制 作 用, 而 且 大 多 是 采 用 HPLC 方 法 检 测 δ- 类 胡 萝 卜 [8,9] 素 含 量 的 变 化 3 HPLC 法 筛 选 PDS 靶 标 酶 的 除 草 剂 高 效 液 相 色 谱 检 测 方 法 具 有 分 辨 率 和 灵 敏 度 高, 分 析 速 度 快, 色 谱 柱 可 反 复 利 用, 流 出 组 分 易 收 集, 重 复 性 好, 定 量 精 度 高, 应 用 范 围 广 等 优 点, 适 用 于 分 析 高 沸 点 大 分 子 强 极 性 热 稳 定 性 差 的 化 合 物 类 胡 萝 卜 素 是 高 度 不 饱 和 化 合 物 ( 多 烯 ), 含 有 一 系 列 共 轭 双 键 和 甲 基 支 链, 特 定 的 化 学 结 构 使 类 胡 萝 卜 素 易 溶 于 有 机 溶 剂, 且 在 可 见 或 紫 外 光 谱 区 域 有 强 烈 的 吸 收, 适 于 高 效 液 相 色 谱 检 测 因 此, 近 十 年 来, 对 于 PDS 靶 标 酶 除 草 剂 的 筛 选 多 采 用 HPLC 方 法 其 中 采 用 比 较 多 的 是 体 外 分 析 不 同 化 合 物 对 PDS 酶 的 抑 制 作 用 主 要 是 通 过 原 核 生 物 获 得 PDS 酶 和 底 物 八 氢 番 茄 红 素, 即 由 含 有 pds 基 因 的 工 程 菌 表 达 PDS 酶, 由 含 有 合 成 八 氢 番 茄 红 素 基 因 的 工 程 菌 生 产 底 物 八 氢 番 茄 红 素, 分 别 提 取 底 物 和 PDS 酶 后, 在 体 外 加 入 待 测 化 合 物 进 行 酶 化 学 反 应, 再 通 过 HPLC 方 法, 在 425nm 下 检 测 产 物 δ- 类 胡 萝 卜 素 的 生 成 量 来 判 断 不 同 化 合 通 讯 作 者 : 南 开 大 学 生 命 科 学 院

125 [8,9] [8,9] 物 对 PDS 酶 活 性 的 抑 制 作 用, 非 常 直 观 简 便, 而 且 较 之 于 同 位 素 示 踪 法 更 安 全, 更 稳 定 另 外, 随 着 HPLC 分 析 方 法 的 不 断 优 化, 采 用 该 方 法 可 以 非 常 有 效 地 筛 选 出 有 抑 制 作 用 的 化 合 物, 因 为 在 测 定 反 应 混 合 物 时 可 以 通 过 改 变 检 测 波 长 同 时 检 测 到 产 物 和 底 物 的 变 化, [10] 能 更 客 观 真 实 地 反 应 化 合 物 的 抑 制 作 用, 并 且 是 在 短 短 25min 之 内 就 能 测 完 一 个 样 品 4 结 论 与 展 望 近 年 来, 利 用 原 核 系 统 和 体 外 PDS 酶 活 反 应, 并 借 助 HPLC 分 析 方 法, 能 够 有 效 筛 选 PDS 靶 标 酶 的 除 草 剂, 而 且 该 方 法 特 别 适 合 于 高 通 量 的 筛 选 PDS 靶 标 酶 的 除 草 剂, 在 该 类 除 [11] 草 剂 的 筛 选 中 备 青 睐 此 外, 随 着 PDS 酶 反 应 产 物 分 离 方 法 和 HPLC 检 测 方 法 的 不 断 优 化, 相 信 会 探 索 出 一 种 更 加 适 合 高 效 灵 敏 的 检 测 和 筛 选 除 草 剂 的 方 法 参 考 文 献 [1] Bramley P M. J Experimental Botany, 2002, 53: [2] Boger P, Sandmann G. Pestic. Outlook, 1998,9: 29. [3] Xu H, Zou X M, Zhu Y Q, et al. Synthesis and herbicidal activity of novel α,α,α-trifluoro-m-tolyl pyridazinone derivatives. Pest Manag Sci : [4] Sandmann G, Ward C E, Lo W C. et al. Bleaching Herbicide Flurtamone Interferes with Phytoene Desaturase,Plant Physiol : [5] Linden H, Misawa N, Chamovitz D, et al. Functional complementation in Escherichia coli of different phytoene desaturase genes and analysis of accumulated carotenes. Z Naturforsch c: [6] Sandmann G, Schneider C, Boger P. A new non-radioactive assay of phytoene desaturase to evaluate bleaching herbicides. Z. Naturforsch c: [7] Hitoshi O, Isao Y, Kiyoshi Arai, et al. Mode of bleaching phytotoxicity of herbicidal diphenylpyrrolidinones. Pest Manag Sci, 2001, 57: [8] Sandmann G, In vitro assay system for phytoene desaturase inhibitors with isolated thylakoids, in Target Assays for Modern Herbicides and Related Phytotoxic Compounds, ed by BoÈger P and Sandmann G, Lewis Publ, Boca Raton, FL, USA, (1993) pp [9] Nancy J. Engelmann1, Randy B. Rogers2, Mary Ann Lila1,2, and John W. Erdman Jr.Herbicide Treatments Alter Carotenoid Profiles for 14C Tracer Production from Tomato (Solanum lycopersicum cv. VFNT cherry) Cell Cultures. J Agric Food Chem. 2009, 57(11): [10] Arno Schmidt and Gerhard Sandmann. In Vitro Characterization of Two Different Phycomyces blakesleeanus Mutants with Impaired Phytoene Desaturation.Journal of Bacteriology, 1990, 172 (7): [11] 赵 显 峰, 潘 丽 莉, 孟 晶, 等. 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 蔬 菜 中 类 胡 萝 卜 素 组 分. 卫 生 研 究.2008, 37(2)

126 高 效 毛 细 管 电 泳 法 用 于 麻 保 沙 星 的 测 定 李 志 伟, 崔 哲, 赵 云 超 ( 河 北 科 技 大 学 化 学 与 制 药 工 程 学 院, 河 北 石 家 庄 ) 麻 保 沙 星 (marbofloxacin) ( 图 1) 是 一 种 动 物 专 用 的 第 三 代 氟 喹 诺 酮 类 抗 菌 药 具 有 抗 菌 [1,2] 谱 广, 抗 菌 活 性 强 的 特 征, 生 物 利 用 度 高, 且 毒 性 低, 较 安 全, 被 列 为 动 物 专 用 药 已 有 HPLC [3~4] 法,LC-MS 法 测 定 麻 保 沙 星 的 报 道 毛 细 管 电 泳 是 一 种 经 济, 快 速, 高 效 的 分 离 分 析 方 法, 论 文 建 立 了 专 属 性 强, 精 确 高 效 的 毛 细 管 电 泳 法 测 定 麻 保 沙 星 原 料 药 含 量 的 方 法, 为 麻 保 沙 星 的 质 量 监 控 提 供 参 考 O O F OH N N N O N 图 1 麻 保 沙 星 的 结 构 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 及 试 剂 毛 细 管 电 泳 仪 ( 北 京 彩 陆 科 学 仪 器 有 限 公 司 ), CL102 型 紫 外 检 测 器,HW-2000 型 色 谱 工 作 站, 石 英 毛 细 管 ( 河 北 永 年 锐 沣 色 谱 器 件 公 司 ) 四 硼 酸 钠, 磷 酸 二 氢 钠, 磷 酸 氢 二 钠, 磷 酸 均 为 分 析 纯, 水 为 重 蒸 水, 所 有 样 品 及 缓 冲 液 均 经 0.45μm 滤 膜 过 滤 麻 保 沙 星 样 品 ( 批 号 ) 为 实 验 室 自 制, 麻 保 沙 星 对 照 品 (Y ,ID0035Y7, 含 量 100%) 购 自 欧 洲 药 典 委 员 会 毛 细 管 柱 为 未 涂 层 石 英 毛 细 管 柱 (75μm 70cm), 运 行 缓 冲 液 为 15mmol/L 的 硼 砂 缓 冲 盐 (ph=9.2, 使 用 前 先 脱 气 ); 采 用 高 度 差 进 样 10s; 分 离 电 压 20kv; 检 测 波 长 295nm, 室 温 下 操 作 1.2 线 性 范 围 依 次 将 配 制 好 的 一 系 列 浓 度 的 麻 保 沙 星 溶 液 100μg/mL,80μg/mL,60μg/mL,40μg/mL, 20μg/mL,10μg/mL 进 样, 以 浓 度 为 横 坐 标, 峰 面 积 为 纵 坐 标 进 行 线 性 回 归, 得 到 的 回 归 方 程 为 Y= X,r=0.9993(n=6), 标 准 曲 线 如 图 2 所 示 结 果 表 明 麻 保 沙 星 在 此 方 法 下 在 10μg/mL~100μg/mL 范 围 内 线 性 良 好 1.3 精 密 度, 稳 定 性 和 重 复 性 试 验 在 上 述 实 验 条 件 下, 将 80μg/mL 的 麻 保 沙 星 样 品 溶 液 重 复 进 样 6 次, 考 察 此 方 法 的 精 密 度, RSD%=1.2%, 表 明 该 方 法 精 密 度 较 高 1.4 回 收 率 试 验 精 密 称 取 0.64g,0.8g,0.92g 麻 保 沙 星 分 别 制 成 64μg/mL,80μg/mL,92μg/mL 溶 液, 测 其 峰 面 积, 再 加 入 80μg/mL 样 品 溶 液 1mL, 测 其 峰 面 积, 结 果 平 均 回 收 率 为 100.2%,RSD% 为 0.97% 121

127 A C(ug/m L) 图 2 标 准 曲 线 2 结 果 与 讨 论 2.1 缓 冲 液 ph 值 的 选 择 在 相 同 浓 度 下 比 较 了 硼 酸 钠 缓 冲 液, 磷 酸 盐 缓 冲 液 和 硼 砂 - 磷 酸 缓 冲 液 三 种 缓 冲 盐 体 系, 实 验 发 现 硼 酸 钠 缓 冲 液 对 麻 保 沙 星 的 分 析 较 为 理 想, 选 择 硼 酸 钠 为 毛 细 管 电 泳 的 缓 冲 液 实 验 考 察 了 在 15mol/L 硼 酸 钠 溶 液 中 加 入 磷 酸 调 ph 值 为 8.0,8.5,9.2 和 0.1mol/L NaOH 调 ph10.0, 实 验 结 果 表 明 ph 为 9.2 时 峰 型 较 好 ( 见 图 3) v T(min) 图 3 麻 保 沙 星 样 品 在 ph=9.2 时 高 效 毛 细 管 电 泳 图 谱 122

128 2.2 缓 冲 液 离 子 浓 度 的 选 择 实 验 选 择 了 10mmol/L,15mmol/L,25mmol/L,30mmol/L 的 硼 酸 钠 溶 液 作 为 缓 冲 液, 随 着 离 子 浓 度 的 增 大, 麻 保 沙 星 出 峰 时 间 延 长, 而 且 浓 度 较 大 时 电 流 过 大, 焦 耳 热 增 大, 使 峰 型 不 稳, 所 以 选 择 15mmol/L 的 硼 酸 钠 溶 液 作 为 缓 冲 液 2.3 样 品 测 定 取 三 批 样 品 麻 保 沙 星, 在 选 定 的 电 泳 条 件 下 分 别 测 定, 结 果 三 批 样 品 的 含 量 均 大 于 99.0%. 3 结 论 选 用 毛 细 管 电 泳 法 分 析 麻 保 沙 星, 缓 冲 液 为 15mmol/L 的 硼 砂 溶 液,pH 值 9.2, 进 样 时 间 10s, 分 离 电 压 20kv, 在 此 条 件 下 麻 保 沙 星 迁 移 时 间 适 中, 分 离 度 较 高, 峰 型 较 好 精 密 度 较 高 (RSD%=1.2%), 在 10μg/mL~100μg/mL 范 围 内 线 性 良 好 (r= ), 检 测 限 较 灵 敏 (2.5μg/mL), 回 收 率 较 高 (100.2%), 在 此 条 件 下 测 的 麻 保 沙 星 的 含 量 为 99.2% 该 方 法 柱 效 较 高, 分 析 时 间 较 快, 使 用 样 品 溶 剂 量 较 少, 为 麻 保 沙 星 的 分 析 测 定 提 供 了 一 种 良 好 的 分 析 方 法 参 考 文 献 [1] 邱 银 生, 吴 佳. 动 物 专 用 氟 喹 诺 酮 类 药 物 研 究 进 展 简 介 [J]. 中 国 兽 药 杂 志,1998,32(3):46~48 [2] 王 志 强, 陈 杖 榴. 动 物 专 用 氟 喹 诺 酮 为 抗 菌 新 药 麻 保 沙 星 [J]. 中 兽 医 医 药 杂,2001,22(4):38~41 [3] 冯 利, 庞 静 秋. 高 效 液 相 色 谱 法 在 药 物 分 析 专 业 的 应 用 [J]. 黑 龙 江 医 药.2003,16(1):43~44 [4] Ismail M, Kattan Y A.2007.Coparative pharmacokinetics of marbofloxacin in healthy and Mannheimia haemolytica infected calves.research in Veterinary Science 82,398~404 Determination of Marbofloxacin by High Performance Capillary Zone Electrophoresis LI Zhi-wei,CUI Zhe,ZHAO Yun-chao ( College of Chemical and Pharmaceutical Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang ) ABSTRACT: A high performance capillary Zone electrophoresis method was established for the determination of Marbofloxacin drug substance. An untreated fused-silica capillary was used with 15m mol/l sodium borate buffer (ph 9.2) as running buffer at the detection wavelength of 295 nm, separation voltage of 20 kv and the injection volume of sample for 10 s. The calibration curve for Marbofloxacin was linear in the concentration range of 10μg/mL~100μg/mL. The average recovery was 100.2% with RSD of 0.97%. Key Words: Marbofloxacin; drug substance; high performance capillary electrophoresis; determination 123

129 毛 细 管 区 带 电 泳 法 拆 分 匹 伐 他 汀 钙 对 映 体 杨 更 亮 1,2, 程 晓 昆 1,2, 王 利 娟 1,2 (1. 河 北 大 学 药 学 院, 保 定 ; 2. 河 北 省 药 物 质 量 分 析 控 制 重 点 实 验 室, 保 定 ) 匹 伐 他 汀 钙 (pitavastatin, pitavastatin calcium, Livalo) 具 有 较 强 的 HMG-CoA 还 原 酶 抑 制 作 用 呈 肝 细 胞 选 择 性 药 动 学 性 质 优 异 安 全 性 好, 被 制 药 界 誉 为 超 级 他 汀 [1], 用 于 原 发 性 高 胆 固 醇 血 症 和 复 合 性 血 脂 异 常 的 基 础 治 疗, 辅 助 膳 食 调 整 以 降 低 总 胆 固 醇 低 密 度 脂 蛋 白 胆 固 醇 载 脂 蛋 白 B 和 甘 油 三 酯 的 升 高, 增 加 高 密 度 脂 蛋 白 胆 固 醇 (HDL-C) [2] 匹 伐 他 汀 钙 在 临 床 上 使 用 的 是 它 的 右 旋 体 :(+)-{ 双 [(3R,5S,6E)-7-[2- 环 丙 基 -4-(4- 氟 代 苯 基 )-3- 喹 琳 基 ]-3,5- 二 羟 基 -6- 庚 烯 酸 ]} 单 钙 盐 化 学 结 构 式 见 图 1 [3] 在 其 合 成 过 程 中 可 能 会 有 匹 伐 [4] 他 汀 钙 的 对 映 异 构 体 作 为 杂 质 存 在, 为 了 使 产 品 能 够 达 到 较 好 的 疗 效, 保 障 用 药 的 安 全 性, 控 制 其 对 映 异 构 体 含 量 是 一 项 非 常 必 要 的 工 作, 但 是 目 前 国 内 外 对 匹 伐 他 汀 异 构 体 的 检 测 方 法 并 不 多 见 本 文 建 立 了 毛 细 管 区 带 电 泳 拆 分 匹 伐 他 汀 钙 的 方 法 1 实 验 部 分 图 1 匹 伐 他 汀 钙 结 构 式 1.1 仪 器 和 试 剂 高 效 毛 细 管 电 泳 仪 ( 北 京 彩 陆 科 学 仪 器 有 限 公 司, 中 科 院 研 究 生 院 应 用 化 学 所 ), 内 设 可 变 波 长 的 紫 外 检 测 器 ;HW-2000 色 谱 工 作 站 ( 南 京 千 谱 软 件 有 限 公 司 ); 未 涂 层 熔 硅 弹 性 石 英 毛 细 管 柱 ( 内 径 50μm, 柱 长 52cm, 河 北 永 年 锐 沣 色 谱 器 件 有 限 公 司 );PHs-3C 型 ph 计 ( 上 海 精 科 仪 器 有 限 公 司 ) 匹 伐 他 汀 原 料 和 匹 伐 他 汀 对 映 体 均 有 兰 州 大 学 提 供 ; 匹 伐 他 汀 钙 片 (Kowa Company, Ltd.Nagoya Factory); Tris( 北 京 双 旋 微 生 物 培 养 基 制 品 厂 )(BR); 十 二 烷 基 磺 酸 钠 ( 天 津 市 科 密 欧 化 学 试 剂 有 限 公 司 )(AR); 羟 丙 基 -β- 环 糊 精 ( 山 东 新 大 精 细 化 工 有 限 公 司 )(AR); 实 验 用 水 均 为 超 纯 水, 其 他 试 剂 均 为 分 析 纯 1.2 实 验 样 品 制 备 取 一 定 量 匹 伐 他 汀 钙 匹 伐 他 汀 钙 对 映 体 及 匹 伐 他 汀 片 分 别 加 入 三 个 试 管 中, 均 用 甲 醇 / 水 (1:1) 溶 解 并 超 声 1.3 实 验 条 件 未 涂 层 熔 硅 石 英 毛 细 管 柱 (52cm 50μm); 运 行 缓 冲 溶 液 含 80mM Tris 盐 酸 7.5g HP-β-CD 5mM SDS 5mM 尿 素,pH=3.35; 检 测 波 长 244nm; 分 离 温 度 23 ; 分 离 电 压 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 ( , ) 作 者 简 介 : 杨 更 亮 (1963), 男, 河 北 人, 教 授, 博 士 生 导 师,Tel: ; ygl@hbu.edu.cn 124

130 18KV; 采 用 虹 吸 进 样, 进 样 高 度 17cm, 进 样 时 间 2s; 每 次 进 样 前 用 0.1mol/L NaOH 溶 液 冲 洗 毛 细 管 柱 5min, 超 纯 水 冲 洗 10min, 缓 冲 溶 液 冲 洗 5min, 每 个 样 品 重 复 进 样 三 次 2 结 果 2.1 实 验 条 件 优 化 实 验 研 究 了 运 行 电 压 背 景 电 解 质 组 成 及 浓 度 环 糊 精 种 类 及 浓 度 缓 冲 溶 液 ph 添 加 剂 等 因 素 对 拆 分 的 影 响 结 果 表 明 : 背 景 电 解 质 组 成 环 糊 精 种 类 及 缓 冲 溶 液 ph 值 对 分 离 度 结 果 影 响 较 大 ; 添 加 剂 种 类 和 浓 度 对 柱 效 和 峰 形 影 响 较 大 在 优 化 的 实 验 条 件 下, 匹 伐 他 汀 钙 对 映 体 达 到 了 基 线 分 离, 分 离 度 可 达 拆 分 匹 伐 他 汀 钙 混 旋 体 色 谱 图 在 1.3 实 验 条 件 下, 拆 分 匹 伐 他 汀 混 旋 体 标 准 样 品 拆 分 的 色 谱 图 如 图 2 所 示, 其 中 标 准 样 品 浓 度 为 0.5mg/ml 图 2 匹 伐 他 汀 钙 电 泳 分 离 图 2.3 拆 分 匹 伐 他 汀 钙 供 试 品 色 谱 图 在 1.3 实 验 条 件 下, 匹 伐 他 汀 钙 片 分 析 如 图 3 所 示, 其 中 供 试 样 品 浓 度 为 5mg/ml 实 验 表 明, 该 厂 家 的 匹 伐 他 汀 钙 片 不 含 其 对 映 体 杂 质 图 3 匹 伐 他 汀 钙 片 电 泳 图 2.3 方 法 的 精 密 度 以 pitavastatin 为 例, 其 日 间 (n=6) 和 日 内 (n=6) 测 定 的 分 离 度 的 标 准 偏 差 (RSD) 分 别 为 2.8% 和 2.4%, 柱 效 的 标 准 偏 差 (RSD) 分 别 为 3.0% 和 2.7% 结 果 表 明, 该 方 法 的 精 密 度 较 高, 重 现 性 较 好 ( 下 转 第 127 页 ) 125

131 基 于 原 子 转 移 自 由 基 聚 合 和 点 击 化 学 方 法 制 备 手 性 色 谱 固 定 相 王 怀 松, 姜 萍, 张 敏, 董 襄 朝 34 ( 南 开 大 学 化 学 学 院 天 津,300071) 原 子 转 移 自 由 基 聚 合 (atom-transfer radical polymerization, ATRP) 作 为 活 性 可 控 自 由 基 聚 合 方 法 之 一, 具 有 适 用 单 体 范 围 广, 可 合 成 指 定 分 子 结 构 窄 分 子 量 分 布 聚 合 物 的 优 点 ATRP 以 有 机 卤 化 物 为 引 发 剂 过 渡 金 属 配 合 物 为 卤 原 子 载 体, 通 过 氧 化 还 原 反 应, 在 自 由 基 活 性 种 和 卤 素 原 子 封 端 的 自 由 基 休 眠 种 之 间 建 立 可 逆 的 动 态 平 衡, 实 现 了 对 聚 合 反 应 的 控 制 本 实 验 采 用 grafting from 的 方 法 [1], 以 甲 基 丙 烯 酸 甲 基 丁 炔 醇 酯 (2-methyl-3-butny-2-ol methacrylate, MBMA) 为 单 体, 采 用 ATRP 方 法, 在 多 孔 硅 胶 表 面 制 得 聚 MBMA 链, 然 后 通 过 点 击 化 学 方 法 接 枝 上 β- 环 糊 精 (β-cd) [2] Fig. 1) 作 为 HPLC 手 性 固 定 相 (CD-click-sil, 结 构 见 Fig. 1 the structure of CD-click-sil 以 CD-click-sil 为 色 谱 固 定 相, 考 察 了 其 对 手 性 化 合 物 的 分 离 能 力 结 果 表 明, 该 固 定 相 对 一 些 手 性 异 构 体 可 以 达 到 基 线 分 离 (Fig. 2) Fig. 2 Enantio-separation of chiral compounds on CD-click-sil stationary phase. HPLC column size was mm. The flow rate was 0.5 ml min -1. Mobile phase: MeOH/TEAA solution. Detection wavelength was 254 nm. 参 考 文 献 : [1] T. Wu, Y. Zhang, X. Wang, Chem. Mater., 2008, 20, 101. [2] R. C. Petter, J. S. Salek, C. T. Sikorski and F. T. Lin, J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 (No ) 资 助 作 者 简 介 : 3 通 讯 联 系 人, xcdong@nankai.edu.cn 126

132 Synthesis of Novel Chiral Stationary Phase based on Atom Transfer Radical Polymerization Method and Click Chemistry WANG Huai-song, JIANG Ping, ZHANG Min, DONG Xiang-chao * (College of Chemistry, Nankai University, Tianjin, , P. R. China) Abstract: A new chiral stationary phase was designed and synthesized via atom transfer radical polymerization (ATRP) and click chemistry. 2-Methyl-3-butny-2-ol methacrylate (MBMA) was polymerized and grafted on the silica surface by surface-initiated ATRP first. Then azide-modified β-cd was immobilized on the alkyne of pmbma as chiral separation material (CD-click-sil). The chromatographic results demonstrate the chiral separation ability of CD-click-sil and illustrate the usefulness of click chemistry in the preparation of CD-click-sil. Key words: atom transfer radical polymerization; β-cyclodextrin; chiral separation. ( 上 接 第 125 页 ) 3 讨 论 目 前 国 内 外 尚 无 采 用 电 泳 模 式 对 匹 伐 他 汀 钙 拆 分 的 报 道, 本 实 验 考 察 了 拆 分 匹 伐 他 汀 钙 的 区 带 电 泳 条 件, 通 过 优 化 实 验 条 件, 实 现 了 基 线 分 离 该 方 法 分 析 速 度 快, 结 果 较 准 确, 试 剂 用 量 少, 分 析 成 本 低, 且 不 污 染 环 境, 为 匹 伐 他 汀 钙 的 质 量 控 制 提 供 了 良 好 的 依 据 参 考 文 献 : [1] 何 笑 荣, 邹 定, 姜 文 清, 马 捷, 李 金 娥. [A]. 中 国 新 药 杂 志. 2005, 14 (4): [2] 汤 仲 明. [A]. 国 际 药 学 研 究 杂 志. 2010, 37 (1): 12 [3] 许 筱, 申 屠 建 中, 胡 应 江. [B]. 新 药 评 述. 2009, 18 (5): [4] Suzuki M, Iwasaki H, Fujikawa Y, et al. Synthesis and biological evalutions of quinoline-based HMG-CoA r eductase inhibitors. Bioorg Med. Chem, 2001, 9 (10): 2727 Chiral separation of pitavastatin by capillary zone electrophoresis YANG Geng-liang 1,2, CHENG Xiao-kun 1,2, WANG Li-juan 1,2 (1. College of Pharmacy, Hebei University, Baoding , China; 2. Hebei Province Key Laboratory of Pharmaceutical Quality Control, Baoding , China) Abstract: The objective of this study was to establish a capillary zone electrophoresis method for the chiral separation of pitavastatin and its enantiomer. In this method, the bare fused-silica capillarie (52cm 50μm) was used and Tris-HCl buffer was employed. In order to optimize the method, more studies were performed with different parameters, i.e. composition of the running buffer, ph of the running buffer, concentration of Tris, additives and so on. Under the optimal separation conditions pitavatatin and its enantiomer were separated well. The result indicating that this method is suitable for the chiral separation of pitvatin and its enantiomer, and is valuable for the limitation control of pitavastatin. Key Words: Pitavastatin; enantiomer; Chiral separation; Capillary zone electrophoresis 127

133 利 用 UHPLC 技 术 优 化 药 典 2010 版 甘 草 的 含 量 测 定 方 法 肖 尧 ( 安 捷 伦 科 技 ( 中 国 ) 有 限 公 司, 北 京 ) 本 文 采 用 了 基 于 亚 二 微 米 填 料 技 术 (STM) 的 安 捷 伦 1290 Infinity LC 超 高 效 液 相 色 谱 (UHPLC) 系 统 对 中 国 药 典 2010 版 中 甘 草 含 量 测 定 的 HPLC 方 法 进 行 了 优 化 和 改 进, 使 得 分 析 速 度 提 高 了 一 倍 多, 并 且 更 好 的 分 离 了 杂 质 成 分, 提 高 了 定 量 分 析 的 准 确 性 2010 版 中 国 药 典 一 部 中 药 部 分 收 载 2165 个 中 药 品 种, 新 增 1095 种, 修 订 634 种, 检 测 品 种 的 增 加 修 订, 对 分 析 方 法 的 效 率 和 数 据 结 果 的 准 确 性 提 出 了 新 的 挑 战, 和 如 何 快 速 准 确 的 对 药 典 种 的 各 个 项 目 进 行 检 测, 是 提 高 药 品 质 量 的 重 要 因 素 传 统 的 HPLC 技 术 对 中 药 及 其 制 剂 的 分 析 通 常 需 要 较 长 的 分 析 时 间, 对 于 有 些 成 分 复 杂 的 样 品, 还 存 在 分 离 效 果 不 佳 的 问 题, 这 些 因 素 严 重 影 响 了 中 药 分 析 速 度 和 质 量 目 前 市 场 上 热 门 的 亚 二 微 米 填 料 (STM) 技 术 和 超 高 效 液 相 色 谱 (UHPLC) 技 术 为 提 高 中 药 及 制 剂 的 整 体 分 析 效 率 提 供 了 良 好 的 解 决 方 案, 可 以 根 据 不 同 的 应 用 需 求, 对 HPLC 方 法 进 行 分 析 速 度, 分 离 效 果 等 方 面 的 优 化, 使 得 色 谱 分 析 方 法 在 更 短 的 时 间 内 获 得 更 好 的 分 离 效 果, 从 而 提 高 中 药 分 析 的 整 体 效 率 并 降 低 检 测 的 成 本 本 文 以 2010 版 中 国 药 典 中 甘 草 定 量 分 析 的 HPLC 方 法 为 基 础, 将 其 转 换 为 UHPLC 方 法 并 进 行 了 优 化, 最 终 得 到 了 快 速 准 确 的 UHPLC 分 析 方 法 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 和 试 剂 液 相 色 谱 仪 :Agilent 1290 Infinity LC 超 高 效 液 相 色 谱 系 统 色 谱 柱 :Agilent Zorbax Stable Bond C18( mm,1.8um)RHHD 色 谱 柱 试 剂 : 实 验 所 用 的 甲 醇, 乙 腈, 乙 醇 和 磷 酸 均 购 买 于 迪 马 公 司 ( 色 谱 纯 ), 超 纯 水 为 Milipore 纯 水 机 制 对 照 品 : 本 实 验 室 用 的 甘 草 苷 甘 草 酸 照 品 及 甘 草 对 照 药 材 均 采 购 于 中 国 生 物 制 品 及 药 品 检 定 所 1.2 样 品 制 备 对 照 品 溶 液 的 制 备 : 取 甘 草 苷 对 照 品 甘 草 酸 对 照 品 适 量, 精 密 称 定, 加 70% 乙 醇 制 成 每 1ml 各 含 0.02mg 0.2mg 的 溶 液, 即 得 样 品 制 备 : 取 甘 草 对 照 药 材 粉 末 0.2g, 精 密 称 定, 置 具 塞 锥 形 瓶 中, 精 密 加 入 70% 乙 醇 100ml, 密 塞, 称 定 重 量, 超 声 处 理 ( 功 率 250W, 频 率 40kHz)30 分 钟, 取 出, 放 冷, 再 称 定 重 量, 用 70% 乙 醇 补 足 减 失 的 重 量, 摇 匀, 滤 过, 取 续 滤 液, 即 得 1.3 液 相 色 谱 条 件 按 照 药 典 方 法 原 始 HPLC 条 件, 使 用 安 捷 伦 方 法 转 换 软 件 直 接 将 药 典 规 定 的 HPLC 方 法 转 换 为 UHPLC 方 法, 按 照 色 谱 柱 规 格 和 流 速 变 化 相 应 调 整 了 梯 度 时 间 和 进 样 量, 得 到 原 始 UHPLC 条 件, 经 过 优 化 和 改 进 后, 调 整 了 流 动 相 比 例 和 梯 度 时 间, 得 到 优 化 UHPLC 条 件, 两 个 条 件 的 具 体 参 数 见 表 1 128

134 表 1 液 相 色 谱 条 件 原 始 UHPLC 条 件 优 化 UHPLC 条 件 药 典 HPLC 方 法 色 谱 柱 Zorbax SB C18( mm,1.8μm) Zorbax SB C18( mm,1.8μm) C18 流 动 相 A=0.05% 磷 酸 水 溶 液 B= 乙 腈 A=0.05% 磷 酸 水 溶 液 B= 乙 腈 A=0.05% 磷 酸 水 溶 液 B= 乙 腈 梯 度 时 间 表 Time B% Time B% Time B% 停 止 时 间 10min 18min - 流 速 0.4mL/min 0.4mL/min - 柱 温 进 样 量 0.8μL 0.8μL 10 μl 检 测 波 长 237nm 237nm 237nm 2 结 果 分 别 按 不 同 色 谱 条 件 对 标 准 品 和 甘 草 对 照 药 材 样 品 进 行 了 分 析, 所 得 结 果 见 图 1 图 2, 两 个 方 法 得 到 的 结 果 均 能 符 合 药 典 对 于 系 统 适 应 性 的 要 求, 并 且 原 始 方 法 比 要 点 原 始 的 HPLC 方 法 速 度 提 高 四 倍 多, 在 优 化 方 法 中, 改 变 了 色 谱 条 件, 使 得 甘 草 酸 中 包 含 的 一 个 杂 质 分 离 出 来, 提 高 了 定 量 准 确 性, 并 且 分 析 时 间 比 药 典 HPLC 方 法 缩 短 一 倍 多 对 样 品 中 的 甘 草 苷 和 甘 草 酸 分 别 使 用 外 标 法 进 行 定 量 计 算, 使 用 原 始 UHPLC 方 法 得 到 的 结 果 为 甘 草 苷 含 1.8% 甘 草 酸 含 量 2.8%; 优 化 的 UHPLC 方 法 计 算 出 甘 草 苷 含 量 1.8% 甘 草 酸 含 量 2.4%, 该 甘 草 药 材 中 甘 草 苷 和 甘 草 酸 含 量 均 符 合 药 典 规 定, 但 是 两 个 分 析 方 法 计 算 出 的 甘 草 苷 含 量 差 异 不 大, 但 是 甘 草 酸 含 量 差 异 较 大, 原 因 是 使 用 改 进 的 方 法 分 离 出 了 更 多 的 杂 质, 使 得 定 量 分 析 的 干 扰 更 小, 准 确 性 更 高 3 讨 论 在 方 法 优 化 的 初 始 阶 段, 分 别 选 择 了 不 同 的 固 定 相 进 行 实 验, 包 括 Zorbax Stable Bond C18 Zorbax Eclipse Plus C18 和 Zorbax Extend C18 色 谱 柱, 发 现 使 用 Zorbax Stable Bond C18 色 谱 柱 得 到 的 色 谱 峰 具 有 较 好 的 峰 型, 拖 尾 因 子 小, 塔 板 数 较 高, 所 以 在 以 后 的 进 一 步 优 化 中 选 用 的 了 Zorbax Stable Bond C18 色 谱 柱 作 为 固 定 相 在 直 接 转 换 得 到 的 UHPLC 方 法 中, 甘 草 酸 峰 附 近 有 干 扰 物 质 的 存 在, 在 调 整 了 梯 度 条 件 后, 仍 旧 不 能 将 甘 草 酸 与 其 前 后 的 干 扰 组 分 完 全 分 离, 经 过 试 验 发 现, 提 高 温 度 有 助 于 这 些 峰 的 分 离, 将 温 度 升 高 至 60, 甘 草 酸 可 以 与 周 围 的 杂 质 得 到 良 好 的 分 离, 分 离 度 均 达 到 1.5 以 上, 可 以 准 确 定 量 这 一 色 谱 条 件 仍 旧 在 色 谱 柱 和 仪 器 可 正 常 工 作 的 范 围 之 内, 并 且 方 法 重 现 性 良 好 129

135 甘 草 酸 甘 草 苷 甘 草 苷 甘 草 酸 图 1 原 始 UHPLC 条 件 得 到 的 色 谱 图 : 上 : 空 白 色 谱 图 ; 中 : 对 照 品 色 谱 图 ; 下 : 甘 草 对 照 药 材 样 品 色 图 mau mau 甘 草 酸 甘 草 苷 mau min min 甘 草 苷 甘 草 酸 图 优 化 UHPLC 条 件 得 到 的 色 谱 图 : 上 : 空 白 色 谱 图 ; 中 : 对 照 品 色 谱 图 ; 下 : 甘 草 对 照 药 材 样 品 色 图 min 130

136 由 于 分 离 了 更 多 的 杂 质, 使 得 方 法 的 定 量 准 确 性 提 高, 使 用 原 始 UHPLC 方 法 与 优 化 UHPLC 方 法 计 算 得 到 的 甘 草 酸 含 量 结 果 相 差 10% 以 上, 可 见 杂 质 的 分 离 对 定 量 结 果 有 较 大 影 响, 提 高 分 离 效 率 和 效 果 对 于 甘 草 定 量 分 析 的 准 确 性 和 质 量 控 制 的 可 靠 性 有 十 分 显 著 的 影 响 相 比 较 药 典 中 收 录 的 梯 度 方 法,UHPLC 方 法 节 省 了 一 半 多 分 析 时 间, 并 且 由 于 使 用 小 内 径 色 谱 柱 使 得 可 以 使 用 较 低 的 流 速 进 行 分 析, 大 大 节 省 了 时 间 和 溶 剂 成 本 4 结 论 本 文 通 过 对 2010 版 中 国 药 典 甘 草 的 含 量 测 定 液 相 方 法 的 转 换 和 优 化, 得 到 了 一 个 能 够 准 确 快 速 对 甘 草 中 甘 草 苷 和 甘 草 酸 进 行 定 量 的 UHPLC 分 析 方 法, 该 方 法 准 确 重 现, 是 一 个 快 速 高 效 测 定 甘 草 含 量 的 分 析 方 法 达 到 了 快 速 高 效 和 节 省 溶 剂 成 本 的 目 的 参 考 文 献 [1] 中 国 药 典 2010 版,2010,1:80-81 Optimization of Glycyrrhizae analysis method in Chinese pharmacopeia 2010 edition using UHPLC technology XIAO Yao (Agilent Technologies Co,.Ltd.(China),Beijing ,China) Abstract : This article transferred a HPLC method in Chinese pharmacopeia 2010 edition to analysis Glycyrrhizae to a UHPLC method by the Agilent 1290 Infinity LC system which based on the sub-two micrometer(stm) and Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC)technology, and optimized the UHPLC method, the result of optimized UHPLC were more accurate and effective than the original HPLC method. Key words:glycyrrhizae;uhplc;chinese Pharmacopeia;Traditional Chinese Medicine 131

137 液 相 色 谱 法 同 时 测 定 3 种 B 族 维 生 素 的 研 究 李 建 平, 党 亚 敏, 夏 义 平, 渠 志 华, 马 永 民 ( 天 津 市 疾 病 预 防 控 制 中 心 ) 实 验 采 用 Waters600E 高 效 液 相 色 谱 仪 带 PDA 检 测 器, Hypersil mm 5μm ODS 柱, 以 甲 醇 + 乙 酸 + 己 烷 磺 酸 钠 为 流 动 相 ; 流 速 1.0 ml /min; 检 测 波 长 270 nm 作 为 实 验 条 件, 外 标 法 定 量 ; 检 测 波 长 270 nm, 流 速 :1.0 ml/min 建 立 可 同 时 测 定 保 健 食 品 中 3 种 水 溶 性 维 生 素 的 高 效 液 相 色 谱 法 实 验 结 果 表 明 各 种 维 生 素 含 量 测 定 方 法 的 线 性 关 系 良 好, r = ~0.9998, 回 收 率 98.1%~100.2%, RSD = 0.17~0.72 用 该 法 测 定 了 市 售 保 健 食 品 中 B 族 维 生 素 的 含 量 本 方 法 操 作 简 便, 分 析 速 度 快, 灵 敏 度 高, 精 密 度 好, 结 果 准 确 可 靠 B 族 维 生 素 是 水 溶 性 维 生 素 中 重 要 的 一 类, 其 中 多 种 是 酶 的 辅 基 和 酶 的 组 成 部 分 当 人 体 内 缺 乏 B 族 维 生 素 时, 便 可 导 致 多 种 疾 病 的 产 生, 而 人 体 自 身 又 无 法 合 成 这 些 化 合 物, 必 须 通 过 食 物 链 或 服 用 复 合 维 生 素 制 剂 给 予 补 充 随 着 人 们 对 生 活 品 质 要 求 的 提 高, 复 合 维 生 素 制 剂 及 高 档 营 养 品 的 出 现, 同 时 测 定 食 物 中 或 药 物 中 B 族 维 生 素 的 含 量 引 起 人 们 的 广 泛 关 注 由 于 维 生 素 的 重 要 营 养 功 能 以 及 它 们 的 相 对 不 稳 定 性, 定 性 和 定 量 分 析 检 测 维 生 素 具 有 一 定 难 度 目 前 现 有 的 分 析 B 族 维 生 素 的 检 测 方 法 包 括 滴 定 法 [1] 紫 外 分 光 光 度 法 荧 光 法 [2,3], 高 效 液 相 色 谱 法 [4-11] 微 生 物 法 [12,13] 这 些 方 法 多 数 是 针 对 某 个 单 一 维 生 素 的 测 定, 而 且 耗 费 时 间 较 长 近 年 来 国 内 外 学 者 对 多 种 B 族 维 生 素 的 同 时 测 定 进 行 了 大 量 研 究, 出 现 了 许 多 分 析 方 法, 其 中 以 高 效 液 相 色 谱 法 和 高 效 毛 细 管 电 泳 法 [14,15] 为 代 表 的 色 谱 分 析 法 较 为 突 出 高 效 毛 细 管 电 泳 法 要 求 的 仪 器 设 备 较 高 无 法 普 及 液 相 色 谱 法 由 于 水 溶 性 维 生 素 之 间 结 构 和 化 学 性 质 相 差 很 大, 主 要 采 用 梯 度 洗 脱 的 方 式, 分 析 时 间 比 较 长, 结 果 的 重 现 性 比 较 差 本 文 采 用 高 效 液 相 色 谱 法 以 非 梯 度 洗 脱 的 方 式 完 成 了 保 健 食 品 中 3 中 B 族 维 生 素 的 同 时 测 定, 得 到 了 满 意 的 结 果 1 材 料 和 方 法 1.1 仪 器 与 设 备 Waters600E 高 效 液 相 色 谱 仪 带 紫 外 检 测 器 ( 美 国 Waters 公 司 ); 超 纯 水 机 ( 北 京 爱 斯 泰 克 科 技 开 发 有 限 公 司 ) ; 超 声 波 清 洗 器 (AS2050BT) ( 天 津 奥 特 赛 恩 斯 仪 器 有 限 公 司 ) 1.2 试 剂 甲 醇 : 色 谱 纯 ( 天 津 康 科 德 试 剂 有 限 公 司 ); 实 验 用 水 : 超 纯 水 ;B1 B2 B6 标 准 品 (sigma 公 司 ) ; 乙 酸 : 分 析 纯 ( 天 津 康 科 德 试 剂 有 限 公 司 ) 己 烷 磺 酸 钠 : 1.3 标 准 液 的 配 置 准 确 称 取 B1 B2 B6 标 准 品 g, 溶 于 0.01Mol/L 盐 酸, 转 移 到 100mL 容 量 瓶, 加 0.01Mol/L 盐 酸 定 容 至 刻 度 此 溶 液 浓 度 为 1.0mg/mL 将 标 准 液 用 0.01mol/L 盐 酸 稀 释 100 倍 后 作 为 使 用 液 1.4 高 效 液 相 色 谱 条 件 色 谱 柱 :Agilent Hypersil ODS mm(5μm); 流 动 相 :10mL 乙 酸 和 1.0g 己 烷 磺 酸 钠 溶 于 700mL 水 中, 与 250mL 甲 醇 混 合, 在 用 水 定 容 至 1000mL; 流 速 :1.0mL/min; 检 测 波 长 :270nm, 柱 温 : 室 温 ; 进 样 量 :20μL 1.5 样 品 前 处 理 取 20 粒 以 上 片 剂 或 胶 囊 试 样 研 磨 或 混 匀, 根 据 试 样 B 族 维 生 素 含 量 准 确 称 取 一 定 量 的 试 样 于 100mL 容 量 瓶 中 加 入 甲 醇 + 水 + 磷 酸 = 混 合 溶 液, 混 匀, 再 用 甲 醇 + 水 + 磷 酸 = 混 合 溶 液 定 容 至 刻 度 超 声 提 取 5min, 以 3000r/min 离 心 5min, 上 清 液 经

138 μm 滤 膜 过 滤 后 待 测 2 结 果 与 讨 论 2.1 色 谱 条 件 的 选 择 流 动 相 的 选 择 流 动 相 是 HPLC 方 法 中 至 关 重 要 的 组 成 部 分, 直 接 关 系 到 目 标 化 合 物 的 有 效 分 离 和 分 析 的 灵 敏 度 目 前 很 多 研 究 者 [8-11] 采 用 磷 酸 二 氢 盐 + 甲 醇 作 为 流 动 相 来 分 析 B 族 维 生 素, 但 是 B 族 维 生 素 在 此 流 动 相 中 很 少 保 留, 出 峰 在 15min 内, 对 于 组 分 相 对 复 杂 的 样 品 不 能 分 离 完 全, 影 响 准 确 定 量 本 文 采 用 离 子 对 试 剂 己 烷 磺 酸 钠 和 乙 腈 乙 酸 作 为 流 动 相 克 服 了 上 述 缺 点 标 准 和 样 品 的 色 谱 图 见 图 1, 图 2 图 1 VB1 VB2 和 VB6 混 合 标 准 溶 液 色 谱 图 图 2 保 健 品 中 VB1 VB2 和 VB6 色 谱 图 检 测 波 长 的 选 择 从 DAD 检 测 器 提 取 的 各 成 分 紫 外 光 谱 图 看 出,VB1 在 245.3nm 有 最 大 吸 收 ;VB2 在 265.5nm 处 有 最 大 吸 收 VB6 在 290.5nm 有 最 大 吸 收, 为 保 证 检 测 的 灵 敏 度 波 长 选 择 在 270nm VB1 VB2 和 VB6 的 光 谱 图 见 图 3 图 4 图 5 图 3 VB6 的 光 谱 图 133

139 图 4 VB2 的 光 谱 图 图 5 VB1 的 光 谱 图 2.2 线 性 关 系 及 检 出 限 将 VB1 VB2 VB6 的 混 合 标 准 溶 液 采 用 逐 级 稀 释 法 用 0.01 mol/l HCl 溶 液 配 制 成 一 系 列 不 同 浓 度 的 混 合 标 准 溶 液, 摇 匀, 分 别 进 样, 以 各 自 的 峰 面 积 (Y) 对 浓 度 (X,μg/ml) 进 行 线 性 回 归 计 算, 维 生 素 B1 维 生 素 B6 维 生 素 B2 回 归 方 程 为 : Y = X , r = ; Y = X , r = ,; Y = 52336X ,r = 以 3 倍 信 噪 比 计, 方 法 的 检 出 限 分 别 为 : 维 生 素 B ng 维 生 素 B ng 和 维 生 素 B ng 2.3 精 密 度 和 回 收 率 实 验 本 法 回 收 率 实 验 选 用 不 含 有 B 族 维 生 素 的 样 品 为 基 质, 设 定 了 3 个 添 加 浓 度 : mg/kg, 制 成 食 品 样 品 按 本 检 验 方 法 所 确 定 的 实 验 条 件, 对 每 个 浓 度 样 品 进 行 6 次 实 验, 测 得 3 种 B 族 维 生 素 回 收 率 和 室 内 精 密 度 的 相 对 标 准 偏 差 见 表 1 表 1 3 中 B 族 维 生 素 回 收 率 和 精 密 度 (n=6) 出 峰 添 加 浓 度 0.5mg/kg 添 加 浓 度 3.0mg/kg 添 加 浓 度 5.0mg/kg 次 序 回 收 率 相 对 标 准 回 收 率 相 对 标 准 回 收 率 相 对 标 准 % 偏 差 % % 偏 差 % % 偏 差 % VB VB VB 小 结 本 文 建 立 的 高 效 液 相 色 谱 法 同 时 测 定 保 健 食 品 中 3 种 水 溶 性 维 生 素 的 方 法 简 单, 不 需 要 梯 度 洗 脱, 快 速, 准 确 度 高, 解 决 了 保 健 食 品 中 基 质 复 杂, 基 质 干 扰 测 定 的 问 题 保 健 食 品 在 添 加 B 族 维 生 素 时 往 往 还 会 根 据 需 要 量 添 加 VC 等 水 溶 性 维 生 素, 因 次 VC 的 含 量 比 B 族 维 生 素 的 含 量 高 很 多, 导 致 色 谱 图 中 B 族 维 生 素 的 峰 很 小, 故 本 实 验 未 将 VC 的 含 量 测 定 同 时 进 行 参 考 文 献 : [1] 中 华 人 民 共 和 国 药 典 委 员 会. 中 华 人 民 共 和 国 药 典 ( 二 部 ) [2] GB /T 食 品 中 硫 胺 素 ( 维 生 素 B1) 的 测 定 [ S]. ( 下 转 第 137 页 ) 134

140 按 照 美 国 药 典 对 地 塞 米 松 磷 酸 钠 注 射 液 含 量 测 定 的 方 法 学 探 讨 于 润 芳, 李 瑾, 王 虹 ( 天 津 金 耀 氨 基 酸 有 限 公 司 ) 在 本 实 验 中, 主 要 为 验 证 美 国 药 典 收 载 的 地 塞 米 松 磷 酸 钠 注 射 液 的 检 验 方 法 对 地 塞 米 松 磷 酸 钠 注 射 液 的 质 量 控 制 要 求, 故 参 照 美 国 药 典 附 录 药 品 质 量 标 准 分 析 方 法 验 证 指 导 原 则 的 要 求, 用 HPLC 法 对 地 塞 米 松 磷 酸 钠 注 射 液 含 量 测 定 项 目 进 行 了 检 验 方 法 的 方 法 学 探 讨 1 仪 器 试 药 与 仪 器 设 备 1.1 试 剂 注 射 用 水 ( 天 津 金 耀 氨 基 酸 有 限 公 司 ) 甲 醇 ( 色 谱 纯,TEDIA COMPANY,INC) 1.2 仪 器 设 备 岛 津 LC-2010A 高 效 液 相 色 谱 仪 CLASS VP 工 作 站 METTLER AE240 电 子 天 平 ; 2 地 塞 米 松 磷 酸 钠 含 量 测 定 方 法 2.1 色 谱 条 件 色 谱 柱 : 艾 杰 尔 C18(4.6mm 200mm, 5μm) 流 动 相 :0.01mol/L 磷 酸 二 氢 钾 与 甲 醇 和 水 (1:1) 溶 液 流 速 :1.6 ml min -1 柱 温 :45 检 测 波 长 :254nm 在 美 国 药 典 规 定 的 条 件 下, 地 塞 米 松 磷 酸 钠 的 保 留 时 间 约 为 5min 2.2 线 性 范 围 的 考 察 精 密 称 取 原 料 约 32mg, 置 表 1 地 塞 米 松 磷 酸 钠 线 性 范 围 考 察 50ml 量 瓶 中, 然 后 分 别 精 密 量 取 ml 置 10ml 量 瓶 中, 用 流 动 相 稀 释 至 刻 度, 摇 匀, 即 得 即 40% 60% 80% 100% 120% 供 试 品 溶 液 ( 见 表 1) 按 上 述 色 谱 条 件, 分 别 吸 取 供 试 品 溶 液 10μl 进 样, 测 定 峰 面 积 积 分 值 (y)( 见 图 1), 结 果 见 表 1 用 峰 面 积 积 分 值 对 浓 度 (x) 进 行 回 归, 得 直 线 回 归 方 程 ( 见 式 (1)) 和 标 准 曲 线 ( 见 图 1)) 组 号 浓 度 /(mg/ml) 峰 面 积 地 塞 米 松 磷 酸 钠 线 性 y = 34216x R 2 = 图 1 地 塞 米 松 磷 酸 钠 标 准 曲 线 图 2 地 塞 米 松 磷 酸 钠 对 照 品 HPLC 图 谱 135

141 每 次 进 样 10μl, 对 峰 面 积 y 进 行 线 性 回 归, 得 回 归 方 程 : y = 34216x (R= ) (1) 线 性 范 围 :32~96μg/ml 范 围 内 成 良 好 的 线 性 关 系 2.3 重 复 性 试 验 精 密 量 取 地 塞 米 松 磷 酸 钠 注 射 液 2ml, 置 50ml 量 瓶 中, 稀 释 至 刻 度 混 匀 ( 浓 度 80μg/ml) 10μl 进 样, 重 复 6 次, 记 录 所 测 定 地 塞 米 松 磷 酸 钠 的 峰 面 积 积 分 值, 计 算 地 塞 米 松 磷 酸 钠 的 RSD 为 0.03% 结 果 见 表 2 表 2 重 复 性 实 验 结 果 表 3 稳 定 性 试 验 结 果 次 数 地 塞 米 松 磷 酸 钠 峰 面 积 RSD/% 测 定 时 间 /h 地 塞 米 松 磷 酸 钠 峰 面 积 RSD/% 稳 定 性 试 验 精 密 量 取 地 塞 米 松 磷 酸 钠 注 射 液 2ml, 置 50ml 量 瓶 中, 稀 释 至 刻 度 混 匀 ( 浓 度 80μg/ml), 按 0,2,4,8,12,24h 不 同 时 间 间 隔 10μl 进 样, 测 定 地 塞 米 松 磷 酸 钠 的 峰 面 积 积 分 值, 计 算 RSD 为 0.02%, 结 果 表 明 样 品 测 定 液 中 地 塞 米 松 磷 酸 钠 在 24h 内 稳 定 见 表 回 收 率 试 验 精 密 称 取 原 料 各 12.8mg 16mg 19.2mg 各 三 份, 分 别 置 200ml 量 瓶 中, 用 流 动 相 稀 释 至 刻 度, 摇 匀, 进 样 10μl, 测 定 峰 面 积 积 分 值, 并 计 算 回 收 率. 结 果 见 表 样 品 含 量 测 定 取 3 批 地 塞 米 松 磷 酸 钠 注 射 液 样 品, 每 批 进 样 2 次, 按 上 述 供 试 品 溶 液 的 制 备 方 法 制 备 供 试 液,10μl 进 样, 测 定 峰 面 积 积 分 值, 计 算 地 塞 米 松 磷 酸 钠 含 量, 结 果 见 表 5 表 4 地 塞 米 松 磷 酸 钠 的 回 收 率 序 号 实 测 峰 面 积 实 测 地 米 量 /mg 加 入 地 米 量 /mg 回 收 率 % 平 均 回 收 率 % RSD% 表 5 样 品 测 定 结 果. 136

142 批 号 峰 面 积 含 量 % % % % % % 表 5 结 果 符 合 药 典 规 定 范 围 90.0%~115.0% 3 结 论 在 此 色 谱 条 件 下, 地 塞 米 松 磷 酸 钠 的 最 小 检 测 浓 度 为 0.2μg/ml 经 验 证, 本 产 品 各 项 指 标 均 符 合 美 国 药 典 标 准, 故 适 用 于 美 国 药 典 检 验 参 考 文 献 : [1] USP32-NF27Page2092 [2] 美 国 药 典 附 录 [3] 中 国 药 典 2005 版 ( 上 接 第 134 页 ) [3] GB /T 食 品 中 核 黄 素 的 测 定 [ S]. [4] Markopoulou CK, Kagkadis KA, Koundourellis JE. An optimized method for the simultaneous determination of vitamins B1,B6,B12 in mul t ivitamin tablets by high performance liquid chromatography. J Pharm Biomed Anal,2002;30(4): [5] 吴 芳, 徐 红 艳.HPLC 法 测 定 复 合 维 生 素 B 片 中 四 种 成 分 的 含 量 [J]. 中 国 医 药 导 报,2007,4(31): [6] 刘 晓 琳 武 谷 钟 淮 滨. HPLC 法 测 定 复 合 维 生 素 B 溶 液 中 维 生 素 B1 维 生 素 B2 维 生 素 B6 和 烟 酰 胺 的 含 量 [J]. 中 国 药 事,2003,17(4): [7] 陈 静 君, 刘 敏, 赖 建 民. 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 六 合 维 生 素 丸 中 3 种 B 族 维 生 素 含 量 [J]. 南 通 大 学 学 报 ( 医 学 版 ),2006,26(4): [8] 崔 蓉, 李 皎, 王 洪 玮. 水 溶 性 维 生 素 的 高 效 液 相 色 谱 测 定 方 法 的 研 究. 中 国 卫 生 检 验 杂 志, 2005, 15(1): [9] 高 旭, 李 淑 娟, 安 娟 等. 高 效 液 相 色 谱 法 同 时 测 定 食 品 中 8 种 水 溶 性 维 生 素. 中 国 医 药 指 南,2008,6 (19): [10] 王 艳, 王 坚 民. 高 效 液 相 色 谱 法 同 时 测 定 元 素 多 维 片 中 5 种 水 溶 性 维 生 素. 中 国 卫 生 检 验 杂 志, 2010, 20(3): [11] 王 希 希, 胡 燕, 孙 轶 卓 等. 反 相 高 效 液 相 色 谱 法 同 时 测 定 血 清 中 5 种 水 溶 性 维 生 素, 四 川 大 学 学 报 ( 医 学 版 ),2010,41(1): [12] GB /T 食 品 中 核 维 生 素 B6 的 测 定 [ S]. [13] GB /T 食 品 中 烟 酸 的 测 定 [ S]. [14] 严 健, 王 小 如, 等. 毛 细 管 电 泳 法 测 定 复 合 维 生 素 B 片 含 量. 中 国 现 代 应 用 药 学 杂 志, 2002 ; 19(4) : [15] 邓 光 辉, 李 济 权, 马 少 妹. 高 效 毛 细 管 电 泳 电 导 法 快 速 检 测 复 方 维 生 素 片 中 的 VB1 VB12 VB6 和 VC. 分 析 实 验 室,2003 ;22(4) :

143 高 效 液 相 色 谱 法 对 呋 塞 米 注 射 液 含 量 检 测 的 方 法 学 验 证 于 润 芳, 唐 洪 ( 天 津 金 耀 氨 基 酸 有 限 公 司 ) 参 照 中 国 药 典 2010 版 附 录 XIXA 药 品 质 量 标 准 分 析 方 法 验 证 指 导 原 则 的 要 求, 对 呋 塞 米 注 射 液 含 量 测 定 项 目 进 行 方 法 学 验 证 呋 塞 米 注 射 液 主 要 成 分 为 呋 塞 米 其 药 理 作 用 : 能 增 加 水 钠 氯 钾 钙 镁 磷 等 的 排 泄, 可 抑 制 前 列 腺 素 分 解 酶 的 活 性, 使 前 列 腺 素 E2 含 量 升 高, 从 而 具 有 扩 张 血 管 作 用 扩 张 肾 血 管, 降 低 肾 血 管 阻 力, 在 呋 塞 米 的 利 尿 作 用 中 具 有 重 要 意 义, 也 是 其 用 于 预 防 急 性 肾 功 能 衰 竭 的 理 论 基 础 其 适 应 症 为 :1. 水 肿 性 疾 病 2. 高 血 压 3. 预 防 急 性 肾 功 能 衰 竭 4. 高 钾 血 症 及 高 钙 血 症 5. 稀 释 性 低 钠 血 症 6. 抗 利 尿 激 素 分 泌 过 多 症 (SIADH) 7. 急 性 药 物 毒 物 中 毒 等 1 仪 器 与 试 药 1.1 仪 器 名 称 型 号 编 号 校 准 日 期 有 效 日 期 高 效 液 相 色 谱 仪 岛 津 LC-2010A C LP 电 子 天 平 METTLER AE 试 药 名 称 规 格 批 号 生 产 厂 家 乙 腈 色 谱 纯 试 剂 TEDIA COMPANY.INC. 冰 醋 酸 分 析 纯 天 津 市 天 新 精 细 化 工 开 发 中 心 四 氢 呋 喃 色 谱 纯 试 剂 天 津 市 光 复 精 细 化 工 研 究 所 试 验 用 水 注 射 用 水 同 试 验 日 期 天 津 金 耀 氨 基 酸 有 限 公 司 注 : 试 验 用 水 均 为 天 津 金 耀 氨 基 酸 有 限 公 司 每 天 生 产 的 注 射 用 水 2 色 谱 条 件 及 测 定 方 法 2.1 色 谱 条 件 色 谱 柱 : 艾 杰 尔 C18(4.6mm 200mm,5μm), 流 动 相 : 水 - 四 氢 呋 喃 - 冰 醋 酸 (70:30:1), 流 速 :1.2 ml min, 柱 温 :30, 检 测 波 长 :272nm 2.2 中 国 药 典 2010 版 收 载 的 呋 塞 米 注 射 液 的 检 验 方 法 : 有 关 物 质 取 本 品 5ml, 用 混 合 溶 剂 [ 取 冰 醋 酸 22ml, 加 乙 腈 - 水 (1:1) 至 1000ml, 混 匀 ] 稀 释 制 成 每 1ml 中 约 含 1mg 的 溶 液, 作 为 供 试 品 溶 液 ; 精 密 量 取 适 量, 用 上 述 混 合 溶 剂 定 量 稀 释 制 成 每 1ml 中 含 10μg 的 溶 液, 作 为 对 照 溶 液 照 含 量 测 定 项 下 的 色 谱 条 件, 取 对 照 溶 液 20μl 注 入 液 相 色 谱 仪, 再 精 密 量 取 供 试 品 溶 液 与 对 照 溶 液 各 20μl, 分 别 注 入 液 相 色 谱 仪, 记 录 色 谱 图 至 主 成 分 峰 保 留 时 间 的 3 倍, 供 试 品 溶 液 的 色 谱 图 中 如 有 杂 质 峰, 单 个 杂 质 峰 面 积 不 得 大 于 对 照 溶 液 主 峰 面 积 的 1.5 倍 (1.5%), 各 杂 质 峰 面 积 的 和 不 得 大 于 对 照 138

144 溶 液 主 峰 面 积 的 3 倍 (3.0%) 含 量 测 定 照 高 效 液 相 测 定 法 ( 附 录 ⅤD) 测 定 色 谱 条 件 与 系 统 适 用 性 试 验 用 十 八 烷 基 硅 烷 键 合 硅 胶 为 填 充 剂 ; 以 水 - 四 氢 呋 喃 - 冰 醋 酸 (70:30:1) 为 流 动 相 ; 检 测 波 长 为 272nm 理 论 板 数 按 呋 塞 米 峰 计 算 不 低 于 4000 测 定 法 精 密 量 取 本 品 5ml, 用 混 合 溶 剂 [ 取 冰 醋 酸 22ml, 加 乙 腈 - 水 (1:1) 至 1000ml, 混 匀 ] 定 量 稀 释 制 成 每 1ml 中 约 含 呋 塞 米 0.1mg 的 溶 液, 精 密 量 取 20μl 注 入 液 相 色 谱 仪, 记 录 色 谱 图 ; 另 取 呋 塞 米 对 照 品 g, 同 法 测 定 按 外 标 法 以 峰 面 积 计 算, 即 得 版 中 国 药 典 标 准 项 目 名 称 考 核 方 法 限 度 专 属 性 酸 破 坏 碱 破 坏 加 热 破 坏 氧 化 破 坏 光 照 破 坏 单 个 杂 质 峰 面 积 不 得 大 于 对 照 溶 液 主 峰 面 积 的 1.5 倍 (1.5%), 各 杂 质 峰 面 积 的 和 不 得 大 于 对 照 溶 液 主 峰 面 积 的 3 倍 (3.0%) 检 测 限 (S/N) 测 定 呋 塞 米 的 含 量 (ng/ml) 样 品 能 被 检 测 出 的 最 低 量 精 密 度 重 复 性 供 试 品 溶 液 分 别 测 定 6 次,RSD % RSD 2.0% 中 间 精 密 度 供 试 品 溶 液 不 同 日 不 同 人 分 别 测 定 6 次, 与 重 复 性 试 验 的 6 次 一 起 计 算 RSD % 线 性 范 围 呋 塞 米 相 关 系 数 R 应 0.99 回 收 率 3 呋 塞 米 注 射 液 的 验 证 方 法 3.1 呋 塞 米 注 射 液 的 限 度 回 收 率 RSD 95.0% 2.0% 指 标 名 称 技 术 要 求 方 法 依 据 含 量 限 度 % 2010 版 中 国 药 典 有 关 物 质 3.2 测 定 结 果 计 算 公 式 : 含 量 测 定 单 个 杂 质 峰 面 积 不 得 大 于 对 照 溶 液 主 峰 面 积 的 1.5 倍 (1.5%) 各 杂 质 峰 面 积 的 和 不 得 大 于 对 照 溶 液 主 峰 面 积 的 3 倍 (3.0%) 2010 版 中 国 药 典 2010 版 中 国 药 典 标 示 量 % = A r m AR m X R 100 % 式 中 :A X 供 试 品 峰 面 积,A R 对 照 品 峰 面 积,m x 供 试 品 质 量,m R 对 照 品 质 量 ( 对 照 品 称 样 量 10.19mg,10.40mg) 有 关 物 质 计 算 单 个 杂 质 : 单 个 杂 质 峰 面 积 / 对 照 溶 液 主 峰 面 积 *0.015*100% 总 杂 质 峰 : 各 杂 质 峰 面 积 的 和 / 对 照 溶 液 主 峰 面 积 *0.03*100% 3.3 样 品 测 定 有 关 物 质 测 定 结 果 (%): 139

145 批 号 单 一 杂 质 总 杂 质 1 2 平 均 1 2 平 均 含 量 测 定 结 果 (%): 批 号 平 均 RSD 验 证 内 容 4.1 专 属 性 1 称 取 无 水 碳 酸 钠 g 配 成 10% 溶 液, 备 用 2 称 取 氯 化 钠 g, 转 移 至 100ml 量 瓶 中, 加 入 纯 化 水 适 量 溶 解 ; 再 加 入 10% 无 水 碳 酸 钠 溶 液, 用 纯 化 水 稀 释 至 刻 度, 摇 匀, 作 为 空 白 辅 料 溶 液 酸 破 坏 : 取 本 品 5ml 至 50ml 量 瓶 中, 加 入 0.1mol/L 盐 酸 溶 液 2ml, 摇 匀, 置 80 水 浴 3h, 放 冷, 用 1mol/L 氢 氧 化 钠 溶 液 调 ph 至 中 性, 用 稀 释 液 稀 释 至 刻 度, 摇 匀, 作 为 供 试 品 溶 液 ; 取 空 白 辅 料 溶 液 适 量 至 50ml 量 瓶 中, 同 法 操 作, 按 有 关 物 质 方 法 进 样 测 定 碱 破 坏 : 取 本 品 5ml 至 50ml 量 瓶 中, 加 入 1mol/L 氢 氧 化 钠 溶 液 1ml, 摇 匀, 置 60 水 浴 1h, 放 冷, 用 1mol/L 盐 酸 溶 液 调 ph 至 中 性, 用 稀 释 液 稀 释 至 刻 度, 摇 匀, 作 为 供 试 品 溶 液 ; 取 空 白 辅 料 溶 液 适 量 至 50ml 量 瓶 中, 同 法 操 作, 按 有 关 物 质 方 法 进 样 测 定 加 热 破 坏 : 取 本 品 ( 玻 璃 瓶 ) 置 沸 水 中 煮 沸 2 小 时 后 取 出, 放 冷, 取 空 白 辅 料 溶 液 适 量, 同 法 操 作, 按 有 关 物 质 方 法 进 样 测 定 氧 化 破 坏 : 取 本 品 5ml, 加 30% 过 氧 化 氢 溶 液 1ml, 摇 匀, 置 60 水 浴 2h 后, 加 稀 释 液 溶 解 并 稀 释 至 50ml, 取 空 白 辅 料 溶 液 5ml 至 50ml 量 瓶 中, 同 法 操 作, 按 有 关 物 质 方 法 进 样 测 定 光 照 破 坏 : 取 本 品 ( 玻 璃 瓶 )10 支, 空 白 辅 料 溶 液 20ml( 置 于 玻 璃 瓶 中 ), 在 照 度 为 LX 日 光 灯 条 件 下 放 置 5 天,10 天 后, 按 有 关 物 质 方 法 进 样 测 定 测 定 结 果 (%): 项 目 批 号 酸 破 坏 碱 破 坏 加 热 破 坏 氧 化 破 坏 光 照 破 坏 光 照 5 天 光 照 10 天 光 照 5 天 光 照 10 天 光 照 5 天 光 照 10 天 检 测 限 精 密 称 取 呋 塞 米 10mg, 加 入 10ml 容 量 瓶 中, 加 入 混 合 溶 剂 [ 取 冰 醋 酸 22ml, 加 乙 腈 - 水 (1:1) 至 1000ml, 混 匀 ] 溶 解 并 稀 释 至 刻 度, 精 密 量 取 1ml 至 100ml 1ml 至 200ml 容 量 瓶 中 容 量 瓶 中, 加 入 混 合 溶 剂 溶 解 并 稀 释 至 刻 度, 按 照 有 关 物 质 方 法 进 样 测 定 样 品 名 称 样 品 在 溶 液 的 最 低 量 (ng/ml) 相 对 于 样 品 的 检 测 限 (ng/ml)( 实 测 值 / 样 品 浓 度 ) 呋 塞 米 % 140

146 4.3 重 复 性 4.4 取 供 试 品 溶 液 分 别 测 定 6 次 含 量, 记 录, 计 算 RSD 批 号 平 均 RSD 中 间 精 密 度 不 同 操 作 人 员, 不 同 时 间 对 供 试 品 溶 液 按 含 量 方 法 进 样 测 定 重 复 测 定 6 次, 共 12 次, 计 算 RSD 批 号 平 均 RSD 呋 塞 米 注 射 液 含 量 趋 势 图 为 1-3 批 号 平 均 RSD 塞 米 注 射 液 含 量 趋 势 图 为 线 性 范 围 按 确 认 的 各 溶 剂 的 验 证 范 围, 以 标 准 溶 液 为 100% 浓 度 为 基 础, 配 制 60% 80% 100% 120% 140% 浓 度 系 列, 作 为 线 性 测 定 溶 液 包 括 范 围 的 最 高 点 和 最 低 点 以 及 标 准 点, 每 个 溶 液 进 样 2 次 20µl, 记 录 色 谱 图 以 峰 面 积 对 浓 度 二 次 回 归, 得 到 回 归 方 程 和 相 关 系 数 ( 标 准 溶 液 的 配 制 要 相 对 样 品 的 浓 度 考 虑 ) 呋 塞 米 线 性 结 果 : X 浓 度 % Y 峰 面 积 平 均 值 相 关 系 数 ( 应 0.99) r R= 回 归 方 程 :Y=0.6x+6E 以 上 结 果 表 明 : 呋 塞 米 注 射 液 浓 度 和 峰 面 积 呈 现 良 好 的 线 性 关 系 ( 呋 塞 米 注 射 液 线 性 试 验 趋 势 图 附 后 ) 4.6 回 收 率 : 标 准 溶 液 : 线 性 项 下 80%,100%,120% 浓 度 溶 液 作 为 标 准 溶 液 呋 塞 米 的 回 收 率 : 精 密 称 取 呋 塞 米 约 0.8 mg 1.0 mg 1.2 mg 各 三 份, 分 别 加 入 100ml 容 141

147 量 瓶 中, 加 入 纯 化 水 稀 释 至 刻 度, 照 呋 塞 米 含 量 测 定 项 下 方 法 测 定, 计 算 回 收 率, 试 验 结 果 见 表 : 浓 度 M 加 入 量 (mg) M 测 得 的 量 (mg) 回 收 率 (>95%) 平 均 回 收 率 (>95%) RSD(%)( 2 %) % % 120% 呋 塞 米 的 回 收 率 均 大 于 95%, 符 合 要 求 5. 变 更 和 偏 差 调 查 如 验 证 过 程 中 出 现 变 更, 则 按 公 司 相 对 应 的 SOP 的 名 称 进 行 如 验 证 过 程 中 出 现 偏 差, 则 按 公 司 相 对 应 的 SOP 的 名 称 进 行 此 次 呋 塞 米 注 射 液 验 证 过 程 中 没 有 出 现 偏 差 6 结 论 : 根 据 实 验 结 果, 与 方 案 中 的 标 准 进 行 比 较, 均 符 合 规 定 此 次 呋 塞 米 注 射 液 按 照 中 国 药 典 2010 年 版 分 析 方 法 验 证 成 功, 此 方 法 可 用 于 呋 塞 米 注 射 液 的 检 测, 可 以 有 效 保 证 产 品 质 量, 为 产 品 使 用 者 提 供 安 全 保 证 7 趋 势 图 呋 塞 米 注 射 液 含 量 趋 势 图 1 呋 塞 米 注 射 液 含 量 趋 势 图 含 量 注 : 呋 塞 米 注 射 液 含 量 趋 势 图 2-6 略 ( 下 转 第 144 页 ) 142

148 反 相 高 效 液 相 色 谱 法 分 离 九 种 精 神 类 药 物 程 明, 王 芳, 李 广 庆 ( 北 京 迪 马 科 技 有 限 公 司, 北 京 ) 精 神 类 药 物 是 指 一 切 作 用 于 中 枢 神 经 系 统 并 能 影 响 人 类 认 知 情 感 和 行 为 等 精 神 功 能 的 药 物, 临 床 常 用 的 主 要 有 : 抗 精 神 病 药 抗 焦 虑 药 抗 抑 郁 药 和 抗 躁 狂 药 需 要 指 出 的 是, 这 种 分 类 方 式 并 不 是 绝 对 的, 各 类 别 之 间 可 能 存 在 某 种 程 度 的 重 叠 和 交 叉 该 类 药 物 都 有 一 定 程 度 的 副 作 用, 长 期 服 用 还 会 造 成 药 物 依 赖 性 和 耐 药 性 本 文 选 取 九 种 常 用 的 三 环 类 抗 抑 郁 药 和 苯 并 二 氮 卓 类 抗 焦 虑 药 作 为 待 测 物, 采 用 反 相 高 效 液 相 色 谱 法, 在 常 规 C18 高 效 液 相 色 谱 柱 (Dikma Diamonsil 5 µm C18(2)) 上 实 现 了 等 度 基 线 分 离 该 测 试 方 法 具 有 操 作 简 单 分 析 时 间 短 选 择 性 和 分 离 度 好 等 优 点 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 与 试 剂 Agilent 1200 高 效 液 相 色 谱 仪 ( 美 国 安 捷 伦 公 司 );Dikma Diamonsil 5 µm C18(2) 高 效 液 相 色 谱 柱 ( 北 京 迪 马 科 技 有 限 公 司 ); 乙 腈 三 氟 乙 酸 ( 北 京 迪 马 科 技 有 限 公 司 ); 蒸 馏 水 ( 屈 臣 氏 ) 1.2 色 谱 分 析 条 件 色 谱 柱 :Dikma Diamonsil 5 µm C18(2) 色 谱 柱 规 格 : mm 流 动 相 : 乙 腈 +0.1% 三 氟 乙 酸 : 水 +0.1% 三 氟 乙 酸 =40:60 流 速 :1.0 ml/min 温 度 :30 C 波 长 :254 nm 1.3 样 品 组 成 和 配 制 苯 并 二 氮 卓 类 抗 焦 虑 药 : 硝 西 泮 阿 普 唑 仑 地 西 泮 奥 沙 西 泮 三 唑 仑 氯 硝 西 泮 三 环 类 抗 抑 郁 药 : 去 甲 替 林 去 甲 多 虑 平 曲 米 帕 明 以 上 九 种 精 神 类 药 物 用 流 动 相 作 溶 剂 配 成 合 适 浓 度, 用 0.45 µm 微 孔 滤 膜 过 滤 2 结 果 与 讨 论 在 该 色 谱 分 析 条 件 下, 九 种 药 物 的 分 离 结 果 如 图 1 所 示 : Time (min) 图 1 九 种 精 神 类 药 物 检 测 色 谱 图 出 峰 顺 序 依 次 为 :1. 硝 西 泮 2. 去 甲 多 虑 平 3. 阿 普 唑 仑 4. 地 西 泮 5. 奥 沙 西 泮 6. 三 唑 仑 7. 去 甲 替 林 8. 氯 硝 西 泮 9. 曲 米 帕 明 143

149 表 1 分 离 度 测 定 结 果 R (2,1) R (3,2) R (4,3) R (5,4) R (6,5) R (7,6) R (8,7) R (9,8) 可 以 看 出, 在 该 色 谱 条 件 下, 九 种 物 质 在 不 到 8 分 钟 的 时 间 洗 脱 出 来 并 达 到 基 线 分 离, 具 有 分 析 时 间 短 分 离 度 高 选 择 性 好 的 优 点 ; 同 时 由 于 该 法 采 用 等 度 洗 脱, 降 低 了 仪 器 的 配 置 要 求, 简 化 了 操 作, 为 建 立 快 速 有 效 的 精 神 类 药 物 检 测 提 供 了 一 定 的 理 论 依 据 参 考 文 献 : [1] H. Y. Aboul-Enein et al., Anal. Profiles Drug Subs. 9, 487 (1980). [2] V. H. Sethy, Arch. Pharmacol. 301, 157 (1978). [3] A. MacDonald et al., Anal. Profiles Drug Subs. 1, 79 (1972). [4] C. M. Shearer, C. R. Pilla, Anal. Profiles Drug Subs. 3, 441 (1974). [5] K. K. Okawa, G. S. Allens, J. Int. Med. Res. 6, 343 (1978). [6] W. C. Winslow, Anal. Profiles Drug Subs. 6, 61 (1977). [7] J. L. Hale, Anal. Profiles Drug Subs. 1, 233 (1972). [8] A. A. Al-Badr, Anal. Profiles Drug Subs. 12, 683 (1983). Abstract: Drugs acting on the central nervous system can affect cognition, emotion and other mental functions. The classes of clinically-used drugs include antipsychotics, anxiolytics, antidepressants and antimanics. However, the classifications are not absolute, as there exists a certain degree of overlap between the categories. These drugs often have side effects of varying degrees, and long-term use can result in addiction and resistance. This paper selects nine commonly used tricyclic antidepressants and benzodiazepine anxiolytics as analytes, using an HPLC method in the Dikma Diamonsil 5 μm C18 (2) column to achieve a baseline separation under isocratic elution. This method is simple, fast and efficient with outstanding selectivity and resolution. ( 上 接 第 142 页 ) 线 性 试 验 趋 势 图 y = 6E+06x R 2 = 参 考 文 献 1.ChP( 中 国 药 典 ) 2010.Vol Ⅱ( 二 部 ):

150 茶 饮 料 中 咖 啡 因 检 测 存 在 问 题 的 探 讨 和 研 究 张 明 月, 夏 义 平 ( 天 津 市 疾 病 预 防 控 制 中 心, 天 津 ) 咖 啡 因 是 从 茶 叶 咖 啡 果 中 提 炼 出 来 的 一 种 生 物 碱, 既 可 作 为 食 品 的 组 分, 又 可 以 作 为 药 品 的 原 料 咖 啡 因 的 含 量 是 茶 饮 料 和 茶 叶 中 重 要 的 品 质 指 标, 咖 啡 因 的 药 理 学 效 应 主 要 是 刺 激 中 枢 神 经 系 统 和 心 肌 [1] 低 中 摄 入 咖 啡 因 时 能 够 振 奋 精 神 提 高 注 意 力 增 强 自 信 心 提 高 工 作 效 率 减 少 疲 乏 感 [ 2 ] 增 强 识 别 能 力 提 高 瞬 时 口 头 记 忆 力 然 而 摄 入 高 含 量 的 咖 啡 因 也 有 诸 多 的 副 作 用, 这 些 副 作 用 包 括 影 响 妊 娠 引 起 月 经 前 期 综 合 征, 甚 至 还 有 引 起 不 孕 和 促 进 癌 症 的 发 生 [1] 随 着 功 能 性 茶 饮 料 的 日 益 流 行, 咖 啡 因 的 摄 入 量 也 是 逐 年 上 升, 因 此 准 确 测 定 咖 啡 因 的 含 量 对 于 保 证 茶 饮 料 的 品 质 和 维 护 人 民 健 康 显 得 十 分 重 要 我 国 食 品 添 加 剂 使 用 卫 生 标 准 GB 规 定 [3] 在 可 乐 型 饮 料 中 加 入 咖 啡 因 限 量 为 150 mg/kg; 美 国 加 拿 大 日 本 阿 根 廷 菲 律 宾 为 200 mg/l 前 南 斯 拉 夫 规 定 不 得 超 过 120mg/L [4] 目 前 测 定 咖 啡 因 的 方 法 很 多, 如 薄 层 色 谱 法 碘 量 法 高 效 液 相 色 谱 法 重 量 法 分 子 印 迹 毛 细 管 整 体 柱 液 相 色 谱 法 和 紫 外 分 光 光 度 法 等 [5], 其 中 最 为 普 及 和 准 确 的 为 高 效 液 相 色 谱 法 相 关 的 监 管 部 门 和 科 研 人 士 [6-8] 进 行 了 积 极 的 研 究 与 探 索, 制 定 了 相 关 的 国 家 标 准 和 取 得 了 一 定 的 科 研 成 果, 但 还 是 存 在 一 些 问 题, 本 文 经 过 试 验 对 这 些 问 题 进 行 了 分 析 与 探 讨 1 材 料 和 方 法 1.1 仪 器 与 设 备 Waters600E-2996 高 效 液 相 色 谱 仪 带 紫 外 检 测 器 ( 美 国 Waters 公 司 ) ; 超 纯 水 机 ( 北 京 爱 斯 泰 克 科 技 开 发 有 限 公 司 ) ; 超 声 波 清 洗 器 (AS2050BT) ( 天 津 奥 特 赛 恩 斯 仪 器 有 限 公 司 ) 1.2 试 剂 甲 醇 : 色 谱 纯 ( 天 津 康 科 德 试 剂 有 限 公 司 ); 实 验 用 水 : 超 纯 水 ; 咖 啡 因 标 准 品 (sigma 公 司 ) ; 乙 酸 钠 : 分 析 纯 ( 天 津 康 科 德 试 剂 有 限 公 司 ) 1.3 标 准 液 的 配 置 咖 啡 因 标 准 液 A: 准 确 称 取 咖 啡 因 标 准 品 g, 溶 于 水, 转 移 到 100mL 容 量 瓶, 加 水 定 容 此 溶 液 浓 度 为 1.0mg/mL 咖 啡 因 标 准 液 B: 准 确 称 取 咖 啡 因 标 准 品 g, 溶 于 甲 醇, 转 移 到 100mL 容 量 瓶, 加 水 定 容 此 溶 液 浓 度 为 1.0mg/mL 分 别 将 两 种 标 准 液 用 水 和 甲 醇 稀 释 10 倍 后 作 为 使 用 液 1.4 高 效 液 相 色 谱 条 件 色 谱 柱 :Agilent Hypersil ODS mm(5μm); 流 动 相 : 甲 醇 + 乙 酸 铵 (0.02mol/L) =15+85; 流 速 :1.0mL/min; 检 测 波 长 :272nm, 柱 温 30 ; 进 样 量 :20μL 1.5 样 品 前 处 理 超 声 波 脱 气, 经 0.45μm 的 微 孔 滤 膜 过 滤, 作 为 待 测 样 品 2 结 果 与 讨 论 2.1 咖 啡 因 标 准 溶 液 本 实 验 考 查 了 以 水 溶 解 的 咖 啡 因 标 准 液 A 与 以 甲 醇 溶 解 的 咖 啡 因 标 准 液 B 在 相 同 的 流 动 相 中 的 峰 面 积 两 种 标 准 液 分 别 进 样 六 次, 将 浓 度 校 正 为 0.100mg/mL 后 的 峰 面 积 进 行 单 因 145

151 素 方 差 分 析 峰 面 积 数 据 见 表 1 表 1 峰 面 积 数 据 进 样 次 序 标 准 液 A 峰 面 积 标 准 液 B 峰 面 积 峰 面 积 经 SPSS11.5 统 计 后,F 值 为 P 值 为 0.000,P 值 小 于 0.05 说 明 这 两 种 标 准 液 在 同 一 浓 度 下 经 色 谱 分 离 后 的 峰 面 积 具 有 统 计 学 意 义, 即 以 水 为 溶 剂 的 咖 啡 因 与 以 甲 醇 为 溶 剂 的 咖 啡 因 在 相 同 浓 度 下 的 峰 面 积 显 著 不 同 国 标 GB/T 中, 高 效 液 相 色 谱 法 的 咖 啡 因 标 准 储 备 液 和 标 准 使 用 液 均 用 甲 醇 配 制 有 机 溶 剂 容 易 挥 发, 导 致 浓 度 不 准 确 ; 茶 饮 料 中 咖 啡 因 的 存 在 形 式 是 以 水 溶 解 因 此 以 甲 醇 溶 解 的 标 准 液 峰 面 积 为 标 准 来 计 算 茶 饮 料 中 的 咖 啡 因 浓 度 必 然 偏 高 在 出 口 饮 料 中 维 生 素 C 和 咖 啡 因 检 验 方 法 SN/T [9] 和 SN/T [10] 中 也 采 用 水 作 为 咖 啡 因 标 准 溶 液 的 溶 剂 1g 咖 啡 因 能 溶 于 50mL [11] 水 完 全 能 满 足 标 准 液 的 配 置 需 要 实 验 表 明, 咖 啡 因 水 溶 液 的 峰 形 也 十 分 尖 锐, 未 见 拖 尾 等 现 象 ( 见 图 1), 故 本 实 验 支 持 用 水 作 为 咖 啡 因 标 准 液 的 溶 剂, 而 采 用 甲 醇 作 为 咖 啡 因 标 准 的 溶 剂 会 导 致 测 定 结 果 偏 高 咖 啡 因 甲 醇 溶 液 标 准 色 谱 图 见 图 2 图 1 咖 啡 因 水 溶 液 标 准 色 谱 图 图 2 咖 啡 因 甲 醇 溶 液 标 准 色 谱 图 2.2 色 谱 条 件 流 动 相 是 色 谱 分 离 中 重 要 的 一 步, 直 接 关 系 到 分 析 的 灵 敏 度 和 能 否 将 样 品 中 的 组 分 有 效 洗 脱 分 离 国 标 GB/T 中 采 用 的 流 动 相 为 甲 醇 + 乙 腈 + 水 = ( 每 升 流 动 相 中 加 入 0.8mol/L 乙 酸 液 50mL), 该 法 在 实 际 操 作 中 易 造 成 峰 形 重 叠, 干 扰 检 测 结 果 [12] 食 品 添 加 剂 的 常 检 项 目 - 苯 甲 酸 山 梨 酸 糖 精 钠 和 合 成 着 色 剂, 所 用 的 流 动 相 均 是 甲 醇 和 乙 酸 铵, 本 文 参 考 文 献 咖 啡 因 的 检 测, 也 选 择 甲 醇 和 0.02mol/L 乙 酸 铵 溶 液 作 为 流 动 相, 有 促 于 咖 啡 因 苯 甲 酸 山 梨 酸 的 同 时 测 定 检 测 波 长 的 选 择 二 极 管 阵 列 检 测 器 在 线 扫 描 的 结 果 表 明 样 品 和 标 准 品 中 咖 啡 因 峰 的 最 大 吸 收 均 在 272nm, 并 且 紫 外 吸 收 光 谱 完 全 一 致, 因 此 测 定 波 长 定 为 272nm, 咖 啡 因 标 准 的 光 谱 图 见 图 A U ?? 图 3 咖 啡 因 标 准 光 谱 图 图 4 茶 饮 料 中 咖 啡 因 色 谱 图 146

152 2.3 线 性 关 系 将 配 制 好 的 一 系 列 标 准 溶 液 A 和 B(0,20,50,100,150μg/mL) 分 别 按 上 述 色 谱 条 件 进 样 20μL, 以 峰 面 积 (y) 对 相 应 浓 度 (c,μg/ml) 作 回 归 分 析, 得 到 回 归 方 程 咖 啡 因 标 准 溶 液 A 的 回 归 方 程 为 :y=75713c+28295, 相 关 系 数 r=0.9997; 咖 啡 因 标 准 溶 液 B 的 回 归 方 程 为 :y=69503c+28820, 相 关 系 数 r= 从 两 条 标 准 工 作 曲 线 上 也 能 看 出 : 当 样 品 的 峰 面 积 一 定 时, 以 咖 啡 因 标 准 溶 液 B 的 回 归 方 程 计 算 出 的 咖 啡 因 结 果 偏 高 本 实 验 测 定 了 市 售 茶 饮 料 中 的 咖 啡 因 含 量, 其 咖 啡 因 峰 面 积 为 按 咖 啡 因 标 准 溶 液 A 和 咖 啡 因 标 准 溶 液 B 的 回 归 方 程 计 算 出 的 咖 啡 因 含 量 分 别 为 90.0 和 98.0μg/mL, 其 绝 对 差 值 为 算 术 平 均 值 的 8.51% 按 照 GB/T 的 精 密 度 要 求 : 对 于 饮 料 样 品 在 重 复 性 条 件 下 获 得 的 两 次 独 立 测 定 结 果 的 绝 对 差 值 不 得 超 过 算 术 平 均 值 的 5% 此 次 测 定 仅 仅 是 因 为 标 准 液 的 溶 剂 不 同 导 致 了 绝 对 差 值 为 算 术 平 均 值 的 8.51% 超 出 了 GB/T 的 精 密 度 要 求 产 饮 料 中 咖 啡 因 色 谱 图 见 图 精 密 度 和 回 收 率 准 确 吸 取 标 准 溶 液 20μL(100μg/mL), 重 复 进 样 6 次, 分 别 测 得 咖 啡 因 标 准 溶 液 A 的 RSD=0.481%(n=6) 咖 啡 因 标 准 溶 液 B 的 RSD=0.252% 取 含 咖 啡 因 的 样 品, 在 1.0mL 样 品 中 准 确 加 入 50μg/mL 的 咖 啡 因 标 准 A 溶 液 mL 按 照 样 品 处 理 测 定 其 回 收 率, 结 果 见 表 1; 在 1.0mL 样 品 中 准 确 加 入 50μg/mL 的 咖 啡 因 标 准 B 溶 液 mL 按 照 样 品 处 理 测 定 其 回 收 率, 结 果 见 表 2 表 1 咖 啡 因 的 回 收 率 ( 以 咖 啡 因 标 准 溶 液 A 计 算 ) 本 底 值 (μg/ml) 加 标 量 (μg) 测 定 值 (μg/ml) 回 收 率 (%) 表 2 咖 啡 因 的 回 收 率 ( 以 咖 啡 因 标 准 溶 液 B 计 算 ) 本 底 值 (μg/ml) 加 标 量 (μg) 测 定 值 (μg/ml) 回 收 率 (%) 本 实 验 以 两 种 不 同 溶 剂 溶 解 咖 啡 因 标 准 进 行 加 标 回 收 实 验, 实 验 结 果 表 明 回 收 率 在 97.5~102.2 之 间, 均 在 可 接 受 范 围 内 以 甲 醇 溶 解 的 咖 啡 因 标 准 作 回 收 实 验 时 可 能 因 为 加 入 的 甲 醇 与 水 溶 液 互 溶 导 致 体 积 减 小, 回 收 率 偏 高 2.5 天 然 咖 啡 因 与 合 成 咖 啡 因 的 鉴 别 食 品 添 加 剂 使 用 卫 生 标 准 GB 中 规 定 只 能 在 可 乐 型 碳 酸 饮 料 中 添 加 咖 啡 因 作 为 食 品 添 加 剂 茶 饮 料 国 家 标 准 [13] GB 和 绿 色 食 品 茶 饮 料 国 家 标 准 147

153 [14] NY/T 也 对 茶 饮 料 中 咖 啡 因 作 了 明 确 的 规 定, 不 允 许 使 用 合 成 咖 啡 因 调 制 饮 料 GB GB 和 NY/T 指 定 的 检 验 方 法 同 为 GB/T , 但 是 GB/T 中 检 验 方 法 能 否 鉴 别 天 然 与 合 成 的 咖 啡 因 还 值 得 商 榷, 因 为 根 据 QB [15] 中 天 然 咖 啡 因 和 合 成 咖 啡 因 在 该 方 法 中 具 有 不 同 的 色 谱 行 为 本 实 验 因 未 能 购 买 到 天 然 咖 啡 因 的 标 准 品, 未 能 进 行 相 关 的 鉴 别 试 验 中 华 人 民 共 和 国 行 业 标 准 QB 采 用 HPLC 对 天 然 与 合 成 的 咖 啡 因 进 行 了 鉴 别, 建 议 国 标 GB/T 增 加 相 关 的 咖 啡 因 鉴 别 试 验 2.6 标 准 的 匹 配 GB GB 和 NY/T 规 定 的 咖 啡 因 含 量 单 位 为 g/kg 或 者 mg/kg, 其 指 定 的 检 验 方 法 均 为 GB/T 但 是 GB/T 中 检 测 饮 料 中 的 咖 啡 因 含 量 的 计 量 单 位 为 mg/l, 这 样 出 现 方 法 和 标 准 使 用 的 伎 俩 单 位 不 统 一, 导 致 无 法 合 理 评 价, 建 议 统 一 计 量 单 位 以 便 合 理 准 确 评 价, 方 便 质 量 控 制 和 市 场 监 管 参 考 文 献 : [1] Yuji YAMAUCHI, Akiko NAKAMURA, Iho KOHNO. Simple and Rapid UV Spectrophotometry of Caffeine in Tea Coupled with Sample re-treatment Using a Cartridge Column Filled with Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP), Chem. Pharm. Bull. 56(2) (2008) [2] Brice C, Smith A1The effects of caffeine on simulated driving, subjective alertness and sustained attention [ J ] 1Hum Psycho2 pharmacol, 2001, 16 (7) : [3] GB 食 品 添 加 剂 使 用 卫 生 标 准 [4] GB/T 饮 料 中 咖 啡 因 的 测 定 [5] 徐 学 笛. 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 咖 啡 因 含 量 的 研 究 与 探 讨, 科 技 成 果 纵 横, [6] 宁 丽 峰, 王 慧 萍, 何 轩, 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 饮 料 中 咖 啡 因 的 含 量, 中 国 卫 生 检 验 杂 志,2009,19, [7] 崔 海 精, 郑 彬, 宁 琳 琪, 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 饮 料 中 的 咖 啡 因, 中 国 热 带 医 学, [8] 乐 健, 洪 战 英, 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 绿 茶 和 饮 料 中 的 咖 啡 因, 药 物 生 物 技 术, [9] SN/T 出 口 饮 料 中 维 生 素 C 和 咖 啡 因 的 检 验 方 法 [10] SN/T 进 出 口 蜂 蜜 中 咖 啡 因 含 量 检 验 方 法 [11] GB 食 品 添 加 剂 咖 啡 因 [12] 徐 陆 妹, 赵 建. 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 饮 料 中 咖 啡 因 的 方 法 改 进 [J]. 中 国 卫 生 检 验 杂 志,2002,12(5): 608. [13] GB 茶 饮 料 [14] NY/T 绿 色 食 品 茶 饮 料 [15] QB 食 品 添 加 剂 天 然 咖 啡 因 148

154 高 效 液 相 法 测 定 比 卡 鲁 胺 含 量 张 莹, 张 建 柱, 李 博, 周 丽, 汪 群 杰 ( 天 津 博 纳 艾 杰 尔 科 技 有 限 公 司, 天 津 ) 采 用 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 比 卡 鲁 胺 含 量 对 方 法 的 精 密 度 最 低 检 出 限 度 重 复 性 稳 定 性 进 行 了 系 统 研 究 本 方 法 能 够 解 决 R- 比 卡 鲁 胺 与 其 异 构 体 杂 质 分 离, 方 法 快 速, 准 确, 灵 敏 度 高 [1] 比 卡 鲁 胺 (bicalutamide) 是 一 种 新 型 非 甾 体 抗 雄 激 素 药 物, 可 阻 断 肾 上 腺 产 生 的 雄 性 激 素 作 用, 抑 制 雄 性 激 素 在 细 胞 核 受 体 部 位 的 结 合 或 吸 收, 导 致 前 列 腺 肿 瘤 萎 缩 临 床 可 单 独 用 于 治 疗 晚 期 前 列 腺 癌, 与 黄 体 生 成 素 释 放 激 素 (LHRH) 类 似 物 或 外 科 睾 丸 切 除 术 联 合 用 于 [2] 晚 期 前 列 腺 癌 的 治 疗, 从 而 避 免 雄 激 素 治 疗 引 起 的 不 良 反 应 和 睾 丸 切 除 术 后 病 人 的 心 理 改 变 比 卡 鲁 胺 是 消 旋 物, 其 抗 雄 激 素 作 用 仅 仅 出 现 在 (R)- 结 构 对 应 体 上 (S)- 异 构 体 相 对 (R)- 异 构 体 消 除 较 为 迅 速, 所 要 在 后 续 的 检 测 中, 严 格 控 制 (S)- 异 构 体 的 含 量 现 有 比 卡 鲁 胺 的 分 析 检 测 方 法 不 能 很 好 的 将 目 标 产 物 和 杂 质 分 开, 本 文 建 立 了 比 卡 鲁 胺 的 检 测 方 法, 该 方 法 能 够 将 比 卡 鲁 胺 与 异 构 体 杂 质 分 开, 该 方 法 快 速, 准 确, 灵 敏 度 高 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 与 试 剂 Agilent1100 高 效 液 相 色 谱 仪, 比 卡 鲁 胺 ( 进 口 ), 乙 腈 ( 色 谱 纯, 美 国 Honeywell 公 司 ), 三 氟 乙 酸 ( 分 析 纯, 北 京 偶 合 科 技 有 限 公 司 ), 水 ( 屈 臣 氏 ) 1.2 含 量 测 定 色 谱 条 件 色 谱 柱 :Venusil MP C18, mm,5μm,100 Å( 天 津 博 纳 艾 杰 尔 科 技 有 限 公 司 ); 流 动 相 :A:0.01% 三 氟 乙 酸 水 溶 液,B:0.01% 三 氟 乙 酸 乙 腈 溶 液, 时 间 /min A% B% 柱 温 :30, 流 速 :1.0mL/min, 检 测 波 长 :276nm, 进 样 量 :20μL 1.3 样 品 的 制 备 和 测 定 样 品 溶 剂 : 流 动 相 A: 流 动 相 B=1:2 样 品 溶 液 : 精 密 称 取 样 品 细 粉 1g, 置 于 100mL 量 瓶 中, 加 样 品 溶 剂 50mL 溶 解, 振 摇 10 分 钟, 加 样 品 溶 剂 50mL 稀 释 至 刻 度, 摇 匀, 过 滤, 作 为 样 品 溶 液 精 密 量 取 20μL 注 入 液 相 色 谱 仪, 记 录 色 谱 图 2 结 果 与 讨 论 2.1 流 动 相 的 选 择 试 验 中 考 察 过 三 氟 乙 酸 对 实 验 结 果 的 影 响, 采 用 流 动 相 A,B 不 加 三 氟 乙 酸 ; 流 动 相 A 加 三 氟 乙 酸, 流 动 相 B 不 加 三 氟 乙 酸 ; 流 动 相 A,B 都 加 三 氟 乙 酸 实 验 表 明, 当 流 动 相 A,B 都 加 三 氟 乙 酸 峰 型 最 好, 说 明 流 动 相 的 ph 值 对 分 离 有 较 好 的 改 善 149

155 图 1 比 卡 鲁 胺 液 相 色 谱 图 (1: 比 卡 鲁 胺 峰,2: 异 构 体 杂 质 A,3: 异 构 体 杂 质 B) 图 2 比 卡 鲁 胺 液 相 色 谱 图 放 大 图 (1: 比 卡 鲁 胺 峰,2: 异 构 体 杂 质 A,3: 异 构 体 杂 质 B) 2.2 最 低 检 出 限 实 验 比 卡 鲁 胺 12.5 mg, 置 25mL 容 量 瓶 中, 加 流 动 相 不 断 稀 释 进 样, 记 录 峰 面 积, 使 峰 高 大 约 为 基 线 噪 音 的 3 倍, 记 录 色 谱 图 试 验 结 果 表 明, 在 上 述 色 谱 条 件 下 比 卡 鲁 胺 检 测 限 为 3ng 2.3 精 密 度 试 验 分 别 取 比 卡 鲁 胺 标 准 品 10mg,20mg,50mg, 精 密 称 定, 置 50mL 容 量 瓶 中, 加 流 动 相 溶 解 并 稀 释 至 刻 度, 定 容 分 别 取 此 三 种 浓 度 的 溶 液 各 10μL, 照 上 述 色 谱 法 各 进 样 6 份, 测 得 三 种 浓 度 主 峰 峰 面 积 RSD 分 别 为 (RSD 0.15%),(RSD,0.14%),(RSD,0.12%), 平 均 RSD=0.13% 2.4 重 复 性 试 验 取 同 一 批 比 卡 鲁 胺 样 品 5 份, 各 20mg 精 密 称 定, 置 50mL 容 量 瓶 中, 加 流 动 相 溶 解 并 稀 释 至 刻 度, 定 容 精 密 吸 取 10μL 注 入 液 相 色 谱 仪, 分 别 测 定 比 卡 鲁 胺 的 含 量, 结 果 表 明, 该 方 法 的 重 复 性 较 好 ( 见 表 1) 2.5 稳 定 性 试 验 在 不 同 时 间 段 考 察 样 品 的 稳 定 性, 室 温 放 置 考 察 日 间 差 异, 过 夜 时 密 闭 放 置 于 4 冰 箱 中, 考 察 日 间 差 异 取 比 卡 鲁 胺 样 品 20mg, 精 密 称 定, 置 50mL 容 量 瓶 中, 加 流 动 相 溶 解 并 稀 释 至 刻 度, 定 容 精 密 吸 取 10μL 注 入 液 相 色 谱 仪, 分 别 测 定 不 同 时 间 比 卡 鲁 胺 的 含 量 结 果 表 明 比 卡 鲁 胺 样 品 溶 液 稳 定 150

156 表 1 卡 比 鲁 胺 样 品 含 量 表 2 比 卡 鲁 胺 样 品 稳 定 性 实 验 样 品 放 置 时 间 (h) 含 量 (mg/ml) 样 品 含 量 (mg/ml) 样 品 样 品 样 品 样 品 加 标 回 收 率 采 用 加 标 回 收 方 法 验 证 方 法 的 准 确 性, 准 确 称 取 20mg 样 品 3 份, 分 别 配 置 为 1mg/mL 溶 液 进 行 加 标 回 收 试 验, 精 密 加 入 标 准 品 适 量, 按 照 含 量 测 定 方 法 进 样 测 定, 并 计 算 回 收 率 实 验 结 果 表 明 加 标 回 收 率 良 好, 证 明 该 方 法 测 定 比 卡 鲁 胺 的 含 量 可 行 ( 见 表 3) 表 3 比 卡 鲁 胺 加 标 回 收 率 实 验 样 品 含 量 (mg/ml) 对 照 品 加 入 量 (mg/ml) 测 定 值 (mg/ml) 回 收 率 % % % % % 2.8 线 性 范 围 精 密 称 取 比 卡 鲁 胺 标 准 品 10mg,20mg,30mg,40mg,50mg, 精 密 称 定, 置 50mL 容 量 瓶 中, 加 流 动 相 溶 解 并 稀 释 至 刻 度, 定 容 分 别 取 此 五 种 浓 度 的 溶 液 按 照 含 量 测 定 方 法 各 进 样 10μL, 测 定 以 标 准 品 浓 度 为 横 坐 标 (X), 以 峰 面 积 为 纵 坐 标 (Y), 绘 制 标 准 曲 线, 进 行 线 性 回 归 回 归 方 程 为 :Y=532635X+1923,r= 线 性 关 系 良 好 3 结 论 针 对 比 卡 鲁 胺 与 其 异 构 体 杂 质 能 分 离 的 情 况 质, 建 立 了 高 效 液 相 测 定 比 卡 鲁 胺 含 量 的 HPLC 方 法 解 决 了 比 卡 鲁 胺 消 旋 异 构 体 杂 质 难 以 分 开 该 方 法 快 速, 准 确, 灵 敏 度 高 可 作 为 控 制 比 卡 鲁 胺 产 品 质 量 的 方 法 参 考 文 献 [1] 孙 忠 全, 钱 伟 庆, 宋 健 达. 比 卡 鲁 胺 治 疗 雄 激 素 非 依 赖 性 前 列 腺 癌 [J]. 中 国 癌 症 杂 志,2006,16(2); [2] SEPP LORENZINO L,SLOVIN S.Prostate cancer:therapeutic patent review[j].exp Opin Ther Patents, 2000,10(12):l Determination of Bicalutamide with high performance liquid chromatography ZHANG Ying, ZHANG Jian-zhu, Li Bo, ZHOU Li,WANG Qun-jie Agela Technologies Inc, Tianjin Abstract: Determination of bicalutamide with high performance liquid chromatography. The paper studied the method in the precision, the detection limit, reproducibility, stability of the system. This method can separate R-bicalutamide,its isomer and impurity.the method is rapid, accurate and sensitive. Keywords: Bicalutamide Isomer HPLC 样 品

157 紫 杉 醇 真 菌 未 知 代 谢 产 物 的 研 究 吴 迪 , 王 伟, 曹 淑 珍, 吕 宪 禹 (1. 南 开 大 学 生 命 科 学 学 院, 天 津 ;2. 天 津 医 科 大 学 肿 瘤 医 院, 天 津 ) 紫 杉 醇 是 从 红 豆 杉 属 植 物 树 皮 中 分 离 提 取 的 一 种 次 生 代 谢 产 物, 具 有 独 特 的 抗 癌 作 用, 紫 杉 醇 是 白 色 结 晶 粉 末, 分 子 式 为 C 47H 51 NO 14, 分 子 量 为 , 溶 点 为 213~216, 难 溶 于 水 及 许 多 药 用 溶 媒, 易 溶 于 氯 仿 丙 酮 等 有 机 溶 剂 紫 杉 醇 目 前 主 要 来 源 是 从 红 豆 杉 树 皮 中 提 取, 这 将 破 坏 野 生 资 源 和 生 态 环 境, 而 且 天 然 红 豆 杉 在 世 界 范 围 内 数 量 很 少, 生 长 周 期 长, 从 而 对 紫 杉 醇 的 进 一 步 开 发 利 用 造 成 了 很 大 的 困 难 微 生 物 发 酵 法 是 生 产 紫 杉 醇 的 一 种 重 要 方 法, 而 研 究 紫 杉 醇 真 菌 发 酵 产 物 中 的 其 他 组 分 也 具 有 重 要 意 义 南 开 大 学 生 命 科 学 学 院 朱 旭 东 分 离 到 一 株 球 毛 壳 真 菌, 将 其 命 名 为 NK-36b; 朱 旭 东 对 NK-36b 的 发 酵 产 物 进 行 了 薄 层 层 析 高 效 液 相 色 谱 质 谱 和 酶 联 免 疫 吸 附 实 验 分 析, 认 为 该 菌 株 发 酵 产 物 中 含 有 紫 杉 醇 图 一 NK-36b 发 酵 产 物 高 效 液 相 色 谱 图 我 们 针 对 NK-36b 发 酵 产 物 中 的 未 知 高 含 量 组 分 化 合 物 X 进 行 研 究 首 先 将 化 合 物 X 自 发 酵 产 物 中 分 离 纯 化 出 来, 之 后 针 对 化 合 物 X 纯 品, 进 行 生 物 活 性 测 试, 并 确 定 了 其 分 子 结 构 1 仪 器 与 样 品 1.1 仪 器 高 效 液 相 色 谱 系 统 包 括 : 高 压 恒 流 泵, 实 验 室 自 制 ; 手 动 进 样 器,7725i;CO-Ⅳ 柱 温 箱, Scienhome 公 司 ;Spectra 200 紫 外 吸 收 检 测 器,Spectra-Physics 公 司 ;C18 色 谱 柱, 天 津 色 谱 科 技 有 限 公 司 1.2 样 品 紫 杉 醇 产 生 真 菌 NK-36b 由 朱 旭 东 提 供 2 实 验 方 法 2.1 化 合 物 X 分 离 纯 化 将 真 菌 发 酵 产 物 真 空 冷 冻 干 燥 后, 置 于 液 氮 中 研 磨 成 粉 末 将 真 菌 粉 末 分 别 按 0.1g/mL 的 比 例 与 乙 酸 乙 酯 混 合 将 真 菌 粉 末 浸 出 液 进 样 到 半 制 备 型 高 效 液 相 色 谱 中, 手 工 收 集 化 合 152

158 物 X 处 流 出 液 将 色 谱 纯 化 收 集 液 转 移 到 圆 底 烧 瓶 中, 室 温 下 旋 转 蒸 发 浓 缩 待 获 得 较 多 沉 淀 后, 将 悬 浊 液 离 心 弃 上 清 取 沉 淀 2.2 化 合 物 X 生 物 活 性 研 究 将 化 合 物 X 配 置 成 不 同 浓 度 的 溶 液, 饲 喂 果 蝇 和 A549 细 胞, 考 察 化 合 物 X 对 它 们 的 影 响 2.3 化 合 物 X 结 构 的 解 析 通 过 离 子 阱 质 谱 傅 里 叶 变 换 质 谱 元 素 分 析 紫 外 光 谱 红 外 光 谱 和 核 磁 共 振 谱 等 仪 器 分 析 技 术, 综 合 化 合 物 X 的 生 物 来 源, 综 合 分 析 确 定 化 合 物 X 分 子 结 构 3 结 果 3.1 化 合 物 X 纯 化 效 果 将 纯 化 获 得 的 化 合 物 X 溶 解 后 进 行 高 效 液 相 色 谱 分 析, 结 果 如 图 所 示 按 照 面 积 归 一 化 法 粗 略 估 算, 化 合 物 X 纯 度 在 95% 以 上 ; 满 足 后 续 实 验 需 求 图 二 化 合 物 X 高 效 液 相 色 谱 图 3.2 化 合 物 X 生 物 活 性 分 析 实 验 发 现 化 合 物 X 对 果 蝇 的 成 活 和 细 胞 生 长 都 有 抑 制 作 用, 是 一 种 广 谱 生 物 毒 性 物 质 图 三 化 合 物 X 对 果 蝇 和 A549 细 胞 的 毒 性 左 : 果 蝇 毒 性 实 验 ; 右 :MTT 实 验 3.3 化 合 物 X 结 构 的 解 析 通 过 离 子 阱 质 谱 测 定 化 合 物 X 相 对 分 子 质 量 为 528 进 一 步 使 用 傅 里 叶 变 换 质 谱 测 定 其 精 确 分 子 质 量 并 检 索 分 子 式, 确 定 化 合 物 X 分 子 式 为 C32H36N2O5, 元 素 分 析 的 结 果 支 持 这 个 结 论 再 综 合 化 合 物 X 的 紫 外 光 谱 红 外 光 谱 核 磁 共 振 谱 的 结 果, 并 考 虑 其 生 物 来 源, 确 定 其 为 球 毛 壳 甲 素 153

159 4 讨 论 图 四 化 合 物 X 的 离 子 阱 质 谱 图 图 五 球 毛 壳 甲 素 分 子 结 构 实 验 表 明 NK-36b 菌 株 能 够 同 时 产 生 紫 杉 醇 和 球 毛 壳 甲 素 两 种 抗 肿 瘤 药 物, 有 助 于 该 菌 株 的 深 入 开 发 利 用 ; 同 时, 基 于 球 毛 壳 甲 素 的 对 NK-36b 菌 株 的 分 子 生 物 学 改 造 也 已 经 开 始 参 考 文 献 : [1] 元 英 进. 抗 癌 新 药 紫 杉 醇 的 药 理 与 临 床 应 用. 北 京 : 化 学 工 业 出 版 社,2002 [2] Schiff PB, Fant J, Horwitz SB. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature, 1979, 277 (5698): 665~667 [3] Hui Ming Ge, Wei Yun Zhang, Gang Ding, et al. Chaetoglobins A and B, two unusual alkaloids from endophytic Chaetomium globosum culture. Chem. Commun., 2008, [4] 倪 志 伟 李 国 红 赵 沛 基 等. 云 南 美 登 木 内 生 真 菌 Chaetomium globosum Ly50 菌 株 的 抗 菌 活 性 成 分 研 究. 天 然 产 物 研 究 与 开 发,2008,20:33-36 [5] Setsuko Sekita, Kunitoshi Yoshihira, Shinsaku Natori et al. Chaetoglobosins, Cytotoxic 10 -(Indo-3-yl) -[13] cytochalasans from Chaetomium spp. Ⅱ Structures of Chaetoglobosins A, B and D. Chem. Pharm. Bull, 1928, 30 (5): The Research about an Unidentified Metabolite from a Taxol-producing Strain WU Di 1, WANG Wei 1, CAO Shu-zhen 2, LV Xian-yu 1 (1.College of Life Sciences, Nankai University,Tianjin , China; 2.Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,Tianjin , China) Abstract: Taxol is a secondary metabolite extracted from the bark of the Pacific yew tree and has unique anti-tumor effects. Microbial fermentation is an important method of yielding taxol, and study about the other components in the taxol-producing fungal fermentation products also has significant meanings. We focused on an unknown component "compound X" with high content in fermented products of Taxol-producing fungi NK-36b. First, the compound X was purified from the fermentation product, and then use the compound X purified for biological activity tests. Finally, Compound X was elucidated as Chaetoglobosin A. Key words: Taxol; Chaetoglobosin A; Fermentation. 154

160 高 效 液 相 色 谱 - 示 差 检 测 法 分 离 蚕 沙 中 的 生 物 碱 * 亓 晖, 张 业 云, 刘 新 来, 赵 辉, 王 鹏, 花 同, 朱 元 元 ( 南 开 大 学 药 学 院, 天 津 ) 蚕 沙 为 蚕 蛾 科 家 蚕 属 昆 虫 家 蚕 幼 虫 的 粪 便, 具 有 较 高 营 养 成 分, 药 用 价 值 很 高 近 年 来 研 究 发 现, 蚕 沙 生 物 碱 成 分 能 抑 制 α- 糖 苷 酶 活 性, 改 善 糖 尿 病 动 物 的 糖 脂 代 谢 异 常, 有 [1-2] 益 于 早 期 糖 尿 病 及 其 慢 性 并 发 症 的 防 治 对 蚕 沙 中 生 物 碱 成 分 做 HPLC 分 析, 实 验 数 据 显 [3] 示, 至 少 含 有 八 种 化 合 物, 周 元 雄 等 人 已 分 离 鉴 定 出 其 中 三 种 化 合 物, 而 另 外 至 少 五 种 化 合 物 还 未 见 报 道 因 此, 有 必 要 对 蚕 沙 生 物 碱 成 分 进 行 较 深 入 的 研 究 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 与 试 剂 SHIMADZU 系 列 高 效 液 相 色 谱 仪 ;Hypersil SCX 色 谱 柱 (250 mm 10.0 mm,5 μm) ; Varian-Mercury V 300 型 高 分 辨 核 磁 波 谱 仪 ;Thermofinnigan LCQ 质 谱 仪 ; 生 药 蚕 沙 由 天 津 市 中 新 药 业 提 供 ;HPLC 用 水 均 为 娃 哈 哈 纯 净 水 ; 其 它 试 剂 均 为 分 析 纯 1.2 HPLC 法 分 离 蚕 沙 中 生 物 碱 成 分 色 谱 条 件 色 谱 柱 :Hypersil SCX 柱 (250 mm 10.0 mm,5 μm); 流 动 相 : 水 - 冰 醋 酸 - 氨 水 (1000: 0.25:0.25;V/V/V); 流 速 :3.0ml/min; 检 测 器 : 示 差 检 测 器 ; 柱 温 : 室 温 供 试 品 溶 液 的 制 备 2kg 蚕 沙 用 离 子 水 6L, 调 ph3.0,40~50 保 温 3 小 时, 过 滤 ; 滤 渣 同 法 再 提 取 两 次, 合 并 三 次 滤 液, 减 压 浓 缩 至 约 2.4L, 静 置 过 夜,10000rpm 离 心 20min, 保 留 上 清 液 取 上 清 液 过 阳 离 子 交 换 树 脂 柱, 以 50% 乙 醇 和 去 离 子 水 依 次 洗 尽 不 吸 附 的 杂 质, 再 采 用 0.5mol/L 氨 水 溶 液 洗 脱, 收 集 α- 糖 苷 酶 抑 制 活 性 检 测 阳 性 部 分, 减 压 蒸 去 氨 水, 得 到 9.7g 深 棕 色 浸 膏 取 9.3g 浸 膏 经 70g 硅 胶 吸 附 脱 色, 无 水 乙 醇 洗 脱, 减 压 蒸 干 后, 得 蚕 沙 总 生 物 碱 提 取 物 3.2g(0.30%), 将 其 溶 解, 做 制 备 用 蚕 沙 提 取 液 中 生 物 碱 成 分 的 HPLC 法 分 离 纯 化 将 上 述 供 试 品 溶 液 以 所 选 色 谱 条 件 进 行 分 离, 谱 图 如 图 1: 图 1 供 试 品 溶 液 HPLC 图 谱 基 金 项 目 : 国 家 科 技 重 大 专 项 项 目 (2009zx09103) 作 者 简 介 : 亓 晖 (1985-), 女, 山 东 人, 硕 士 研 究 生, qihui1985@126.com 通 讯 联 系 人 : 朱 元 元, 女, 副 教 授, zhuyy@nankai.edu.cn 155

161 分 离 得 到 干 燥 固 体 物 质 : 化 合 物 A(119.5mg) 和 化 合 物 B(20mg) 1.3 结 构 鉴 定 对 化 合 物 A 和 B 做 MS 1 13 H-NMR 和 C-NMR 分 析 : 化 合 物 A: 白 色 固 体 ;ESI-MSm/z [M+H] + ; 1 H-NMR(300MHz,D2O) δ3.236(9h, s),3.877(2h,s); 13 C-NMR(75MHz,D2O):δ (C=O),68.907(CH 2),55.077(CH3 3) [4] 碳 谱 及 氢 谱 数 据 与 文 献 报 道 的 甜 菜 碱 数 据 ) 一 致, 故 确 定 结 构 为 1- 羧 基 -N,N,N- 三 甲 基 乙 内 酯, 亦 称 甜 菜 碱, 结 构 如 图 2 所 示 化 合 物 B: 白 色 晶 体,mp 178 ;ESI-MS m/z:164 [M+H] + ; 1 H-NMR (D2O, 300 MHz) δ: (3H, m, 2H-6; H-3), (3H, m, H-2;H-4;H-1e), 3.09 (1H, dd, H-1a), 2.86 (1H, t, H-5); 13 C-NMR (D2O, 75MHz) δ:76.2 (C-3), 67.7 (C-4), 66.9 (C-2), 59.9 (C-6), 57.7 (C-5), 45.8 [5] (C-1) 以 上 数 据 与 DNJ 标 准 品 及 其 文 献 值 相 符, 确 认 该 化 合 物 为 DNJ, 结 构 如 图 3 所 示 CH 3 O H 3 讨 论 CH 3 N + CH 2 COO - N H H O CH 3 H O O H 图 2 图 色 谱 柱 的 选 择 蚕 沙 生 物 碱 成 分 分 子 极 性 较 大, 采 用 常 规 的 反 相 C18 色 谱 柱 无 法 分 析 为 此 选 择 了 磺 酸 基 柱, 效 果 较 好, 且 有 合 理 的 保 留 时 间 (<15min) 3.2 色 谱 条 件 的 选 择 实 验 探 索 得 知 当 流 动 相 为 水 - 冰 醋 酸 - 三 乙 胺 (1000:1:1, V/V/V) 时, 分 离 效 果 较 好 且 峰 形 对 称, 但 三 乙 胺 的 后 处 理 困 难, 难 以 得 到 纯 净 化 合 物, 因 此 改 用 有 挥 发 性 的 氨 水 对 流 动 相 ( 水 - 冰 醋 酸 - 氨 水 ) 配 比 进 行 考 察, 发 现 配 比 为 水 - 冰 醋 酸 - 氨 水 (1000:0.25:0.25) 时 保 留 时 间 分 离 效 果 重 复 性 均 较 理 想 3.3 检 测 器 的 选 择 对 蚕 沙 生 物 碱 成 分 进 行 紫 外 扫 描, 发 现 紫 外 吸 收 很 弱, 同 时 考 虑 实 验 室 条 件, 采 用 通 用 型 检 测 器 - 示 差 折 光 检 测 器 (RID), 它 是 利 用 样 品 与 流 动 相 的 折 光 率 不 同 而 检 出 信 号, 对 没 有 紫 外 吸 收 的 物 质, 如 高 分 子 化 合 物 糖 类 脂 肪 烷 烃 等 都 能 够 检 测 参 考 文 献 : [1] Bollen M,Vandebreck A,Stalmans W,etal. [J]. Biochem Pharmacol,1988,37(5) :905~909 [2] Arai M,Minatoguchi S,Takemure G,etal. [J]. Circulation, 1998, 97(13): [3] 周 光 雄, 阮 杰 武, 黄 关 燕 等.[J]. 中 药 材.2007,30(11): [4] 刘 新 亚, 马 龙, 堵 年 生 等.[J]. 西 北 药 学 杂 志.2004,19(2):63-64 [5] Asano N, Tomioka E, Kizu H, etal. [J]. Carbohydr Res, 1994, 253: Alkaloid Constituents from Silkworm Dropping by HPLC-RID Qi Hui, Zhang Yeyun, Liu Xinlai, Zhao Hui,Wang Peng, Hua Tong, ZhuYuanyuan* (College of Pharmacy,Nankai University,Tianjin ,China) Abstract: Objective: To extract and isolate chemical constituents from the total alkaloids of silkworm dropping(can Sha). Methods: Chemical constituents were isolated by HPLC, ion-exchange resin.the structures of the isolated compounds were determined by spectral means. Results: Two compounds were isolated and identified as Betaine (A), Methyl nicotinate (B),Compounds B is isolated and identified from Can Sha for the first time. Key words: Silkworm dropping(can Sha);Alkaloid;Betaine;Methyl nicotinate 156

162 1 导 言 紫 云 喷 雾 剂 制 备 及 其 阿 魏 酸 含 量 测 定 李 瑾 ( 天 津 金 耀 氨 基 酸 有 限 公 司 ) 1.1 研 究 目 的 和 意 义 紫 云 喷 雾 剂 处 方 源 于 部 颁 标 准 紫 云 膏 处 方 组 成 为 紫 草 地 榆 当 归 冰 片 诸 药 合 用, 可 活 血 祛 瘀, 抗 菌 消 炎, 使 组 织 再 生 和 伤 口 愈 合 及 美 白 皮 肤 去 疤 痕 等, 是 一 种 理 想 的 治 疗 各 种 外 伤 感 染 及 炎 症 方 剂 实 验 中, 以 紫 草, 当 归, 地 榆, 冰 片 为 原 料, 通 过 提 取 分 离 等 过 程 提 取 其 中 有 效 成 分, 制 备 紫 云 喷 雾 剂 1.2 研 究 方 法 提 取 工 艺 条 件 的 筛 选 : 用 不 同 浓 度 的 乙 醇 溶 剂 将 药 材 先 浸 泡 60min, 对 紫 草, 当 归, 地 榆, 冰 片 按 正 交 设 计 方 案 进 行 回 流 提 取, 以 当 归 中 的 阿 魏 酸 含 量 作 为 评 价 指 标, 用 HPLC 法 测 定 其 含 量, 优 化 最 佳 提 取 工 艺 因 素 包 括 溶 剂 量 提 取 时 间 提 取 次 数 等 喷 雾 剂 的 制 备 : 以 原 处 方 称 取 当 归 地 榆 紫 草 按 试 验 安 排 加 乙 醇 浸 泡 60min, 回 流 提 取, 回 收 乙 醇, 减 压 浓 缩 至 约 200ml, 过 滤 后 置 250ml 容 量 瓶, 精 密 称 取 冰 片 溶 于 95% 的 乙 醇 中 与 其 混 匀, 定 容 2 工 艺 研 究 2.1 工 艺 路 线 醇 提 中 药 药 材 药 渣 醇 提 液 旋 蒸 浓 缩 液 抽 滤 沉 淀 物 滤 液 定 量 药 液 制 备 加 入 溶 解 于 95% 乙 醇 的 冰 片 待 测 液 喷 雾 剂 阿 魏 酸 含 量 常 规 质 量 研 究 图 1 工 艺 路 线 示 意 图 2.2 提 取 工 艺 条 件 的 筛 选 阿 魏 酸 含 量 测 定 方 法 的 确 定 : 本 试 验 选 用 阿 魏 酸 作 为 定 量 指 标, 进 行 了 方 法 学 考 察 线 性 范 围 的 考 察 : 精 密 称 取 阿 魏 酸 对 照 品 5mg, 置 25ml 容 量 瓶 中, 用 65% 甲 醇 超 声 溶 解, 定 容 至 刻 度 精 密 吸 取 0.5,1.0,1.5,2.0,2.5, 图 2 阿 魏 酸 标 准 曲 线 157

163 3.0ml 对 照 品 溶 液, 分 别 吸 取 每 组 对 照 品 溶 液 10μl 进 样, 测 定 峰 面 积 积 分 值 (y) 用 峰 面 积 积 分 值 对 浓 度 (x) 进 行 回 归, 得 直 线 回 归 方 程 ( 见 式 (1) 和 标 准 曲 线 ( 见 图 2)) 每 次 进 样 10μl, 对 峰 面 积 y 进 行 线 性 回 归, 得 回 归 方 程 : y=22671x (r=0.9998) (1) 线 性 范 围 :0.01~0.06mg/ml 范 围 内 成 良 好 的 线 性 关 系 精 密 度 试 验 : 精 密 吸 取 对 照 品 溶 液 ( 阿 魏 酸 浓 度 0.06mg/ml)10μl 进 样, 重 复 6 次, 记 录 所 测 定 阿 魏 酸 的 峰 面 积 积 分 值, 阿 魏 酸 的 RSD 为 1.41%, 表 明 仪 器 的 精 密 度 良 好 稳 定 性 试 验 : 取 某 样 品 测 定 液, 按 0,2,4,8,24h 不 同 时 间 间 隔 进 样, 测 定 阿 魏 酸 的 峰 面 积 积 分 值, 计 算 RSD 为 1.46%, 结 果 表 明 样 品 测 定 液 中 阿 魏 酸 在 24h 内 稳 定 阴 性 对 照 实 验 : 阴 性 提 取 液 ( 处 方 中 缺 当 归 药 材 ), 按 提 取 物 测 定 液 的 制 备 方 法 制 备 供 试 液, 进 样 测 定 结 果 其 色 谱 在 阿 魏 酸 相 应 保 留 时 间 无 峰, 说 明 处 方 中 其 他 成 分 对 测 定 结 果 无 干 扰 ( 见 图 4) 当 归 药 材 试 验 : 精 密 称 取 当 归 粉 末 0.25g( 三 批 ) 测 得 阿 魏 酸 的 峰 面 积 积 分 值 计 算 得 当 归 药 材 中 阿 魏 酸 的 百 分 含 量 为 0.051% ( 药 典 规 定 阿 魏 酸 的 含 量 总 量 不 得 低 于 0.050%) 见 表 采 用 L 9 (3 4 ) 表 作 正 交 试 验 因 素 水 平 : 根 据 药 材 所 含 有 效 成 分 的 化 学 性 质, 选 用 L 9 ( 3 4 ) 正 交 设 计 表 安 排 实 验 其 水 平 因 素 表 见 表 2 表 2 提 取 试 验 因 素 水 平 水 平 因 素 溶 剂 用 量 / 倍 A 乙 醇 浓 度 /% B 提 取 时 间 /min C 提 取 次 数 / 次 D 试 验 方 法 及 结 果 : 按 L 9 (3 4 ) 正 交 表 方 案 安 排 试 验 以 原 处 方 量 比 例 (0.4 倍 量 ) 称 取 当 归 地 榆 紫 草, 按 试 验 安 排 加 乙 醇 浸 泡 60min, 回 流 提 取, 回 收 乙 醇, 减 压 浓 缩 至 约 250ml, 用 15g 硅 藻 土 加 水 进 行 抽 滤, 制 成 滤 饼 将 药 液 倒 在 滤 饼 上 进 行 抽 滤, 倒 入 250ml 容 量 瓶 中 定 容 取 滤 液 8ml 至 离 心 管 中,4000r/min 离 心 20min, 得 上 清 液 精 密 吸 取 5ml 上 清 液 置 于 10ml 容 量 瓶 中, 定 容, 用 0.45μm 微 孔 滤 膜 过 滤 后 取 10μl 进 样, 记 录 所 测 定 阿 魏 酸 的 峰 面 积 积 分 值 ( 见 图 11), 计 算 阿 魏 酸 含 量 结 果 见 表 3 表 3 提 取 工 艺 条 件 L 9 ( 3 4 ) 正 交 试 验 结 果 实 验 号 因 素 1A 2B 3C 4D 阿 魏 酸 /(μg/ml) 1 1(10 倍 ) 1(30%) 1(60min) 1(1 次 ) (50%) 2(120 min) 2(2 次 ) (70%) 3(180 min) 3(2 次 ) (12 倍 ) (14 倍 ) K K K A 2 B 3 C 2 D 1 R 试 验 结 果 的 统 计 分 析 : 极 差 分 析 : 由 表 3 中 的 R 值 可 知, 影 响 阿 魏 酸 含 量 因 素 的 大 小 顺 序 均 为 B>C>A>D 乙 醇 浓 度 是 重 要 影 响 因 素, 提 取 时 间 溶 剂 用 量 和 提 取 次 数 次 之 表 1 当 归 药 材 中 阿 魏 酸 的 含 量 测 定 批 号 阿 魏 酸 含 量 / (mg/g) 阿 魏 酸 含 量 /% 平 均 方 差 分 析 : 采 用 国 际 通 用 SAS 统 计 软 件 对 正 交 试 验 结 果 进 行 方 差 分 析, 结 果 见 表 4 由 方 差 158

164 分 析 结 果 可 知, 因 素 B 有 显 著 性, 即 乙 醇 浓 度 对 阿 魏 酸 含 量 有 影 响, 结 合 R 值, 取 B 3 ;A C D 均 无 显 著 性, 水 平 可 任 取 按 生 产 实 际 中 降 低 消 耗, 提 高 效 率 的 原 则, 确 定 较 优 的 提 取 工 艺 条 件 为 A 3 B 3 C 2 D 1, 即 加 入 14 倍 量 的 70% 乙 醇, 回 流 提 取 提 取 1 次, 时 间 为 120min 表 4 方 差 分 析 分 析 结 果 Source SS Df MS F P B C 误 差 * 总 注 :* 因 素 A D 的 变 异 作 为 误 差 项 较 优 提 取 工 艺 的 验 证 : 按 上 述 较 优 工 艺 条 件 进 行 试 验 验 证 (n=4), 结 果 见 表 5 阿 魏 酸 的 平 均 含 量 为 21.24μg/ml, 表 明 所 确 定 的 较 优 工 艺 合 理 可 行 2.3 喷 雾 剂 的 制 备 3 质 量 研 究 3.1 含 量 测 定 加 样 回 收 率 试 验 : 精 密 吸 取 已 知 含 量 的 同 一 批 喷 雾 剂 样 品 6 份, 每 份 5.00ml, 分 别 各 精 密 加 入 5.00ml 阿 魏 酸 对 照 品 溶 液 ( 浓 度 :0.05mg/ml), 混 匀 按 上 述 样 喷 雾 剂 样 品 测 定 液 的 制 备 方 法 制 备 测 试 夜, 进 样 10μl, 测 定 峰 面 积 积 分 值, 并 以 公 式 (2) 计 算 回 收 率 结 果 见 表 6 阿 魏 酸 测 得 量 样 品 中 阿 魏 酸 的 量 阿 魏 酸 回 收 率 (%)= (2) 加 入 的 阿 魏 酸 对 照 品 的 量 表 6 阿 魏 酸 的 回 收 率 实 测 峰 回 收 率 序 号 实 测 阿 魏 酸 量 /mg 样 品 中 阿 魏 酸 量 /mg 加 入 阿 魏 酸 量 /mg 面 积 % 平 均 回 收 率 % 样 品 含 量 测 定 : 取 4 批 喷 雾 剂 样 品, 每 批 取 3 份, 按 上 述 喷 雾 剂 样 品 测 定 液 的 制 备 方 法 制 备 供 试 液,10μl 进 样, 测 定 峰 面 积 积 分 值, 计 算 阿 魏 酸 含 量, 结 果 见 表 7 表 7 样 品 测 定 结 果. 批 号 样 品 号 峰 面 积 * 阿 魏 酸 含 量 /(μg/ml) 批 内 RSD/% 注 :* 阿 魏 酸 含 量 为 喷 雾 剂 样 品 被 稀 释 一 倍 后 的 含 量 表 5 较 优 工 提 取 工 艺 的 验 证 结 果 序 号 阿 魏 酸 含 量 /(μg/ml) 平 均 RSD% 159

165 图 3 阿 魏 酸 对 照 品 HPLC 图 谱 图 4 阴 性 对 照 HPLC 图 谱 图 5 当 归 药 材 HPLC 图 谱 (a. 阿 魏 酸 ) 图 6 紫 云 喷 雾 剂 提 取 液 HPLC 图 谱 (a. 阿 魏 酸 ) 4 讨 论 与 结 论 4.1 讨 论 提 取 工 艺 方 面 : 将 醇 提 液 回 收 乙 醇 浓 缩 后, 需 过 滤, 但 浓 缩 液 粘 度 较 大, 在 过 滤 时 很 困 难, 速 度 很 慢 为 了 解 决 这 一 问 题, 采 用 硅 藻 土 作 助 滤 剂, 取 得 了 较 好 的 效 果, 过 滤 速 度 大 大 提 高, 节 省 了 时 间 含 量 测 定 方 面 : 进 行 阿 魏 酸 含 量 测 定 时 参 考 有 关 文 献, 比 较 了 不 同 流 动 相, 如 甲 醇 - 水 甲 醇 - 冰 醋 酸 等 溶 剂 系 统, 结 果 以 甲 醇 1% 冰 醋 酸 (32:68) 条 件 下 分 离 效 果 最 好, 杂 质 干 扰 较 小, 阿 魏 酸 的 保 留 时 间 约 为 10min 在 测 定 提 取 液 中 阿 魏 酸 含 量 时, 采 用 了 甲 醇 制 备 测 试 液 由 于 方 法 的 实 验 步 骤 简 单 易 行, 而 且 节 约 能 源 所 以 选 用 此 方 法 作 为 提 取 液 测 定 液 的 制 备 方 法 4.2 结 论 本 文 根 据 处 方 的 功 能 主 治 和 处 方 中 各 中 药 成 分 的 理 化 性 质, 结 合 处 方 中 各 中 药 的 药 理 研 究 及 临 床 用 药 要 求, 采 用 正 交 设 计 方 法 对 紫 云 喷 雾 剂 的 提 取 工 艺 和 制 剂 成 型 工 艺 进 行 了 筛 选 其 最 佳 提 取 工 艺 为 加 入 14 倍 量 的 70% 的 乙 醇 浸 泡 原 料 药 60min, 回 流 提 取 120min, 提 取 次 数 为 1 次 同 时, 在 提 取 工 艺 的 研 究 中, 建 立 了 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 紫 云 喷 雾 剂 中 阿 魏 酸 含 量 的 方 法, 为 确 保 研 究 数 据 的 可 靠 性, 本 试 验 对 其 方 法 学 进 行 了 研 究 其 中 阿 魏 酸 在 0.01~0.06mg /ml 范 围 内 与 峰 面 积 积 分 值 呈 良 好 的 线 性 关 系,r=0.9998, 平 均 回 收 率 =97.40%,RSD= 1.09% 结 果 表 明 : 该 工 艺 简 便 合 理 可 行 ; 所 建 立 的 定 量 检 测 方 法 能 准 确 快 速 地 对 紫 云 喷 雾 剂 中 阿 魏 酸 的 含 量 进 行 测 定 图 7 紫 云 喷 雾 剂 样 品 HPLC 图 谱 (a. 阿 魏 酸 ) 参 考 文 献 ( 略 ) 160

166 空 气 中 异 丁 烷 气 体 标 准 物 质 的 研 制 袁 岭 ( 天 津 市 化 学 试 剂 四 厂, 天 津 ) 本 文 论 述 了 用 比 较 法 对 空 气 中 异 丁 烷 气 体 标 准 物 质 的 制 备, 并 以 气 相 色 谱 法 对 其 均 匀 性 和 稳 定 性 进 行 考 察 证 明 达 到 国 家 二 级 气 体 标 准 物 质 要 求, 研 制 方 法 可 行, 量 值 准 确 可 靠 1 前 言 空 气 中 异 丁 烷 气 体 标 准 物 质 广 泛 用 于 石 油 化 工 环 境 监 测 等 领 域, 更 用 于 气 体 安 全 报 警 仪 的 校 准 和 检 测 本 文 详 细 介 绍 了 瓶 装 空 气 中 异 丁 烷 标 准 样 品, 其 组 分 含 量 为 i-c4h10 0.1% 1.0% (mol/mol) 的 标 准 气 体 的 制 备 方 法 定 值 方 法 及 不 确 定 度 的 合 成 方 法 2 标 准 气 体 的 制 备 2.1 气 体 的 充 填 装 置 配 制 气 体 中 使 用 的 装 置 是 本 单 位 自 行 设 计 制 造 的 该 装 置 由 真 空 泵 压 差 计 压 力 表 气 路 系 统 气 瓶 连 接 部 件 组 成 气 路 系 统 由 高 压 中 压 和 低 压 真 空 系 统 三 部 分 组 成 可 使 组 分 气 体 和 稀 释 气 体 的 充 填 彼 此 独 立, 避 免 相 互 污 染, 整 个 系 统 气 密 性 良 好 2.2 气 瓶 的 预 处 理 本 实 验 采 用 国 产 4 升 钢 瓶 作 包 装 容 器, 配 气 之 前 气 瓶 经 清 洗 加 热 及 抽 真 空 处 理, 检 查 钢 瓶 处 于 完 好 状 态 方 可 使 用 2.3 气 体 的 制 备 将 预 处 理 好 的 钢 瓶 接 到 配 起 系 统 中, 跟 据 分 压 法 配 置 空 气 中 含 异 丁 烷 气 体, 其 浓 度 分 别 为 0.1% 和 1.0% 各 两 瓶 配 气 用 纯 气 的 含 量 分 别 为 i-c4h10(99.9%), N2(99.999%), O2(99.99%) 3 标 准 气 体 的 定 值 本 实 验 采 用 SP-2100 气 相 色 谱 仪 作 高 精 度 比 较 分 析 法, 该 方 法 通 过 测 量 一 级 气 体 标 准 物 的 色 谱 峰 面 积 和 待 定 值 气 体 标 准 物 的 色 谱 峰 面 积 待 测 气 体 摩 尔 分 数 的 相 对 标 准 偏 差 是 由 一 级 气 体 摩 尔 分 数 的 相 对 标 准 偏 差 以 及 在 色 谱 仪 上 一 级 气 体 的 峰 面 积 的 测 量 相 对 标 准 偏 差 和 待 测 气 体 峰 面 积 测 量 相 对 标 准 偏 差 合 成 而 得 到 的 将 S 乘 以 包 含 因 子 (K=2, 相 对 置 信 概 率 95%) 即 可 得 到 待 测 气 体 摩 尔 分 数 的 不 确 定 度 表 中 列 出 空 气 中 异 丁 烷 标 准 气 体 ( 瓶 号 为 ) 以 及 待 测 气 体 ( 瓶 号 为 ) 的 色 谱 分 析 数 据, 样 品 定 值 数 据 见 表 1 161

167 表 1 样 品 定 值 数 据 表 样 品 编 号 X X 色 谱 峰 面 积 /ml X X X X 面 积 平 均 值 X/mL 面 积 测 定 的 标 准 偏 差 S/mL 面 积 测 定 的 相 对 标 准 偏 差 S/X 0.5% 0.3% 0.4% 0.6% 根 据 测 得 色 谱 峰 面 积 按 下 式 定 值 : C2=C1 S 样 S 标 式 中 :C 一 级 气 体 的 摩 尔 分 数 ; S 标 一 级 气 体 的 色 谱 峰 面 积 ; S 样 待 测 气 体 的 色 谱 峰 面 积 ; C 待 测 气 体 的 摩 尔 分 数 如 果 S1 S2 S3 S4 分 别 表 示 C1 C2 S 标 S 样 的 测 量 标 准 偏 差, 则 有 ( S2 =( S1 C2 )2 C1 )2 +( S3 ) S 标 2 +( S4 S 样 待 测 气 体 的 摩 尔 分 数 及 相 对 标 准 偏 差 见 表 2 表 2 ) 2 待 测 气 体 的 摩 尔 分 数 及 相 对 标 准 偏 差 钢 瓶 编 号 C2 ( S2 C2 )2 S2 C2 U % % 故 待 测 气 体 的 摩 尔 分 数 为 其 相 对 不 确 定 度 为 2%, 待 测 气 体 的 摩 尔 分 数 为 其 相 对 不 确 定 度 为 2% 4 标 准 气 样 均 匀 性 和 稳 定 性 的 考 察 4.1 标 准 气 样 的 均 匀 性 考 察 标 准 气 体 混 合 均 匀 的 程 度, 直 接 影 响 标 准 样 品 组 分 含 量 的 准 确 性 也 是 评 价 分 压 法 配 气 准 确 性 的 依 据 之 一 为 此 分 别 配 制 两 组 空 气 中 含 异 丁 烷 气 体 的 样 品 配 制 完 毕 后, 立 即 进 行 均 化 处 理 半 小 时, 并 用 色 谱 仪 检 测 样 品 中 异 丁 烷 组 分 含 量 的 变 化 情 况, 均 匀 性 实 验 结 果 见 表 3 表 3 均 匀 性 实 验 结 果 钢 瓶 编 号 组 分 i-c4h1% i-c4h10% i-c4h10% i-c4h10% i-c4h10% i-c4h10% 均 化 处 理 后 考 查 时 间 再 静 置 两 小 时 后 再 静 置 四 小 时 后 实 验 结 果 表 明 样 品 气 配 制 好 后, 经 半 小 时 均 化 处 理 已 经 混 均 162

168 4.2 标 准 气 样 的 稳 定 性 考 察 稳 定 性 是 标 准 气 体 的 一 项 十 分 重 要 的 特 性 指 标, 本 课 题 用 GC 法 对 两 种 含 量 的 标 准 气 体 随 时 间 和 压 力 变 化 其 量 值 的 稳 定 性 进 行 为 期 一 年 的 考 察, 其 结 果 见 表 4 表 5 表 4 含 异 丁 烷 1% 标 准 气 样 稳 定 性 的 实 验 结 果 瓶 号 编 号 考 察 时 间 及 分 析 结 果 平 均 值 X 标 准 偏 差 S 不 确 定 度 % 表 5 含 异 丁 烷 0.1% 标 准 气 样 稳 定 性 的 实 验 结 果 钢 瓶 编 号 考 察 时 间 及 分 析 结 果 平 均 值 X 标 准 偏 差 S 不 确 定 度 % 由 结 果 表 明, 标 准 气 体 浓 度 值 的 变 化 在 分 析 方 法 误 差 范 围 之 内, 考 察 期 内 组 分 的 量 值 是 稳 定 的 4.3 标 准 气 样 组 分 随 压 力 变 化 其 稳 定 性 考 察 本 实 验 对 配 制 好 的 两 组 气 样, 用 GC 仪 分 别 对 i-c4h10 组 分 进 行 测 定, 实 验 压 力 分 别 选 定 为 8MPa, 6MPa, 4MPa, 2MPa, 和 0.5MPa 其 结 果 见 表 6 表 7: 163

169 表 6 含 量 1% 标 准 气 样 中 含 量 随 压 力 变 化 的 考 察 结 果 钢 瓶 编 号 压 力 MPa i-c4h10% i-c4h10% i-c4h10% i-c4h10% 分 析 值 平 均 值 X 标 准 偏 差 S 不 确 定 度 % 表 7 含 量 0.1% 标 准 气 样 中 含 量 随 压 力 变 化 的 考 察 结 果 钢 瓶 编 号 压 力 MPa i-c4h10% i-c4h10% i-c4h10% i-c4h10% 分 析 值 平 均 值 X 标 准 偏 差 S 不 确 定 度 % 由 实 验 结 果 表 明, 空 气 中 异 丁 烷 标 准 气 的 含 量 值 的 变 化 在 分 析 误 差 范 围 之 内 5 结 论 本 课 题 采 用 国 产 钢 瓶 贮 装 的 组 分 含 量 为 i-c4h10% 0.1% 1.0% (mol/mol) 的 空 气 中 异 丁 烷 标 准 气 样 品, 经 一 年 的 考 察 实 验 表 明 组 分 含 量 稳 定 参 考 文 献 [ 1 ] GB/T , 气 体 分 析 校 准 用 混 合 气 的 制 备 压 力 法 [ 2 ] 全 浩 韩 永 志 主 编 标 准 物 质 及 其 应 用 技 术 北 京 : 中 国 标 准 出 版 社,2002 [ 3 ] 金 美 兰 赵 建 南 编 著 标 准 气 体 及 其 应 用 北 京 : 化 学 工 业 出 版 社,2003 [ 4 ] 韩 永 志, 标 准 物 质 手 册,1998 年 The air in the standard gas isobutane of material YUAN Ling (Tianjin Forth Chemical Reagent Factory, Tianjin ) Abstract: The paper discusses the method of using standard gas air isobutane material preparation, and by gas chromatography for its uniformity and stability. Prove to national standard material requirements, gas energy method is feasible and reliable. Keywords: air, gas isobutane standard substance and developed 164

170 室 内 环 境 空 气 中 TVOC 测 定 注 意 要 点 闫 卿 卿, 苏 广 志, 杨 绍 康 ( 天 津 市 房 屋 质 量 安 全 鉴 定 检 测 中 心, 天 津 ) 从 TVOC 定 量 重 复 性 和 TVOC 分 析 的 检 测 灵 敏 度 两 方 面 入 手, 讨 论 了 在 TVOC 分 析 测 定 过 程 中 需 要 注 意 的 问 题 TVOC( 总 挥 发 性 有 机 物 ); 重 复 性 ; 灵 敏 度 ; 热 解 析 对 于 室 内 空 气 质 量 标 准 中 主 要 的 五 项 分 析 项 目 的 检 测, 应 该 说 最 难 掌 握 和 难 以 做 得 好 的 是 室 内 空 气 中 总 挥 发 性 有 机 物 ( TVOC ) 的 热 解 析 / 毛 细 管 气 相 色 谱 分 析 尽 管 在 民 用 建 筑 工 程 室 内 环 境 污 染 控 制 规 范 中 和 GB/T 室 内 空 气 质 量 标 准 中 都 介 绍 了 TVOC 分 析 的 原 理 方 法 然 而, 在 实 际 操 作 应 用 中 都 不 易 做 好, 存 在 不 少 具 体 问 题 归 纳 起 来, 主 要 存 在 二 大 类 问 题 : 定 量 分 析 重 复 性 做 不 好, 实 质 上 也 就 反 映 了 分 析 准 确 度 差 检 测 灵 敏 度 低, 标 准 规 定 的 最 低 检 测 限 0.5 μ g/m 3, 往 往 达 不 到 我 们 做 了 大 量 试 验 研 究, 总 结 出 以 下 注 意 要 点, 供 提 供 开 展 室 内 空 气 中 TVOC 分 析 检 测 的 工 作 者 参 考 1 关 于 TVOC 定 量 分 析 重 复 性 问 题 1.1 标 样 取 样 方 法 由 于 空 气 中 TVOC 的 定 量 方 法 是 采 用 外 标 法, 需 用 液 体 标 样 或 气 体 标 样 气 体 标 样 国 内 还 在 有 关 单 位 攻 关, 国 内 尚 无 商 品 供 应, 自 行 配 置 TVOC 气 体 标 样 较 难, 不 易 配 置 准 确 所 以, 基 本 上 是 采 用 色 谱 纯 物 质 精 密 天 平 秤 重 法 配 制 TVOC 液 体 标 样 标 准 中 只 简 单 地 写 一 句 话 : 采 用 液 体 外 标 法 或 气 体 外 标 法 将 其 定 量 注 入 吸 附 管 在 实 际 操 作 中, 如 何 将 标 样 百 分 之 百 地 注 入 吸 附 管 ( 即 标 样 取 样 方 法 ) 是 不 可 忽 视 的, 将 直 接 影 响 TVOC 定 量 分 析 的 重 复 性 1.2 正 确 选 用 毛 细 柱 众 所 周 知, 采 用 小 口 径 毛 细 柱 就 必 须 进 行 分 流 进 样, 而 对 于 复 杂 组 份 的 毛 细 柱 分 流 进 样 法 就 较 难 做 好 定 量 重 复 性 实 践 证 明, 采 用 分 离 性 能 较 好 的 大 口 径 毛 细 柱, 不 分 流 的 直 接 进 样 法, 可 获 得 很 好 的 重 复 性 1.3 仪 器 程 序 升 温 的 重 复 性 由 于 TVOC 分 析 必 须 采 用 柱 箱 程 序 升 温 来 解 决 组 份 分 离, 因 此, 气 相 色 谱 仪 器 中 柱 箱 程 序 升 温 的 重 复 性 及 控 温 精 度 就 十 分 重 要, 将 直 接 影 响 TVOC 的 定 性 定 量 重 复 性 1.4 TVOC 吸 附 管 热 解 析 进 样 方 法 热 解 析 分 析 的 原 理 是 吸 附 管 采 样 后, 将 吸 附 管 加 热, 解 析 挥 发 性 有 机 物, 将 待 测 组 份 随 载 气 进 入 毛 细 管 气 相 色 谱 仪 然 而, 在 具 体 操 作 上, TVOC 吸 附 管 热 解 析 进 样 有 二 种 方 法 :(1) 将 吸 附 管 置 入 加 热 炉 并 通 载 气, 由 载 气 将 TVOC 组 份 解 析 到 100ml 的 大 针 筒 中 ( 即 TVOC 气 样 采 集 ) 然 后 用 小 针 筒 ( 1ml 注 射 器 ) 从 大 针 筒 中 取 样 后 注 入 气 相 色 谱 仪 汽 化 室, 或 用 10ml 注 射 器 从 大 针 筒 中 取 样 后 再 注 入 六 通 阀 中 定 量 管, 再 用 切 换 六 通 阀, 实 现 定 体 积 气 体 进 样 这 种 方 法, 我 们 称 谓 针 筒 取 样 进 样 法 ;(2) 将 TVOC 吸 附 管 置 于 300 的 加 热 炉 中 将 TVOC 组 份 热 解 析 并 连 接 六 通 阀 直 接 注 入 气 相 色 谱 仪 汽 化 室, 这 种 方 法, 我 们 称 谓 热 解 析 直 接 进 样 法 显 然, 从 理 论 分 析 和 实 践 证 明 针 筒 取 样 进 样 法 是 根 本 做 不 好 重 复 性 的, 只 有 热 解 析 直 接 进 样 法 可 保 证 做 好 TVOC 分 析 的 重 复 性 165

171 2 关 于 TVOC 分 析 的 检 测 灵 敏 度 问 题 2.1 热 解 析 进 样 方 法 从 上 所 述, 采 用 热 解 析 后 针 筒 取 样 进 样 法, 方 法 本 身 就 将 TVOC 样 品 经 载 气 稀 释 了 100 倍, 实 质 是 减 小 了 进 样 量 因 此 标 准 规 定 的 最 低 检 测 限 0.5 μ g/m 3 就 往 往 难 以 达 到 而 采 用 热 解 析 直 接 进 样 法, 是 将 采 集 到 吸 附 管 中 的 TVOC 组 份, 全 部 注 入 了 色 谱 柱 系 统, 只 要 仪 器 的 敏 感 度 达 到 Mt g /s 的 技 术 指 标, 实 践 证 明 完 全 可 以 达 到 标 准 规 定 的 要 求 : 0.5 μ g/m 影 响 氢 焰 检 测 器 ( FID ) 检 测 灵 敏 度 的 因 素 ( 1 )N 2 /H 2 的 流 量 比 ;( 2 ) 空 气 的 流 量 大 小 ; ( 3) 咀 的 孔 径 大 小 ;( 4 ) 极 化 极 与 喷 咀 口 的 距 离 位 置 ; ( 5 ) 放 大 器 输 入 高 阻 大 小 ;( 6 ) 放 大 器 的 内 衰 减 以 上 因 素, 有 的 是 仪 器 的 设 计 参 数, 有 的 是 使 用 者 操 作 参 数, 只 要 认 识 和 熟 悉 其 影 响 灵 敏 度 的 规 律, 正 确 选 择 这 些 参 数, 就 可 获 得 最 佳 检 测 灵 敏 度 3 总 结 室 内 空 气 中 总 挥 发 性 有 机 物 ( TVOC ) 的 热 解 析 / 毛 细 管 气 相 色 谱 分 析, 要 做 好 定 量 分 析 重 复 性, 要 达 到 标 准 规 定 的 精 密 度 准 确 度 和 检 测 下 限, 就 必 须 正 确 选 用 热 解 析 直 接 进 样 装 置, 要 采 用 正 确 的 标 样 取 样 方 法, 要 正 确 选 用 毛 细 柱, 要 正 确 选 择 气 相 色 谱 仪 并 将 色 谱 分 析 条 件 调 试 到 最 佳 灵 敏 度 状 态 The Points to be Noted of the TVOC Analysis In Indoor Environment Air YAN Qing-qing,SU Guang-zhi,YANG Shao-kang ( Tianjin Housing Center for Envaluation and Inspection of Quality & Safety Tianjin ) Abstract: TVOC from the TVOC analysis of quantitative reproducibility and detection sensitivity of two-pronged approach, discussed in TVOC analysis of the Determination of issues that required attention. Key Words: TVOC(total volatility organic compound); repeatability; sensibility; the analytic of theory of heat. 166

172 氮 中 甲 烷 乙 烷 丙 烷 和 正 丁 烷 混 合 气 体 标 准 物 质 的 研 制 袁 岭 ( 天 津 市 化 学 试 剂 四 厂, 天 津 ) 本 文 论 述 了 氮 中 甲 烷 乙 烷 丙 烷 和 正 丁 烷 混 合 气 体 标 准 物 质 的 制 备 方 法, 均 匀 性 稳 定 性 和 压 力 递 减 后 组 分 含 量 的 变 化 情 况, 定 值 结 果 及 不 确 定 度 的 估 计 1 前 言 氮 中 甲 烷 乙 烷 丙 烷 和 正 丁 烷 混 合 气 体 标 准 物 质 ( 以 下 简 写 为 CH 4 -C 2 H 6 - C 3 H 8 -n-c 4 H 10 /N 2 ) 主 要 用 于 油 田 开 采 中 录 井 仪 的 检 测 和 钻 井 初 期 对 采 集 样 品 中 主 要 成 分 的 含 量 分 析 为 了 确 保 该 气 体 标 准 物 质 的 质 量 和 技 术 水 平, 对 该 标 准 物 质 研 制 显 得 十 分 重 要 本 文 研 究 了 瓶 装 的 甲 烷 乙 烷 丙 烷 和 正 丁 烷 混 合 气 体 标 准 物 质, 其 组 分 含 量 CH 4 :10%; C 2 H 6 :2.5%;C 3 H 8 :2.5%;n-C 4 H 10 :2.5% 并 对 其 稳 定 性 均 匀 性 和 压 力 递 减 后 组 分 含 量 的 变 化 进 行 了 考 察, 给 出 了 总 不 确 定 度 2 混 合 气 体 标 准 物 质 的 制 备 2.1 方 法 原 理 CH 4 - C 2 H 6 - C 3 H 8 - n-c 4 H 10 /N 2 混 合 气 体 标 准 物 质 按 照 国 家 标 准 GB 气 体 分 析 校 准 用 混 合 气 体 的 制 备 称 重 法 制 备, 它 是 以 经 典 的 称 量 法 为 基 础, 以 国 际 单 位 制 质 量 为 基 准 的 绝 对 法, 是 国 际 上 公 认 的 标 准 方 法 配 制 时 用 精 密 标 准 天 平 分 别 称 量 充 入 钢 瓶 中 的 组 分 气 和 稀 释 气 的 质 量, 然 后 根 据 它 们 的 质 量 确 定 其 含 量, 混 合 气 体 标 准 物 质 的 组 分 含 量 定 义 为 组 分 气 的 物 质 的 量 ( 摩 尔 ) 与 混 合 气 的 总 物 质 的 量 之 比, 即 : X i = n i n 式 中 X i 为 组 分 i 的 物 质 的 量 分 数 ;n i 为 组 分 i 的 物 质 的 量 ;n 为 混 合 气 体 总 物 质 的 量 2.2 混 合 气 体 标 准 物 质 的 制 备 CH 4 - C 2 H 6 - C 3 H 8 - n-c 4 H 10 /N 2 混 合 气 体 标 准 物 质 是 以 甲 烷 99.95%, 乙 烷 99.9%, 丙 烷 99.9%, 正 丁 烷 99.9%, 高 纯 氮 % 为 原 料 气, 采 用 称 量 法 配 制 而 成 的 称 量 天 平 为 上 海 第 二 天 平 仪 器 厂 生 产 的 TG320 型 精 密 标 准 机 械 天 平, 最 大 称 量 20kg, 最 小 分 度 值 10mg 配 气 称 量 时 一 律 采 用 替 代 法, 它 不 仅 可 以 消 除 天 平 的 不 等 臂 误 差, 而 且 还 可 以 减 少 浮 力 以 及 钢 瓶 吸 附 水 对 称 量 的 影 响 配 气 装 置 和 气 瓶 预 处 理 装 置 为 我 单 位 设 计 加 工 的, 配 气 装 置 设 计 合 理, 气 密 性 好, 能 够 满 足 配 气 要 求, 气 瓶 经 过 多 次 抽 真 空 加 热, 填 充 高 纯 气 置 换 处 理 后 方 可 使 用 3 混 合 气 体 标 准 物 质 性 能 检 验 3.1 混 合 气 体 标 准 物 质 均 匀 性 检 验 CH 4 - C 2 H 6 - C 3 H 8 - n-c 4 H 10 /N 2 混 合 气 体 标 准 物 质 的 均 匀 程 度, 将 直 接 影 响 标 准 气 体 组 分 含 量 的 准 确 性, 为 此 将 标 准 物 质 配 制 好 后 立 即 进 行 均 化 处 理 1 小 时 后 分 析, 观 察 气 体 组 成 的 变 化 情 况, 结 果 列 于 表 1 167

173 表 1 CH 4 - C 2 H 6 - C 3 H 8 - n-c 4 H 10 /N 2 均 匀 性 检 验 数 据 ( 单 位 :mol/ mol) 瓶 号 组 分 CH 4 C 2 H 6 C 3 H 8 n-c 4 H 10 均 匀 化 处 理 后 1 小 时 10.1% 2.57% 2.50% 2.56% 再 静 置 1 小 时 后 10.2% 2.55% 2.51% 2.55% 再 静 置 2 小 时 后 10.1% 2.56% 2.51% 2.55% 实 验 结 果 表 明,CH 4 - C 2 H 6 - C 3 H 8 - n-c 4 H 10 /N 2 混 合 气 配 制 完 毕 后, 通 过 均 匀 化 处 理 1 小 时 后 即 可 处 于 均 匀 状 态 3.2 混 合 气 体 标 准 物 质 稳 定 性 检 验 稳 定 性 是 标 准 物 质 的 一 项 十 分 重 要 的 特 性 指 标, 我 们 采 用 气 相 色 谱 法 对 CH 4 - C 2 H 6 - C 3 H 8 - n-c 4 H 10 /N 2 标 准 物 质 稳 定 性 进 行 了 下 列 两 种 实 验 混 合 气 体 组 分 含 量 随 时 间 变 化 的 实 验 表 2 在 一 年 内 分 析 了 CH 4 - C 2 H 6 - C 3 H 8 - n-c 4 H 10 /N 2 标 准 物 质 含 量 随 时 间 变 化 的 情 况, 结 果 列 于 表 2 稳 定 性 检 验 数 据 ( 单 位 :mol/ mol) 瓶 号 组 分 名 称 CH 4 C 2 H 6 C 3 H 8 n-c 4 H % 2.53% 2.56% 2.55% % 2.52% 2.54% 2.56% % 2.51% 2.56% 2.56% % 2.51% 2.55% 2.54% % 2.53% 2.55% 2.55% 分 析 时 间 及 结 果 % 2.52% 2.57% 2.55% % 2.52% 2.57% 2.56% % 2.51% 2.56% 2.54% % 2.53% 2.56% 2.56% % 2.52% 2.55% 2.55% % 2.52% 2.55% 2.55% % 2.51% 2.57% 2.56% 平 均 值 10.3% 2.52% 2.56% 2.55% 标 准 偏 差 u 0.12% 0.24% 0.39% 0.31% 稳 定 性 由 表 2 的 数 据 可 知 CH 4 - C 2 H 6 - C 3 H 8 - n-c 4 H 10 /N 2 混 合 气 体 标 准 物 质 在 一 年 内 是 稳 定 可 靠 的 混 合 气 体 组 分 含 量 随 压 力 变 化 的 实 验 为 了 检 验 组 分 含 量 随 压 力 的 变 化 情 况, 并 确 定 标 准 混 合 气 的 使 用 压 力 下 限, 分 析 了 4.0~0.2Mpa CH 4 - C 2 H 6 - C 3 H 8 - n-c 4 H 10 /N 2 标 准 混 合 气 组 分 含 量 的 变 化 情 况, 其 结 果 列 于 表 3 4 总 不 确 定 度 的 分 析 及 估 算 4.1 原 料 纯 度 的 不 确 定 度 根 据 气 相 色 谱 法 对 原 料 气 纯 度 分 析, 乙 烷 丙 烷 正 丁 烷 为 99.9%, 由 杂 质 引 入 的 标 准 不 确 定 度 应 为 , 由 甲 烷 杂 质 引 入 的 标 准 不 确 定 度 应 为 , 由 高 纯 氮 中 杂 质 168

174 引 入 的 标 准 不 确 定 度 应 为 , 因 此 可 忽 略 不 计 表 3 稳 定 性 检 验 数 据 ( 单 位 :mol/ mol) 瓶 号 组 分 名 称 CH 4 C 2 H 6 C 3 H 8 n-c 4 H MP a 10.0% 2.57% 2.51% 2.53% 3.0MP a 9.90% 2.56% 2.52% 2.54% 2.0MP a 10.0% 2.58% 2.51% 2.53% 压 力 递 减 后 分 析 结 果 1.0MP a 10.1% 2.57% 2.50% 2.52% 0.8MP a 10.0% 2.58% 2.51% 2.53% 0.6MP a 10.1% 2.57% 2.51% 2.53% 0.4MP a 10.0% 2.56% 2.50% 2.52% 0.2MP a 10.0% 2.57% 2.51% 2.53% 平 均 值 10.0% 2.57% 2.51% 2.53% 标 准 偏 差 由 表 3 的 结 果 表 明 CH 4 - C 2 H 6 - C 3 H 8 - n-c 4 H 10 /N 2 标 准 物 质 组 分 含 量 在 4.0~0.2MPa 较 稳 定 4.2 均 匀 性 引 入 的 不 确 定 度 从 均 匀 性 试 验 数 据 可 以 看 出, 标 准 气 体 在 规 定 时 间 内 加 以 滚 动 混 合 后, 其 组 分 完 全 均 匀 充 分, 由 其 引 入 的 不 确 定 度 可 忽 略 不 计 4.3 稳 定 性 引 入 的 不 确 定 度 经 一 年 的 稳 定 性 试 验, 研 制 的 标 准 气 体 稳 定 性 良 好, 对 氮 中 甲 烷 乙 烷 丙 烷 和 正 丁 烷 混 合 标 准 气 体 最 大 重 复 性 不 超 过 0.4% 4.4 不 确 定 度 的 合 成 标 准 混 合 气 组 分 含 量 不 确 定 度 来 源 于 配 制 称 量 过 程 的 不 确 定 度, 原 料 气 纯 度 分 析 的 不 确 定 度, 稀 释 气 中 i 组 分 含 量 及 其 测 定 的 不 确 定 度, 气 瓶 处 理 引 入 的 不 确 定 度, 气 瓶 和 砝 码 浮 力 修 正 的 不 确 定 度, 标 准 物 质 稳 定 性 引 起 的 不 确 定 度 不 确 定 度 计 算 公 式 如 下 称 量 过 程 中 相 对 不 确 定 度 为 : X X i i m i m i (1 X ) + i m m j j X j 式 中 :m i 为 充 入 气 瓶 中 i 组 分 的 质 量 (g); m j 为 充 入 气 瓶 中 j 组 分 的 质 量 (g); Δm 为 i 组 分 质 量 称 量 的 不 确 定 度 (g); Δm j 为 j 组 分 质 量 称 量 的 不 确 定 度 (g); 标 准 气 体 定 值 的 合 成 标 准 不 确 定 度 为 : u c = u + u + u + u 2 称 量 2 原 料 气 2 稀 释 气 2 稳 定 性 标 准 气 体 定 值 的 扩 展 不 确 定 度 (U) 由 下 式 计 算 得 出 : U = k u (k=2) 根 据 上 述 公 式 计 算 出 混 合 气 体 标 准 物 质 的 扩 展 不 确 定 度 如 表 4 所 示 C 169

175 表 4 CH 4 - C 2 H 6 - C 3 H 8 - n-c 4 H 10 /N 2 定 值 结 果 ( 单 位 :mol/ mol) 序 号 瓶 号 组 分 名 称 定 值 结 果 总 不 确 定 度 % CH % C 2 H % 1.8 C 3 H % 1.6 n-c 4 H % 1.8 CH % C 2 H % 1.7 C 3 H % 1.8 n-c 4 H % 1.8 CH % C 2 H % 1.9 C 3 H % 1.8 n-c 4 H % 1.9 由 表 4 可 以 看 出 该 混 合 气 体 标 准 物 质 总 不 确 定 度 小 于 2.0% 5 结 论 采 用 重 量 法 配 制 的 CH 4 - C 2 H 6 - C 3 H 8 - n-c 4 H 10 /N 2 混 合 气 体 标 准 物 质, 经 过 性 能 试 验 考 察, 组 分 含 量 稳 定, 混 合 气 体 标 准 物 质 总 不 确 定 度 小 于 2.0% 标 准 气 体 使 用 压 力 下 限 为 0.2MPa, 有 效 使 用 期 为 12 个 月 参 考 文 献 [1]GB , 气 体 分 析 - 校 准 用 混 合 气 体 的 制 备 - 称 量 法. [2] 李 春 瑛 等. 标 准 气 体 研 制 过 程 中 的 不 确 定 度 估 算 及 其 表 示 方 法. 低 温 与 特 气,2000,18(3):2. [3] 金 美 兰 等. 标 准 气 体 及 其 应 用. 北 京 : 化 学 工 业 出 版 社,2003. [4] 全 浩 主 编. 标 准 物 质 及 其 应 用 技 术. 北 京 : 国 家 标 准 出 版 社,2003 The development of the standard substance from the mixed gas of methane, ethane, propane and normal butane in nitrogen YUAN Ling (Tianjin Forth Chemical Reagent Factory, Tianjin ) Abstract: The paper is demonstrated to show the preparation method, homogeneity and stability of the standard substance from the mixed gas of methane, ethane, propane and normal butane in nitrogen. Meanwhile, it also provides the analysis on the changes, valuing result and the indeterminacy estimation of the component concentration after the pressure depletion. Key Words: methane, ethane, propane, normal butane, standard substance 170

176 高 纯 CO2 中 微 量 气 体 分 析 气 相 色 谱 仪 的 改 装 张 令 甲 1, 吕 宪 禹 2, 张 钰 浩 3 (1. 山 东 鲁 南 瑞 虹 化 工 仪 器 有 限 公 司, 山 东 ; 2. 南 开 大 学 生 命 科 学 学 院, 天 津 ; 1 前 言 3. 华 北 电 力 大 学 核 科 学 与 工 程 学 院, 北 京 ) 高 纯 C0 2 中 微 量 O 2 N 2 CO 及 CH 4 不 能 直 接 用 通 用 气 相 色 谱 仪 分 析, 因 有 两 大 致 命 弱 点 : 1. O 2 N 2 要 达 到 R>1.5 的 分 离, 需 使 用 分 子 筛 色 谱 柱, 而 分 子 筛 色 谱 柱 对 二 氧 化 碳 有 不 可 逆 吸 附, 二 氧 化 碳 将 让 分 子 筛 色 谱 柱 很 快 失 效, 表 现 为 O 2 N 2 无 法 分 离 ;2. 大 量 的 CO 2 可 使 甲 烷 转 化 炉 中 的 镍 触 媒 中 毒 且 CO 2 的 峰 很 宽 并 有 很 大 托 尾, 分 析 周 期 达 1 小 时 此 问 题 困 扰 着 许 多 色 谱 分 析 工 作 者 通 过 对 通 用 气 相 色 谱 仪 的 巧 妙 改 装, 彻 底 去 除 了 以 上 两 大 致 命 弱 点, 且 一 次 进 样 在 4 分 钟 内 完 成 全 分 析 2 实 验 2.1 仪 器 和 试 剂 1SP-6890 气 相 色 谱 仪 TCD/FID( 山 东 鲁 南 瑞 虹 化 工 仪 器 有 限 公 司 ); 2 标 气 ( 山 东 八 三 标 气 厂 ); 3 镍 触 媒 ( 上 海 国 药 集 团 ) 2.2 仪 器 改 装 采 用 双 阀 三 柱 两 检 一 转 化 模 式 ( 见 图 1) 图 1. 高 纯 CO2 中 微 量 气 体 分 析 气 相 色 谱 仪 改 装 气 路 流 程 图 工 作 过 程 : 被 分 析 的 混 合 气 体, 通 过 进 样 六 通 阀, 被 载 气 1 带 入 预 柱 (TDX-01), 等 O 2 N 2 CO 及 CH 4 离 开 此 柱, 二 氧 化 碳 还 没 有 出 来 时, 切 换 反 吹 六 通 阀, 使 预 柱 处 于 反 吹 壮 态, 将 二 氧 化 碳 反 吹 放 空 ; 由 预 柱 出 来 的 O 2 N 2 CO 及 CH 4 通 过 专 用 三 通 分 流 进 入 两 根 柱 子, 一 根 是 5A 柱 接 TCD 分 析 O 2 N 2 ; 另 一 根 是 活 性 碳 柱, 经 转 化 炉 接 FID, 分 析 CO CH 4 3 实 验 与 结 果 开 动 仪 器, 给 适 当 色 谱 条 件, 进 标 气 (CO 2 作 平 衡 气 ) 求 校 正 因 子 ; 进 生 产 中 的 高 纯 CO 2, 171

177 色 谱 图 见 图 电 压 (mv) 电 压 (mv) 时 间 (min) 时 间 (min) 峰 号 峰 名 保 留 时 间 峰 高 峰 面 积 含 量 PPm 1 氧 气 氮 气 一 氧 化 碳 甲 烷 图 2. 高 纯 CO2 中 微 量 气 体 分 析 色 谱 图 连 续 进 6 次 的 结 果 见 表 1 表 1. 进 生 产 中 的 高 纯 CO 2, 连 续 进 6 次 的 结 果 次 数 / 结 果 标 准 偏 差 O 2 (PPm) N 2 (PPm) CO(PPm) CH 4 (PPm) 目 前 有 12 台 改 装 仪 器, 在 全 国 各 地 正 常 运 转, 第 一 台 已 连 续 正 常 运 转 22 个 月 4. 讨 论 由 结 果 看, 改 装 后 的 仪 器 :1 效 率 高 : 能 在 4 分 钟 内 一 次 进 样 完 成 全 分 析 ;2 灵 敏 度 高 : 能 捡 测 到 1PPm 的 微 量 组 分 ;3 稳 定 性 高 : 标 准 偏 差 小 于 0.15;4 可 靠 性 好 : 能 长 期 连 续 良 好 运 行 另 外, 改 装 后 的 仪 器 直 接 能 做 各 种 浓 度 O 2 N 2 CO CO 2 CH 4 及 C2/C3 烃 类 和 H 2 等 分 析 参 考 文 献 : [1] 许 国 旺 等. 现 代 实 用 气 相 色 谱 法. 化 学 工 业 出 版 社 2004 [2] 杨 海 鹰 等. 气 相 色 谱 在 石 油 化 工 中 的 应 用. 化 学 工 业 出 版 社 2005 [3] 孙 传 经 等. 气 相 色 谱 分 析 原 理 与 技 术. 化 学 工 业 出 版 社 1985 [4] 金 美 兰 赵 建 南. 标 准 气 体 及 其 应 用. 化 学 工 业 出 版 社.2003 [5] 中 国 标 准 出 版 社. 仪 器 仪 表 常 用 标 准 汇 编, 分 析 仪 表 卷

178 Prediction of retention times in multiple-ramp temperature programmed gas chromatography using non-linear plate theory Huang-fu Xu-dan, Li Xiao-wei, Li Wen-chen (The School of Material Science and Engineering, Tianjin University, Tianjin, , China) Abstract: An approach based on non-linear plate theory was used to predict retention times of 10 compounds in ten different multiple-ramp temperature programs under constant flow with the non-polar HP-5 column. The non-linear plate theory was described that the distribution coefficient K was not linear partition isotherm. The function of capacity factor lnk and temperature T appeared non-linear covering the wide temperature range 30 to 250 used in this study, so the equation of lnk =at 3 +bt 2 +ct+d was adopted. The prediction accuracy had shown that the relative errors within ±1% accounted for 38.30%, the relative errors between ±1%-±2% accounted for 34.04% and the relative errors between ±2%-±3% accounted for 23.45%. Key words: Prediction, non-linear plate theory, retention times, temperature programmed 1 Introduction Chromatography is a robust, consistent technique for separating analytes in complex mixtures, but optimizing the separation of complex samples with a wide range of boiling points can be very time-consuming [1]. In order to circumvent labour intensive trial, the development of good calculation tools is therefore an important task. So the computer-assisted prediction has been addressed by many authors [2-4] and finite element methods by computer simulation for prediction of retention time also have attracted some authors [1, 5-6]. In the prediction of temperature programmed retention time, the notion of differential and integral was described by many authors. Snijders et al. [7] used this method and for most components a good agreement between experimental and predicted data was observed, but for certain components large differences were sometimes observed between experimental and predicted data. Although those methods may yield satisfactory results, some of those methods must rigorously figure out the position of each location to calculate the carrier gas velocity which may make the calculation complicated. No reports have appeared to predict the multiple-ramp temperature programmed retention time based on non-linear plate theory under constant flow. In this paper, a non-linear plate theory model for the prediction of the retention time is presented. 2 Theory Martin and Synge put forward the linear plate theory in the year of The plate theory assumed that [8] : Continuous or packed type of distillation column (in which equilibrium is not established at any point) could be divided up into a number of layers each of which was equivalent to one theoretical plate, and the height of such a layer was called the H.E.T.P. or 'height equivalent to one theoretical plate'; The calculation can be performed with that assumption. The mobile phase jumps between the plates. The whole chromatographic process can be expressed as follows: the solute is put in the zeroth-plate, then jumps into the first plate and achieves distribution balance according to the 173

179 distribution coefficient. Then the components go on jumping and re- distributing according to the distribution coefficient. For illustration purpose, we can assume that the capacity factor is k =1, the total number of plates is 5 and the total time for jumping is γ=1.5. One unit of solute Q=1 is initially present in the zeroth plate of the column. Table 1 showed this distribution. Table 1 Distribution of the solute in a column (N=5). γ=1.5, k =1. Jumping times n=16. Jumping times r= Column outlet n= From the table1, we can get that after n=4, solute begins to appear at the column outlet and the maximum amount of solute is eluted at a value of n between 8 and 9. In order to predict the retention time, we should relate the jumping times to the time γ. The retention time equals that the time from the component entering the column to when the elution curves have the maximum value. Although each jump is instantaneous, reaching the balance in the statistical significance will also take time which can be called Δγ (time interval).this is the linear plate theory. However, temperature programmed retention time can not be predicted based on linear plate theory because the distribution coefficient is not a constant in the programmed temperature. The non-linear plate theory is that If Δγ is sufficiently small, the temperature of the whole column and the retention factor k within each jump can be considered constant. The actual temperature Ti at each jump can be calculated from Ti=T0+r ni Δγ (1) Where T0 is the initial absolute temperature, r is the applied temperature program. According to the equation, tr= tm(1+k ) (2) k can be calculated by the equation k = tr/ tm -1 (3) we fitted the curves lnk versus temperature by lnk =at 3 +bt 2 +ct+d [9] (4) Then the the retention times can be predicted. 174

180 3 Experimental section A 30m 0.32mm 0.25um non-polar HP-5 column was used throughout the study. The temperature of detector and inlet were kept in 250 and the mass flow was kept in 1ml/min. The constant flow model was used. Pure nitrogen was used as the carrier gas. An Agilent 6890 gas chromatograph, equipped with a flame ionization detector, a split injection adjusted to give a split ratio of approximately 50:1 The column oven was operated at two different temperature conditions, six isothermal and ten multiple-ramp temperature-programmed gradients; Isothermal: 250,200,150,100,50,30 ; gradient 1, 30 (held 2 min)+5 /min to 70 (held 1 min)+25 /min to 250 ; gradient 2, 30 (held 2 min)+10 /min to 70 (held 1 min)+25 /min to250 ; gradient 3, 30 (held 2 min)+15 /min to 70 (held 1 min)+25 /min to 250 ; gradient 4, 30 (held 2 min)+ 25 /min to 70 (held 1 min)+10 /min to 250 ; gradient 5, 30 (held 2 min)+ 20 /min to 70 (held 1 min)+20 /min to 250 ; gradient 6, 30 (held 2 min)+20 /min to 70 (held 1 min)+25 /min to 250 ; gradient 7, 30 (held 2 min)+10 /min to 70 (held 1 min)+25 /min to 250 ; gradient 8, 30 (held 2 min)+15 /min to 70 (held 1 min)+ 5 /min to 50 ; gradient 9, 30 (held 2 min)+20 /min to 70 (held 1 min)+ 5 /min to 50 ; gradient 10, /min to 50 ; The process ⅠDetermination of the hold-up time: the hold-up time was directly measured under the six isothermal temperature conditions with methane ⅡThe retention times of compounds in the six isothermal temperature conditions were measured and then the retention factors in the six isothermal temperature conditions were calculated according the equation (3). Ⅲ Fitting the curves lnk versus temperature for compounds by equation (4) Ⅳ Calculate the retention times of compounds under the different temperature programmed gradients by computer program using the coefficient a,b,c and d of the fitted curves. Ⅵ Measure the retention times of compounds under the different multiple-ramp temperature programmed gradients. 4 Results and discussion The fitting coefficient a,b,c,d and the correlation coefficient were given in the table 2 Table 2 The fitting coefficient a,b,c,d and the correlation coefficient of fitting curves for compounds compounds a b c d R 2 naphthalene o-dichlorobenzene benzene methano butyric acid heptanoic acid butyl acetate amyl acetate Notably, It can be seen from the table 2, the correlation coefficients of all the compounds were greater than Then the retention times can be predicted by the fitting coefficient using the non-linear plate theory model. The measured, predicted retention times and the relative errors were shown in the tables 3and 4.The RE% can be calculated by RE%=(tp-tR)/tp 100. tp is the 175

181 measured values and tr is the predicted values. Table 3 The measured, calculated retention times and the relative errors RE%. gradient 1 gradient 2 gradient 3 compounds tr tp RE% tr tp RE% tr tp RE% naphthalene anthraquinone o-dichlorobenzene benzene methano butyric acid heptanoic acid amyl acetate Table 4 The measured, calculated retention times and the relative errors RE%. gradient Compound ethanol 1,4 dioxane butyl acetate iso-amyl acetate tr tp RE% tr tp RE% tr tp RE% tr tp RE% gradient gradient gradient gradient gradient gradient gradient From the table 3 and 4, it was observed that the relative errors within ±1% accounted for 38.30%, the relative errors between ±1%-±2% accounted for 34.04% and the relative errors between ±2%-±3% accounted for 23.45%.In a word, for most experiment a good agreement between experimental and predicted data was observed. In the gradient 8, after about 4.6min, the temperature-program began to cool, but ethanol was eluted out in the 3.48 min which meant that the latter cooling temperature program had no effect on the elute. As for ethanol, 1, 4 dioxane, butyl acetate and iso-amyl acetate were eluted out after 4.6min which meant that the latter cooling temperature program had great effect on the retention times. The effect of the latter cooling temperature program in the gradient 9 was similar to the gradient 8. Gradient 10 was cooling temperature program and the prediction accuracy was also high. Therefore, there was a lag phenomenon which made the predicted value smaller than the actual value. So we can predict of retention times in temperature- programmed gas chromatography using non-linear plate theory. References [1] Fredrik Aldaeus, Yasar Thewalim, Anders Colmsjo*.J. Chromatogr, A 2009, 1216, [2] E.Dose,J.Anal.Chem. 1987, 59, [3] T.I.Al-Bajjari,S.LeVent and D.R.Taylor,J.Chromatogr. A1994, 683, [4] Vezzani, P. Moretti, M. Mazzi, G. Castello*, J. Chromatogr. A 2004, 1055, [5] K. Kaczmarski, J. Computers. Chem. Eng.1996, 20, [6] S.M. Ulmeanu, J. Josserand, H. Jensen, G. Bouchard, P.-A. Carrupt, H.H. Girault, J. Chromatogr. A 2005, 1063, [7] Henri Snijders,Hans Gerd Janssen, J. Chromatogr. A 1995, 718, [8] A.J.P.Martin,R.L.M.Synge.J.Biochem. 1941, 35,

182 The hold-up time has no effect on the prediction of retention times in temperature- programmed gas chromatography using plate theory Huang-fu Xu-dan, Ao Min, Lan Che (The School of Material Science and Engineering, Tianjin University, Tianjin, , China) Abstract: The effect of hold-up time on the prediction of retention times in temperature programmed gas chromatography using plate theory has been studied in this paper. The result showed that γ (the total jumping time) can be assumed to be an arbitrary value which may be less than the minimum of real retention time. The prediction accuracy of retention times can not depend on the hold-up time. Key words: Prediction, non-linear plate theory, retention times, the hold-up time 1 Introduction In the prediction of temperature-programmed retention time, the notion of differential and integral was described by many authors. The column can be divided into a series of small segments according to the time intervals within which the time of mobile phase flowing through each segment is very short, so the separation at each segment can be considered isotherm and the carrier gas velocity and the retention factors are taken as constant. The total retention time under the temperature-programmed condition is equivalent to the sum of the individual time segments corresponding to a migration distance equal to the column length [1]. Snijders et al. [2] used this method and for most components a good agreement between experimental and predicted data was observed. However, the hold-up time in each segment must be known. That is to say, it would be necessary to know the pressure of column inlet and outlet and the viscosity of the carrier gas. That involved the complex calculation process which increased the use difficulty of this method. Although there were many methods to obtain the hold-up time [3-4], the calculation process was very complex. In this paper, we proved and verified that γ (the total jumping time) can be assumed to be an arbitrary value which may be less than minimum of real retention time in this paper. 2 Theory Martin and Synge put forward the plate theory in the year of The plate theory assumed that [5] : Continuous or packed type of distillation column (in which equilibrium is not established at any point) could be divided up into a number of layers each of which was equivalent to one theoretical plate, and the height of such a layer was called the H.E.T.P. or 'height equivalent to one theoretical plate'; The calculation can be performed with that assumption. According to the plate theory, the column could be divided up into a number of layers each of which is equivalent to one theoretical plate. The mobile phase jumps between the plates. The whole chromatographic process can be expressed as follows: the solute is put in the zeroth-plate, then jumps into the first plate and achieves distribution balance according to the distribution coefficient. Then the components go on jumping and re- distributing according to the distribution coefficient. 3 Results and discussing For illustration purpose, we can assume that the capacity factor is k1 =1, the total number of 177

183 plates is 5 and the total time for jumping is γ1=1.5. One unit of solute Q=1 is initially present in the zeroth plate of the column.table 1 showed this distribution. Table 1 Distribution of the solute in a column (N=5). γ1=1.5, k1 =1. Jumping times n=16. Jumping times r= Column outlet n= From the table 1, we can get that after n=4, solute begins to appear at the column outlet and the maximum amount of solute is eluted at a value of n between 8 and 9. A plot of mass of solute leaving the column vs n is shown in Figure 1. The retention time equals that the time from the component entering the column to when the elution curves have the maximum value. Although each jump is instantaneous, reaching the balance in the statistical significance will also take time which can be called Δγ (time interval). Assuming the total jumping times is n, then Δγ=γ/n. Where γ can be assumed to be an arbitrary value and the value of γ can not affect the prediction of retention time. This can be proved as mass of sulute Figure 1 Elute curve following: according to the plate theory, we can get tr =tm (1+k ). (1) If we make, tm (1+k ) =γ (1+δ) and δ=(tr-γ)/γ (2) n Elute curve Elution curve for one unit of solute from five-plate column. γ1=1.5, k1 =1. Jumping times n=16. Compared (1) and (2), we can get tr= tr when γ is an arbitrary value. This also can be proved by the figure 3 and 4. In order to compare figure1, we can assume that the capacity factor is k2 =2, the total number of plates is 5 and the total time for jumping is γ2=1. One unit of solute Q=1 is initially present in the zeroth plate of the column. A plot of mass of solute leaving the column vs n is shown in Figure

184 Table 2 Distribution of the solute in a column (N=5). γ2=1, k2 =2. Jumping times n=16. Jumping times n Column outlet n= Elute curve mass of solute n Elute curve Figure 2 Elution curve for one unit of solute from five-plate column. γ2=1, k2 =2. Jumping times n=16. The jumping times corresponding to the peak of the elute curve is different in the figure 1 and 2, but we can respectively calculate the retention times. For γ1=1.5, δ1=1, jumping times n=16 and the jumping times corresponding to the peak of the elute curve is n=8, so tr1=8*δγ1=8*1.5/16=0.75.for γ2=1, δ2=2, jumping times n=16 and the jumping times corresponding to the peak of the elute curve is n=12, so tr2=12*δγ2=12*1/16=0.75.from the above calculation, we can get that γ can not affect the prediction accuracy of retention times. References [1] G. Castello*, P. Moretti, S. Vezzani, J.Chromatogr. A2009, 1216, [2] Henri Snijders,Hans Gerd Janssen, J. Chromatogr. A 1995, 718, [3] Rosa Lebrón-Aguilar, Jesús Eduardo Quintanilla-López, José Antonio García-Domínguez, Hold-up time in gas chromatography I. New approach to its estimation, Journal of Chromatography A, 1997, 760(2): 219~226 [4] Jesús Eduardo Quintanilla-López, Rosa Lebrón-Aguilar, José Antonio García-Domínguez, The hold-up time in gas chromatography Ⅱ. Validation of the estimation based on the concept of zero carbon atoms alkane, Journal of Chromatography A, 1997, 767(1-2): 127~136 [5] A.J.P.Martin,R.L.M.Synge.J.Biochem. 1941, 35,

185 The effect of temperature on the entropy and enthalpy in the prediction of temperature programmed retention times Huang-fu Xu-dan, Li Deng-ke (The School of Material science and engineering, Tianjin University, Tianjin, , China) Abstract: Several equation of lnk and T were studied in this paper. The equation of lnk =at 3 +bt 2 +ct+d was best to show the effect of temperature on the entropy and enthalpy in the prediction of temperature- programmed retention times. The prediction can be performed covering the wide temperature range with that equation. Key words: Fitting, Retention times, Temperature- programmed 1 Introduction Chromatography is a robust, consistent technique for separating analytes in complex mixtures, but optimizing the separation of complex samples with a wide range of boiling points can be very time-consuming [1]. Grant and Hollis [2] suggested a method for the prediction of linear temperature programmed retention time on non-polar column.they made the assumption that temperature had no effect on the entropy and enthalpy. However this assumption can only come into existence in the relatively narrow temperature ranges. If there was a broad temperature range, the errors may become larger. The equation about relationship of retention factor and the temperature is well ' H S known, that is ln k = + ln β. Considering the effect of temperature on the entropy RT R and enthalpy, a lot of mathematical models has been improved on this point such as lnk =at+b+c/t [3-4], lnk =a/t 2 +b/t+c [5].However, we found that if the curves of lnk versus T were fitted by lnk =at 3 +bt 2 +ct+d, the correlation coefficient of fitting curves were very near 1. 2 Experimental section A 30m 0.32mm 0.25um non-polar HP-5 column was used throughout the study. Pure nitrogen was used as the carrier gas. An Agilent 6890 gas chromatograph, equipped with a flame ionization detector, a split injection adjusted to give a split ratio of approximately 50:1. Six isothermal condition: 250,200,150,100,50,30, Two parallel trials were required for each test and the relative error of the values from the two parallel trials was less than 3. Compounds: naphthalene, anthraquinone, o-dichlorobenzene, benzene methanol, butyric acid, heptanoic acid, butyl acetate, iso-amyl acetate, 1,4 dioxane, ethanol. The process: Ⅰ.Determination of the hold-up time: the hold-up time was directly measured under the six isothermal temperature conditions with methane. Ⅱ.The retention times of compounds in the six isothermal temperature conditions were measured and then the retention factors in the six isothermal temperature conditions were calculated according the equation k = tr/ tm -1 (1). Ⅲ. Fitting the curves lnk versus temperature for compounds by equation lnk =at 3 +bt 2 +ct+d (2). 3 Results and discussion Table 1 showed the measured hold-up time under isothermal conditions. 180

186 Table1 The measured hold-up time under isothermal conditions Temperature/K Measured value/min Then the retention time under the isothermal conditions can be measured. The retention factor under the six isothermal temperature conditions can be calculated according the equation (1) and the curves lnk -T for compounds were fitted by equation (2). Figure 1 showed the fitting curves of compounds with different functional groups. lnk' T naphthalene o-dichlorobenzene lnk' T benzene methanol butyric acid heptanoic acid butyl acetate amyl acetate Fig.1. Fitting curves of lnk versus temperature for the compounds with different functional groups.(a) is for aromatic compounds;(b) is for alcohol, acid and ester compounds. Obviously, it can be seen from the figure 1, the data points were scattered in both sides of the curves.that implied the relationship of lnk and T described by equation (2) was fairly accurate. The fitting coefficient a,b,c,d and the correlation coefficient were also given in the table 2. Table 2 The fitting coefficient a,b,c,d and the correlation coefficient of fitting curves for compounds compounds a b c d R 2 naphthalene o-dichlorobenzene benzene methano butyric acid heptanoic acid butyl acetate amyl acetate Notably, it can be seen from the table 2, the correlation coefficients of all the compounds were greater than So the equation of lnk =at 3 +bt 2 +ct+d is best to show the effect of temperature on the entropy and enthalpy in the prediction of temperature- programmed retention times. So the prediction can be performed covering the wide temperature range with the equation of lnk =at 3 +bt 2 +ct+d. References (leaved out) 181

187 Using Plate Theory for the prediction of retention times in programmed temperature analyses ZHANG Lan-lan, Li Deng-ke, (The School of Material Science and Engineering of Tianjin University, Tianjin , China) Abstract: A novel approach is described to predict retention times of the compounds during the temperature programmed capillary gas chromatography with plate theory. In this study, the used model permits the prediction of the retention times of twenty different types of compounds analyzed with three different TP runs carried out on the HP-5 column. It is shown that the temperature programmed data can be successfully predicted using several preliminary runs carried out in six isothermal conditions 30, 50, 100, 150, 200, 250 C, the differences between the predicted and measured retention times were typically less than 1%. Key words: retention time; plate theory; prediction 1 Introduction To select the best analytical conditions for an efficient and rapid separation [1], many works make use of the structural parameters of solutes to predict the relevant retention behaviors in temperature programmed gas chromatography currently [2], although these procedures for the identification of a certain kind of chemical substances are useful, in practical it limits their use for complex samples or for samples with a wide range of boiling points. The finite element method has been used to predict the retention times of complex compounds during gas chromatography [3]. But due to the requirement of relatively sophisticated and time-consuming mathematical analyses, the procedure is still of limited practical use, especially for routine analysis. Other prediction methods have been published [4]. In all of them the carrier gas hold-up time tm, is necessary in order to calculate the values of the retention time tr, which is obtained through the direct measurement or the calculation of the average carrier gas velocity. When the overall programmed run includes tracts with different temperature gradient or an initial and final isothermal tract, they should accurately calculate the dead time to complete the calculation, however, the modified plate theory does not require the accurate determination of dead time, the detailed discussion will be mentioned in the another paper. Compared with other theories and methods, the plate theory is visual image, In order to prove the correctness of our conclusions, this paper selected 20 different types of compounds analyzed with three kinds of non-linear models in isothermal conditions and three different TP runs carried out on the HP-5 column for the prediction of retention times. 2 Theory The basic assumption of plate theory is thoroughly described in the literature [5]. Which can give the definite mathematical model and calculate the concentration of solute in each plate of the column at any time in temperature programmed conditions, shown in the table 1. 3 Experimental Section 3.1 Materials The analyses were carried out on a capillary column: a non-polar HP-5 filled with Cross linked 5% PH ME Siloxane. The length of the column was 30m and the phase thickness 0.25µm, the nominal internal diameter of the column was 0.32 mm, which was obtained from Agilent Technologies. In both the calculated and empirical experiments the chromatograms obtained 182

188 Table 1. The specific distribution process of non-linear plate theory on HP-5 column in programmed temperature, initial temperature is K, samples used for the ethanol, assuming theoretical plate numbers are 5, and jump 5 times, the capacity factor of ethanol is in K, the dead time in K is 2.778, so τ= Jump number \ theoretical plate Assumed n=5 m= Jump number=0 solid Total time=0 mobile T=303.15K solid k'= mobile Jump number=1 solid total time= mobile T= K solid k'= mobile Jump number=2 solid total time= mobile T= K solid k'= mobile Jump number=3 solid total time= mobile T= K solid k'= mobile Jump number=4 solid total time= mobile T= K solid k'= mobile resulted from twenty kinds of different polar functional groups of solutes. Main categories are aldehydes, alcohols, and acids, including acetaldehyde, formaldehyde, ethanol, methanol, isoamyl alcohol, benzyl alcohol, dimethyl carbonate, ethyl acetate, isoamyl acetate, methyl benzoate, n-butyric acid, heptylic acid, n-heptane, dichloromethane, hexachloro-1,3-butadiene, mtbe, benzene, 1,4 dioxane, o-dichlorobenzene, naphthalene, anthraquinone. 3.2 Instrumentation Gas chromatographic measurements were made with an Agilent Technologies HP 6890 gas chromatograph equipped with a flame ionization detector (FID), employing chemical station software (Rev. A.04.02) for data acquisition. Nitrogen was used as the carrier gas with a constant mass flow rate corresponding to a velocity of 1ml/min. Sample volumes of about 0.2µl were introduced by split injection (split ratio 1:50). The injection and detector temperature were 250 C. Retention times were measured in a linear temperature program starting at 30 C and terminated at 250 C with different program rates as indicated in the text. The column temperature controlled by the gas chromatograph s software with an approximation of ±1 C. 3.3 Calculations establishing mathematical model Fristly measured the retention times of twenty kinds of different polar functional groups of compounds in six different temperatures 30 C, 50 C, 100 C, 150 C, 200 C, 250 C respectively, according to the average linear velocity of carrier gas in above-mentioned temperature calculate 183

189 the corresponding hold up times t M, and fitting the datas of viod times with temperatures, then t = t 1 k ', obtained the capacity factors in the above temperatures on make use of the formula ( ) R M + non-polar HP-5 column, using natural logarithm of capacity factor plotted as a function of the temperature, comparing with diverse step linear fittings predict retention time Many analyses were carried out at three temperature programmed at constant flow, and the specific conditions are described in table 2. The datas are shown in Table 3. initial temp, Table 2 Detailed programmed temperature ramp temp 1 ramp temp 2 ramp temp 3 C initial time, min rate, final temp, 4 Results and Discussion Table 3 C / min C The average experimental retention time, trexp(min); obtained in three temperature programmed at constant flow(1ml/min) on HP-5 (30 m 0.32 mm, 0.25 µm layer thickness). The relative percent error between experimental and calculated retention time EN %=100 (trexp-trcal)/ trcal is also shown in the table 3.l Compound 5 /min 15 /min 25 /min trexp trcal EN (%) trexp trcal EN (%) trexp trcal EN (%) hexachloro-1,3-butadiene acetaldehyde methyltertiarybutylether methanol formaldehyde ethanol benzene dimethyl carbonate normal heptane ,4 dioxane butyl acetate isoamyl alcohol isoamyl acetate butyrate o-dichlorobenzene methyl benzoate benzyl alcohol naphthalene heptylic acid anthraquinone ( 下 转 第 188 页 ) 184

190 塔 板 理 论 预 测 恒 流 模 式 下 变 化 柱 长 毛 细 管 色 谱 程 序 升 温 保 留 时 间 张 兰 兰 1 1 2, 敖 敏, 张 仲 荣 (1. 天 津 大 学 材 料 科 学 与 工 程 学 院 ; 2. 中 国 汽 车 技 术 研 究 中 心 ) 塔 板 理 论 是 色 谱 热 力 学 理 论 的 重 要 部 分, 本 文 使 用 数 学 方 法 完 成 了 塔 板 理 论 建 模 过 程, 在 此 基 础 上 运 用 计 算 机 实 现 了 对 柱 长 发 生 变 化 的 色 谱 柱 在 程 序 升 温 条 件 下 进 行 保 留 时 间 的 预 测 早 期 的 保 留 时 间 预 测 [1] 的 研 究 都 是 在 同 一 操 作 条 件 下 使 用 同 样 柱 长 的 色 谱 柱, 通 过 恒 温 数 据 对 程 序 升 温 保 留 时 间 进 行 预 测 ( 这 里 的 同 一 操 作 条 件 是 指 温 度 压 力 流 量 以 及 色 谱 工 作 站 中 默 认 的 其 它 参 数 条 件 ) 随 着 色 谱 柱 的 使 用 致 使 柱 机 械 损 坏, 以 及 在 实 验 操 作 中 不 同 型 号 色 谱 柱 间 的 更 换 不 当 导 致 的 柱 子 折 断, 柱 长 发 生 了 明 显 的 变 化, 即 使 在 同 样 的 操 作 条 件 下 色 谱 保 留 时 间 较 早 期 的 测 定 值 也 发 生 了 很 大 的 变 化, 为 了 实 现 精 确 的 分 析,Nestor Etxebarria [2-3] 提 出 了 保 留 时 间 锁 定 的 方 法, 这 种 方 法 在 一 定 程 度 上 缓 解 了 分 析 工 作 者 的 困 扰, 但 是 使 色 谱 分 析 局 限 于 少 数 公 司 的 柱 子 的 使 用 本 论 文 以 塔 板 理 论 为 基 础 提 出 了 在 恒 流 操 作 模 式 下 利 用 折 断 前 的 数 据 在 程 序 升 温 条 件 下 预 测 现 有 柱 长 保 留 时 间 的 新 方 法 1 理 论 部 分 1.1 理 论 根 据 塔 板 理 论, 气 液 色 谱 过 程 可 看 成 是 组 份 在 固 定 液 里 的 溶 解 平 衡, 即 被 分 离 的 组 份 需 在 这 两 相 间 进 行 反 复 多 次 的 分 配, 并 最 终 随 流 动 相 流 出 而 保 留 时 间 就 基 于 这 一 相 互 作 用 ( 有 机 化 合 物 与 色 谱 柱 固 定 相 之 间 反 复 的 相 互 作 用 ) 过 程 提 出 的 随 着 溶 质 在 色 谱 柱 内 迁 移, 各 块 塔 板 上 的 溶 质 在 固 定 相 的 量 和 流 动 相 的 量 也 是 随 时 变 化 的, 当 组 份 最 高 浓 度 流 出 色 谱 柱 时, 在 色 谱 图 上 显 示 为 色 谱 峰 的 最 高 值, 此 时 对 应 的 时 间 即 为 此 组 份 的 保 留 时 间, 由 此 可 知 保 留 时 间 是 由 色 谱 过 程 中 的 热 力 学 因 素 所 决 定, 即 在 一 定 的 色 谱 操 作 条 件 下, 保 留 时 间 由 物 质 在 色 谱 中 的 分 配 系 数 决 定 [4-5] 物 质 在 色 谱 中 的 分 配 系 数, 也 叫 平 衡 常 数, 是 指 在 一 定 温 度 压 力 下, 气 液 相 间 达 到 分 配 平 衡 时, 组 份 分 配 在 气 相 中 的 平 均 浓 度 与 其 分 配 ( 溶 解 ) 在 液 相 中 的 平 均 浓 度 之 比 值, 即 K=CL/CM 式 中 CL 为 组 份 在 固 定 液 里 的 浓 度,CM 为 组 份 在 载 气 中 的 浓 度 它 是 由 组 份 及 固 定 液 热 力 学 性 质 决 定 的, 只 随 柱 温 柱 压 固 定 相 组 成 流 动 相 组 成 待 测 组 份 性 质 变 化, 与 柱 中 气 相 液 相 体 积 无 关 但 由 于 K 为 热 力 学 平 衡 常 数, 由 热 力 学 性 质 可 知, 压 力 对 K 的 影 响 很 小, 可 忽 略 不 计 因 此 在 相 同 程 序 温 度 下, 对 于 同 一 待 测 组 份 分 别 在 柱 长 发 生 变 化 的 同 一 根 色 谱 柱 中 分 配 系 数 的 关 系 : 柱 长 发 生 变 化 前 后, 两 柱 中 固 定 相 组 成 流 动 相 组 成 待 测 组 份 性 质 都 可 看 作 常 数, 而 又 在 相 同 程 序 温 度 下 的 操 作, 所 以 对 于 相 同 程 序 温 度 下, 色 谱 柱 不 同 柱 长 的 分 配 系 数 K 是 相 同 的 因 此, 从 理 论 上 讲 色 谱 柱 长 短 的 变 化, 色 谱 操 作 条 件 ( 如 流 速 柱 压 ) 的 变 化 对 热 力 学 的 影 响 是 比 较 小 的, 在 许 多 情 况 下 可 以 忽 略 它 们 的 影 响, 早 期 获 得 的 恒 温 数 据 与 变 化 了 的 色 谱 柱 或 操 作 条 件 下 获 得 的 恒 温 数 据 并 不 应 该 存 在 本 质 上 的 区 别, 它 们 都 只 能 是 色 谱 与 组 分 之 间 的 热 力 学 性 质 的 反 映 由 于 色 谱 的 分 配 系 数 K 与 容 量 因 子 k 存 在 如 下 关 系 : K=β k (1-1) 185

191 式 中 β 为 相 比, 是 柱 型 及 其 结 构 的 重 要 特 征 对 于 同 一 根 色 谱 柱, 其 柱 型 及 其 结 构 是 定 值, 与 柱 子 长 短 无 关, 因 此 相 比 β 可 以 看 作 常 数, 这 样 由 上 式 可 知, 分 配 系 数 K 正 比 于 容 量 因 子 k 又 知 色 谱 中 容 量 因 子 与 保 留 时 间 tr 的 关 系 式 : 则 : k =tr/tm-1 (1-2) K=β k =β (tr/tm-1) (1-3) 由 上 述 分 析 知, 对 于 变 化 了 的 色 谱 柱 在 任 意 操 作 条 件 下 的 K 是 不 变 的, 说 明 K 与 tm 存 在 一 定 的 对 应 关 系, 此 时 的 时 死 时 间 tm 已 不 在 是 色 谱 意 义 上 的 死 时 间, 它 是 保 证 在 流 量 流 速 压 力 变 时 能 找 到 与 K 对 应 的 数 学 量 Ґ, 即 K=β (tr/ґ-1) (1-4) 如 果 能 找 到 K 与 Ґ 的 对 应 关 系, 不 仅 可 以 再 次 验 证 保 留 时 间 是 色 谱 与 组 分 之 间 的 热 力 学 性 质 的 反 映, 而 且 能 够 为 使 用 早 期 的 恒 温 数 据 对 现 行 的 色 谱 保 留 时 间 进 行 预 测 提 供 理 论 依 据 1.2 数 学 模 型 的 建 立 由 K 与 Ґ 的 对 应 关 系 可 知, 能 够 使 用 早 期 的 恒 温 数 据 对 现 在 的 色 谱 保 留 时 间 进 行 预 测 首 先 需 要 确 定 容 量 因 子 与 温 度 间 的 数 学 模 型, 根 据 早 期 分 配 系 数 K, 能 找 到 与 之 对 应 的 数 值 Ґ, 由 于 同 一 根 色 谱 柱 其 相 比 可 视 为 常 数, 即 能 找 到 早 期 的 容 量 因 子 与 死 时 间 的 对 应 关 系, 则 容 量 因 子 与 温 度 间 的 数 学 模 型 可 以 沿 用 即 可 选 用 恒 流 操 作 模 式 下 王 静 [3] 选 择 的 容 量 因 子 与 温 度 间 的 数 学 模 型 ln k =at 3 +bt 2 +ct+d 及 预 测 程 序 2 实 验 部 分 2.1 实 验 样 品 从 芳 香 烃 卤 代 烃 烯 烃 烷 烃 醚 醛 酸 酮 酯 和 醇 类 具 有 不 同 官 能 团 的 有 机 化 合 物 中 分 别 选 取 苯, 苯 甲 醇, 邻 二 氯 苯,1,3 丁 二 烯, 正 庚 烷,1,4 二 氧 六 环, 乙 醛, 甲 醛, 乙 醇, 甲 醇, 正 丁 醇, 正 庚 酸, 乙 酸 异 戊 酯, 异 戊 醇, 萘, 碳 酸 二 甲 酯, 乙 酸 丁 酯 18 种 样 品 ( 注 : 室 温 下, 萘 与 蒽 醌 均 为 固 体, 将 萘 溶 于 无 水 乙 醇 中, 蒽 醌 溶 于 二 氯 甲 烷 溶 剂 中 配 制 成 均 匀 溶 液 ) 2.2 实 验 仪 器 HP6890 气 相 色 谱 仪 ( 美 国 安 捷 伦 科 技 有 限 公 司 ) 进 样 器 : 分 流 进 样 方 式, 分 流 比 1:50, 温 度 250 检 测 器 :FID 检 测 器, 温 度 250 色 谱 柱 :HP-5 (Crosslinked 5%PH ME Siloxane,30m 0.32mm 0.25µm) HP-5 (Crosslinked 5%PH ME Siloxane,22m 0.32mm 0.25µm) 恒 流 操 作 模 式 : 载 气 在 柱 出 口 处, 质 量 流 量 保 持 恒 定, 流 量 为 1ml/min 2.3 不 同 柱 长 单 阶 程 序 升 温 条 件 下 保 留 时 间 的 预 测 实 验 条 件 : 在 不 同 长 度 HP-5 柱 上, 测 定 18 种 样 品 在 单 阶 程 序 升 温 条 件 下 的 保 留 时 间, 温 度 条 件 设 定 如 下 : 初 始 温 度 为 30, 分 别 以 5 /min,15 /min,25 /min 的 升 温 速 率 升 至 250 ; 为 保 证 所 测 定 的 保 留 时 间 的 准 确 性, 各 样 品 在 每 一 温 度 条 件 下 进 行 两 次 平 行 实 验, 且 两 次 平 行 实 验 的 相 对 误 差 不 超 过 1% 每 次 进 样 量 均 为 0.2µl 预 测 时 间 误 差 分 析 :18 种 样 品 在 不 同 柱 长 的 弱 极 性 HP-5 柱 上, 三 种 单 阶 程 序 升 温 条 件 下 保 留 时 间 的 计 算 值 与 实 测 值 的 比 较 如 表 2-1 表 2-2 所 示 其 中 tr 为 两 次 平 行 实 验 所 测 得 的 保 留 时 间 的 平 均 值,tp 为 保 留 时 间 的 预 测 值 RE% 为 预 测 值 与 实 测 值 之 间 的 相 对 误 差, 表 征 预 186

192 测 的 准 确 度 为 (2-1) 式 : t P t R RE % = 100% (2-1) t R 表 2-1 HP-5 色 谱 柱 (30m) 单 阶 程 序 升 温 保 留 时 间 预 测 值 与 实 测 值 比 较 5 /min 15 /min 25 /min 样 品 tp tr RE% tp tr RE% tp tr RE% 苯 苯 甲 醇 蒽 醌 邻 二 氯 苯 ,3 丁 二 烯 正 庚 烷 ,4 二 氧 六 环 乙 醛 甲 醛 无 水 乙 醇 甲 醇 正 丁 酸 正 庚 酸 乙 酸 异 戊 酯 异 戊 醇 萘 碳 酸 二 甲 酯 乙 酸 丁 酯 表 2-2 HP-5 色 谱 柱 (22m) 单 阶 程 序 升 温 保 留 时 间 预 测 值 与 实 测 值 比 较 5 /min 15 /min 25 /min 样 品 tp tr RE% tp tr RE% tp tr RE% 苯 苯 甲 醇 蒽 醌 邻 二 氯 苯 ,3 丁 二 烯 正 庚 烷 ,4 二 氧 六 环 乙 醛 甲 醛 无 水 乙 醇 甲 醇 正 丁 酸 正 庚 酸 乙 酸 异 戊 酯 异 戊 醇 萘 碳 酸 二 甲 酯 乙 酸 丁 酯

193 3 结 论 本 文 以 塔 板 理 论 为 基 础, 利 用 色 谱 保 留 值 模 型, 对 柱 长 改 变 的 毛 细 管 色 谱 柱 气 相 色 谱 在 程 序 升 温 操 作 条 件 下 的 保 留 时 间 进 行 了 预 测, 实 验 说 明 在 恒 流 操 作 模 式 下, 完 全 可 以 用 王 静 选 择 的 数 学 模 型 ln k =at 3 +bt 2 +ct+d 并 且 两 表 中 实 测 数 据 比 较, 在 保 留 时 间 减 少 近 40% 的 情 况 下, 用 折 断 前 的 恒 温 数 据 对 柱 长 改 变 了 的 弱 极 性 HP-5 柱 上 在 单 阶 程 序 升 温 条 件 下 对 具 有 不 同 官 能 团 的 18 种 样 品 的 保 留 时 间 的 预 测 进 行 研 究, 由 预 测 值 与 实 测 值 的 比 较, 误 差 ±3% 有 94.44%, 误 差 大 于 ±3% 的 仅 占 5.56% 以 上 的 误 差 分 析 说 明, 在 不 同 柱 长 同 一 单 阶 程 序 升 温 条 件 下, 我 们 采 用 早 期 的 恒 温 数 据 预 测 早 期 柱 长 以 及 柱 长 发 生 变 化 后 的 保 留 时 间 这 一 想 法 是 可 行 的, 而 且 这 种 方 法 在 预 测 保 留 时 间 时 具 有 相 当 高 的 精 度 除 此 之 外 此 方 法 还 解 决 了 长 期 以 来 色 谱 柱 在 使 用 过 程 中 不 断 折 断, 而 造 成 的 须 舍 弃 以 前 的 恒 温 数 据 重 新 测 量 新 恒 温 数 据 进 行 程 序 升 温 保 留 时 间 预 测 的 困 扰, 从 而 节 省 了 大 量 的 人 力 物 力 和 财 力 参 考 文 献 : [1] 王 静, 塔 板 理 论 对 毛 细 管 色 谱 程 序 升 温 保 留 时 间 预 测 的 研 究, 硕 士 学 位 论 文, 天 津 大 学,2003. [2] Leonid M.Blumberg; Matthew S.Klee. J. Anal.Chem , 70, [3] NestorEtxebarria; OlatzZuloaga; MaitaneOlivares. J. Chromatogr., A 2009, 1216, [4] 孙 传 经, 气 相 色 谱 分 析 原 理 与 技 术, 北 京 : 化 学 工 业 出 版 社,1979,2~14. [5] 洪 厚 胜, 袁 慕 康, 张 庆 文 等, 色 谱 保 留 值 预 测 模 型 的 研 究 进 展, 分 析 科 学 学 报,2006,vol.22(No.6): 726~728. ( 上 接 第 184 页 ) The proposed method of retention time prediction in programmed temperature could be used as a new cheap, precise and time saving prediction method (as compared to the present methods). Presented results confirm the application of nonlinear plate theory as a basic chromatographic distribution theory to predict the retention time in programmed temperature. This method is characterized by high accuracy and wide temperature range of predictive ability, suitable for most organic compound types. References [1] P. Moretti; S. Vezzani; E.Garrone; G.Castello. J. Chromatogr., A 2004, 1038, [2] H.W. Habgood; W.E. Harris. J Anal. Chem. 1960, 32, 450. [3] Fredrik Aldaeus; Yasar Thewalim; Anders Colmsjö. J. Chromatogr., A 2009, 1216, [4] W.E. Harris and H.W. Habgood, Programmed Temperature Gas Chromatography, Wiley, New York, [5] A. J. P.Matin; R.L.M. Synge. J. Biochem. 1941, 151,

194 塔 板 理 论 对 毛 细 管 色 谱 程 序 温 度 流 量 模 式 下 保 留 时 间 预 测 的 研 究 张 兰 兰 , 李 笑 玮, 颜 昊, 孙 志 豪, 王 伟 (1. 天 津 大 学 材 料 科 学 与 工 程 学 院 ; 2. 王 朝 葡 萄 酒 酿 造 有 限 公 司 ) 塔 板 理 论 是 色 谱 热 力 学 理 论 的 重 要 部 分, 本 文 使 用 数 学 方 法 完 成 了 在 程 序 温 度 流 量 模 式 下 塔 板 理 论 的 建 模 过 程, 在 此 基 础 上 运 用 计 算 机 实 现 了 色 谱 柱 在 程 序 温 度 流 量 条 件 下 进 行 保 留 时 间 的 预 测 目 前 预 测 保 留 时 间 的 研 究 主 要 集 中 在 恒 流 与 恒 压 模 式 下 程 序 升 温 条 件 下 的 保 留 时 间 预 测, 为 了 实 现 精 确 的 分 析, 人 们 也 开 发 了 在 程 序 流 量 下 保 留 时 间 的 预 测, 但 是 由 于 其 方 法 比 较 复 杂 不 易 在 实 际 中 应 用, 因 此 发 展 比 较 缓 慢 本 论 文 以 塔 板 理 论 为 基 础 提 出 了 在 程 序 温 度 流 量 操 作 模 式 下 保 留 时 间 预 测 简 单 易 行 的 新 方 法 1 理 论 部 分 1.1 理 论 根 据 塔 板 理 论, 气 液 色 谱 过 程 可 看 成 是 组 份 在 固 定 液 里 的 溶 解 平 衡, 即 被 分 离 的 组 份 需 在 这 两 相 间 进 行 反 复 多 次 的 分 配, 并 最 终 随 流 动 相 流 出 而 保 留 时 间 就 基 于 这 一 相 互 作 用 ( 有 机 化 合 物 与 色 谱 柱 固 定 相 之 间 反 复 的 相 互 作 用 ) 过 程 提 出 的 随 着 溶 质 在 色 谱 柱 内 迁 移, 各 块 塔 板 上 的 溶 质 在 固 定 相 的 量 和 流 动 相 的 量 也 是 随 时 变 化 的, 当 组 份 最 高 浓 度 流 出 色 谱 柱 时, 在 色 谱 图 上 显 示 为 色 谱 峰 的 最 高 值, 此 时 对 应 的 时 间 即 为 此 组 份 的 保 留 时 间, 由 此 可 知 保 留 时 间 是 由 色 谱 过 程 中 的 热 力 学 因 素 所 决 定, 即 在 一 定 的 色 谱 操 作 条 件 下, 保 留 时 间 由 物 质 在 色 谱 中 的 分 配 系 数 决 定 [1-2] 物 质 在 色 谱 中 的 分 配 系 数, 也 叫 平 衡 常 数, 是 指 在 一 定 温 度 压 力 下, 气 液 相 间 达 到 分 配 平 衡 时, 组 份 分 配 在 气 相 中 的 平 均 浓 度 与 其 分 配 ( 溶 解 ) 在 液 相 中 的 平 均 浓 度 之 比 值, 即 K=CL/CM 式 中 CL 为 组 份 在 固 定 液 里 的 浓 度,CM 为 组 份 在 载 气 中 的 浓 度 它 是 由 组 份 及 固 定 液 热 力 学 性 质 决 定 的, 只 随 柱 温 柱 压 固 定 相 组 成 流 动 相 组 成 待 测 组 份 性 质 变 化, 与 柱 中 气 相 液 相 体 积 无 关 但 由 于 K 为 热 力 学 平 衡 常 数, 由 热 力 学 性 质 可 知, 压 力 对 K 的 影 响 很 小, 可 忽 略 不 计 因 此 在 相 同 程 序 温 度 流 量 下, 对 于 同 一 待 测 组 份 分 别 在 柱 长 发 生 变 化 的 同 一 根 色 谱 柱 中, 固 定 相 组 成 流 动 相 组 成 待 测 组 份 性 质 温 度 都 可 看 作 常 数, 压 力 的 变 化 可 忽 略, 在 此 条 件 下 分 配 系 数 K 也 是 相 同 的, 但 是, 由 于 柱 长 变 短 后 对 其 死 时 间 有 很 大 影 响, 并 且 由 于 在 程 序 温 度 流 量 下, 流 量 温 度 分 别 随 着 时 间 不 断 变 化, 因 此 影 响 此 条 件 下 物 质 保 留 时 间 的 参 数 已 不 再 是 一 个, 而 是 一 个 多 参 数 需 要 建 立 新 的 数 学 模 型 进 行 程 序 温 度 流 量 下 的 保 留 时 间 的 预 测 1.2 数 学 模 型 的 建 立 对 于 程 序 温 度 流 量 模 式 下, 温 度 和 流 量 都 在 随 时 变 化, 此 时 容 量 因 子 是 温 度 流 量 的 函 数, 所 以 此 条 件 下 不 能 沿 用 王 静 [3] 选 择 的 数 学 模 型 ln k =at 3 +bt 2 +ct+d, 而 应 该 重 新 建 立 二 元 数 学 模 型 根 据 保 留 时 间 tr 与 容 量 因 子 k 的 关 系 式 :tr = tm(k +1), 计 算 k 的 先 决 条 件 是 要 获 知 死 时 间 tm 所 以 容 量 因 子 与 温 度 流 量 的 函 数 关 系, 就 转 化 为 死 时 间 与 温 度 流 量 的 函 数 关 系, 所 以 须 找 到 死 时 间 与 温 度 流 量 三 者 间 的 函 数 关 系 2 实 验 部 分 189

195 2.1 实 验 样 品 从 芳 香 烃 卤 代 烃 烯 烃 烷 烃 醚 醛 酸 酮 酯 和 醇 类 具 有 不 同 官 能 团 的 有 机 化 合 物 中 分 别 选 取 苯, 苯 甲 醇, 邻 二 氯 苯,1,3 丁 二 烯, 正 庚 烷,1,4 二 氧 六 环, 乙 醛, 甲 醛, 乙 醇, 甲 醇, 正 丁 醇, 正 庚 酸, 乙 酸 异 戊 酯, 异 戊 醇, 萘, 碳 酸 二 甲 酯, 乙 酸 丁 酯 18 种 样 品 ( 注 : 室 温 下, 萘 与 蒽 醌 均 为 固 体, 将 萘 溶 于 无 水 乙 醇 中, 蒽 醌 溶 于 二 氯 甲 烷 溶 剂 中 配 制 成 均 匀 溶 液 ) 2.2 实 验 仪 器 HP6890 气 相 色 谱 仪 ( 美 国 安 捷 伦 科 技 有 限 公 司 ) 进 样 器 : 分 流 进 样 方 式, 分 流 比 1:50, 温 度 250 检 测 器 :FID 检 测 器, 温 度 250 色 谱 柱 :HP-5 (Crosslinked 5%PH ME Siloxane,30m 0.32mm 0.25µm) HP-5 (Crosslinked 5%PH ME Siloxane,22m 0.32mm 0.25µm) 2.3 不 同 温 度 流 量 程 序 条 件 下 保 留 时 间 的 预 测 实 验 条 件 : 在 HP-5 柱 上 测 定 18 种 样 品 在 程 序 温 度 流 量 条 件 下 的 保 留 时 间, 温 度 条 件 设 定 如 下 : 初 始 温 度 为 30, 分 别 以 5 /min,15 /min,25 /min 的 升 温 速 率 升 至 250 ; 与 上 面 温 度 条 件 需 同 时 设 定 的 流 量 程 序 为 : 流 量 程 序 : 初 始 流 量 为 0.5ml/min, 保 持 2 分 钟 后, 以 每 分 钟 0.2 ml/min 的 流 量 速 率 升 至 1.5 ml/min 后, 保 持 1 分 钟, 再 以 每 分 钟 0.5 ml/min 的 流 量 速 率 升 至 2ml/min 为 保 证 所 测 定 的 保 留 时 间 的 准 确 性, 各 样 品 在 每 一 温 度 条 件 下 进 行 两 次 平 行 实 验, 且 两 次 平 行 实 验 的 相 对 误 差 不 超 过 1% 每 次 进 样 量 均 为 0.2µl 预 测 时 间 误 差 分 析 :18 种 样 品 在 不 同 柱 长 的 弱 极 性 HP-5 柱 上, 三 种 温 度 流 量 程 序 条 件 下 保 留 时 间 的 计 算 值 与 实 测 值 的 比 较 如 表 2-1 所 示 其 中 tr 为 两 次 平 行 实 验 所 测 得 的 保 留 时 间 的 平 均 值,tp 为 保 留 时 间 的 预 测 值 RE% 为 预 测 值 与 实 测 值 之 间 的 相 对 误 差, 表 征 预 测 的 准 确 度, 按 式 (2-1) 计 算 t P t R RE % = 100% (2-1) t R 在 流 量 程 序 及 三 种 温 度 条 件 下,18 种 样 品 在 弱 极 性 HP-5 柱 上 保 留 时 间 的 计 算 值 与 实 测 值 的 比 较 如 表 2-1 所 示 3 结 论 对 程 序 温 度 流 量 模 式 下 具 有 不 同 官 能 团 的 18 种 样 品 在 弱 极 性 HP-5 柱 上 保 留 时 间 的 预 测 进 行 研 究, 发 现 全 部 被 测 样 品 的 预 测 值 与 实 测 值 的 相 对 误 差 均 在 ±2.5% 以 内, 以 上 的 误 差 分 析 说 明, 在 同 一 操 作 条 件 下, 我 们 采 用 早 期 的 恒 温 数 据 预 测 温 度 流 量 程 序 下 的 保 留 时 间, 考 虑 的 因 素 只 是 组 份 在 每 块 塔 板 上 的 平 衡 分 配, 并 不 会 因 为 程 序 升 温 流 量 过 程 变 得 复 杂 我 们 只 需 要 在 原 有 计 算 程 序 的 基 础 上 加 入 控 制 流 量 变 化 的 内 容, 进 一 步 验 证 了 这 种 方 法 的 可 行 性 以 及 在 预 测 保 留 时 间 方 面 具 有 很 高 的 精 度 由 于 对 不 同 流 量 程 序 变 化 温 度 程 序 变 化 操 作 条 件 下 预 测 结 果 的 研 究 表 明, 运 用 塔 板 理 论 可 以 完 成 对 不 同 柱 长 及 任 意 操 作 模 式 下 保 留 时 间 的 预 测 这 必 将 为 塔 板 理 论 预 测 保 留 时 间 的 实 际 应 用 奠 定 坚 实 的 理 论 基 础 190

196 表 2-1 HP-5 色 谱 柱 程 序 温 度 流 量 2 保 留 时 间 预 测 值 与 实 测 值 比 较 5 /min 15 /min 25 /min 样 品 tp tr RE% tp tr RE% tp tr RE% 苯 乙 酸 异 戊 酯 蒽 醌 正 庚 酸 ,3 丁 二 烯 正 庚 烷 ,4 二 氧 六 环 乙 醛 甲 醛 无 水 乙 醇 苯 甲 醇 正 丁 酸 邻 二 氯 苯 异 戊 醇 萘 碳 酸 二 甲 酯 乙 酸 丁 酯 参 考 文 献 : [1] 孙 传 经, 气 相 色 谱 分 析 原 理 与 技 术, 北 京 : 化 学 工 业 出 版 社,1979,2~14. [2] 洪 厚 胜, 袁 慕 康, 张 庆 文 等, 色 谱 保 留 值 预 测 模 型 的 研 究 进 展, 分 析 科 学 学 报,2006,vol.22(No.6): 726~

197 气 相 色 谱 法 测 定 涂 料 中 挥 发 性 卤 代 烃 张 克 贤 ( 天 津 现 代 职 业 技 术 学 院, 天 津 ) 利 用 气 相 色 谱 法 测 定 涂 料 中 挥 发 性 卤 代 烃, 采 用 电 子 捕 获 鉴 定 器 (ECD) 进 行 检 测, 峰 面 积 ( 响 应 值 ) 与 浓 度 进 行 线 性 回 归, 得 到 线 性 回 归 方 程, 进 行 外 标 法 测 定 的 方 法 测 定 了 三 种 涂 料 中 的 二 氯 甲 烷 和 四 氯 化 碳 两 种 挥 发 性 卤 代 烃 该 方 法 简 便 灵 敏 度 高 和 重 复 性 好 样 品 的 加 标 回 收 率 为 85.3%~95.6%, 标 准 曲 线 的 相 关 系 数 为 和 , 相 对 标 准 偏 差 为 5.96% 和 1.24% 涂 料 中 一 般 含 有 一 定 量 溶 剂, 随 着 人 们 环 保 意 识 的 增 强, 对 涂 料 无 毒 无 污 染 要 求 越 来 越 高 目 前 市 场 上 环 保 型 涂 料 逐 渐 取 代 一 般 型 涂 料 挥 发 性 卤 代 烃 是 一 类 对 人, 对 环 境 有 害 的 溶 剂 一 般 包 括 二 氯 甲 烷 1,1- 二 氯 乙 烷 1,2- 二 氯 乙 烷 1,1,1- 三 氯 乙 烷 1,1,2- 三 氯 乙 烷 三 氯 甲 烷 和 四 氯 化 碳, 环 保 型 涂 料 对 其 有 限 量 要 求 目 前 标 准 中 气 相 色 谱 法 测 定 挥 发 性 卤 代 烃, 有 采 用 氢 火 焰 离 子 鉴 定 器 (FID) 对 其 进 行 鉴 定, 但 其 灵 敏 度 不 如 电 子 捕 获 鉴 定 器 (ECD) 电 子 捕 获 鉴 定 器 (ECD) 对 卤 原 子 有 较 高 灵 敏 度, 适 合 检 测 挥 发 性 卤 代 烃 近 期 颁 布 的 标 准 和 报 道 采 用 电 子 捕 获 鉴 定 器 (ECD) 检 测 挥 发 性 卤 代 烃 [1,2,3], 其 定 量 方 法 为 内 标 法 也 有 报 道 峰 高 ( 响 应 值 ) 与 浓 度 进 行 线 性 回 归, 得 到 线 性 回 归 方 程, 进 行 外 标 法 测 定 的 方 法 [4] 本 文 介 绍 电 子 捕 获 鉴 定 器 (ECD) 检 测 挥 发 性 卤 代 烃 定 量 方 法 采 用 峰 面 积 ( 响 应 值 ) 与 浓 度 进 行 线 性 回 归, 得 到 线 性 回 归 方 程, 进 行 外 标 法 测 定 的 方 法 对 样 品 涂 料 的 二 氯 甲 烷 和 四 氯 化 碳 两 种 挥 发 性 卤 代 烃 进 行 测 定, 方 法 简 便 灵 敏 度 高 和 重 复 性 好 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 与 试 剂 仪 器 气 相 色 谱 仪 ( 上 海 天 美 仪 器 有 限 公 司 ); 电 子 捕 获 鉴 定 器 (Ni 63 源 )( 工 作 站 :D-7900); 色 谱 柱 : 甲 基 聚 硅 氧 烷 固 定 相 (30m 0.25mm 0.25µm); 微 量 注 射 器 :5 微 升 试 剂 二 氯 甲 烷 ( 色 谱 纯 ),1,1- 二 氯 乙 烷 ( 色 谱 纯 ),1,2- 二 氯 乙 烷 ( 色 谱 纯 ),1,1,1- 三 氯 乙 烷 ( 色 谱 纯 ),1,1,2- 三 氯 乙 烷 ( 色 谱 纯 ), 三 氯 甲 烷 ( 色 谱 纯 ), 四 氯 化 碳 ( 色 谱 纯 ), 稀 释 剂 : 甲 醇 ( 色 谱 纯 ) 1.2 色 谱 分 析 条 件 进 样 方 式 : 分 流 进 样 ; 载 气 流 速 (N2):4mL/min; 柱 温 :180 ; 进 样 口 温 度 :210 ; 检 测 器 温 度 :300 ; 尾 吹 :30 ml/min; 进 样 量 :0.2µL 以 保 留 时 间 (min) 定 性, 峰 面 积 (A,uV/s) 外 标 法 定 量 图 1 为 卤 代 烃 分 离 色 谱 图 2 结 果 与 讨 论 2.1 标 准 曲 线 的 制 作 和 检 出 限 在 开 始 对 样 品 进 行 GC-ECD 测 定 之 前, 先 测 定 标 准 工 作 液, 直 到 相 应 组 分 色 谱 响 应 值 稳 定 后 开 始 进 标 样, 制 作 标 准 曲 线, 之 后 进 行 样 品 测 定 以 响 应 值 峰 面 积 (A, uv/s) 与 质 量 浓 度 (X,mg/L) 进 行 线 性 回 归, 得 回 归 方 程 和 相 关 系 数 作 者 简 介 : 张 克 贤 (1963-), 男, 天 津 市 人, 天 津 现 代 职 业 技 术 学 院 工 程 师, 主 要 从 事 新 技 术 开 发 和 化 验 员 职 业 技 能 培 训 工 作 192

198 图 1 卤 代 烃 分 离 色 谱 图 保 留 时 间 : 1.685min(CH3OH) ; 1.983min(CH2Cl2) ; 2.183min(1,1-CHCl2CH3) ; 2.527min(CHCl3);2.853min(1,1,1-CCl3CH3);3.143min(CCl4);4.997min(1,1,2-CHCl2CH2Cl) 取 g 二 氯 甲 烷 ( 色 谱 纯 ) 或 四 氯 化 碳 ( 色 谱 纯 ) 置 于 1000mL 容 量 瓶 中, 用 甲 醇 ( 色 谱 纯 ) 定 容 至 刻 度 ( 卤 代 烃 含 量 1g/L) 取 卤 代 烃 含 量 (1g/L)1mL 置 于 1000mL 容 量 瓶 中, 用 甲 醇 ( 色 谱 纯 ) 定 容 至 刻 度 ( 卤 代 烃 含 量 1mg/L) 分 别 取 二 氯 甲 烷 和 四 氯 化 碳 ( 色 谱 纯,1mg/L) 和 2.00 于 50mL 容 量 瓶 中, 用 甲 醇 ( 色 谱 纯 ) 定 容 至 刻 度 该 系 列 含 卤 代 烃 为 和 0.040mg/L 依 次 取 标 准 溶 液 0.2µL 注 入 气 相 色 谱 仪, 记 下 各 次 色 谱 峰 面 积 (A, uv/s), 以 响 应 值 峰 面 积 (A,uV/s) 与 质 量 浓 度 (X,mg/L) 进 行 线 性 回 归, 得 回 归 方 程 和 相 关 系 数 表 1 标 准 系 列 的 测 试 结 果 浓 度 (mg/l) 峰 面 积 ( 二 氯 甲 烷 ) 峰 面 积 ( 四 氯 化 碳 ) 二 氯 甲 烷 标 准 溶 液 回 归 方 程 和 相 关 系 数 :A = 2680X R 2 = 四 氯 化 碳 标 准 溶 液 回 归 方 程 和 相 关 系 数 :A = X R 2 = 通 过 下 式 计 算 涂 料 中 组 分 含 量 C(µg/kg) C(µg/kg)= X V 1000/m X- 测 试 液 中 卤 代 烃 的 质 量 浓 度,mg/L V- 样 品 定 容 体 积,mL m- 样 品 取 样 量,g 样 品 配 制 称 取 1g( 精 确 至 ) 样 品 置 于 50mL 容 量 瓶 中 用 甲 醇 ( 色 谱 纯 ) 定 溶 至 刻 度 振 荡 混 匀 沉 淀 后 取 清 液 进 行 测 定, 进 样 量 0.2µL 通 过 测 定 空 白 液, 由 仪 器 噪 声 和 标 样 峰 面 积 计 算 方 法 的 检 出 限 二 氯 甲 烷 为 3 mg/l; 四 氯 化 碳 为 mg/l 2.2 回 收 率 实 验 将 三 个 不 同 样 品 分 别 做 回 收 率 实 验 ( 内 墙 涂 料 1 # 内 墙 涂 料 2 # 和 外 墙 涂 料 ) 取 同 一 样 品 193

199 2 份, 分 别 加 入 不 同 量 二 氯 甲 烷 标 准, 按 本 法 重 复 测 定 6 次, 其 结 果 见 表 二 另 外 再 取 同 一 样 品 2 份, 分 别 加 入 不 同 量 四 氯 化 碳 标 准 溶 液, 按 本 法 重 复 测 定 6 次, 其 结 果 见 表 三 回 收 率 在 85.3%~95.6% 表 2 二 氯 甲 烷 准 确 度 实 验 结 果 (mg/kg) 样 品 名 称 本 底 均 值 (mg/kg) CH2Cl2 标 准 加 入 量 (mg/kg) 测 定 均 值 (mg/kg) 回 收 率 (%) 内 墙 涂 料 1 # 内 墙 涂 料 2 # 外 墙 涂 料 表 3 四 氯 化 碳 准 确 度 实 验 结 果 (mg/kg) 样 品 名 称 本 底 均 值 (mg/kg) CCl4 标 准 加 入 量 (mg/kg) 测 定 均 值 (mg/kg) 回 收 率 (%) 内 墙 涂 料 1 # 内 墙 涂 料 2 # 外 墙 涂 料 精 密 度 实 验 取 两 个 不 同 样 品, 按 本 法 重 复 测 定 6 次, 其 结 果 见 表 四 表 4 精 密 度 实 验 结 果 样 品 名 称 样 品 测 定 量 平 均 值 相 对 标 准 偏 差 % 内 墙 涂 料 1 # (CH2Cl2) 外 墙 涂 料 (CH2Cl2) 内 墙 涂 料 1 # (CCl4) 外 墙 涂 料 (CCl4) 结 论 环 保 型 涂 料 需 要 严 格 控 制 有 害 化 学 物 质 的 添 加 量 挥 发 性 卤 代 烃 是 严 格 禁 止 添 加 到 涂 料 中 利 用 气 相 色 谱 法 测 定 涂 料 中 挥 发 性 卤 代 烃, 方 法 简 便 灵 敏 度 高 和 重 复 性 好 方 法 的 加 标 回 收 率 为 85.3%~95.6%; 标 准 曲 线 的 相 关 系 数 为 和 ; 相 对 标 准 偏 差 为 5.96% 和 1.24% 适 合 标 准 检 测 和 一 般 质 量 检 测, 参 考 文 献 [1]HJ/T 环 境 标 志 产 品 技 术 要 求 胶 黏 剂 [2]HJ/T 环 境 标 志 产 品 技 术 要 求 水 性 涂 料 [3] 安 琼, 董 元 华, 倪 俊, 等.[J] 色 谱,2002,20(2): [4] 张 莘 民, 徐 朝. [J] 色 谱,2000,18(3):

200 气 相 色 谱 法 测 定 烃 中 环 丁 砜 的 研 究 徐 忠 贤 ( 中 国 石 油 化 工 股 份 有 限 公 司 天 津 分 公 司 质 量 检 验 车 间 ) 本 文 采 用 气 相 色 谱 法, 用 Agilent 公 司 30m 0.32mm 0.5μm 毛 细 管 柱, 对 烃 中 环 丁 砜 进 行 了 含 量 测 定 方 法 简 单, 结 果 准 确 重 整 生 成 油 中 的 芳 香 烃 是 利 用 环 丁 砜 作 溶 剂 抽 提 分 离 出 来 的, 抽 提 过 程 完 成 后 对 溶 剂 环 丁 砜 要 进 行 回 收 利 用, 本 文 采 用 气 相 色 谱 法 对 烃 中 环 丁 砜 含 量 进 行 了 测 定 结 果 满 意, 达 到 较 好 的 精 密 度 和 准 确 度 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 和 试 剂 仪 器 : 安 捷 伦 7890 气 相 色 谱 仪,G4513A 十 六 位 自 动 进 样 器,355 SCD 检 测 器, 安 捷 伦 化 学 工 作 站 试 剂 : 环 丁 砜 ( 99.5%), 纯 苯 ( 99.5%) 1.2 色 谱 条 件 色 谱 柱 :Agilent 公 司 30m 0.32mm 0.5μm 毛 细 管 柱 ; 柱 温 :185 ; 检 测 器 :355 SCD 硫 检 测 器 200, 真 空 状 态 ;355 SCD 燃 烧 器 815 ; 汽 化 室 温 度 :250 2 含 量 测 定 2.1 标 准 溶 液 配 制 采 用 母 液 稀 释 法 配 制 1ppm 环 丁 砜 标 样 : 用 移 液 管 准 确 移 取 1ml 环 丁 砜 至 100ml 容 量 瓶 中, 加 入 溶 剂 纯 苯 至 刻 度, 此 时 溶 液 浓 度 为 10000ppm, 作 为 母 液 ; 从 母 液 中 准 确 移 取 1ml 至 100ml 容 量 瓶 中, 加 入 苯 至 刻 度, 此 时 溶 液 浓 度 为 100ppm, 称 为 1# 溶 液, 再 准 确 移 取 1# 溶 液 1ml 至 100 ml 容 量 瓶 中, 用 苯 稀 释 至 刻 度, 配 制 完 成 1 ppm 环 丁 砜 标 准 溶 液, 以 上 溶 液 配 制 过 程 中 均 要 摇 匀 标 液 谱 图 如 图 1: 信 号 /μv 保 留 时 间 /min 图 1 1ppm 标 样 色 谱 图 195

201 2.2 校 正 因 子 的 计 算 用 上 述 色 谱 条 件 对 标 准 溶 液 进 行 测 定, 进 样 量 是 1μl, 重 复 进 样 4 次, 记 录 峰 面 积, 如 果 峰 面 积 重 复 性 差 需 重 做 上 述 工 作, 从 而 测 定 出 环 丁 砜 的 校 正 因 子 fs= Ws /As fs 标 准 物 质 校 正 因 子 Ws 标 准 物 质 的 含 量 As 标 准 物 质 的 峰 面 积 2.3 精 密 度 试 验 针 对 同 一 样 品 SN504, 重 复 进 样 5 次, 外 标 校 正 获 得 样 品 中 环 丁 砜 含 量, 典 型 谱 图 如 图 2, 分 析 结 果 如 表 1: 信 号 /μv 保 留 时 间 /min 图 2 0.6ppm 标 样 色 谱 图 表 1 外 标 校 正 获 得 样 品 中 环 丁 砜 含 量 进 样 次 数 平 均 值 环 丁 砜 含 量 (ppm) 经 过 试 验 测 得 标 准 偏 差 SD=0.05(n=5) 符 合 方 法 UOP660 重 复 性 要 求 3 结 果 与 讨 论 原 来 用 微 填 充 毛 细 管 柱 和 FID 检 测 器 测 定 环 丁 砜 含 量, 本 方 法 采 用 30m 0.32mm 0.5 μm 毛 细 管 柱 和 SCD 检 测 器 测 定 环 丁 砜 含 量, 结 果 发 现 后 者 分 析 结 果 的 重 复 性 明 显 优 于 前 者 本 方 法 环 丁 砜 标 准 溶 液 配 制 采 用 苯 作 溶 剂 好 于 方 法 UOP660 中 水 作 溶 剂, 同 时 操 作 简 便 易 行 硫 选 择 性 检 测 器 SCD 灵 敏 度 高, 背 景 噪 音 相 对 也 高, 需 要 每 天 分 析 标 样 两 次, 两 次 分 析 峰 面 积 的 平 均 值 该 方 法 操 作 简 单, 重 复 性 好, 能 满 足 炼 油 厂 重 整 装 置 样 品 烃 中 环 丁 砜 的 测 定 196

202 气 相 色 谱 法 测 定 原 油 高 温 模 拟 蒸 馏 徐 忠 贤 ( 中 国 石 油 化 工 股 份 有 限 公 司 天 津 分 公 司 质 量 检 验 车 间 ) 利 用 美 国 安 捷 伦 公 司 7890 气 相 色 谱 分 析 仪 和 荷 兰 AC 公 司 分 析 软 件 进 行 原 油 高 温 模 拟 蒸 馏 测 试, 分 析 的 馏 程 范 围 为 初 馏 点 ~750 采 用 nc5~nc120 的 正 构 烷 烃 混 合 物 作 为 模 拟 蒸 馏 的 沸 点 校 正 样, 外 标 参 考 油 样 品 用 于 测 定 检 测 器 的 响 应 因 子, 沸 点 范 围 是 ~ 该 分 析 方 法 重 复 性 好, 可 指 导 原 油 的 炼 制, 优 化 重 油 的 加 工 气 相 色 谱 进 行 原 油 高 温 模 拟 蒸 馏 测 试 的 优 点 是 分 析 速 度 快, 重 复 性 好 以 及 样 品 用 量 少 目 前 炼 油 厂 原 油 品 种 多 变, 而 原 油 馏 程 的 测 定 是 评 价 原 油 质 量 的 主 要 指 标 和 确 定 原 油 加 工 方 案 的 重 要 依 据 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 与 试 剂 安 捷 伦 公 司 7890 色 谱 仪, 带 氢 火 焰 离 子 化 检 测 器 (FID),7683B 八 位 自 动 进 样 器 天 平 : 感 量 为 g 二 硫 化 碳 : 分 析 纯 ; 沸 点 校 正 样 :nc5~nc28(19 个 正 构 烷 烃 混 合 物 ) 和 nc30~nc120(38 个 正 构 烷 烃 混 合 物 ); 外 标 样 : 沸 程 为 366.0~544.5 参 考 油 nc5~nc120 沸 点 校 正 样 配 制 : 在 nc30~nc120 沸 点 校 正 样 试 剂 瓶 中, 加 入 10g 二 硫 化 碳, 摇 匀 溶 解 取 该 校 正 样 1.5mL 于 2 ml 取 样 瓶 中, 再 在 该 取 样 瓶 中 加 入 4μL nc5~nc28 沸 点 校 正 样, 摇 匀 1.2 色 谱 条 件 色 谱 柱 :AC 公 司 HT750 5m 0.53mm 0.09μm 毛 细 管 柱 ; 柱 温 : 初 始 温 度 40, 以 10 /min 的 速 度 升 到 430, 保 持 5min; 检 测 器 温 度 :430 ; 载 气 流 速 :19.0 ml/min, 高 纯 氦 ; 燃 气 流 速 :35 ml/min, 高 纯 氢 ; 助 燃 气 流 速 :350 ml/min, 净 化 压 缩 空 气 ; 进 样 量 : 1μL 1.3 分 析 方 法 的 建 立 保 留 时 间 对 沸 点 的 校 正 按 1.2 色 谱 条 件, 分 析 nc5~nc120 沸 点 校 正 样, 典 型 的 色 谱 图 见 图 1, 其 沸 点 与 保 留 时 间 的 关 系 曲 线 见 图 2 选 择 最 佳 的 积 分 条 件, 建 立 正 构 烷 烃 保 留 时 间 和 沸 点 的 校 正 表 Signal/pA Retention time/min 图 1 nc5~nc120 沸 点 校 正 样 色 谱 图 197

203 Retention time/min 图 2 Boiling point/ 沸 点 与 保 留 时 间 的 关 系 曲 线 外 标 样 的 分 析 在 2mL 取 样 瓶 中, 准 确 称 取 一 定 量 参 考 油 ( 约 0.015g), 加 入 约 为 参 考 油 100 倍 的 二 硫 化 碳 溶 剂, 再 准 确 称 量, 混 合 均 匀 按 1.2 色 谱 条 件, 分 析 该 外 标 样, 典 型 的 色 谱 图 见 图 3 对 色 谱 信 号 采 用 切 片 积 分 来 计 算 面 积, 通 过 外 标 样 的 分 析, 可 计 算 出 检 测 器 的 响 应 因 子, 同 时 可 以 考 察 仪 器 状 态, 若 各 点 偏 差 在 允 许 范 围 内, 见 表 1, 表 明 仪 器 性 能 符 合 要 求 Signal/pA 响 应 因 子 按 (1) 式 计 算 : R f Wr = ( W + W ) A r rs r 图 3 Retention time/min 外 标 样 的 色 谱 图 (1) 式 中 : Rf : 响 应 因 子 ; Wr : 参 考 油 重 量,g; Wrs : 外 标 样 溶 剂 重 量,g;Ar : 外 标 样 从 启 动 到 洗 脱 结 束 点 的 总 面 积 198

204 表 1 参 考 油 的 偏 差 允 许 范 围 回 收 率 /m% 沸 点 / 沸 点 允 许 偏 差 / IBP FBP 原 油 样 品 分 析 每 次 样 品 分 析 前 均 要 进 行 基 线 补 偿 分 析, 按 1.2 色 谱 条 件, 分 析 二 硫 化 碳 溶 剂 基 线 补 偿 分 析 要 求 反 复 进 行, 直 到 获 得 具 有 干 净 稳 定 高 温 平 台 的 补 偿 基 线 在 进 行 沸 点 校 正 样 外 标 样 和 原 油 样 分 析 时 由 所 得 信 号 扣 除 补 偿 基 线 信 号 在 2mL 取 样 瓶 中, 准 确 称 取 一 定 量 原 油 ( 约 0.015g), 加 入 约 为 原 油 100 倍 的 二 硫 化 碳 溶 剂, 再 准 确 称 量, 混 合 均 匀 按 1.2 色 谱 条 件 进 行 分 析, 运 行 高 温 模 拟 蒸 馏 软 件, 得 到 原 油 高 温 模 拟 蒸 馏 的 分 析 结 果 报 告 原 油 样 品 分 析 的 总 收 率 按 (2) 式 计 算 : ( Ws + Wss ) W % = R f As 100 W s (2) 式 中 :W% : 原 油 样 品 总 收 率,%; Rf : 响 应 因 子 ;As : 原 油 样 品 从 启 动 到 洗 脱 结 束 点 的 总 面 积 ;Ws : 原 油 样 品 重 量,g;Wss : 原 油 样 品 溶 剂 重 量, g 响 应 信 号 大 小 和 保 留 时 间 分 别 对 应 于 馏 出 百 分 率 和 沸 点 温 度 从 试 验 开 始 计 算 样 品 的 收 率, 当 收 率 为 0.5% 时, 把 该 点 温 度 定 为 样 品 的 初 馏 点 (IBP), 当 收 率 为 99.5%, 把 该 点 温 度 定 为 样 品 的 终 馏 点 (FBP) 原 油 样 品 分 析 的 色 谱 图 见 图 4 Signal/pA Retention time/min 图 4 原 油 的 高 温 模 拟 蒸 馏 色 谱 图 199

205 2 结 果 与 讨 论 2.1 分 析 方 法 的 精 密 度 对 中 转 罐 连 续 分 析 5 次, 进 行 重 复 性 实 验, 分 析 结 果 见 表 2 从 表 2 数 据 可 见, 高 温 模 拟 蒸 馏 时, 仪 器 性 能 很 稳 定, 分 析 重 复 性 好 表 2 分 析 方 法 重 复 性 考 察 实 验 沸 点 / Boiling point/ 收 率 /m% Recovery/m% 平 均 值 /m% Average /m% 标 准 偏 差 /m% SD /m% 相 对 标 准 偏 差 /% RSD /% IBP IBP~ IBP~ IBP~ IBP~ IBP~ IBP~ IBP~ IBP~ IBP~ IBP~ IBP~ FBP 分 析 中 应 注 意 的 问 题 由 于 固 定 液 的 高 温 流 失 和 重 质 馏 分 的 影 响, 硅 橡 胶 蒸 气 和 重 质 馏 分 的 燃 烧 会 在 离 子 头 喷 嘴 周 围 形 成 晶 状 沉 积 物, 从 而 影 响 FID 响 应 特 性 严 重 时 会 堵 塞 喷 嘴, 点 不 着 火, 无 响 应 信 号, 因 此 应 定 期 清 除 沉 积 物 由 于 样 品 的 残 存, 会 使 模 拟 蒸 馏 分 析 数 据 不 精 确, 因 而 原 油 分 析 前 的 基 线 补 偿 要 反 复 进 行, 直 到 补 偿 基 线 干 净 且 具 有 稳 定 的 高 温 平 台 为 止, 同 时 要 注 意 定 期 清 洗 进 样 衬 管 对 耐 温 密 封 隔 片 ( 进 样 器 垫 片 ) 要 注 意 它 有 一 定 的 穿 刺 寿 命, 一 般 隔 片 只 能 有 效 穿 刺 60 次 左 右, 应 按 此 数 要 求 更 换 隔 片, 以 保 证 整 个 气 路 不 漏 气 3 结 论 使 用 AC 公 司 的 高 温 模 拟 蒸 馏 软 件, 采 用 毛 细 管 色 谱 柱 进 行 分 离, 外 标 法 定 量 来 分 析 原 油 的 馏 程, 测 定 的 馏 程 范 围 可 为 IBP~750 实 验 结 果 表 明, 该 分 析 方 法 重 复 性 好, 初 馏 点 和 终 馏 点 的 标 准 偏 差 <1, 各 馏 分 收 率 的 标 准 偏 差 <0.3%; 该 分 析 方 法 精 确 度 高, 样 品 用 量 少, 操 作 简 便 快 速, 发 挥 了 积 极 有 效 的 作 用 200

206 基 质 固 相 分 散 - 气 相 色 谱 法 测 定 水 产 品 中 痕 量 菊 酯 类 药 物 含 量 刘 宝 蜜, 闫 宏 远, 杜 精 精, 褚 春 霞, 杨 更 亮 (1. 河 北 省 药 物 质 量 分 析 控 制 重 点 实 验 室 ;2. 河 北 大 学 药 学 院, 保 定 ) 菊 酯 类 药 物 是 一 类 广 谱 杀 虫 剂, 已 用 于 粮 食 蔬 菜 水 果 等 农 作 物 的 除 虫 并 广 泛 应 用 于 渔 业 生 产 中 的 清 塘 毒 杀 杂 鱼 和 有 害 生 物 等 [1] 这 类 药 物 若 使 用 不 当, 对 鱼 类 和 人 类 会 造 成 较 大 危 害 由 于 实 际 样 品 组 分 复 杂 且 目 标 物 含 量 低, 所 以 样 品 前 处 理 方 法 在 整 个 分 析 过 程 中 显 得 尤 为 重 要 传 统 的 样 品 前 处 理 过 程 操 作 复 杂, 耗 时, 样 品 易 损 失, 提 取 与 净 化 效 率 低, 且 需 大 量 样 品 及 有 机 溶 剂, 易 造 成 环 境 污 染 [2] 而 基 质 固 相 分 散 技 术 作 为 美 国 农 业 部 最 新 农 药 残 留 检 测 样 品 前 处 理 技 术 克 服 了 上 述 缺 点 [3], 本 实 验 采 用 基 质 固 相 分 散 技 术 结 合 GC-ECD 法 分 析 水 产 品 中 痕 量 菊 酯 类 药 物 残 留, 方 法 简 单 快 速, 适 用 于 水 产 品 中 菊 酯 类 药 物 残 留 分 析 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 和 试 剂 GC-2014 气 相 色 谱 仪 (ECD 检 测 器 );N2000 色 谱 工 作 站 ;DB-5 色 谱 柱 (30 m 0.53 mm 1.0 μm); 自 制 基 质 固 相 分 散 提 取 柱 ; 高 效 氯 氰 菊 酯 氯 菊 酯 标 准 品 ; 硅 藻 土 无 水 硫 酸 钠 正 己 烷 乙 酸 乙 酯 二 氯 甲 烷 ( 分 析 纯, 保 定 华 新 试 剂 公 司 ) 1.2 色 谱 条 件 进 样 口 温 度 :285 ; 检 测 器 温 度 :290 ; 分 流 进 样, 分 流 比 :1:1; 载 气 : 高 纯 氮 气 (> %) ; 柱 流 速 : 7.45 ml/min ; 进 样 量 1.0 μl 色 谱 柱 升 温 程 序 : 250 (4 min) C/min (10 min) 1.3 样 品 处 理 精 密 称 取 0.25 g 样 品 和 0.75 g 活 化 后 的 中 性 氧 化 铝 于 玻 璃 研 钵 中 充 分 研 磨 MSPD 提 取 柱 从 下 至 上 依 次 填 入 一 层 滤 纸, 少 许 脱 脂 棉,1 g 无 水 硫 酸 钠 和 硅 藻 土, 再 加 入 上 述 研 磨 均 匀 的 样 品 用 6.0 ml 正 己 烷 - 二 氯 甲 烷 (1:1,v/v) 分 两 次 洗 涤 研 钵 与 研 锤, 然 后 采 用 同 一 洗 涤 液 淋 洗 层 析 柱, 控 制 流 速 大 约 1.0 ml/min 收 集 洗 脱 液 至 5.0 ml 容 量 瓶 中, 定 容 后 取 1.0 ml 挥 干, 加 200 μl 正 己 烷 充 分 溶 解 后 进 行 色 谱 分 析 2 结 果 与 讨 论 2.1 MSPD 条 件 的 优 化 在 基 质 固 相 分 散 技 术 中, 分 散 剂 种 类 样 品 - 填 料 比 洗 脱 液 极 性 及 用 量 都 会 对 测 定 结 果 产 生 影 响 实 验 中 对 这 四 个 影 响 因 素 进 行 了 考 察 优 化 通 过 方 法 优 化, 最 终 结 果 如 下 :(1) 用 中 性 氧 化 铝 作 吸 附 剂, 硅 藻 土 作 净 化 剂, 可 除 去 很 多 极 性 杂 质, 达 到 净 化 目 的 (2) 正 己 烷 为 非 极 性 溶 剂, 与 不 同 的 极 性 溶 剂 混 合 可 得 到 中 等 极 性 的 混 合 溶 剂 本 实 验 用 正 己 烷 - 二 氯 甲 烷 (1:1,v/v) 洗 脱, 可 以 达 到 较 满 意 的 效 果 (3) 中 性 氧 化 铝 : 样 品 比 例 为 3:1, 用 6.0 ml 正 己 烷 - 二 氯 甲 烷 (1:1,v/v) 洗 脱, 方 法 集 提 取 净 化 于 一 体, 操 作 简 单, 稳 定 可 靠 2.2 线 性 关 系 与 检 测 限 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( ) 河 北 省 自 然 科 学 基 金 (B ) 教 育 部 留 学 回 国 基 金 河 北 省 留 学 人 员 科 技 活 动 择 优 资 助 项 目 河 北 省 高 校 百 名 优 秀 创 新 人 才 支 持 计 划 资 助 项 目 作 者 简 介 : 杨 更 亮 (1963- ), 男, 河 北 人, 教 授, Tel: , ygl@hbu.edu.cn 201

207 配 制 一 系 列 不 同 浓 度 ( μg/ml) 的 混 标 工 作 溶 液, 在 最 优 色 谱 条 件 下 进 样 分 析, 以 各 组 分 的 峰 面 积 y 对 质 量 浓 度 x 绘 制 标 准 曲 线, 线 性 方 程 分 别 为 y= x (r 2 =0.9997, 高 效 氯 氰 菊 酯 );y= x (r 2 =0.9995, 氯 菊 酯 ) 2.3 样 品 测 定 从 市 场 购 买 的 水 产 品 样 品 按 1.3 样 品 处 理 过 程 进 行 处 理 后 采 用 GC-ECD 进 行 分 析, 均 没 有 检 测 到 两 种 菊 酯 药 物 残 留 分 别 在 样 品 中 准 确 添 加 三 种 不 同 水 平 ( mg/kg) 的 混 合 菊 酯 标 准 溶 液, 放 置 数 分 钟 后 同 样 按 1.3 方 法 和 优 化 的 色 谱 条 件 进 行 处 理 和 测 定 每 个 样 品 均 平 行 测 定 3 次, 计 算 平 均 回 收 率 和 相 对 标 准 偏 差, 两 种 药 物 残 留 的 回 收 率 在 72.5%~106.6% 之 间, 相 对 标 准 偏 差 在 1.1%~6.7% 之 间, 能 满 足 药 物 残 留 分 析 要 求 洗 脱 剂 比 较 峰 面 积 高 效 氯 氰 菊 酯 氯 菊 酯 正 己 烷 丙 酮 乙 酸 乙 酯 二 氯 甲 烷 正 己 烷 - 丙 酮 洗 脱 剂 正 己 烷 - 二 氯 甲 烷 正 己 烷 - 乙 酸 乙 酯 图 2-1 洗 脱 剂 种 类 的 比 较 图 2-2 加 标 样 品 谱 图 参 考 文 献 : [1] Esteve-Turrillas FA, Pastor A. [J]. Anal Bioanal Chem, 2006, 384(3): [2] Chu XG, Hu XZ, Yao HY. [J]. J Chromatogr A, 2005, 1063(7): [3] 秦 峰.[J]. 化 学 通 报,2009,10(2): Matrix Solid Phase Dispersion - Gas Chromatography for the Determination of Trace Pyrethroids in aquatic Products LIU Bao-mi, YAN Hong-yuan, DU Jingjing, CHU Chun-xia, YANG Geng-liang* (College of Pharmacy, Hebei University, Baoding, , China) Abstract: A new analytical method based on matrix solid-phase dispersion coupled with GC-ECD was developed for the determination of permethrin and cypermethrin in aquatic products. Varies parameters including types of sorbent and eluent, and proportion of sample to sorbent were investigated. The aquatic products were dispersed with neutral alumina adsorbent and eluted using n-hexane-dichloromethane (1:1, v/v). The average recoveries of the analytes in three spiked samples were in a range of 72.5%~106.6% with relative standard deviation less than 6.7%. This proposed method was simple, rapid, consumes less sample and organic solvents, and suitable for the detection of trace cypermethrin and pyrethroids in aquatic products. Key words: Matrix solid phase dispersion; Gas chromatography; Aquatic products; Pyrethroids 202

208 硫 化 氢 分 析 浅 析 纪 玉 金, 马 秀 英, 唐 太 平 ( 渤 海 钻 探 井 下 技 术 服 务 分 公 司 ) 本 文 介 绍 了 用 气 相 色 谱 法 测 定 天 然 气 中 的 硫 化 氢 含 量 的 方 法 建 立 重 复 性 准 确 度 的 测 定, 以 及 在 分 析 过 程 中 样 品 的 处 理, 不 同 取 样 器 具 对 分 析 结 果 的 影 响, 形 成 完 整 的 分 析 模 式 硫 化 氢 是 一 种 毒 性 很 强 的 剧 毒 物, 是 易 致 人 死 亡 的 气 体 因 此 在 天 然 气 勘 探 开 发 过 程 中 对 硫 化 氢 测 定 建 立 一 种 硫 化 氢 准 确 的 测 定 方 法 是 非 常 重 要, 因 此, 从 2000 年 就 开 始 建 立 和 研 究 气 相 色 谱 法 测 定 天 然 气 中 的 硫 化 氢, 通 过 十 多 年 的 研 究 对 比 应 用, 形 成 了 取 样 样 品 处 理 分 析 结 果 处 理 的 完 整 体 系, 该 方 法 分 析 过 程 简 单 数 据 准 确 分 析 范 围 宽 安 全 性 强 和 适 用 范 围 广 1 仪 器 分 析 方 法 的 建 立 和 应 用 1.1 原 理 介 绍 气 相 色 谱 分 析 天 然 气 中 的 硫 化 氢 含 量 : 硫 化 氢 在 色 谱 柱 中 通 过 分 离 进 入 火 焰 光 度 检 测 器, 由 于 硫 化 氢 中 硫 在 富 氢 火 焰 燃 烧 时 发 出 394nm 波 长 的 特 征 光, 这 种 特 征 光 通 过 单 色 滤 光 片 进 入 光 电 倍 增 管, 光 的 信 号 就 转 变 为 电 信 号, 这 个 信 号 再 经 过 放 大 器 放 大 后, 由 数 据 处 理 系 统 采 集 处 理, 最 后 得 出 分 析 谱 图 1.2 气 相 色 谱 仪 介 绍 Agilent 6890N 气 相 色 谱 仪 : 该 仪 器 的 气 路 系 统 采 用 了 防 硫 材 料 制 作, 具 有 自 动 进 样 系 统, 仪 器 操 作 具 有 较 好 的 稳 定 性 火 焰 光 度 检 测 器 : 这 是 对 硫 能 产 生 特 征 光 谱 的 检 测 器, 该 检 测 器 具 有 较 高 的 灵 敏 度 1.3 分 析 方 法 的 建 立 硫 化 氢 色 谱 分 析 方 法 具 有 速 度 快 定 量 准 确 精 度 高 的 特 点, 但 是 它 的 缺 点 是 仪 器 结 构 复 杂 难 掌 握, 样 品 量 少, 在 日 产 几 万 立 方 米 天 然 气 井 中 分 析 结 果 重 复 性 较 差 a. 分 析 柱 : 磷 酸 三 甲 苯 酯 担 体, 这 种 具 有 分 离 速 度 快 回 收 率 高 容 易 定 量 等 特 点, 但 是 它 对 天 然 气 易 中 毒, 我 们 对 这 个 色 谱 柱 进 行 了 专 项 处 理, 对 天 然 气 中 硫 化 氢 分 析 取 得 了 比 较 满 意 的 效 果 b. 标 准 气 体 : 建 立 的 分 析 方 法 是 外 标 法, 所 选 用 的 标 准 硫 化 氢 气 体 是 北 京 氦 普 北 分 气 体 有 限 公 司 生 产 的 c. 分 析 与 计 算 分 析 : 将 气 相 色 谱 仪 三 路 气 体 比 例 调 节 好, 检 测 器 点 火, 待 仪 器 稳 定 后, 将 标 准 气 体 进 入 仪 器 进 行 分 析, 因 为 硫 化 氢 气 体 易 吸 附 在 钢 瓶 上, 因 此 要 放 空 数 秒, 连 续 进 样 数 次,( 见 谱 图 1) 取 平 行 标 准 气 两 个, 记 录 峰 高 h1 或 峰 面 积 s1 把 取 样 袋 ( 钢 瓶 ) 与 仪 器 进 样 口 连 接 好, 然 后 放 空 十 多 秒 后 将 样 品 进 入 仪 器 进 行 分 离, 得 到 样 品 谱 图 ( 见 谱 图 2) 并 记 录 峰 高 h2 或 峰 面 积 s2 计 算 : s 1 :30= s 2 :x 其 中 x 为 样 品 中 硫 化 氢 含 量 1.4 应 用 在 分 析 方 法 建 立 后 对 油 田 气 井 中 含 硫 化 氢 样 品 进 行 了 分 析, 表 1 为 近 几 年 油 气 井 天 然 气 中 的 硫 化 氢 含 量 203

209 谱 图 1: 标 准 气 体 谱 图 谱 图 2: 硫 化 氢 气 体 谱 图 2 硫 化 氢 气 体 的 特 性 及 在 取 样 处 理 和 分 析 上 浅 析 2.1 天 然 气 中 硫 化 氢 含 量 的 不 均 匀 性 天 然 气 中 硫 化 氢 含 量 是 不 均 匀 的, 在 同 一 层 样 品 因 取 样 时 间 不 同, 硫 化 氢 含 量 也 是 不 同 的 2.2 不 同 的 取 样 器 具 硫 化 氢 含 量 不 同 从 表 3 看 出 : 不 同 的 取 样 方 法 对 结 果 有 影 响, 排 水 取 样 影 响 最 大, 有 部 分 硫 化 氢 溶 解 在 水 中, 造 成 结 果 偏 低 钢 瓶 取 样 会 有 部 分 硫 化 氢 分 子 吸 附 在 钢 瓶 上, 导 致 含 量 偏 低, 气 袋 取 样 在 分 析 结 果 上 从 理 论 上 讲 应 该 较 为 准 确 2.3 样 品 稀 释 处 理 的 误 差 分 析 利 用 Hamilton Microlab 500 型 稀 释 仪 对 高 含 量 硫 化 氢 气 体 进 行 稀 释 ( 稀 释 剂 为 氮 气 ) 从 表 4 分 析 得 出 : 样 品 稀 释 要 以 标 准 气 体 的 含 量 为 准, 稀 释 倍 数 过 大 和 过 小 都 会 产 生 误 差, 当 稀 释 倍 数 过 小 时, 含 量 超 出 线 性 范 围 直 接 影 响 了 分 析 的 准 确 性 204

210 表 1 油 气 井 天 然 气 中 硫 化 氢 含 量 统 计 表 样 品 硫 化 氢 含 量 (PPM) 取 样 时 间 表 2 硫 化 氢 含 量 不 均 匀 性 统 计 取 样 井 段 取 样 时 间 硫 化 氢 含 量 (ppm) 第 一 层 第 三 层 第 三 层 表 3 取 样 器 具 对 硫 化 氢 含 量 影 响 统 计 样 品 取 样 时 间 硫 化 氢 含 量 (ppm) 排 水 取 气 钢 瓶 取 气 气 袋 取 气 同 一 样 品 同 一 样 品 同 一 样 品 同 一 样 品 同 一 样 品 同 一 样 品 表 4 同 一 样 品 稀 释 对 硫 化 氢 含 量 影 响 统 计 稀 释 倍 数 硫 化 氢 含 量 (ppm) 标 准 气 体 含 量 (ppm)

211 顶 空 气 相 色 谱 法 测 定 DT 中 有 机 溶 剂 残 留 量 蔡 振 华, 李 月 鹏, 蒋 庆 峰 ( 天 津 药 物 研 究 院 分 析 测 试 中 心, 天 津 ) DT 是 一 种 5- 羟 色 胺 (5-HT) 和 去 甲 肾 上 腺 素 再 摄 取 双 重 抑 制 剂, 通 过 抑 制 5-HT 和 去 甲 肾 上 腺 素 再 摄 取 来 提 高 这 些 神 经 递 质 的 含 量, 起 到 抗 抑 郁 的 作 用 DT 对 抑 郁 症 的 其 他 躯 体 症 状 如 全 身 疼 痛 和 胃 肠 紊 乱 有 很 好 疗 效, 因 而 比 目 前 的 抗 抑 郁 药 物 更 具 有 优 势 由 于 其 生 产 工 艺 中 使 用 到 了 异 丙 醇 乙 酸 甲 酯 乙 酸 乙 酯 甲 苯 和 二 甲 亚 砜 等 五 种 有 机 溶 剂, 根 据 目 前 新 药 审 批 对 有 机 溶 剂 残 留 量 的 要 求, 必 需 对 其 残 留 量 进 行 考 察 因 此, 按 照 中 国 药 典 2005 年 版 二 部 的 要 求 和 ICH 中 关 于 药 品 溶 剂 残 留 量 的 规 定, 制 定 了 用 顶 空 气 相 色 谱 法 测 定 DT 中 有 机 溶 剂 残 留 量 的 方 法 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 与 试 药 Agilent 6890 气 相 色 谱 仪 及 7694E 顶 空 进 样 器 ( 美 国 安 捷 伦 公 司 ) 甲 醇 异 丙 醇 乙 酸 甲 酯 乙 酸 乙 酯 甲 苯 和 二 甲 亚 砜 均 为 分 析 纯 化 学 试 剂 供 试 品 DT 由 本 院 合 成 室 提 供 ( 批 号 01, 02, 03) 1.2 色 谱 条 件 色 谱 柱 为 HP -624 毛 细 管 柱 (30.0m 0.53mm 3.00µm); 载 气 为 氮 气 (99.999% ); 载 气 流 速 为 3.0mL/min; 程 序 升 温 : 柱 温 初 始 为 40, 保 持 4min, 然 后 以 20 /min 的 速 率 升 温 至 200, 保 持 3min; 进 样 口 设 置 温 度 为 250 ; 分 流 比 为 10:1; 检 测 器 为 氢 火 焰 离 子 化 检 测 器 (FID), 设 置 温 度 为 250 顶 空 进 样 条 件 设 置 : 顶 空 瓶 加 热 温 度 120 ; 进 样 环 温 度 130 ; 传 送 管 温 度 140 ; 平 衡 时 间 20min; 进 样 时 间 为 1min; 进 样 环 体 积 为 1mL 1.3 溶 液 的 配 制 标 准 贮 备 液 的 配 制 精 密 移 取 400μL 异 丙 醇 320μL 乙 酸 甲 酯 350μL 乙 酸 乙 酯 65μL 甲 苯 和 285μL 二 甲 亚 砜, 置 于 装 有 适 量 甲 醇 的 25mL 量 瓶 中, 用 甲 醇 稀 释 到 刻 度, 混 匀, 作 为 标 准 贮 备 液 标 准 溶 液 的 配 制 溶 液 精 密 量 取 贮 备 液 1mL 置 25mL 量 瓶 中, 用 甲 醇 稀 释 到 刻 度, 摇 匀, 作 为 标 准 2 结 果 2.1 方 法 专 属 性 考 察 取 标 准 溶 液 按 和 空 白 溶 液 按 上 述 色 谱 条 件 进 行 测 定, 色 谱 分 离 图 谱 见 图 1 空 白 溶 剂 峰 不 干 扰 残 留 溶 剂 的 测 定, 各 残 留 溶 剂 的 分 离 度 均 大 于 线 性 关 系 试 验 精 密 移 取 贮 备 液 mL 置 25mL 量 瓶 中, 用 甲 醇 稀 释 到 刻 度, 混 匀, 制 成 一 系 列 浓 度 的 对 照 品 溶 液 分 别 取 2mL 溶 液 加 入 到 顶 空 瓶 中, 作 者 简 介 : 蔡 振 华 (1976-), 女, 江 苏 人, 助 理 研 究 员,Tel: , caizh@tjipr.com 206

212 密 封, 进 样 1mL, 记 录 色 谱 图, 以 峰 面 积 为 纵 坐 标 (Y), 对 照 品 浓 度 为 横 坐 标 ( X), 进 行 线 性 回 归 计 算 得 回 归 方 程 : 异 丙 醇 在 ~1.0048mg/mL 浓 度 范 围 内, Y= X, r=0.999 乙 酸 甲 酯 在 ~0.9956mg/mL 浓 度 范 围 内, Y= X, r=0.997 乙 酸 乙 酯 在 ~1.008 µ g/ml 浓 度 范 围 内, Y= X, r=0.999 甲 苯 在 ~0.1802mg/mL 浓 度 范 围 内, Y= X,r=0.997 二 甲 亚 砜 在 ~1.0032mg/mL 浓 度 范 围 内,Y= X, r=0.999 结 果 表 明 :5 种 溶 剂 线 性 关 系 良 好 2.3 精 密 度 试 验 取 标 准 溶 液 2mL 置 10mL 顶 空 瓶 中, 密 封, 连 续 进 样 5 次, 计 算 异 丙 醇 乙 酸 甲 酯 乙 酸 乙 酯 甲 苯 和 二 甲 亚 砜 峰 面 积 的 RSD 分 别 为 3.30% 2.66% 3.35% 3.60% 2.79%(n=5) 2.4 最 小 检 测 限 试 验 用 对 照 品 溶 液, 采 用 逐 步 稀 释 法 至 信 噪 比 约 为 3 时, 异 丙 醇 乙 酸 甲 酯 乙 酸 乙 酯 甲 苯 和 二 甲 亚 砜 的 最 小 检 测 浓 度 分 别 为 3.0µg/mL 3.0µg/mL 3.0µg/mL 2.0µg/mL 25.0µg/mL 2.5 回 收 率 试 验 取 DT 样 品 ( 01 批 ) 约 200mg 共 6 份, 精 密 称 定, 置 10mL 顶 空 瓶 中, 分 别 加 入 2.0mL 标 准 溶 液, 密 封 进 样 计 算 异 丙 醇 乙 酸 甲 酯 乙 酸 乙 酯 甲 苯 和 二 甲 亚 砜 平 均 回 收 率 (n=5) 分 别 为 % % % % %;RSD 分 别 为 2.32% 3.82% 1.93% 7.70% 7.30% 2.6 供 试 品 溶 液 的 测 定 取 本 品 约 200mg, 精 密 称 定, 置 10mL 顶 空 瓶 中, 加 甲 醇 2mL 溶 解, 加 塞 密 封, 进 样, 记 录 色 谱 图, 按 外 标 法 计 算 供 试 品 中 异 丙 醇 乙 酸 甲 酯 乙 酸 乙 酯 甲 苯 和 二 甲 亚 砜 的 残 留 量 结 果 见 表 1, 样 品 色 谱 图 谱 见 图 1 表 1 三 批 样 品 溶 剂 残 留 量 测 定 结 果 批 号 异 丙 醇 检 出 量 乙 酸 甲 酯 检 出 量 乙 酸 乙 酯 检 出 量 甲 苯 检 出 量 二 甲 亚 砜 检 出 量 ppm 280 ppm 1112 ppm 未 检 出 560 ppm ppm 373 ppm 719 ppm 未 检 出 569 ppm ppm 372 ppm 655 ppm 未 检 出 430 ppm 3 讨 论 药 物 中 的 残 留 溶 剂 是 指 在 合 成 原 料 药 或 制 剂 生 产 的 过 程 中 使 用 或 产 生 的 挥 发 性 有 机 化 学 物 质, 它 们 在 实 际 的 生 产 中 未 能 被 完 全 清 除 近 年 来, 药 品 中 残 存 的 有 机 溶 剂 的 毒 性 和 致 癌 作 用 日 益 引 起 重 视 根 据 新 药 审 批 的 要 求, 对 合 成 中 使 用 到 的 第 一 二 三 类 溶 剂 均 要 进 行 测 定 顶 空 进 样 分 析 的 优 点 是 :1 无 非 挥 发 性 组 分 对 进 样 口 和 色 谱 柱 的 污 染 ;2 增 加 了 挥 发 性 被 分 析 物 的 灵 敏 度, 可 分 析 固 体 以 及 液 体 样 品 中 的 挥 发 性 物 质 ;3 灵 敏 度 高, 能 进 行 准 确 的 定 量 分 析 207

213 空 白 溶 液 (A) 标 准 溶 液 (B) 样 品 溶 液 ( C) 图 1 空 白 溶 液 (A) 标 准 溶 液 (B) 与 样 品 溶 液 ( C) 的 色 谱 图 1. 空 白 溶 剂 - 甲 醇 2. 异 丙 醇 3. 乙 酸 甲 酯 4. 乙 酸 乙 酯 5. 甲 苯 6. 二 甲 亚 砜 参 考 文 献 [1] 国 家 药 典 委 员 会. 中 华 人 民 共 和 国 药 典 ( 二 部 )[M] 北 京 : 化 学 工 业 出 版 社, 2005: 附 录 54 Headspace GC Determination of Residual Organic Solvents in DT CAI Zhen-hua LI Yue-peng JIANG Qing-feng (Tianjin Institute of Pharmaceutical Research,Tianjin,300193) Abstract:Objective: To establish a method for determing the residual organic solvents in DT. Methods : The residual organic solvents were quantitatively determined by temperature programmed using headspace injector and a flame-ionization detector. The capillary column was HP-624. The initial column temperature was kept at 40 for 4min, then raised to 200 at the rate of 20 /min. Results:There was a good liner in the experimental concentration. The average recoveries were %,103.55%,105.42%,101.37%, %. Conclusion: The proposed method is easily operative and simple, accurate and rapid with good sensitivity. Key Words:Headspace; GC; DT; residual organic solvents 208

214 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 顶 空 气 相 色 谱 法 测 定 HHL 中 大 孔 树 脂 有 机 溶 剂 残 留 量 金 松 子 1 2 1, 胡 佰 艳, 蔡 振 华 蒋 庆 峰 1 (1. 天 津 药 物 研 究 院 分 析 测 试 中 心 ; 2. 河 南 大 学 药 学 院, 开 封,475001) 大 孔 吸 附 树 脂 (maeroporous resin) 是 20 世 纪 60 年 代 末 发 展 起 来 的 一 类 有 机 高 聚 物 吸 附 [1] 剂, 具 有 多 孔 网 状 结 构 和 较 好 的 吸 附 性 能 近 年 来, 大 孔 吸 附 树 脂 已 广 泛 用 于 制 剂 和 天 然 植 物 中 活 性 成 分 ( 如 皂 苷 总 黄 酮 内 酯 生 物 碱 等 大 分 子 化 合 物 ) 的 提 取 分 离 与 纯 化, 但 大 孔 树 脂 在 制 造 过 程 中, 能 带 来 少 量 的 苯 二 甲 苯 苯 乙 烯 等 一 些 有 机 有 害 成 分, 从 而 造 成 被 提 取 纯 化 出 来 的 提 取 物 中 有 有 害 物 质 残 留 的 风 险 因 此, 建 立 大 孔 树 脂 有 机 残 留 的 检 测 方 法 很 有 必 要 [2] 中 药 HHL 是 玄 参 科 植 物 的 干 燥 根 茎, 具 有 清 湿 热 除 骨 蒸 消 疳 热 等 功 效 在 HHL 提 取 物 的 制 备 工 艺 中 使 用 了 苯 乙 烯 骨 架 型 大 孔 吸 附 树 脂 根 据 国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 局 的 要 求, 这 种 吸 附 树 脂 应 检 测 的 残 留 有 机 物 主 要 有 7 种 : 正 己 烷 苯 甲 苯 二 甲 苯 苯 乙 烯 二 乙 烯 基 苯 和 二 乙 基 苯, 同 时 在 提 取 制 备 过 程 中 使 用 到 乙 醇 乙 酸 乙 酯 和 正 十 二 烷 也 应 检 测 本 文 采 用 气 相 色 谱 法 测 定 HHL 中 大 孔 树 脂 有 机 溶 剂 以 及 提 取 过 程 中 使 用 到 的 有 机 溶 剂 残 留 物, 其 线 性 回 收 率 较 好, 灵 敏 度 高 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 与 试 剂 HP 6890N 气 相 色 谱 仪,Agilent 7694E 顶 空 进 样 器, 氢 火 焰 离 子 化 检 测 器 (FID), 载 气 为 氮 气 ( % ), DM -624 毛 细 管 柱 (30.0m 0.53mm 3.00µm) (6%- 氰 丙 基 苯 -94%- 二 甲 基 硅 氧 烷 共 聚 物 ); 乙 醇 乙 酸 乙 酯 正 己 烷 苯 甲 苯 二 甲 苯 苯 乙 烯 二 乙 基 苯 二 乙 烯 基 苯 正 十 二 烷 N,N- 二 甲 基 甲 酰 胺 ( 分 析 纯 ) 蒸 馏 水 样 品 共 5 批, 由 天 津 药 物 研 究 院 提 供 1.2 顶 空 条 件 取 2mL 溶 液 于 10mL 顶 空 瓶 中, 顶 空 平 衡 温 度 为 80, 平 衡 时 间 50min, 轻 微 振 荡, 进 样 体 积 1mL 1.3 色 谱 条 件 柱 温 采 用 程 序 升 温 : 以 40 维 持 5 分 钟, 以 6 /min 的 升 温 速 率 升 温 至 190, 维 持 10 分 钟, 再 以 10 /min 的 升 温 速 率 升 温 至 200, 维 持 1 分 钟 气 化 室 温 度 为 250, 载 气 ( 氮 气 ) 流 速 为 2.5mL/min, 分 流 比 1:1, 氢 火 焰 离 子 化 检 测 器 (FID), 检 测 器 温 度 为 250, 进 样 量 为 1mL 1.4 溶 液 的 配 制 分 别 精 密 移 取 乙 醇 2.2ml 正 己 烷 11μL 乙 酸 乙 酯 1.9mL 苯 (1 10, 用 二 甲 基 甲 酰 胺 稀 释 )8μL 甲 苯 8μL 二 甲 苯 7μL 苯 乙 烯 8μL 二 乙 基 苯 8μL 二 乙 烯 基 苯 7.5μL 正 十 二 烷 9μL 到 装 有 适 量 二 甲 基 甲 酰 胺 的 100mL 量 瓶 中, 用 二 甲 基 甲 酰 胺 稀 释 到 刻 度, 混 匀, 即 得 标 准 贮 备 液 ; 精 密 量 取 此 液 5mL 置 装 有 适 量 50% 二 甲 基 甲 酰 胺 水 溶 液 的 50mL 量 瓶 中, 用 50% 二 甲 基 甲 酰 胺 水 溶 液 稀 释 到 刻 度, 混 匀, 即 得 标 准 溶 液 作 者 简 介 : 金 松 子 (1970-), 女, 吉 林 人, 副 研 究 员,Tel: , jinsz@tjipr.com 209

215 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 2 结 果 2.1 标 准 曲 线 的 绘 制 取 标 准 溶 液 2mL 置 10mL 顶 空 瓶 中, 加 盖 密 封 按 上 述 色 谱 条 件 进 行 测 定 各 溶 剂 的 残 留 限 度 及 保 留 时 间 见 下 表 1 表 1 溶 剂 的 残 留 限 度 及 保 留 时 间 溶 剂 残 留 限 度 (ppm) 保 留 时 间 (min) 乙 醇 正 己 烷 乙 酸 乙 酯 苯 甲 苯 二 甲 苯 苯 乙 烯 二 乙 基 苯 二 乙 烯 基 苯 正 十 二 烷 分 别 移 取 标 准 贮 备 液 mL 置 50mL 量 瓶 中, 用 50% 二 甲 基 甲 酰 胺 水 溶 液 稀 释 到 刻 度, 混 匀 取 01 批 样 品 700mg 共 5 份, 精 密 称 定, 分 别 依 次 加 入 上 述 标 准 溶 液, 密 封 后 混 匀, 进 行 测 定 分 别 取 2mL 溶 液 加 入 到 顶 空 瓶 中, 密 封, 进 样 1mL 以 各 溶 剂 峰 的 峰 面 积 (Y) 对 质 量 浓 度 (X) 进 行 线 性 回 归, 结 果 见 表 2 表 2 线 性 范 围 与 回 归 方 程 溶 剂 限 度 范 围 (μg/ml) 回 归 方 程 相 关 系 数 乙 醇 ~ Y= X r=0.998 正 己 烷 ~ Y= X r=0.999 乙 酸 乙 酯 ~ Y= X r=0.994 苯 ~ Y= X r=0.990 甲 苯 ~ Y= X r=0.987 二 甲 苯 ~ Y= X r=0.989 苯 乙 烯 ~ Y= X r=0.983 二 乙 基 苯 ~ Y= X r=0.991 二 乙 烯 基 苯 ~ Y= X r=0.993 正 十 二 烷 ~ Y= X r= 精 密 度 的 测 定 取 01 批 样 品 700mg 共 6 份, 精 密 称 定, 分 别 加 入 标 准 溶 液 2mL 置 10mL 顶 空 瓶 中, 密 封 后 混 匀 连 续 进 样 6 次 计 算 乙 醇 正 己 烷 乙 酸 乙 酯 苯 甲 苯 二 甲 苯 苯 乙 烯 二 乙 基 苯 二 乙 烯 基 苯 正 十 二 烷 的 峰 面 积 的 RSD 为 5.19% 10.27% 8.48% 8.70% 8.08% 6.84% 5.45% 6.36% 3.52% 13.92% 2.3 样 品 中 残 留 溶 剂 的 回 收 率 分 别 取 标 准 贮 备 液 4.0mL 5.0mL 6.0mL 置 装 有 适 量 50% 二 甲 基 甲 酰 胺 水 溶 液 的 50mL 量 瓶 中, 用 50% 二 甲 基 甲 酰 胺 水 溶 液 稀 释 到 刻 度, 摇 匀, 配 成 已 知 浓 度 的 标 准 溶 液 取 01 批 样 品 700mg 共 9 份, 精 密 称 定, 分 别 加 入 上 述 标 准 溶 液, 密 封 后 混 匀, 进 行 测 定 在 此 试 验 条 件 下, 乙 醇 正 己 烷 乙 酸 乙 酯 苯 甲 苯 二 甲 苯 苯 乙 烯 二 乙 基 苯 210

216 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 二 乙 烯 基 苯 正 十 二 烷 的 回 收 率 分 别 为 % % % % % % % % % RSD 分 别 为 4.41% 7.62% 6.05% 5.96% 6.91% 10.78% 4.74% 6.65% 5.16% 10.06% 2.4 最 小 检 测 限 试 验 取 标 准 溶 液 用 溶 剂 逐 步 稀 释, 以 信 噪 比 S/N=3 计 算 检 测 限 在 此 试 验 条 件 下, 乙 醇 正 己 烷 乙 酸 乙 酯 苯 甲 苯 二 甲 苯 苯 乙 烯 二 乙 基 苯 二 乙 烯 基 苯 正 十 二 烷 的 最 小 检 测 浓 度 分 别 为 1.74μg/mL 0.07μg/mL 0.34μg/mL 0.07μg/mL 0.07μg/mL 0.68μg/mL 0.14μg/mL 0.69μg/mL 1.38μg/mL 0.67μg/mL 2.5 样 品 测 定 精 密 称 取 01 批 样 品 700mg 置 顶 空 瓶 中, 加 2mL 标 准 溶 液, 加 盖 密 封, 溶 解 混 匀, 即 为 加 样 标 准 溶 液 取 五 批 样 品, 精 密 称 取 700mg 到 顶 空 瓶 中, 加 50% 二 甲 基 甲 酰 胺 水 溶 液 2mL 溶 解 混 匀, 加 盖 密 封, 按 上 述 色 谱 条 件 以 外 标 法 进 行 测 定 结 果 见 表 3 五 批 样 品 中 正 己 烷 苯 二 乙 基 苯 二 乙 烯 基 苯 正 十 二 烷 均 未 检 出, 而 所 检 出 的 乙 醇 乙 酸 乙 酯 甲 苯 二 甲 苯 苯 乙 烯 含 量 均 符 合 中 国 药 典 2005 年 版 标 准 样 品 色 谱 图 见 图 1 a 空 白 溶 剂 图 b 标 准 溶 液 图 c HHL 样 品 图 图 1 残 留 溶 剂 测 定 的 气 相 色 谱 图 211

217 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 表 3 三 批 样 品 溶 剂 残 留 量 测 定 结 果 批 号 乙 醇 乙 酸 乙 酯 甲 苯 二 甲 苯 苯 乙 烯 含 量 ppm 1700ppm 7.5ppm 4.3ppm 2.6ppm ppm 1600ppm 7.4ppm 4.2ppm 2.6ppm ppm 1600ppm 7.3ppm 4.4ppm 2.7ppm ppm 1600ppm 7.1ppm 4.0ppm 2.9ppm ppm 1500ppm 6.8ppm 3.9ppm 2.5ppm 3 讨 论 大 孔 树 脂 残 留 物 在 有 机 溶 剂 ( 如 DMF DMSO) 中 的 溶 解 性 好, 但 采 用 纯 有 机 溶 剂 会 使 这 些 残 留 物 在 液 一 气 两 相 中 的 分 配 系 数 K 增 加, 导 致 检 测 灵 敏 度 下 降 因 此, 采 用 DMF 一 水 混 合 溶 剂, 既 保 证 了 待 测 残 留 物 与 样 品 都 能 溶 解, 又 增 大 了 残 留 物 在 顶 空 气 体 中 的 浓 度, 使 分 析 灵 敏 度 提 高 由 于 样 品 存 在 较 严 重 的 基 质 效 应, 因 此, 根 据 中 国 药 典 的 相 关 要 求, 采 用 了 标 准 溶 液 加 入 法 以 消 除 基 质 效 应 的 影 响 参 考 文 献 [1] 马 振 山. 大 孔 吸 附 树 脂 在 药 学 研 究 领 域 的 应 用 [J]. 中 成 药,1997,19(12):40. [2] 苗 明 三, 李 振 国. 现 代 实 用 中 药 质 量 控 制 技 术 [M]. 北 京 : 人 民 卫 生 出 版 社,2000.7l9. Determination of macro-porous resin residua in HHL by Headspace Capillary Gas Chromatography JIN Song-zi 1, HU Bai-yan 2, CAI Zhen-hua 1, JIANG Qing-feng 1 (1. Tianjin institute of Pharmaceutical Research, Tianjin, , China; 2. Pharmacy college of Henan University, Kaifeng, , China) Abstract To establish a method for the detecting the residual organic solvents of macro-porous resin in HHL by headspace capillary gas chromatography.a DB-624 capilary column was used with nitrogen gas as carrier and FID as detector. Solvent media was DMF. The organic residuals including ethanol, n-hexane, acetidin, benzene, methyl-benzene, diethyl-benzene, evinyl-benzen, divinylbenzene and dodecane picrorhiza were completely separated.there was a good linearity in the experimental concentration, The average recoveries of the 10 residua were in the range of 89.5%~110%, their RSDs were 3.54%~11.50%, and the detection limits of 0.07~1.74μg/ml. Key words: HHL; Headspace GC; macro-porous resin residues 212

218 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 GC-MS 法 评 估 陈 皮 原 料 品 质 周 德 英 1, 刘 志 华 2 (1. 天 津 中 新 药 业 隆 顺 榕 制 药 厂, 天 津 ;2. 河 北 工 业 大 学 化 工 学 院, 天 津 ) 陈 皮 (Pericarpium citri reticulatae) 为 芸 香 科 植 物 橘 (Citrus reticulata Blanco) 及 其 栽 培 变 种 的 干 燥 成 熟 果 皮, 药 材 分 为 陈 皮 和 广 陈 皮 陈 皮 气 香, 味 辛 苦, 性 温 具 有 理 气 健 脾 燥 湿 化 痰 的 功 能 [1], 主 要 含 挥 发 油 黄 酮 类 生 物 碱 肌 醇 等 成 分 挥 发 油 中 主 要 含 柠 檬 烯 (Limonene), 黄 酮 类 主 要 为 橙 皮 苷 (Hesperidin) [2] 陈 皮 挥 发 油 对 胃 肠 道 有 温 和 的 刺 激 作 用 ; 对 呼 吸 道 有 刺 激 性 被 动 祛 痰 的 作 用 其 醇 提 物 平 喘 效 果 较 好 [3] 除 配 方 使 用 外, 还 是 多 种 理 气 健 脾 和 燥 湿 化 痰 类 中 成 药 的 重 要 组 成 药 味 近 年 来 随 着 先 进 的 仪 器 分 析 手 段, 如 气 相 色 谱 - 质 谱 联 用 仪 (GC-MS) 等 引 入 中 医 药 领 域, 陈 皮 的 化 学 成 分 进 一 步 明 确 陈 有 根 等 通 过 气 相 色 谱 - 质 谱 法 研 究 了 不 同 产 地 陈 皮 所 含 挥 发 油 产 分 含 量 差 异 [4] 易 伦 朝 等 用 同 样 方 法 验 证 了 陈 久 者 良 的 说 法 [5] 严 寒 静 等 对 广 陈 皮 挥 发 油 成 分 分 析, 也 鉴 定 了 茶 枝 柑 中 20 种 化 学 成 分, 行 柑 中 11 种 化 学 成 分 [6] 宋 辉 和 史 东 恒 分 别 对 陈 皮 的 炮 制 和 加 工 工 艺 进 行 了 研 究, 获 得 了 最 佳 炮 制 工 艺 和 根 据 临 床 需 要 进 行 陈 皮 炮 制 的 改 进 方 法, 有 效 提 高 了 有 效 成 分 的 提 取 率 [7] [8] 目 前 还 没 有 文 献 报 导 有 关 市 售 陈 皮 有 效 成 分 批 间 差 异 和 根 据 该 差 异 控 制 陈 皮 的 内 在 品 质 和 根 据 临 床 需 要 进 行 品 质 鉴 定 的 方 法 使 用 气 相 色 谱 - 质 谱 联 用 的 方 法 分 析 药 用 植 物 有 效 成 分 的 指 纹 图 谱 法 正 在 逐 步 成 为 目 前 控 制 药 用 植 物 材 料 及 其 制 剂 质 量 的 重 要 手 段 本 文 使 用 上 述 方 法 对 三 批 市 售 陈 皮 的 挥 发 油 成 分 进 行 了 初 步 分 析, 这 些 结 果 对 制 定 陈 皮 原 料 及 以 陈 皮 为 原 料 的 制 品 标 准 提 供 了 重 要 线 索, 尤 其 在 药 用 植 物 有 效 成 分 的 提 取 和 质 量 控 制 上 有 着 现 实 意 义 1 仪 器 与 材 料 1.1 仪 器 菲 尼 根 TRACE-DSQ 型 气 相 色 谱 - 质 谱 联 用 仪 (GC-MS),DB-5 弹 性 石 英 毛 细 管 色 谱 柱 1.2 材 料 试 验 所 用 材 料 陈 皮 为 市 售 样 品, 根 据 不 同 采 样 点, 分 别 把 样 品 编 为 三 个 批 号, 它 们 分 别 是 样 品 样 品 和 样 品 本 文 所 用 试 剂 均 为 国 产 色 谱 纯 2 实 验 方 法 及 结 果 2.1 挥 发 油 的 提 取 按 中 国 药 典 (2005 年 版 ) 附 录 XD 挥 发 油 测 定 法 甲 法 提 取 挥 发 油 [1]XD57, 收 集 备 用 从 不 同 样 品 里 提 取 的 挥 发 油 分 别 按 照 其 原 料 批 号 命 名 为 提 取 物 , 提 取 物 , 提 取 物 出 油 率 分 别 为 1.22%,1.36%,1.27% 2.2 GC-MS 分 析 条 件 色 谱 柱 为 DB-5 弹 性 石 英 毛 细 管 柱 (50m 0.25mm 0.25μm), 初 始 温 度 40, 停 留 3.5 min; 程 序 升 温 5 至 240 用 时 14 min,240 保 持 8 min ; 气 化 室 温 度 250 ; 进 样 量 0.05 μl ; 分 流 比 30:1; 载 气 为 高 纯 氦 气, 接 口 温 度 为 200 质 谱 条 件 :EI 离 子 源, 离 子 源 温 度 200, 电 子 能 量 70eV, 扫 描 质 量 范 围 40~500u 标 准 图 库 NIST,16 万 张 作 者 简 介 : 周 德 英 (1974- ), 女, 天 津 人, 高 级 工 程 师,Tel: , zhoudeying7477@eyou.com 213

219 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 2.3 供 试 品 液 的 制 备 把 上 述 三 种 挥 发 油 提 取 物 分 别 用 无 水 硫 酸 钠 干 燥 所 得 产 品 分 别 命 名 为 供 试 品 , 供 试 品 和 供 试 品 重 复 性 稳 定 性 和 重 现 性 试 验 取 供 试 品 进 行 分 析, 连 续 重 复 进 样 5 次, 获 得 10 个 特 征 峰 ( 面 积 归 一 化 浓 度 大 于 0.5%) 且 每 个 峰 相 对 保 留 时 间 RSD 均 小 于 0.5%, 相 对 含 量 RSD 均 小 于 2%, 数 据 结 果 表 明 仪 器 及 色 谱 条 件 精 密 度 良 好, 适 合 本 样 品 的 检 测 取 供 试 品 放 置 于 室 温, 分 别 于 h 进 样, 每 次 检 测 出 现 的 10 个 特 征 峰 相 对 保 留 时 间 RSD 均 小 于 0.5%, 相 对 含 量 RSD 均 小 于 2%, 这 些 数 据 结 果 表 明 样 品 在 24 小 时 内 取 供 试 品 液 成 分 无 显 著 变 化, 样 品 稳 定 性 较 好 取 样 品 , 将 其 分 为 5 份, 分 别 提 取 挥 发 油 后, 得 到 五 种 供 试 品 液, 分 别 命 名 为 供 试 品 , 供 试 品 , 供 试 品 , 供 试 品 , 供 试 品 把 这 五 种 供 试 品 液 分 别 按 照 2.2 的 条 件 上 样 分 析, 每 个 供 试 品 都 出 现 10 个 特 征 峰 五 种 供 试 品 的 10 个 特 征 峰 相 对 保 留 时 间 RSD 均 小 于 0.5%, 相 对 含 量 RSD 均 小 于 2%, 数 据 结 果 表 明 陈 皮 挥 发 油 的 提 取 方 法 和 检 测 重 现 性 良 好, 建 立 的 方 法 可 以 作 为 陈 皮 的 指 纹 图 谱 质 量 标 准 3. 样 品 的 检 测 把 从 2.3 得 到 的 三 种 供 试 品 液 分 别 按 上 述 方 法 分 别 进 样 分 析, 每 个 供 试 品 液 的 10 个 主 要 成 分 的 ( 面 积 归 一 化 浓 度 0.5% 以 上 ) 相 对 含 量 见 表 1, 供 试 品 的 挥 发 油 GC 指 纹 图 谱 见 图 1 表 1 不 同 批 次 陈 皮 样 品 挥 发 油 主 要 成 分 相 对 含 量 (%) 批 号 峰 号 R T : Relative abundance T i m e ( m i n ) 图 1 供 试 品 挥 发 油 气 相 色 谱 指 纹 图 谱 4. 主 要 色 谱 峰 分 析 用 菲 尼 根 TRACE-DSQ 型 气 相 色 谱 - 质 谱 联 用 仪 检 测 并 分 析 供 试 品 , 然 后 对 检 测 到 的 10 个 特 征 色 谱 峰 进 行 鉴 别, 结 果 如 表 2 所 示 5 结 论 与 讨 论 经 实 验 研 究 建 立 的 指 纹 图 谱 重 复 性 良 好, 稳 定 性 和 重 现 性 能 够 满 足 实 验 要 求, 通 过 对 不 同 批 次 的 陈 皮 挥 发 油 气 相 色 谱 图 进 行 分 析, 发 现 有 10 个 共 有 峰 含 量 较 高, 特 征 明 显, 具 有 214

220 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 代 表 性, 他 们 的 峰 位 和 大 致 的 比 例 关 系, 能 够 作 为 一 个 整 体, 较 清 楚 地 显 示 出 指 纹 图 谱 的 特 有 属 性, 适 合 作 为 评 价 指 标 峰 进 行 品 质 的 鉴 定, 样 品 之 间 的 差 异 未 影 响 指 纹 图 谱 的 整 体 特 征 使 用 气 相 色 谱 - 质 谱 联 用 的 方 法 分 析 药 用 植 物 有 效 成 分 的 指 纹 图 谱 法 正 在 逐 步 成 为 目 前 控 制 药 用 植 物 材 料 及 其 制 剂 质 量 的 重 要 手 段 通 过 对 10 个 共 有 化 学 成 分 之 间 比 例 的 测 定 确 定 了 陈 皮 原 料 的 品 质 鉴 定 方 法, 建 立 了 原 料 的 质 量 标 准 这 些 结 果 对 制 定 陈 皮 原 料 及 以 陈 皮 为 原 料 的 制 品 标 准 提 供 了 重 要 线 索, 尤 其 在 药 用 植 物 有 效 成 分 的 提 取 和 质 量 控 制 上 有 着 现 实 意 义 表 2 陈 皮 (061208) 挥 发 油 GC-MS 分 析 结 果 序 号 保 留 时 间 分 子 式 C10H16 C10H16 C10H16 C10H16 C10H14 C10H16 C10H16 C10H18O C10H18O C9H11NO2 分 子 量 化 合 物 名 称 α- 蒎 烯 2,6, 6- 三 甲 基 二 环 - (3,1, 1)-2- 庚 烯 β- 蒎 烯 6,6- 二 甲 基 -2- 亚 甲 基 降 蒎 烷 β- 月 桂 烯 7 甲 基 3 亚 甲 基 1, 6 辛 二 烯 萜 品 烯 1- 甲 基 -4-(1- 甲 基 乙 基 )-1,3- 己 二 烯 对 伞 花 烃 1- 甲 基 -4-(1- 甲 基 乙 基 ) 苯 柠 檬 烯 1- 甲 基 -1-(1- 甲 基 乙 烯 基 ) 环 己 烯 异 萜 品 烯 1- 甲 基 -4-(1- 甲 基 亚 乙 基 ) 环 己 烯 4- 萜 品 醇 2-(4- 甲 基 -3- 环 己 烯 基 )-2- 丙 醇 α- 松 油 醇 (S)-α,α-4- 三 甲 基 -3- 环 己 烯 -1- 甲 醇 2- 甲 氨 基 - 苯 甲 酸 甲 酯 参 考 文 献 : [1] 国 家 药 典 委 员 会. [S] 中 华 人 民 共 和 国 药 典 2005 版 ( 一 部 ). 北 京 : 化 学 工 业 出 版 社, 2005: [2] 欧 立 娟, 刘 启 德. [J] 陈 皮 药 理 作 用 研 究 进 展. 中 国 药 房. 2006, 17(5): [3] 张 志 海, 王 彩 云, 杨 天 鸣 等. [J] 陈 皮 化 学 成 分 及 药 理 作 用 研 究 进 展. 西 北 药 学 杂 志,2005,20(1):47. [4] 陈 有 根, 范 崔 生. [J]4 种 陈 皮 药 材 挥 发 油 成 分 的 研 究. 江 西 中 医 学 院 学 报,1998,10(2): [5] 易 伦 朝, 谢 培 山, 梁 逸 曾. [J]GC-MS 和 HPLC 对 陈 皮 陈 久 者 良 的 验 证. 中 国 药 学 杂 志,2005,40(21): [6] 严 寒 静, 房 志 坚, 黄 宁, 等. [J] 中 药 陈 皮 挥 发 油 的 成 分 分 析. 广 东 药 学,2001,11(1):17-18 [7] 宋 辉, 陈 友 国. [J] 用 正 交 试 验 探 讨 陈 皮 的 炮 制. 中 药 材,1993,16(9): [8] 史 东 恒, 张 锡 耀. [J] 切 制 陈 皮. 中 国 中 药 杂 志,1992,17(8): Detection of Essential Oils from Pericarpium Citri Reticulatae by GC-MS ZHOU De-ying 1, LIU Zhi-hua 2 (1.Tianjin Zhongxin Pharmaceutical Longshunrong Manufactory,Tianjin ,China; 2. School of Chemical Engineering,Hebei Industrial University,Tianjin ,China) Abstract: [Objective]The main component of Pericarpium citri reticulatae is essential oils. It is necessary to establish the quantitative determination on Pericarpium citri reticulatae content. [Method]The essential oil was analyzed quantitatively and qualitatively on GC-MS instrument; For controlling the quality, GC fingerprint of essential oil from Pericarpium citri reticulatae was set up.[results]ten compounds including limonene were identified in three samples sold in the market. [Conclusion] The fingerprint and percentage of limonene can help distinguish the quality and assess the differences of Pericarpium citri reticulatae. Key words: Pericarpium citri reticulatae;essential oils;gc fingerprint 215

221 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 超 临 界 CO2 萃 取 法 与 水 蒸 气 蒸 馏 法 提 取 陈 皮 挥 发 油 的 化 学 成 分 比 较 周 德 英 1, 刘 志 华 2 (1. 天 津 中 新 药 业 隆 顺 榕 制 药 厂, 天 津 ;2. 河 北 工 业 大 学 化 工 学 院, 天 津 ) 陈 皮 (Pericarpium citri reticulatae) 为 芸 香 科 植 物 橘 (Citrus reticulata Blanco) 及 其 栽 培 变 种 的 干 燥 成 熟 果 皮, 药 材 分 为 陈 皮 和 广 陈 皮 具 有 理 气 健 脾 燥 湿 化 痰 的 功 能 [1], 主 要 含 挥 发 油 黄 酮 类 生 物 碱 肌 醇 等 成 分 挥 发 油 中 主 要 含 柠 檬 烯 (Limonene), 黄 酮 类 主 要 为 橙 皮 苷 (Hesperidin) [2] 陈 皮 挥 发 油 对 胃 肠 道 有 温 和 的 刺 激 作 用 ; 对 呼 吸 道 有 刺 激 性 被 动 祛 痰 的 作 用 陈 皮 煎 剂 对 支 气 管 有 微 弱 的 扩 张 作 用, 其 醇 提 物 平 喘 效 果 较 好 [3] ; 对 心 脏 有 兴 奋 作 用, 能 增 强 心 肌 收 缩 力 扩 张 冠 状 动 脉 升 高 血 压 提 高 机 体 应 激 能 力 ; 陈 皮 提 取 液 具 有 延 缓 衰 老 及 提 高 生 命 活 力 的 作 用, 可 能 与 抗 氧 化 有 关 近 年 来 随 着 先 进 的 化 学 分 析 仪 器, 如 气 相 色 谱 - 质 谱 联 用 仪 (GC-MS) 等 引 入 中 医 药 领 域 超 临 界 萃 取 技 术 是 一 项 集 提 取 分 离 浓 缩 为 一 体 的 新 技 术 尤 其 CO2 无 色 无 毒, 廉 价 易 得, 临 界 压 力 低, 并 且 临 界 温 度 也 接 近 常 温, 因 此 超 临 界 CO2 萃 取 技 术 在 药 用 植 物 有 [4-6] 效 成 分 提 取 工 艺 改 进 中 的 得 到 越 来 越 广 泛 的 应 用 本 实 验 分 别 采 用 了 超 临 界 CO2 萃 取 (SCDE) 法 和 水 蒸 气 蒸 馏 (SD) 法 从 陈 皮 中 提 取 挥 发 油, 并 用 GC-MS 法 对 两 种 不 同 提 取 方 法 获 得 的 提 取 物 进 行 化 学 成 分 定 性 和 定 量 比 较 1 仪 器 与 样 品 1.1 仪 器 HA 型 超 临 界 萃 取 装 置, 江 苏 南 通 华 安 超 临 界 萃 取 有 限 公 司 生 产 ; 多 功 能 提 取 器, 衡 阳 市 金 山 中 药 设 备 制 造 有 限 公 司 生 产 ; 菲 尼 根 TRACE-DSQ 型 气 相 色 谱 - 质 谱 联 用 仪 (GC-MS), 美 国 热 电 公 司 1.2 样 品 陈 皮 为 市 售 样 品 处 理 方 法 为 粉 碎 后 过 1 号 筛 2 实 验 方 法 2.1 超 临 界 CO2 萃 取 法 取 200g 样 品 装 入 萃 取 釜 中 在 萃 取 压 力 15Mpa, 萃 取 温 度 为 40, CO2 流 量 为 18 L/h, 选 用 90% 的 乙 醇 为 夹 带 剂 的 条 件 下 萃 取 2h, 收 集 陈 皮 挥 发 油 重 复 3 次, 计 算 平 均 出 油 率 2.2 水 蒸 气 蒸 馏 法 取 200g 样 品, 按 中 国 药 典 (2005 版 ) 附 录 挥 发 油 测 定 法 甲 法 提 取 挥 发 油 [2] 重 复 3 次, 计 算 平 均 出 油 率 2.3 GC-MS 分 析 条 件 气 相 色 谱 : 色 谱 柱 为 DB-5 弹 性 石 英 毛 细 管 柱 (50m 0.25mm 0.25um), 初 始 温 度 50, 停 留 3 min; 程 序 升 温 20 /min 至 250, 保 持 5 min; 气 化 室 温 度 260 ; 进 样 量 0.05μl; 分 流 比 30 1; 载 气 为 高 纯 氦 气 质 谱 条 件 :EI 离 子 源, 离 子 源 温 度 200, 电 子 能 量 70eV, 扫 描 范 围 30~500u 标 准 质 谱 图 库 NIST(16 万 张 ) 3 结 果 3.1 不 同 提 取 方 法 对 陈 皮 油 出 油 率 的 影 响 作 者 简 介 : 周 德 英 (1974- ), 女, 天 津 人, 高 级 工 程 师,Tel: , zhoudeying7477@eyou.com 216

222 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 Relative abundance Relative abundance 不 同 提 取 方 法 对 陈 皮 挥 发 油 出 油 率 和 性 状 的 影 响 如 表 1 所 示 由 表 1 可 见,SCDE 法 提 取 陈 皮 挥 发 油 所 需 时 间 较 短,SD 法 所 需 时 间 较 长 ; 而 前 者 出 油 率 是 后 者 的 1.30 倍, 分 别 为 1.67% 和 1.28%; 两 种 提 取 方 法 所 得 到 的 陈 皮 挥 发 油 的 性 状 也 不 同, 使 用 前 者 提 取 得 到 的 是 浅 黄 色 油 状 物, 使 用 后 者 提 取 得 到 的 是 几 乎 无 色 油 状 物 表 1 SCDE 法 与 SD 法 提 取 广 藿 香 油 对 比 提 取 方 法 提 取 时 间 /h 出 油 率 % 性 状 SCDE 浅 黄 色 油 状 物 SD 几 乎 无 色 油 状 物 3.2 不 同 提 取 方 法 所 得 提 取 物 中 化 学 成 分 的 定 性 和 定 量 比 较 按 2.3 所 述 GC-MS 条 件 对 两 种 提 取 方 法 所 得 产 物 进 行 分 析, 得 总 离 子 流 图, 如 图 1 和 图 2 所 示 运 用 色 谱 数 据 处 理 系 统, 对 陈 皮 挥 发 油 各 组 分 进 行 面 积 归 一 化 可 得 各 组 分 相 对 含 量 SCDE 法 提 取 的 陈 皮 挥 发 油 中 共 分 离 出 11 种 相 对 含 量 大 于 0.5% 的 化 合 物, 该 11 种 化 合 物 峰 面 积 之 和 占 色 谱 出 峰 总 面 积 的 99% 以 上, 且 均 可 得 到 质 谱 鉴 定 SD 法 提 取 的 陈 皮 挥 发 油 中 共 分 离 出 10 种 相 对 含 量 大 于 0.5% 的 化 合 物, 该 10 种 化 合 物 峰 面 积 之 和 占 色 谱 出 峰 总 面 积 的 97% 以 上, 也 可 得 到 质 谱 鉴 定 RT: Time (min) RT: 图 陈 皮 蒸 馏 产 物 的 气 相 色 谱 - 质 谱 总 离 子 流 图 Time (min) 图 2 陈 皮 超 临 界 CO2 萃 取 产 物 的 气 相 色 谱 - 质 谱 总 离 子 流 图 两 种 提 取 方 法 所 得 化 合 物 成 分 定 性 及 每 种 化 合 物 相 对 含 量 对 比 如 表 2 所 示 4 讨 论 两 种 提 取 方 法 得 到 的 挥 发 油 的 组 分 及 含 量 相 差 较 大, 面 积 百 分 含 量 大 于 0.5% 的 物 质 有 十 余 种, 并 且 各 成 分 的 含 量 也 相 差 较 大 运 用 SCDE 法 提 取 所 能 得 到 的 β- 水 芹 烯, 石 竹 烯 虽 含 量 较 低, 但 SD 法 提 取 时 均 未 检 出 ( 相 对 含 量 低 于 0.5%); 运 用 SD 法 提 取 所 能 得 到 的 β- 蒎 烯,2- 甲 氨 基 - 苯 甲 酸 甲 酯 在 SCDE 法 提 取 时 也 未 检 出 运 用 SCDE 法 所 提 取 到 的 陈 皮 挥 发 油 中 沸 点 高, 相 对 分 子 质 量 较 大 的 成 分 比 SD 法 多 SCDE 法 提 取 过 程 在 密 闭 系 统 中 进 行, 且 操 作 温 度 低, 因 此 烯 类 成 分 不 易 损 失, 热 不 稳 定 成 分 及 易 氧 化 的 组 分 也 不 会 受 到 破 坏, 217

223 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 出 油 率 也 高 于 SD 法 1.30 倍 从 出 油 率 和 成 分 定 性 定 量 结 果 上 分 析,SCDE 法 提 取 过 程 优 于 SD 法 提 取 过 程 表 2 超 临 界 CO2 萃 取 法 和 水 蒸 气 蒸 馏 法 提 取 得 到 陈 皮 挥 发 油 化 学 成 分 对 比 序 号 SCDE 保 留 时 间 SD 化 合 物 名 称 分 子 式 分 子 量 SCDE 百 分 含 量 % SD α- 蒎 烯 C10H β- 水 芹 烯 C10H 未 检 出 β- 蒎 烯 C10H 未 检 出 β- 月 桂 烯 C10H 萜 品 烯 C10H 对 伞 花 烃 C10H 柠 檬 烯 C10H 异 萜 品 烯 C10H 石 竹 烯 C15H 未 检 出 萜 品 醇 C10H18O α- 松 油 醇 C10H18O γ- 榄 香 烯 C15H 未 检 出 甲 氨 基 - 苯 甲 酸 甲 酯 C9H11O2 151 未 检 出 1.49 面 积 百 分 含 量 ( 合 计 ) 参 考 文 献 : [1] 国 家 药 典 委 员 会. [S] 中 华 人 民 共 和 国 药 典 2005 版 ( 一 部 ). 北 京 : 化 学 工 业 出 版 社, 2005:30-31 [2] 欧 立 娟, 刘 启 德. [J]. 陈 皮 药 理 作 用 研 究 进 展. 中 国 药 房,2006, 17(5): [3] 张 志 海, 王 彩 云, 杨 天 鸣. [J] 陈 皮 化 学 成 分 及 药 理 作 用 研 究 进 展. 西 北 药 学 杂 志,2005,20(1):47 [4] 张 杰. [J] 浅 谈 超 临 界 CO2 萃 取 技 术. 黑 龙 江 医 药 科 学,2007,30(1):22-23 [5] 王 忠 华, 张 钟 宪. [J] 超 临 界 二 氧 化 碳 萃 取 技 术. 化 学 工 程 与 装 备,2007,20(1):57-59 [6] 董 新 艳, 张 兴 儒. [J] 超 临 界 萃 取 技 术 在 中 草 药 研 究 中 的 应 用. 青 海 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 ),2005,23 (3):15-18 Comparison of Essential Oils from Pericarpium Citri Reticulatae by Supercritical CO2 Extraction and Stream Distillation ZHOU De-ying 1, LIU Zhi-hua 2 (1.Tianjin Zhongxin Pharmaceutical Longshunrong Manufactory,Tianjin ,China; 2. School of Chemical Engineering,Hebei Industrial University,Tianjin ,China) Abstract: [Objective] To compare essential oil from Pericarpium citri reticulatae by different extract techniques. [Method] Essential oils were extracted by supercritical CO2 extraction and stream distillation. The chemical components of essential oil were analyzed on GC-MS instrument. [Result] The extraction yield was 1.67% by SCDE and 1.28% by SD. The result of GC-MS analysis showed that 11 components of the essential oil by SCDE composed about 98% of the total, and 10 components by SD composed about 97% of the total. Relative content of main component limonene is 72.40% by SCDE and 80.75% by SD. [Conclusion] The extraction yield and the chemical components of the essential oils between two methods are different obviously. Key words: Pericarpium citri reticulatae;supercritical CO2 extraction;stream distillation;gc-ms 218

224 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 超 临 界 CO2 萃 取 法 与 蒸 馏 法 提 取 连 翘 挥 发 油 的 成 分 比 较 周 德 英 1, 刘 志 华 2 (1. 天 津 中 新 药 业 隆 顺 榕 制 药 厂, 天 津 ;2. 河 北 工 业 大 学 化 工 学 院, 天 津 ) 连 翘 (Fructus forsythiae) 为 木 樨 科 植 物 连 翘 (Forsythia suspensa (Thunb.)Vahl 的 干 燥 果 实, 味 苦 性 微 寒, 归 肺 心 小 肠 经 秋 季 果 实 初 熟 尚 带 绿 色 时 采 收 除 去 杂 质, 蒸 熟, 晒 干, 习 称 青 翘 ; 果 实 熟 透 时 采 收, 晒 干, 除 去 杂 质, 习 称 老 翘 连 翘 具 有 清 热 解 毒, 消 肿 散 结 用 于 痈 疽, 瘰 疬, 乳 痈, 丹 毒, 风 热 感 冒, 温 病 初 起, 温 热 入 营, 高 热 烦 渴, 神 昏 发 斑, 热 淋 尿 闭 [1], 主 要 含 挥 发 油 黄 酮 类 木 脂 体 类 三 萜 类 等 成 分 连 翘 挥 发 油 有 抑 制 流 感 病 毒 的 作 用, 对 金 黄 色 葡 萄 球 菌 肺 炎 双 球 菌 白 色 念 珠 菌 有 明 显 抑 制 作 用, 对 结 核 杆 菌 也 有 抑 制 作 用 [3] [4] 孙 国 祥 等 人 对 连 翘 的 HPLC 指 纹 图 谱 进 行 了 研 究, [5] 近 年 来 随 着 先 进 的 挥 发 油 提 取 方 法 和 设 备 及 化 学 分 析 仪 器, 如 气 相 色 谱 - 质 谱 联 用 仪 (GC-MS) 等 引 入 中 医 药 领 域, 尤 其 是 连 翘 挥 发 油 的 化 学 成 分 进 一 步 明 确, 对 挥 发 油 的 提 取 工 艺 的 改 进 有 指 导 意 义 超 临 界 萃 取 技 术 是 一 项 集 提 取 分 离 浓 缩 为 一 体 的 新 技 术 尤 其 CO2 无 色 无 毒, 廉 价 易 得, 临 界 压 力 低, 并 且 临 界 温 度 也 接 近 常 温, 因 此 超 临 界 CO2 萃 取 技 术 在 药 用 植 物 有 效 成 分 提 取 工 艺 改 进 中 的 得 到 越 来 越 广 泛 的 应 用 [6-10] 本 实 验 分 别 采 用 了 (SCDE) 法 和 水 蒸 气 蒸 馏 (SD) 法 从 连 翘 中 提 取 挥 发 油, 并 用 GC-MS 法 对 两 种 不 同 提 取 方 法 获 得 的 提 取 物 进 行 化 学 成 分 定 性 和 定 量 比 较 1 仪 器 与 样 品 1.1 仪 器 HA 型 超 临 界 萃 取 装 置, 江 苏 南 通 华 安 超 临 界 萃 取 有 限 公 司 生 产 ; 多 功 能 提 取 器, 衡 阳 市 金 山 中 药 设 备 制 造 有 限 公 司 生 产 ; 菲 尼 根 TRACE-DSQ 型 气 相 色 谱 - 质 谱 联 用 仪 (GC-MS), 美 国 热 电 公 司 1.2 样 品 连 翘 为 市 售 样 品 处 理 方 法 为 粉 碎 后 过 1 号 筛 2 实 验 方 法 2.1 超 临 界 CO2 萃 取 法 取 200g 样 品 装 入 萃 取 釜 中 参 考 王 鹏 [11] 等 人 超 临 界 CO2 萃 取 连 翘 挥 发 油 的 所 述 方 法, 萃 取 压 力 30Mpa, 萃 取 温 度 为 35,CO2 流 量 为 24 L/h, 萃 取 3h, 收 集 连 翘 挥 发 油 重 复 3 次, 计 算 平 均 出 油 率 2.2 水 蒸 气 蒸 馏 法 取 200g 样 品, 按 中 国 药 典 (2005 版 ) 附 录 挥 发 油 测 定 法 甲 法 提 取 挥 发 油 [1] 重 复 3 次, 计 算 平 均 出 油 率 2.3 GC-MS 分 析 条 件 气 相 色 谱 : 色 谱 柱 为 DB-5 弹 性 石 英 毛 细 管 柱 (50m 0.25mm 0.25um), 初 始 温 度 55, 停 留 4 min; 程 序 升 温 20 /min 至 280, 保 持 5 min; 气 化 室 温 度 260 ; 进 样 量 0.05μl; 分 流 比 30 1; 载 气 为 高 纯 氦 气 质 谱 条 件 :EI 离 子 源, 离 子 源 温 度 200, 电 子 能 量 70eV, 扫 描 范 围 30~500u 标 准 质 谱 图 库 NIST(16 万 张 ) 作 者 简 介 : 周 德 英 (1974- ), 女, 天 津 人, 高 级 工 程 师,Tel: , zhoudeying7477@eyou.com 219

225 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 3 结 果 3.1 不 同 提 取 方 法 对 连 翘 油 出 油 率 的 影 响 不 同 提 取 方 法 对 连 翘 挥 发 油 出 油 率 和 性 状 的 影 响 如 表 1 所 示 由 表 1 可 见,SCDE 法 提 取 连 翘 挥 发 油 所 需 时 间 较 短,SD 法 所 需 时 间 较 长 ; 而 前 者 出 油 率 是 后 者 的 1.12 倍, 分 别 为 3.89% 和 3.47%; 两 种 提 取 方 法 所 得 到 的 连 翘 挥 发 油 的 性 状 也 不 同, 使 用 前 者 提 取 得 到 的 是 淡 黄 色 油 状 物, 微 具 松 节 油 气 味, 使 用 后 者 提 取 得 到 的 是 几 乎 无 色 油 状 物 表 1 SCDE 法 与 SD 法 提 取 连 翘 挥 发 油 对 比 提 取 方 法 提 取 时 间 /h 出 油 率 % 性 状 SCDE 淡 黄 色 油 状 物 SD 几 乎 无 色 油 状 物 3.2 不 同 提 取 方 法 所 得 提 取 物 中 化 学 成 分 的 定 性 和 定 量 比 较 按 2.3 所 述 GC-MS 条 件 对 两 种 提 取 方 法 所 得 产 物 进 行 分 析, 得 总 离 子 流 图, 如 图 1 和 图 2 所 示 运 用 色 谱 数 据 处 理 系 统, 对 连 翘 挥 发 油 各 组 分 进 行 面 积 归 一 化 可 得 各 组 分 相 对 含 量 SCDE 法 提 取 的 连 翘 挥 发 油 中 共 分 离 出 13 种 相 对 含 量 大 于 0.1% 的 化 合 物, 该 13 种 化 合 物 峰 面 积 之 和 占 色 谱 出 峰 总 面 积 的 99% 以 上, 且 均 可 得 到 质 谱 鉴 定 SD 法 提 取 的 连 翘 挥 发 油 中 共 分 离 出 15 种 相 对 含 量 大 于 0.1% 的 化 合 物, 该 15 种 化 合 物 峰 面 积 之 和 占 色 谱 出 峰 总 面 积 的 98% 以 上, 也 可 得 到 质 谱 鉴 定 RT: Relative abundance Time (min) 图 1 连 翘 超 临 界 CO2 萃 取 产 物 的 气 相 色 谱 - 质 谱 总 离 子 流 图 RT: Relative abundance Time (min) 图 2 连 翘 蒸 馏 产 物 的 气 相 色 谱 - 质 谱 总 离 子 流 图 两 种 提 取 方 法 所 得 化 合 物 成 分 定 性 及 每 种 化 合 物 相 对 含 量 对 比 如 表 2 所 示 220

226 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 表 2 超 临 界 CO2 萃 取 法 和 水 蒸 气 蒸 馏 法 提 取 得 到 连 翘 挥 发 油 化 学 成 分 对 比 保 留 时 间 SCDE SD 化 合 物 名 称 分 子 式 相 对 分 子 量 百 分 含 量 % SCDE SD 崁 烯 C10H α- 蒎 烯 C10H β- 水 芹 烯 C10H α- 侧 柏 烯 C10H <0.1% β- 月 桂 烯 C10H β- 蒎 烯 C10H 对 伞 花 烃 C10H 苯 甲 醇 C7H8O 108 <0.1% 柠 檬 烯 C10H 孟 二 烯 C10H 榄 香 烯 C15H α- 松 油 烯 C10H α- 松 油 醇 C10H18O 香 草 醛 C8H8O 杜 松 烯 C15H 面 积 百 分 含 量 ( 合 计 ) 讨 论 两 种 提 取 方 法 得 到 的 挥 发 油 的 组 分 及 含 量 相 差 不 大, 面 积 百 分 含 量 大 于 0.1% 的 物 质 分 别 有 十 余 种, 并 且 各 成 分 的 含 量 相 差 不 大 运 用 SD 法 提 取 所 能 得 到 的 α- 侧 柏 烯, 苯 甲 醇 虽 含 量 较 低, 但 SCDE 法 提 取 时 均 未 检 出 ( 相 对 含 量 低 于 0.1%); 运 用 SD 法 提 取 所 能 得 到 的 在 SCDE 法 提 取 时 均 可 检 出 运 用 SCDE 法 所 提 取 到 的 连 翘 挥 发 油 中 沸 点 低, 相 对 分 子 质 量 较 大 的 成 分 比 例 较 SD 法 少 SCDE 法 提 取 过 程 在 密 闭 系 统 中 进 行, 且 操 作 温 度 低, 因 此 烯 类 成 分 不 易 损 失, 热 不 稳 定 成 分 及 易 氧 化 的 组 分 也 不 会 受 到 破 坏, 出 油 率 也 高 于 SD 法 1.12 倍 从 出 油 率 和 成 分 定 性 定 量 结 果 上 分 析,SCDE 法 提 取 连 翘 挥 发 油 与 SD 法 提 取 方 法 区 别 不 大, 也 说 明 SCDE 提 取 连 翘 挥 发 油 为 有 效 方 法, 只 是 目 前 还 不 能 连 续 操 作, 如 能 改 进 SCDE 提 取 中 药 挥 发 油 为 可 连 续 操 作 将 大 大 节 省 工 作 效 率 参 考 文 献 : [1] 国 家 药 典 委 员 会. 中 华 人 民 共 和 国 药 典 2005 版 ( 一 部 )[S]. 北 京 : 化 学 工 业 出 版 社, 2005, [2] 吴 寿 金, 赵 泰, 秦 永 祺. 现 代 中 草 药 成 分 化 学 [M]. 中 国 医 药 科 技 出 版 社, 2002, [3] 张 海 燕. 连 翘 化 学 成 分 及 药 理 活 性 的 研 究 进 展 [J]. 中 药 材, 2000, 23(10): 657. [4] 刘 明. 中 药 连 翘 药 理 作 用 的 研 究 近 况. 现 代 医 药 卫 生 [J], 2007, 23(16): [5] 孙 国 祥, 穆 善 学, 侯 志 飞 等. 连 翘 的 HPLC 指 纹 图 谱 研 究 [J]. 中 成 药, 2007, 29(2): [6] 张 杰. 浅 谈 超 临 界 CO2 萃 取 技 术 [J]. 黑 龙 江 医 药 科 学,2007,30(1): [7] 王 忠 华, 张 钟 宪. 超 临 界 二 氧 化 碳 萃 取 技 术 [J]. 化 学 工 程 与 装 备,2007,20(1): [8] 董 新 艳, 张 兴 儒. [J] 超 临 界 萃 取 技 术 在 中 草 药 研 究 中 的 应 用. 青 海 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 ),2005,23(3):15-1. [9] 唐 一 梅, 李 仲 瑾, 张 丽 等.[J] 超 临 界 萃 取 技 术 在 中 药 研 究 中 的 应 用. 西 北 药 学 杂 志,2007,22(5): [10] 刘 志 华, 周 德 英. 超 临 界 CO2 萃 取 法 与 水 蒸 气 蒸 馏 法 提 取 广 藿 香 挥 发 油 的 化 学 成 分 比 较 [J]. 安 徽 农 业 科 学, 2009, 37(19): ( 下 转 第 223 页 ) 221

227 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 Nano-LC/MS/MS 鉴 定 组 蛋 白 翻 译 后 修 饰 陈 英, 张 锴 南 开 大 学 化 学 学 院, 天 津 组 蛋 白 翻 译 后 修 饰 包 括 ---- 磷 酸 化 泛 素 化 乙 酰 化 和 甲 基 化, 这 些 修 饰 是 表 观 遗 传 学 的 重 要 内 容, 对 染 色 体 的 结 构 和 功 能 有 重 要 的 影 响 目 前 通 过 特 异 性 抗 体 或 质 谱 技 术 等 方 法 已 经 发 现 了 组 蛋 白 上 有 几 十 种 不 同 的 修 饰 但 是, 发 生 在 组 蛋 白 上 的 翻 译 后 修 饰 数 量 预 计 远 [1] 超 过 已 鉴 定 出 的 量, 应 该 还 有 更 多 的 修 饰 没 有 发 现 大 量 的 修 饰 具 有 潜 在 的 功 能 响 应 基 于 质 谱 技 术 的 蛋 白 质 组 学 方 法 是 鉴 定 翻 译 后 修 饰 位 点 的 有 力 工 具, 然 而, 它 的 瓶 颈 在 于 很 难 从 复 杂 样 品 中 鉴 定 未 知 的 修 饰 本 文, 我 们 以 鉴 定 酵 母 中 组 蛋 白 上 新 的 翻 译 后 修 饰 为 目 标, 将 组 蛋 白 提 纯 技 术 胶 内 酶 解 和 shotgun 技 术 相 结 合, 采 用 PTMs 软 件 分 析 策 略 鉴 定 酵 母 组 蛋 白 上 新 的 翻 译 后 修 饰 形 式 1 研 究 方 法 我 们 以 鉴 定 酵 母 菌 中 的 组 蛋 白 H2B H3 和 H4 上 新 的 翻 译 后 修 饰 形 式 为 目 标, 首 先 从 酵 母 中 提 取 出 组 蛋 白 再 采 用 凝 胶 蛋 白 电 泳 分 离 ( 图 1), 进 一 步 分 离 组 蛋 白 混 合 物 通 过 胶 内 酶 解 技 术, 将 组 蛋 白 酶 解 成 多 肽, 采 用 Nano-LC/MS/MS 分 析 和 蛋 白 信 息 化 检 索, 鉴 定 出 酵 母 组 蛋 白 上 多 种 翻 译 后 修 饰 并 且 用 质 谱 裂 解 碎 片 分 析 免 疫 印 记 法 合 成 多 肽 的 二 级 质 谱 碎 片 ( 图 2) 比 较 和 色 谱 保 留 分 析 等 多 种 方 法 验 证 了 这 些 修 饰 2 结 果 与 讨 论 我 们 鉴 定 出 位 于 酵 母 组 蛋 白 H2B H3 和 H4 多 个 赖 氨 酸 位 点 上 发 生 乙 酰 化 和 甲 基 化 修 饰, 同 时 我 也 发 现 了 新 的 丙 酰 化 和 丁 酰 化 修 饰 通 过 免 疫 印 记 法 二 级 质 谱 解 析 和 液 相 色 谱 保 留 分 析, 验 证 了 新 发 现 的 两 种 修 饰 形 式 图 1 凝 胶 电 泳 分 离 组 蛋 白 图 联 合 生 物 信 息 学 工 具, 二 级 质 谱 的 裂 解 碎 片 的 信 息 分 析, 以 及 色 谱 保 留 性 质, 我 们 进 一 步 发 现 了 14 个 新 的 质 量 偏 移, 也 排 除 了 基 因 突 变 和 处 理 过 成 中 化 学 反 应 的 可 能, 这 预 示 着 可 能 是 一 些 新 的 修 饰 形 式 这 些 修 饰 的 化 学 性 质 还 需 进 一 步 的 鉴 定 3 小 结 通 过 将 shotgun 策 略 和 生 物 信 息 学 相 结 合, 我 们 探 索 了 鉴 定 组 蛋 白 中 新 的 翻 译 后 修 饰 形 式 的 方 法, 并 成 功 的 在 酵 母 组 蛋 白 H2B H3 和 H4 上 鉴 定 了 未 见 报 道 的 丙 酰 化 和 丁 酰 化 修 饰 形 式, 同 时 发 现 了 一 些 潜 在 的 蛋 白 修 饰 形 式 参 考 文 献 [1] Kouzarides, T., Chromatin modifications and their function. Cell 2007, 128, (4), 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 ( ) zhangkai@nankai.edu.cn 222

228 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 Unmodified FQKSTELLIR RT=39.18 min Relative Abundance + 42 MS/MS :unmodified peptide Vs modified peptides y b b2-nh 3 b2 y y4 y y5 b6 b9 y b O NH N O m/z FQK(AC) (AC)STELLIR RT=48.59 min O M -H 2 O y7 N y8 NH 2 Relative Abundance M ++ -H 2 O b3 b2-nh 3 y b y6 y y2 y b y O b7 N y NH b O b Relative Abundance m/z FQK(Prop) (Prop)STELLIR RT=50.37 min M ++ -H 2 O b2 y y8 b2-nh y b3 y2 y3 y y6 b7 b8 b b m/z In vivo H3 peptide 图 2 乙 酰 化 丙 酰 化 多 肽 及 相 应 非 修 饰 多 肽 二 级 质 谱 碎 片 ( 上 接 第 221 页 ) Comparison of Essential Oils from Fructus Forsythiae by Supercritical CO2 Extraction and Stream Distillation ZHOU De-ying 1, LIU Zhi-hua 2 (1.Tianjin Zhongxin Pharmaceutical Longshunrong Manufactory,Tianjin ,China; 2. School of Chemical Engineering, Hebei Industrial University, Tianjin ,China) Abstract: [Objective] To compare essential oil from Fructus forsythiae by different extract techniques. [Method] Essential oils were extracted by supercritical CO2 extraction and stream distillation. The chemical components of essential oil were analyzed on GC-MS instrument. [Result] The extraction yield was 3.89% by SCDE and 3.47% by SD. The result of GC-MS analysis showed that 13 components of the essential oil by SCDE composed about 99% of the total, and 15 components by SD composed about 98% of the total. Relative content of main component β-pinene is 59.12% by SCDE and 54.30% by SD. [Conclusion] The extraction yield and the chemical components of the essential oils between two methods are not different obviously. Key words: Fructus forsythiae; Supercritical CO2 extraction; Stream distillation; GC-MS 223

229 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 青 翘 与 老 翘 挥 发 油 的 化 学 成 分 比 较 周 德 英 1, 刘 志 华 2 (1. 天 津 中 新 药 业 隆 顺 榕 制 药 厂, 天 津 ;2. 河 北 工 业 大 学 化 工 学 院, 天 津 ) 连 翘 (Fructus forsythiae) 为 木 樨 科 植 物 连 翘 (Forsythia suspensa (Thunb.)Vahl 的 干 燥 果 实, 味 苦 性 微 寒, 归 肺 心 小 肠 经 秋 季 果 实 初 熟 尚 带 绿 色 时 采 收 除 去 杂 质, 蒸 熟, 晒 干, 习 称 青 翘 ; 果 实 熟 透 时 采 收, 晒 干, 除 去 杂 质, 习 称 老 翘 连 翘 具 有 清 热 解 毒, 消 肿 散 结 用 于 痈 疽, 瘰 疬, 乳 痈, 丹 毒, 风 热 感 冒, 温 病 初 起, 温 热 入 营, 高 热 烦 渴, 神 昏 发 斑, 热 淋 尿 闭 [1], 主 要 含 挥 发 油 黄 酮 类 木 脂 体 类 三 萜 类 等 成 分 连 翘 挥 发 油 有 抑 制 流 感 病 毒 的 作 用, 对 金 黄 色 葡 萄 球 菌 肺 炎 双 球 菌 白 色 念 珠 菌 有 明 显 抑 制 作 用, 对 结 核 杆 菌 也 有 抑 制 作 用 [2-4] 近 年 来 随 着 先 进 的 挥 发 油 提 取 方 法 和 设 备 及 化 学 分 析 仪 器, 如 气 相 色 谱 - 质 谱 联 用 仪 (GC-MS) 等 引 入 中 医 药 领 域, 尤 其 是 连 翘 挥 发 油 的 化 学 成 分 进 一 步 明 确, 对 挥 发 油 的 提 取 工 艺 的 改 进 有 指 导 意 义 超 临 界 萃 取 技 术 是 一 项 集 提 取 分 离 浓 缩 为 一 体 的 新 技 术 尤 其 CO2 无 色 无 毒, 廉 价 易 得, 临 界 压 力 低, 并 且 临 界 温 度 也 接 近 常 温, 因 此 超 临 界 CO2 萃 取 技 术 在 药 用 植 物 有 效 成 分 提 取 工 艺 改 进 中 的 得 到 越 来 越 广 泛 的 应 用 [5-9] 为 进 一 步 提 高 连 翘 的 药 材 资 源 利 用 率, 本 实 验 采 用 了 SCDE 法 从 青 翘 和 老 翘 中 提 取 挥 发 油, 并 用 GC-MS 法 对 两 种 不 同 采 摘 时 期 的 连 翘 挥 发 油 进 行 化 学 成 分 定 性 和 定 量 比 较 1 仪 器 与 样 品 1.1 仪 器 HA 型 超 临 界 萃 取 装 置, 江 苏 南 通 华 安 超 临 界 萃 取 有 限 公 司 生 产 ; 菲 尼 根 TRACE-DSQ 型 气 相 色 谱 - 质 谱 联 用 仪 (GC-MS), 美 国 热 电 公 司 1.2 样 品 青 翘 和 老 翘 均 为 为 市 售 样 品, 购 自 安 国 药 材 市 场 处 理 方 法 为 粉 碎 后 过 1 号 筛 2 实 验 方 法 2.1 超 临 界 CO2 萃 取 法 取 200g 样 品 装 入 萃 取 釜 中 萃 取 压 力 30Mpa, 萃 取 温 度 为 35,CO2 流 量 为 24 L/h, 萃 取 3h, 收 集 连 翘 挥 发 油 重 复 3 次, 计 算 平 均 出 油 率 2.2 GC-MS 分 析 条 件 气 相 色 谱 : 色 谱 柱 为 DB-5 弹 性 石 英 毛 细 管 柱 (50m 0.25mm 0.25um), 初 始 温 度 55, 停 留 4 min; 程 序 升 温 20 /min 至 280, 保 持 5 min; 气 化 室 温 度 260 ; 进 样 量 0.05μl; 分 流 比 30 1; 载 气 为 高 纯 氦 气 质 谱 条 件 :EI 离 子 源, 离 子 源 温 度 200, 电 子 能 量 70eV, 扫 描 范 围 30~400u 标 准 质 谱 图 库 NIST(16 万 张 ) 3 结 果 3.1 不 同 提 取 方 法 对 连 翘 油 出 油 率 的 影 响 青 翘 与 老 翘 挥 发 油 对 比 如 表 1 所 示 表 1 青 翘 与 老 翘 挥 发 油 对 比 样 品 提 取 时 间 /h 出 油 率 % 性 状 青 翘 几 乎 无 色 油 状 物 老 翘 淡 黄 色 油 状 物 224

230 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 3.2 挥 发 油 化 学 成 分 的 定 性 和 定 量 比 较 按 2.2 所 述 GC-MS 条 件 对 青 翘 与 老 翘 所 得 产 物 进 行 分 析, 得 总 离 子 流 图, 如 图 1 和 图 2 所 示 运 用 色 谱 数 据 处 理 系 统, 对 挥 发 油 各 组 分 进 行 面 积 归 一 化 可 得 各 组 分 相 对 含 量 青 翘 挥 发 油 中 共 分 离 出 100 种 相 对 含 量 大 于 0.2% 的 化 合 物, 该 10 种 化 合 物 峰 面 积 之 和 占 色 谱 出 峰 总 面 积 的 99% 以 上, 且 均 可 得 到 质 谱 鉴 定 老 翘 发 油 中 共 分 离 出 15 种 相 对 含 量 大 于 0.2% 的 化 合 物, 该 15 种 化 合 物 峰 面 积 之 和 占 色 谱 出 峰 总 面 积 的 98% 以 上, 也 可 得 到 质 谱 鉴 定 RT: Relative 6.0 abundance Time (min) 图 1 青 翘 挥 发 油 的 气 相 色 谱 - 质 谱 总 离 子 流 图 RT: Relative 6.0 abundance Time (min) 图 2 老 翘 挥 发 油 的 气 相 色 谱 - 质 谱 总 离 子 流 图 青 翘 和 老 翘 挥 发 油 成 分 定 性 及 每 种 化 合 物 相 对 含 量 对 比 如 表 2 所 示 表 2 青 翘 和 老 翘 挥 发 油 化 学 成 分 对 比 序 号 保 留 时 间 ( 分 ) 青 翘 老 翘 化 合 物 名 称 分 子 式 相 对 分 子 量 百 分 含 量 (%) 青 翘 老 翘 崁 烯 C10H α- 蒎 烯 C10H β- 水 芹 烯 C10H α- 侧 柏 烯 C10H 未 检 出 β- 月 桂 烯 C10H β- 蒎 烯 C10H 对 伞 花 烃 C10H 苯 甲 醇 C7H8O 108 未 检 出 柠 檬 烯 C10H 孟 二 烯 C10H 榄 香 烯 C15H α- 松 油 烯 C10H α- 松 油 醇 C10H18O 香 草 醛 C8H8O3 204 未 检 出 杜 松 烯 C15H 面 积 百 分 含 量 ( 合 计 )

231 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 3.3 结 论 老 翘 挥 发 油 含 量 明 显 大 于 青 翘, 并 且 老 翘 所 提 取 的 挥 发 油 中 沸 点 高 的 化 学 成 分 所 占 比 例 也 高 于 青 翘 有 文 献 报 导 青 翘 中 连 翘 苷 含 量 是 老 翘 中 连 翘 苷 含 量 的 两 倍 左 右 [10], 因 此 连 翘 中 不 同 有 效 成 分 的 含 量 与 其 果 实 的 采 摘 时 机 也 有 关 系 参 考 文 献 : [1] 国 家 药 典 委 员 会.[S] 中 华 人 民 共 和 国 药 典 2005 版 ( 一 部 ). 北 京 : 化 学 工 业 出 版 社,2005: [2] 吴 寿 金, 赵 泰, 秦 永 祺.[M] 现 代 中 草 药 成 分 化 学. 中 国 医 药 科 技 出 版 社,2002: [3] 张 海 燕.[J] 连 翘 化 学 成 分 及 药 理 活 性 的 研 究 进 展. 中 药 材,2000,23(10):657 [4] 刘 明.[J] 中 药 连 翘 药 理 作 用 的 研 究 近 况. 现 代 医 药 卫 生,2007,23(16): [5] 张 杰.[J] 浅 谈 超 临 界 CO2 萃 取 技 术. 黑 龙 江 医 药 科 学,2007,30(1):22-23 [6] 王 忠 华, 张 钟 宪.[J] 超 临 界 二 氧 化 碳 萃 取 技 术. 化 学 工 程 与 装 备,2007,20(1): [7] 董 新 艳, 张 兴 儒.[J] 超 临 界 萃 取 技 术 在 中 草 药 研 究 中 的 应 用. 青 海 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 ),2005,23(3):15-18 [8] 唐 一 梅, 李 仲 瑾, 张 丽 等.[J] 超 临 界 萃 取 技 术 在 中 药 研 究 中 的 应 用. 西 北 药 学 杂 志,2007,22(5): [9] 刘 志 华, 周 德 英. [J] 超 临 界 CO2 萃 取 法 与 水 蒸 气 蒸 馏 法 提 取 广 藿 香 挥 发 油 的 化 学 成 分 比 较. 安 徽 农 业 科 学,2009,37(19): [10] 李 书 渊, 施 玉 旋, 罗 婷.[J] 青 翘 与 青 翘 种 子 及 老 翘 中 连 翘 苷 的 含 量 测. 时 珍 国 医 国 药,2006,17(9):1720 Comparison of Essential Oils from Fructus Forsythiae in green and grown ZHOU De-ying 1, LIU Zhi-hua 2 (1.Tianjin Zhongxin Pharmaceutical Longshunrong Manufactory,Tianjin ,China; 2. School of Chemical Engineering, Hebei Industrial University, Tianjin ,China) Abstract: [Objective] To compare essential oil from Fructus forsythiae by different extract techniques. [Method] Essential oils were extracted by supercritical CO2 extraction and stream distillation. The chemical components of essential oil were analyzed on GC-MS instrument. [Result] The extraction yield was 3.89% by SCDE and 3.47% by SD. The result of GC-MS analysis showed that 13 components of the essential oil by SCDE composed about 99% of the total, and 15 components by SD composed about 98% of the total. Relative content of main component β-pinene is 59.12% by SCDE and 54.30% by SD. [Conclusion] The extraction yield and the chemical components of the essential oils between two methods are not different obviously. Key words: Fructus forsythiae; Supercritical CO2 extraction; Stream distillation; GC-MS 226

232 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 TSQ Quantum 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 测 定 十 种 全 氟 烷 基 化 合 物 1 前 言 刘 飞, 王 勇 为, 刘 婷 ( 赛 默 飞 世 尔 科 技 ( 中 国 ) 有 限 公 司 色 谱 质 谱 部 ) 全 氟 烷 基 化 合 物 (Perfluorinated alkyl substances,pfas) 是 一 类 普 遍 存 在 的 环 境 污 染 物, 自 1951 年 由 3M 公 司 研 制 成 功 以 来, 已 有 50 多 年 的 生 产 和 使 用 历 史, 以 其 良 好 的 表 面 活 性 被 广 泛 应 用 于 纺 织 造 纸 包 装 皮 革 装 潢 表 面 活 性 剂 等 多 个 领 域 由 于 PFAS 具 有 难 降 解 性 生 物 蓄 积 性 沿 食 物 链 在 生 物 体 内 富 集 以 及 潜 在 的 生 物 毒 性, 如 其 中 的 全 氟 辛 烷 磺 酸 (PFOS) 具 有 很 强 持 久 性, 在 任 何 水 解 光 解 和 生 物 降 解 环 境 条 件 下 都 不 降 解, 并 且 会 远 距 离 迁 移, 这 类 化 合 物 受 到 了 越 来 越 多 的 关 注, 并 成 为 国 际 上 环 境 科 学 和 毒 理 学 研 究 的 热 点 已 报 道 过 的 分 析 PFAS 的 方 法 可 用 单 级 四 极 杆 液 质 液 质 质 ( 比 如 Q-TOF 或 三 重 四 极 杆 ) 气 质 联 用 GC/MS 液 相 色 谱 荧 光 检 测 等 我 国 也 出 台 了 PFOS 的 分 析 测 试 标 准 :GB/T 食 品 包 装 材 料 中 全 氟 辛 烷 磺 酰 基 化 合 物 (PFOS) 的 测 定 高 效 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法,GB/T 氟 化 工 产 品 和 消 费 品 种 全 氟 辛 烷 磺 酰 基 化 合 物 (PFOS) 的 测 定 高 效 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 也 已 实 施 本 实 验 采 用 HPLC-ESI-MS/MS 联 用 技 术, 建 立 了 快 速 准 确 高 灵 敏 度 的 同 时 测 定 十 种 PFAS 的 方 法 十 种 全 氟 烷 基 化 合 物 包 括 全 氟 己 酸 ( perfluorohexanoate, PFHxA ) 全 氟 辛 酸 ( perfluorooctanoate, PFOA ) 全 氟 壬 酸 ( perfluorononanoate, PFNA ) 全 氟 癸 酸 ( perfluorodecanoate, PFDA ) 全 氟 十 一 酸 (perfluoroundecanoate,pfuda) 全 氟 十 二 酸 (perfluorododecanoate,pfdoa) 全 氟 丁 烷 磺 酸 (perfluorobutanesulfonate,pfbs) 全 氟 己 烷 磺 酸 (perfluorohexanesulfonate,pfhxs) 全 氟 辛 烷 磺 酸 (perfluorooctanesulfonate,pfos) 全 氟 癸 烷 磺 酸 (perfluorodecanesulfonate, PFDS) 2 实 验 部 分 2.1 仪 器 与 试 剂 TSQ Quantum 串 联 质 谱 仪 ( 赛 默 飞 世 尔 科 技 Thermo Fisher Scientific 公 司 ), 配 置 Surveyor 液 相 色 谱 系 统 (Thermo Fisher Scientific 公 司 ) Thermo Hypersil Gold C18 柱 ( mm, 5 μm) 标 准 品 :PFHxA,PFOA,PFNA,PFDA,PFuDA,PFDoA,PFBS,PFHxS,PFOS, PFDS 购 自 加 拿 大 Wellington Laboratories, 纯 度 98% 准 确 称 取 适 量 以 上 标 准 品, 用 甲 醇 配 制 并 稀 释 成 浓 度 为 10 μg/l 的 混 合 标 准 溶 液 甲 醇, 乙 酸 铵 (HPLC 级, 美 国 Thermo Fisher 公 司 ), 水 为 二 次 蒸 馏 水 2.2 色 谱 与 质 谱 条 件 色 谱 条 件 :Thermo Hypersil Gold C18 柱 ( mm,5 μm), 柱 温 30 ; 流 动 相 A: 甲 醇, 流 动 相 B:5 mm 乙 酸 铵 水 溶 液, 采 用 梯 度 洗 脱 ( 洗 脱 程 序 见 表 1); 流 速 :0.25 ml/min; 进 样 体 积 :10 μl 表 1 梯 度 洗 脱 程 序 时 间 (min) A 甲 醇 (%) B 5 mm 乙 酸 铵 水 溶 液 (%)

233 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 质 谱 条 件 : ESI 负 离 子 模 式 喷 雾 电 压 :3.0 KV; 鞘 气 :40 arb; 辅 助 气 :10 arb; 毛 细 管 温 度 :380 ; 碰 撞 气 : 氩 气 (1.5 mtorr) 采 用 选 择 反 应 监 测 (SRM) 扫 描 模 式, 十 种 PFAS 的 SRM 参 数 见 表 2 表 2 十 种 PFAS 的 SRM 参 数 化 合 物 (Comp.) 分 子 式 (Formula) 母 离 子 (parent ion) 子 离 子 (Product Ion) 碰 撞 能 量 (Collision Energy, V) 全 氟 丁 烷 磺 酸 (PFBS) C4F9SO3NA 全 氟 癸 酸 (PFDA) C9F19COOH 513 全 氟 十 二 酸 (PFDoA) C11F23COOH 全 氟 癸 烷 磺 酸 (PFDS) C10F21SO3NA 全 氟 己 酸 (PFHxA) C5F11COOH 全 氟 己 烷 磺 酸 (PFHxS) C6F13SO3NA 全 氟 壬 酸 (PFNA) C8F17COOH 全 氟 辛 酸 (PFOA) C7F15COOH 全 氟 辛 烷 磺 酸 (PFOS) C8F17SO3NA 全 氟 十 一 酸 (PFUdA) C10F21COOH * * * * * * * * * * 13 注 :* 代 表 定 量 子 离 子 3 结 果 与 讨 论 3.1 LC-MS/MS 方 法 优 化 及 灵 敏 度 考 察 经 优 化 流 动 相 和 质 谱 参 数, 采 用 ESI 负 离 子 模 式 检 测, 十 种 全 氟 烷 基 化 合 物 均 有 很 高 的 灵 敏 度 在 该 实 验 条 件 下 所 得 LC/MS/MS 色 谱 图 见 图 1(0.1 ng/ml) 3.2 方 法 的 线 性 考 察 将 浓 度 为 10 ng/ml 的 混 合 标 准 溶 液 逐 级 稀 释 成 4.0,2.0,1.0,0.25,0.1 μg/l 系 列 混 合 标 准 溶 液, 分 别 进 样 分 析 以 各 分 析 物 定 量 子 离 子 色 谱 峰 面 积 对 质 量 浓 度 作 标 准 曲 线, 所 得 线 性 方 程 及 线 性 系 数 见 图 2 4 结 论 本 文 建 立 的 十 种 全 氟 烷 基 化 合 物 的 高 效 液 相 色 谱 - 电 喷 雾 串 联 质 谱 (LC-ESI-MS/MS) 检 测 方 法, 灵 敏 度 高 实 用 性 强, 特 异 性 好 分 析 速 度 快 等 特 点, 完 全 符 合 我 国 法 规 及 欧 盟 等 关 于 PFOA/PFOS 的 检 测, 可 广 泛 用 于 纺 织 品 等 消 费 品 及 环 境 样 品 中 全 氟 烷 基 化 合 物 的 检 测 228

234 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 D:\APPLICATIONS\...\PFOAMix_100ppt2 RT: SM: 5G RT: SN: 503 PFBS (298.9>80.3) PFOAMix_0.1ppb RT: SM: 5G 100 PFOS (498.9>99.1) RT: 8.79 SN: PFHxA (312.9>269) RT: 7.48 SN: PFDA (513>468.9) RT: 9.05 SN: PFHxS (398.9>80.3) RT: 8.16 SN: PFUdA (562.9>519.2) RT: 9.25 SN: PFOA (412.9>369.1) RT: 8.54 SN: PFDS (598.9>99.1) 100 RT: 9.23 SN: PFNA (462.9>218.9) RT: 8.80 SN: PFDoA (612.9>569.2) RT: 9.48 SN: Time (min) Time (min) 图 1 十 种 全 氟 烷 基 化 合 物 的 LC/MS/MS 色 谱 图 (0.1 ng/ml) 图 2 十 种 全 氟 烷 基 化 合 物 的 标 准 曲 线 (0.1-4 ng/ml) 229

235 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 高 效 液 相 色 谱 串 联 质 谱 法 测 定 五 种 微 囊 藻 毒 素 刘 飞, 王 勇 为 ( 赛 默 飞 世 尔 科 技 ( 中 国 ) 有 限 公 司 ) 建 立 了 高 效 液 相 色 谱 / 串 联 质 谱 法 (LC-MS/MS) 同 时 定 量 检 测 微 囊 藻 毒 素 (MC- RR,YR, LR, LW, LF) 的 方 法 该 法 检 出 限 (LOD) 为 0.2 μg/kg, 定 量 限 (LOQ) 为 0.7 μg/kg, 标 准 曲 线 的 线 性 相 关 系 数 均 大 于 0.99, 回 收 率 为 85.3% %, 该 方 法 操 作 简 便 且 灵 敏 度 较 高 1 引 言 近 几 十 年 由 于 水 体 富 营 养 化 程 度 的 日 益 加 剧, 涉 及 范 围 不 断 扩 大, 包 括 水 源 水 库 水 在 内 的 淡 水 水 体 经 常 发 生 蓝 藻 水 华 有 害 藻 类 水 华 的 频 繁 发 生 已 成 为 国 内 外 普 遍 关 注 的 环 境 问 题 据 2004 年 资 料, 已 从 不 同 藻 株 中 分 离 鉴 定 了 70 多 种 微 囊 藻 毒 素 [1] 在 已 发 现 的 蓝 藻 毒 素 中, 微 囊 藻 毒 (Microcystins,MCs) 是 一 种 在 蓝 藻 水 华 污 染 中 出 现 频 率 最 高 造 成 危 害 最 严 重 的 藻 毒 素 种 类 [2] MCs 的 一 般 结 构 为 环 (D- 丙 氨 酸 -L-X- 赤 -β- 甲 基 -D- 异 天 冬 氨 酸 -L-Z-Adda-D- 异 谷 氨 酸 -N- 甲 基 脱 氢 丙 氨 酸 ) 其 中,Adda (3- 氨 基 -9- 甲 氧 基 -2,6,8- 三 甲 基 -10- 苯 基 -4,6- 二 烯 酸 ) 是 一 种 特 殊 的 氨 基 酸 [3] 在 已 发 现 的 MCs 异 构 体 中,MC-LR, RR, YR 毒 性 最 强 (L R Y 分 别 代 表 亮 氨 酸 精 氨 酸 色 氨 酸 ) MCs 是 一 种 水 溶 性 肝 毒 素 [4-5], 它 对 动 物 和 人 类 健 康 的 潜 在 危 害 逐 渐 引 起 关 注 由 于 藻 毒 素 可 通 过 食 物 链 累 积, 供 食 用 的 水 产 品 如 鱼 类 贝 类 等 也 可 能 携 带 藻 毒 素 危 害 人 类 健 康 为 防 止 藻 毒 素 对 人 类 的 进 一 步 危 害, 需 进 行 更 广 泛 而 深 入 的 研 究 目 前 WHO 仅 规 定 了 饮 用 水 中 微 囊 藻 毒 素 可 耐 受 量 1.0 μg/l, 及 暂 定 的 微 囊 藻 毒 素 临 时 可 耐 受 的 每 日 摄 取 量 0.04 μg/(kg d BW) [6], 结 合 各 国 微 囊 藻 毒 素 的 安 全 限 量 标 准, 微 囊 藻 毒 素 每 日 安 全 摄 入 总 量 在 2.4 μg 之 内 应 是 安 全 的 但 鱼 类 等 水 产 品 中 微 囊 藻 毒 素 的 限 量 还 有 待 进 一 步 的 研 究 鉴 于 微 囊 藻 毒 素 对 人 体 的 危 害, 应 逐 步 建 立 和 完 善 水 产 品 中 MCs 含 量 的 检 测 方 法, 并 制 定 食 品 中 MCs 的 限 量 越 来 越 多 的 分 析 技 术 用 于 MCs 的 检 测 当 中, 水 体 中 MCs 中 的 检 测 方 法 已 相 对 较 完 善 [7-8] 本 文 报 道 了 同 时 对 MC- RR,YR, LR, LW, LF 进 行 定 量 分 析 的 高 效 液 相 色 谱 / 串 联 质 谱 (LC MS/MS ) 分 析 方 法, 这 些 毒 素 可 产 生 典 型 的 离 子 谱, 质 谱 仪 对 藻 毒 素 有 最 佳 分 辨 效 果, LC MS/MS 方 法 由 于 其 优 良 的 选 择 性, 对 样 品 的 纯 化 步 骤 要 求 不 高, 能 够 在 混 合 物 中 同 时 实 现 多 种 藻 类 毒 素 的 分 离 和 鉴 定 2 实 验 部 分 2.1 仪 器 与 试 剂 液 质 联 用 仪 由 Surveyor 液 相 色 谱 系 统 和 Thermo Fisher TSQ Quantum 三 重 四 极 杆 串 联 质 谱 组 成 ; 氮 气 吹 干 仪 ( 美 国 Zymark 公 司 );MilliQ 去 离 子 水 发 生 器 ( 美 国 Millipore 公 司 ); Sartorius 冷 冻 离 心 机 ;WH-861 漩 涡 混 合 器 二 次 去 离 子 水 ; 甲 醇 ( 色 谱 纯 ); Oasis HLB 固 相 萃 取 柱 (Waters 公 司,60 mg,3 ml); 标 准 品 : 微 囊 藻 毒 素 -LR(MC-RR), 微 囊 藻 毒 素 -LF(MC-YR), 微 囊 藻 毒 素 -YR(MC-LR), 微 囊 藻 毒 素 -RR(MC-LW), 微 囊 藻 毒 素 -LW(MC-LF), 纯 度 不 低 于 95%; 鲫 鱼 样 品 来 自 市 场, 冷 冻 保 存 于 实 验 室 230

236 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 分 别 准 确 称 取 标 准 品 各 mg, 至 10 ml 棕 色 容 量 瓶, 用 甲 醇 定 容,-20 避 光 保 存 再 用 甲 醇 稀 释 上 述 标 准 储 备 液, 配 制 成 1.0 µg/ml 的 混 合 标 准 溶 液, 于 4 避 光 保 存 1 个 月 2.2 液 相 色 谱 和 质 谱 条 件 液 相 色 谱 条 件 色 谱 柱 :Polaris C18 色 谱 柱 (150 mm 2.1 mm 5 μm) ; 流 动 相 : 甲 醇 -0.1%( 体 积 分 数 ) 甲 酸 水 溶 液 ; 流 速 :0.25 ml/min; 梯 度 洗 脱 程 序 :0.00min(20% 甲 醇,80% 甲 酸 水 溶 液 ),4.00 min (95% 甲 醇,5% 甲 酸 水 溶 液 ),8.00 min(95% 甲 醇,5% 甲 酸 水 溶 液 ), 8.10 min (20% 甲 醇, 80% 甲 酸 水 溶 液 ),10.00 min (20% 甲 醇,80% 甲 酸 水 溶 液 ); 柱 温 :25 ; 进 样 量 :10 μl 质 谱 条 件 电 离 方 式 为 电 喷 雾 电 离 源 (ESI+); 选 择 反 应 监 测 (SRM); 毛 细 管 温 度 300 ; 喷 雾 电 压 (spray voltage) 3.5 kv; 鞘 气 (N2) 流 量 :6 L/min; 辅 助 气 (N2) 流 量 :2 L/min; 碰 撞 气 (N2) 压 力 : 1.5 mtorr 表 1 MCs 的 母 离 子 / 子 离 子 离 子 及 碰 撞 能 量 化 合 物 Compounds 母 离 子 Parent ion(m/z) 子 离 子 Daughter ion(m/z) 碰 撞 能 量 Collision energy(ev) MC-RR 519.8[M+2H] * MC-YR [M+H] * MC-LR 995.6[M+H] * * 30 MC-LW [M+H] * 43 MC-LF 986.6[M+H] * 22 * 定 量 离 子 (quantitative ion) 3 结 果 与 讨 论 3.1 线 性 范 围 定 量 限 和 检 出 限 将 MC- RR,YR, LR, LW, LF 逐 级 稀 释 配 置 成 ng/ml 系 列 浓 度 的 混 合 标 样, 在 1.0~50.0 ng/ml 内 线 性 良 好, 当 信 噪 比 (S/N) 为 3 时, 方 法 检 出 限 分 别 为 0.2,0.3,0.3,0.4,0.4 μg/kg 以 3 倍 信 噪 比 10 倍 信 噪 比 分 别 计 算 检 出 限 和 定 量 限, 结 果 见 表 2, 相 关 系 数 均 大 于 0.99, 显 示 了 良 好 的 相 关 性 MC- RR,YR,LR, LW, LF 的 检 出 限 分 别 为 0.7,1.0,0.8,1.2,1.3 RR YR LR LW LF RT: 4.32 RT: 4.70 RT: 4.76 RT: 6.37 RT: Time (min) RR YR LR LW LF RT: 4.29 RT: 4.66 RT: 4.72 RT: 6.28 RT: Time (min) 图 1 5 种 MCs 标 准 品 及 加 标 鱼 样 加 标 5µg/kg 的 LC/MS/MS 谱 图 ( 下 转 234 页 ) 231

237 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 高 效 液 相 色 谱 串 联 质 谱 法 筛 选 10- 脱 乙 酰 基 巴 卡 丁 Ⅲ 产 生 菌 郝 晓 冉, 牛 学 良, 陈 煌, 吕 宪 禹, 朱 旭 东 ( 南 开 大 学 生 命 科 学 院 分 子 真 菌 学 实 验 室, 天 津,300071) 癌 症 成 为 当 今 世 界 威 胁 人 类 健 康 的 第 一 大 杀 手, 在 众 多 抗 癌 药 物 中, 紫 杉 醇 ( Taxol ) 由 于 其 可 靠 的 疗 效 独 特 的 抗 肿 瘤 作 用 机 制 [1] 对 多 种 癌 症 有 广 泛 的 抑 制 作 用 [2] 等 使 其 成 为 过 去 数 十 年 发 现 的 最 好 的 抗 癌 药 物 之 一 目 前 生 产 紫 杉 醇 的 方 法 主 要 包 括 红 豆 杉 树 皮 提 取 法 及 树 枝 提 取 - 半 合 成 法, 受 原 料 和 技 术 的 限 制, 短 期 内 还 无 法 实 现 大 量 生 产 紫 杉 醇, 以 满 足 广 大 病 患 的 需 要 从 环 境 中 筛 选 紫 杉 醇 或 其 前 提 产 生 菌 是 解 决 这 一 问 题 的 捷 径 10- 脱 乙 酰 巴 卡 亭 Ⅲ(10-Deacetylbaccatin Ⅲ, 10-DAB) 分 子 量 是 , 溶 于 乙 醇 二 氯 甲 烷 等, 是 紫 杉 醇 和 生 物 半 合 成 [3] 的 前 体, 如 果 可 以 大 量 生 产 10-DAB [4], 将 其 用 于 生 物 半 合 成, 就 能 生 产 出 大 量 紫 杉 醇, 造 福 于 人 类 本 文 利 用 高 效 液 相 色 谱 串 联 质 谱 法 从 环 境 中 筛 选 出 一 株 产 10-DAB 的 真 菌 1 材 料 与 方 法 1.1 仪 器 与 材 料 Spectra-physics 高 效 液 相 色 谱 仪 ;Beckman 质 谱 仪 ; 旋 转 蒸 发 器 ( 上 海 亚 荣 生 化 仪 器 厂 ) 10- 脱 乙 酰 巴 卡 亭 Ⅲ(Sigma 公 司 ); 甲 醇 ( 色 谱 纯 ); 氯 仿 ( 色 谱 纯 ) 1.2 标 准 溶 液 的 配 制 10- 脱 乙 酰 巴 卡 亭 Ⅲ 储 液 的 配 制 : 准 确 称 取 10 mg 标 准 品 于 1.5 ml Ep 管 中, 用 1 ml 甲 醇 溶 解, 混 匀 后 置 冰 箱 冷 藏 储 存 标 准 工 作 溶 液 的 配 制 : 吸 取 储 备 液 100 μl 于 1.5 ml Ep 管 中, 加 900μl 甲 醇 稀 释 至 1 mg/ml 相 同 方 法 用 甲 醇 稀 释 配 成 0.1 mg/ml 工 作 浓 度 的 标 样 冰 箱 储 存 备 用 1.3 样 品 制 备 待 测 菌 株 摇 瓶 培 养 9 天, 布 氏 漏 斗 分 离 菌 丝 和 发 酵 液 菌 丝 研 磨 后 用 50 ml 甲 醇 浸 泡 过 夜, 发 酵 液 低 压 旋 蒸 浓 缩, 浓 缩 液 和 菌 丝 浸 泡 液 混 合 后 过 滤 去 除 残 余 菌 丝 混 合 液 浓 缩 至 一 定 体 积 后 (5 ml) 用 氯 仿 : 甲 醇 (v/v,10:1) 萃 取 过 夜 氯 仿 相 在 通 风 厨 吹 干, 样 品 用 1 ml 甲 醇 再 次 溶 解, 离 心 去 除 杂 质, 上 清 液 用 有 机 微 孔 滤 膜 过 滤 后 进 行 HPLC-MS 分 析 1.4 仪 器 分 析 条 件 液 相 色 谱 条 件 :Kromasil C-18 5μm 250mmx4.6mm, 流 动 相 : 甲 醇 : 水 溶 液 =70:30; 柱 温 :30, 进 样 量 :10μL, 流 速 为 1 ml/min 质 谱 条 件 : 电 离 模 式 :ESI(+); 检 测 方 式 : 一 针 进 样 2 结 果 与 讨 论 2.1 高 效 液 相 色 谱 法 筛 选 出 一 株 产 10- 脱 乙 酰 巴 卡 亭 Ⅲ 真 菌 采 用 C-18 ODS 分 析 型 色 谱 柱 ( mm, Kromasil), 柱 温 调 节 为 30, 流 动 相 ( 甲 醇 : 超 纯 水 =7:3) 流 速 为 1 ml/min, 检 测 波 长 λ=227 nm, 进 样 量 20 µl, 重 复 3 次, 结 果 如 图 1 图 2 所 示 232

238 2010 年 9 月 第一届环渤海色谱学术交流会 第十九届天津市色谱学术交流会 会报 图 DAB 0.1 mg/ml 标准品色谱图 图 2. 发酵产物色谱图 10-DAB 标准品产生色谱峰的保留时间为 4.500min 而发酵产物经处理之后的出峰时 间为 min 二者的出峰时间在允许误差范围内可视为相同 据此进一步证明样品中含 有 10-DAB 2.2 质谱进一步验证该菌株产 10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ 发酵产物经甲醇浸提 旋蒸浓缩和 HPLC 纯化后 进行质谱检测 如图 3 图 4 图 DAB 0.1 mg/ml 标准品质谱图 图 4. 样品质谱图 如图 3.图 4.所示 样品中的主要成分分子量[M+K+2H]+= [M+ CF3COO]- = 由此可以得出[M]= 与 10-DAB 标准品的分子量相同 证明该菌发酵产物含有 10-DAB 通过高效液相色谱串联质谱方法可以快速准确的筛选 10-DAB 产生菌 233

239 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 参 考 文 献 : [1] Downs Ls Jr, Judson PL, Argenta PA, et al. A phase I study of ifosfamide, paclitaxel, and carboplatin in advanced and recurrent cervical cancer. Gynecol Oncol, 2003, 95(2):347~351 [2]. 李 桂 云, 陈 必 良, 马 向 东. 紫 杉 醇 对 浆 液 性 卵 巢 癌 细 胞 HO-8910 细 胞 凋 亡 的 诱 导 作 用. 肿 瘤 研 究 与 临 床,2002,16(1):11~13 [3].. Patel RN.Tour De Paclitaxel: biosynthesis for semisynthesis. Annu. Rev.Microbiol, 1998, 98:361~395 [4] Arturo Battaglia, Andrea Guerrini, Eleonora Baldelli.et al. Synthesis of 7- and 10-spermine conjugates of paclitaxel and 10-deacetyl-paclitaxel as potential prodrugs. Tetrahedron Letters,2006,47: Screening Fungi Producing 10- Deacetylbaccatin Ⅲ Using HPLC and MS Techniques Hao Xiao-ran, Niu Xue-liang, Chen Huang, Lv Xian-yu, Zhu Xu-dong (Nankai University, College of Life Science, Tianjin , China) Abstract: Establish a method screening for fungi producing 10- deacetylbaccatin Ⅲ using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and Mass Spectra(MS) techniques. The fungi were cultured for 9 days in liquid medium. Separated the fermented liquid and hyphae. Then the culture was concentrated, extracted by chloroform: methanol (v/v), dried, and dissolved in methanol. Tested sample was tested by Chromatography and mass spectrometry to determining whether strains produce 10- deacetylbaccatin Ⅲ. Key words: High Performance Liquid Chromatography; Mass Spectra; 10-Deacetylbaccatin Ⅲ. ( 上 接 231 页 ) 参 考 文 献 [1] Ming Dai, Ping Xie, Gaodao Liang. Simultaneous determination of microcystin-lr and its glutathione conjugate in fish tissues by liquid chromatography tandem mass spectrometry [J]. Journal of chromatography B. 2008, 862: [2] 聂 晶 晶, 李 元, 李 琴. 微 囊 藻 毒 素 检 测 方 法 的 研 究 进 展 [J]. 中 国 环 境 检 测.2007, 23(2): [3] Humberto Vieira Frias, Maria Anita Mendes, Karina Helena Morais Cardozo.Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event[j]. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2006, 344: [4] 郑 明 岚. 微 囊 藻 毒 素 无 害 化 处 理 的 研 究 进 展 [J]. 卫 生 研 究. 2007, 36(1): [5] 赵 建 伟, 黄 廷 林. 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 饮 用 水 中 的 微 囊 藻 毒 素 RR 和 LR [J]. 中 国 环 境 检 测. 2006, 22(3): [6] WHO. Guidelines for drinking - water quality [M].3ed. Geneva :World Health Organization, 2004 : [7] Wei Xu, Qi Chen, Ting Zhang. Development and application of ultra performance liquid chromatography electrospray ionization tandem triple quadrupole mass spectrometry for determination of seven microcystins in water samples [J]. analytica chimica acta. 2008, 626: [8] Jing Wang, Xiaolu Pang. An ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for determination of microcystins occurrence in surface water in Zhejiang Province, China [J]. Toxicon. 2007, 49 : [9] Liming Cong, Baifen Huang, Qi Chen. Determination of trace amount of microcystins in water samples using liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry [J]. Analytica Chimica Acta. 2006, 569:

240 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 熊 果 酸 脂 质 体 人 体 药 代 动 力 学 研 究 黄 月 珍 1 2 3, 阎 昭, 董 伟 林 (1. 天 津 医 科 大 学 药 学 院 2010 届 药 学 本 科 毕 业 生 ;2. 天 津 市 肿 瘤 医 院 ; 3. 天 津 医 科 大 学 基 础 医 学 院 天 津 ) 熊 果 酸 (Ursolic acid,ua), 是 一 类 存 在 于 天 然 植 物 中 五 环 三 萜 类 化 合 物, 在 自 然 界 分 布 较 广 目 前, 熊 果 酸 的 防 癌 抗 癌 作 用 已 引 起 广 泛 重 视 熊 果 酸 对 肿 瘤 形 成 各 阶 段 都 有 预 防 和 抑 制 作 用 它 可 以 抑 制 各 种 肿 瘤 细 胞 的 生 长, 介 导 肿 瘤 细 胞 凋 亡 [1-3] 熊 果 酸 口 服 剂 量 下 未 发 现 毒 副 作 用 4 而 且 熊 果 酸 还 具 有 增 强 机 体 免 疫 功 能 以 及 肝 损 伤 保 护 作 用 目 前 大 多 数 抗 肿 瘤 药 物 都 具 有 不 同 程 度 的 肝 损 伤 作 用 ; 肝 癌 的 化 疗 尚 缺 少 一 种 既 抗 肿 瘤 又 保 护 正 常 肝 细 胞 的 药 物, 而 熊 果 酸 恰 恰 有 望 弥 补 这 一 缺 陷 [1] 1 实 验 部 分 1.1 材 料 与 方 法 药 品 与 试 剂 试 验 用 药 物 : 注 射 用 熊 果 酸 纳 米 脂 质 体, 临 床 研 究 批 号 :090601( 仅 供 临 床 研 究 用 药 ), 武 汉 利 元 亨 药 物 技 术 有 限 公 司 试 验 用 标 准 品 : 熊 果 酸 对 照 品, 含 量 100%, 货 号 : , 中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所 提 供 试 验 用 标 准 品 : 甘 草 次 酸 对 照 品, 含 量 100%, 货 号 : , 中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所 提 供 试 剂 : 乙 腈 ( 色 谱 纯 ), 美 国 Fisher 公 司 ; 甲 醇 ( 色 谱 纯 ), 美 国 Fisher 公 司 ; 甲 酸 铵 ( 分 析 纯 ), 上 海 润 捷 化 学 试 剂 有 限 公 司 试 验 仪 器 液 质 联 用 系 统 : 美 国 Waters 公 司 UPLC-TQD 型 超 效 液 相 色 谱 - 质 谱 联 用 系 统 各 种 溶 液 的 配 制 称 取 熊 果 酸 对 照 品 2.5mg, 用 甲 醇 定 容 于 25mL 棕 色 容 量 瓶 中, 即 为 100.0µg ml -1 的 对 照 品 储 备 液 用 乙 腈 逐 级 稀 释 配 制 成 系 列 溶 液 ( ng ml -1 ) 称 取 甘 草 次 酸 对 照 品 2.5mg, 用 甲 醇 定 容 于 25mL 棕 色 容 量 瓶 中, 即 为 100.0µg ml -1 的 内 标 储 备 液 精 密 吸 取 该 储 备 液 10mL 置 100mL 棕 色 容 量 瓶 中, 用 乙 腈 稀 释 定 容 得 到 浓 度 为 10μg ml -1 的 内 标 溶 液 以 上 配 制 的 标 准 溶 液 均 4 保 存 1.2 血 药 浓 度 分 析 血 浆 样 品 处 理 方 法 准 确 量 取 血 浆 ( 空 白 含 药 )100µL, 加 入 内 标 溶 液 (10 µg ml -1 )100µL, 混 匀 后 加 入 0.1% 盐 酸 水 溶 液 1mL, 混 匀, 在 37 水 浴 中 放 置 30 分 钟 后 加 入 乙 酸 乙 酯 1mL, 涡 旋 振 荡 1min, 2000rpm 离 心 10min, 取 上 清 液, 常 温 下 氮 气 吹 干, 测 定 时 残 留 物 加 200µL 流 动 相 复 溶, 进 样 5µL 液 相 色 谱 - 质 谱 联 用 分 析 条 件 色 谱 柱 :ACQUITY UPLC BEH, C8, 1.7μm, ( )mm I.D. 作 者 简 介 : 黄 月 珍 (1987- ), 女, 天 津 医 科 大 学 药 学 院,2010 届 本 科 毕 业 生 Tel: , hyz121314@sina.com 阎 昭 (1973- ), 男, 天 津 医 科 大 学 肿 瘤 医 院, 副 主 任 药 师,Tel: , yanzhaotj@126.com 235

241 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 柱 温 :40 流 动 相 : 乙 腈 -10mmol L -1 甲 酸 铵 ( 含 10% 乙 腈 )(89: 11)(v/v) 流 速 :0.2mL min -1 进 样 量 :5μL 质 谱 条 件 : 电 喷 雾 离 子 化 源 (ESI), 负 离 子 检 测 毛 细 管 电 压 :3.8kV; 锥 孔 电 压 :80V; 源 温 度 : 110 ; 雾 化 温 度 :350 ; 雾 化 气 (N2) 流 速 :600L h -1 ; 锥 孔 气 (N2):50L h -1 用 于 定 量 分 析 的 离 子 反 应 分 别 为 : 熊 果 酸 m/z , 甘 草 次 酸 m/z 熊 果 酸 及 内 标 的 二 级 全 扫 描 质 谱 图 见 图 结 果 2.1 分 析 方 法 的 确 证 方 法 的 特 异 性 空 白 血 浆 空 白 血 浆 加 入 10ng ml -1 熊 果 酸 及 人 服 药 后 血 浆 经 提 取 后, 进 行 UPLC-MS-MS 分 析, 分 别 得 色 谱 图 熊 果 酸 及 内 标 的 保 留 时 间 分 别 为 1.96min 和 1.68min 从 色 谱 图 上 可 以 看 出, 空 白 血 浆 中 的 内 源 性 物 质 不 干 扰 熊 果 酸 及 内 标 的 测 定 (1) 熊 果 酸 ; (2) 甘 草 次 酸 图 1-1. 熊 果 酸 及 甘 草 次 酸 ( 内 标 ) 的 ESI 二 级 全 扫 描 质 谱 图 1 空 白 人 血 浆 210ng ml -1 的 空 白 人 血 浆 加 熊 3 10ng ml -1 的 空 白 人 血 浆 加 熊 果 酸 图 2-1. 熊 果 酸 血 浆 MRM 色 谱 图 236

242 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 方 法 的 线 性 取 人 空 白 血 浆 100μL, 再 加 入 不 同 浓 度 的 熊 果 酸 标 准 液 100μL, 使 成 为 含 和 5000ng ml -1 的 血 浆, 经 提 取 后, 进 行 UPLC-MS-MS 分 析 以 测 得 的 样 品 与 内 标 峰 面 积 比 对 浓 度 用 加 权 最 小 二 乘 法 进 行 线 性 回 归 (1/X 2 ), 得 回 归 方 程 即 为 熊 果 酸 的 血 浆 标 准 曲 线, 回 归 曲 线 见 图 5-2 其 典 型 曲 线 为 :Y= X (r=0.996) 方 法 的 精 密 度 与 准 确 度 进 行 ng ml -1 三 种 不 同 浓 度 样 品 的 批 内 和 批 间 精 密 度 准 确 度 分 析 批 内 分 析 每 一 浓 度 各 做 6 个 样 品, 共 做 三 批 三 种 浓 度 的 批 内 批 间 精 密 度 均 小 于 10%, 偏 差 在 (-2.0~2.0)% 之 间 方 法 的 稳 定 性 考 察 进 行 ng ml -1 三 种 不 同 浓 度 血 浆 样 品 在 室 温 放 置 6h 经 处 理 后 进 样 器 放 置 24h 冻 融 循 环 3 次 -20 冻 存 90 天 的 稳 定 性 分 析 每 一 浓 度 各 做 6 份 测 定 的 相 对 标 准 差 均 小 于 10%, 偏 差 在 (-5.63~6.50)% 之 间, 表 明 在 上 述 条 件 下, 熊 果 酸 血 浆 样 品 均 较 稳 定 方 法 的 灵 敏 度 进 行 10ng/mL 浓 度 血 浆 样 品 的 测 定, 共 做 6 份 测 定 的 相 对 标 准 偏 差 为 8.14%, 偏 差 在 (-11.3~10.8)% 之 间 熊 果 酸 的 最 低 检 测 浓 度 为 10ng/mL 方 法 的 回 收 率 用 ng ml -1 三 种 浓 度 进 行 血 浆 中 药 物 浓 度 测 定 回 收 率 试 验, 每 个 浓 度 各 做 6 份 样 品, 按 血 浆 样 品 处 理 方 法 项 操 作, 以 熊 果 酸 从 血 浆 中 处 理 后 测 定 值 与 相 应 浓 度 的 标 准 品 测 定 值 相 比, 计 算 其 回 收 率 在 20~4000ng ml -1 浓 度 范 围 内 熊 果 酸 的 平 均 回 收 率 在 (72.2~75.1)% 之 间 内 标 的 平 均 回 收 率 为 (64.2±2.20)% 2.2 各 剂 量 组 血 药 浓 度 24 位 受 试 者 以 37 mg/m 2 74 mg/m 2 98 mg/m 2 剂 量 静 脉 滴 注 给 药, 在 不 同 时 间 采 集 的 血 浆 样 品, 按 血 浆 样 品 处 理 方 法 项 下 操 作, 进 行 分 析 测 定 2.3 药 代 动 力 学 参 数 用 24 位 受 试 者 静 脉 推 注 给 药 和 98 mg/m 2 三 个 剂 量 组 的 血 药 浓 度 - 时 间 数 据, 用 中 国 药 理 学 会 数 学 药 理 专 业 委 员 会 编 制 的 DAS2.0 程 序 估 算 主 要 药 代 动 力 学 参 数 用 梯 形 法 计 算 曲 线 下 面 积 受 试 者 单 次 静 脉 滴 注 高 中 低 三 个 剂 量 熊 果 酸 脂 质 体 的 药 代 动 力 学 参 数 比 较 见 表 2-1 表 2-1 受 试 者 单 次 静 脉 滴 注 高 中 低 三 个 剂 量 注 射 用 熊 果 酸 脂 质 体 的 药 代 动 力 学 参 数 比 较 药 代 参 数 单 位 低 剂 量 37 mg/m 2 中 剂 量 74 mg/m 2 高 剂 量 98 mg/m 2 AUC(0-t) µg h L ± ± ± AUC(0- ) µg h L ± ± ± MRT(0-t) h 3.732± ± ±0.34 MRT(0- ) h 4.228± ± ±0.952 t1/2 h 4.527± ± ±2.08 Tmax h 4.031± ± ±0 CL L/h/m ± ± ±1.231 Vd L/m ± ± ±27.92 Cmax μg L ± ± ±

243 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 3 讨 论 24 名 健 康 受 试 者 分 别 单 次 静 脉 滴 注 熊 果 酸 脂 质 体 低 中 高 三 个 剂 量 组 (37 mg/m 2 / 人 74 mg/m 2 / 人 98 mg/m 2 / 人 ) 后, 熊 果 酸 脂 质 体 AUC 0-16h 与 剂 量 呈 正 相 关, 相 关 系 数 为 其 药 代 动 力 学 参 数 呈 现 一 级 动 力 学 特 征 给 药 剂 量 与 进 入 人 体 内 的 药 量 之 间 呈 正 相 关 低 中 高 三 个 剂 量 组 熊 果 酸 的 t 1/2 说 明 该 药 物 属 于 快 速 处 置 类 药 物 在 选 择 给 药 方 案 时, 应 该 借 鉴 给 药 窗 的 大 小 来 制 定 给 药 方 案 4 结 论 24 名 健 康 受 试 者 分 别 单 次 静 脉 滴 注 熊 果 酸 脂 质 体 低 中 高 三 个 剂 量 组, 结 果 表 明 药 物 AUC 0-16h 与 剂 量 呈 正 相 关, 相 关 系 数 为 其 药 代 动 力 学 参 数 呈 现 一 级 动 力 学 特 征 参 考 文 献 : [1] 王 春 雷, 芦 柏 震, 侯 桂 兰. 熊 果 酸 抗 肿 瘤 作 用 研 究 进 展 [J]. 安 徽 医 药,2005,9(10): [2] 颜 玲, 陈 会 敏. 熊 果 酸 的 免 疫 学 活 性 [J]. 湖 北 民 族 学 院 学 报,2005,22(1): [3] Chen guo-qing,shen Yi,Duan Hong.Anti-tumor Effect and Its Mechanisms of Ursolic Acid on Human Esophageal Carcinoma Cell Eca-109 in Vivo[J]. Chin J Cancer Res, 2008,20(3): [4] 李 开 泉, 陈 武, 熊 筱 娟 等. 乌 索 酸 的 化 学 药 理 及 临 床 应 用 进 展 [J]. 中 成 药,2002,24(9): Pharmacokinetics of Intravenous Liposome of Ursolic Acid in Human Huang Yue-zhen 1,Yan Zhao 2,Dong Wei-lin 3 (1.University gratuator in 2010,college of pharmacy,tianjin Medical University;2Tianjin tumor hospital; 3.college of basic medicine,tianjin Medical University) Abstract Objective : To study phase Ⅰ of clinical research to study the pharmacokinetics of liposome of ursolic acid and to supply guide for reasonable and safe medication in clinic. Methods : Determined the concentration of UA in plasma by UPLC-MS-MS. Calculated the pharmacokinetic parameter and evaluate the pharmacokinetic test.results Results: After 24 subjects were intravenously dripped on a single low,middle,high dose,the three maximum concentrations of UA are ±437.7μg L -1, ±867.9μg L -1, ±748.8μg L -1, AUC0-t ±602.3µg h L -1,7163.9±974.2µg h L -1,9644±1193.2µg h L -1,and t1/ ±2.259h, 4.782±1.755h,3.902±2.08h.Conclusion Conclusion:AUC0-t liposome of ursolic acid is positive correlation to the dose, and the correlation coefficient is Its pharmacokinetic parameters present first-order kinetics characteristics. Key words: Ursolic acid;uplc-ms-ms;pharmacokinetics. 238

244 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 海 洋 生 物 体 中 的 多 环 芳 烃 的 检 测 方 法 探 讨 5 降 升 平 ( 天 津 科 技 大 学 现 代 分 析 技 术 研 究 中 心, 天 津 ) 多 环 芳 烃 (PAHs) 是 指 含 有 两 个 或 两 个 以 上 苯 环, 以 线 状 角 状 或 簇 状 排 列 的 稠 环 型 化 合 [1] 物, 是 世 界 公 认 的 持 久 性 难 降 解 半 挥 发 性 有 机 化 合 物, 有 致 癌 致 畸 致 突 变 等 危 害 这 [2] 些 污 染 物 容 易 被 水 体 中 的 悬 浮 颗 粒 物 吸 附, 并 且 进 入 沉 积 物 中, 进 而 通 过 生 物 体 的 积 累, 对 近 岸 海 域 生 态 系 统 及 人 群 造 成 极 大 危 害 目 前 沉 积 物 或 土 壤 中 多 环 芳 烃 的 提 取 及 检 测 方 法 [3] 主 要 有 超 声 波 层 析 柱 净 化 气 相 色 谱 质 谱 法 索 式 提 取 层 析 柱 净 化 高 效 液 相 色 谱 [4] 荧 光 紫 外 串 联 法, 而 生 物 体 中 多 环 芳 烃 的 检 测 报 道 较 少 本 实 验 样 品 前 处 理 方 法 采 用 索 式 提 取 硅 胶 氧 化 铝 柱 净 化 法, 用 气 相 色 谱 - 选 择 离 子 质 谱 法 (GC-MS-SIS) 检 测, 结 果 显 示 质 谱 具 有 选 择 性, 通 过 定 性 离 子 的 扫 描 可 以 去 除 大 量 干 扰 信 号, 并 且 定 性 能 力 强, 因 此 本 文 采 用 GC-MS-SIS 法 测 定 生 物 体 中 多 环 芳 烃 的 含 量, 抗 干 扰 能 力 强 定 性 定 量 结 果 可 靠 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 和 试 剂 Varian 4000MS 型 气 相 色 谱 质 谱 联 用 仪, 美 国 瓦 里 安 公 司 ; 旋 转 蒸 发 仪, 上 海 雅 荣 生 化 设 备 仪 器 有 限 公 司 ; 索 氏 提 取 器 ; 具 塞 玻 璃 层 析 柱 正 己 烷 丙 酮 二 氯 甲 烷, 色 谱 纯 ; 无 水 Na2SO4, 分 析 纯,400 下 烘 干 4 h; 中 性 氧 化 铝, 层 析 纯,100~200 目,400 下 烘 干 4 h, 加 4% 的 水 去 活 化 ; 硅 胶, 层 析 纯,60~100 目,140 下 烘 干 4 h; 高 纯 铜 粉,99.8% 多 环 芳 烃 标 准 物 质 : 萘 菲 蒽 荧 蒽 屈 苯 并 (a) 芘, 国 家 标 准 物 质 中 心 ; 芴 芘 苯 并 (a) 蒽 苯 并 (e) 芘, 美 国 AccuStandard 1.2 试 样 的 制 备 提 取 和 净 化 将 海 洋 生 物 体 样 品 用 海 水 洗 涤, 除 去 杂 物 和 壳, 取 其 组 织, 匀 浆 处 理, 风 干 后 收 集 备 用 然 后 称 取 20g 与 20g 无 水 Na2SO4 混 匀, 用 正 己 烷 处 理 过 的 滤 纸 筒 包 好 放 入 索 氏 提 取 器 中 加 100mL 正 己 烷 丙 酮 ( 体 积 比 1:1) 浸 泡 12h, 在 75~80 水 浴 中 回 流 提 取 16 h, 冷 却 至 室 温, 用 250mL 质 量 分 数 2% 的 Na2SO4 溶 液 洗 涤, 收 集 有 机 相 到 旋 转 蒸 发 器 浓 缩 瓶 中, 浓 缩 至 5mL, 浓 缩 液 通 过 活 化 的 氧 化 铝 / 硅 胶 / 无 水 硫 酸 钠 (5g 氧 化 铝 5g 硅 胶 1g 无 水 硫 酸 钠 ) 层 析 柱 后, 加 入 5mL 正 己 烷 淋 洗, 再 加 入 80mL 体 积 比 1:4 二 氯 甲 烷 正 己 烷 溶 液, 收 集 淋 洗 液, 浓 缩 定 容 至 1mL, 加 1g 高 纯 铜 粉, 超 声 5min, 做 为 样 品 净 化 液 进 行 GC-MS 分 析 1.3 色 谱 条 件 VF-5ms 毛 细 管 柱 (30m 0.25mm 0.10μm); 进 样 口 温 度 290 ; 初 始 柱 温 150, 以 4 /min 升 到 270, 然 后 保 持 16min; 分 流 比 5:1; 以 高 纯 氦 气 为 载 气, 流 量 1mL/min; 进 样 量 1μL; 离 子 源 为 EI 源, 离 子 阱 温 度 220, 传 输 线 温 度 280 ; 溶 剂 延 迟 时 间 3min 2 结 果 与 讨 论 2.1 目 标 物 的 分 离 定 性 离 子 的 选 择 及 质 谱 识 别 将 标 样 和 样 品 都 制 备 好 后, 分 别 用 配 有 氢 火 焰 检 测 器 的 气 相 色 谱 仪 (GC-FID) 和 GC-MS 分 析, 结 果 显 示 GC-FID 法 得 到 的 样 品 色 谱 图 背 景 值 高, 杂 质 对 目 标 物 的 干 扰 严 重, 不 能 有 效 鉴 别 目 标 物 并 对 其 进 行 定 量, 而 通 过 分 析 GC-MS-SIS 法 得 到 的 样 品 总 离 子 流 图, 峰 型 比 较 规 整, 背 景 值 低, 对 目 标 物 的 干 扰 小, 而 且 GC-MS-SIS 法 得 到 的 标 准 品 信 噪 比 要 比 全 扫 作 者 简 介 : 降 升 平 (1977-), 男, 山 西 人, 工 程 师,Tel: , jiangshengping@tust.edu.cn 239

245 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 描 方 式 下 的 信 噪 比 高 2~3 倍 因 此 选 择 GC-MS-SIS 法 可 以 有 效 克 服 GC-FID 法 的 缺 点 利 用 10 种 目 标 物 的 混 合 标 准 液 进 行 GC-MS 分 析, 得 到 总 离 子 流 图 1, 根 据 质 谱 图 选 出 每 种 目 标 物 中 离 子 相 对 强 度 比 值 和 特 征 离 子 的 质 荷 比 数 值 见 表 1 特 征 离 子 的 选 择 原 则 是 : 在 基 质 干 扰 较 小 的 情 况 下 首 选 基 峰 离 子 强 度 较 大 的 离 子 和 分 子 离 子 峰 ; 在 考 虑 低 质 量 区 的 情 况 下 尽 量 选 取 质 荷 比 较 大 的 离 子 从 表 1 可 以 看 出, 多 环 芳 烃 的 分 子 结 构 稳 定 离 子 源 发 射 的 电 子 不 易 破 坏 其 分 子 的 骨 架, 只 能 使 分 子 失 去 一 个 电 子 形 成 分 子 离 子 所 以 该 类 化 合 物 的 基 峰 离 子 均 为 分 子 离 子 在 定 性 离 子 数 较 少 的 情 况 下, 被 测 物 定 性 离 子 与 该 标 准 物 定 性 离 子 间 丰 度 比 的 匹 配 度 显 得 尤 其 重 要 表 1 中 的 离 子 强 度 比 是 和 基 峰 离 子 做 比 得 到 的, 基 峰 离 子 的 强 度 为 100% 在 分 析 样 品 时, 不 仅 要 在 标 准 物 的 保 留 时 间 出 峰, 而 且 质 谱 图 中 的 每 个 定 性 离 子 之 间 的 强 度 比 也 要 与 表 中 的 强 度 比 符 合 才 能 确 认 是 该 目 标 物 1- 奈 ;2- 芴 ;3- 菲 ;4- 蒽 ;5- 荧 蒽 ;6- 芘 ;7- 屈 ;8- 苯 并 (a) 蒽 ;9- 苯 并 (e) 芘 ;10- 苯 并 (a) 芘 表 1 图 1 10 多 环 芳 烃 组 分 的 GC-MS 总 离 子 流 图 10 种 多 环 芳 烃 的 保 留 时 间 定 性 离 子 及 相 对 强 度 比 PAHs 保 留 时 间 /min 定 性 离 子 扫 描 时 间 段 /min 强 度 比 萘 * 7.5~9.0 2:7:6:13:100 芴 * 9.0~14.2 4:6:5:7:100 菲 * 14.2~17.0 4:9:6:17:100 蒽 * 14.2~17.0 4:8:6:13:100 荧 蒽 * 17.0~22.0 5:9:2:100 芘 * 17.0~22.0 4:10:2:100 屈 * 22.0~28.0 5:8:2:100 苯 并 (a) 蒽 * 22.0~28.0 6:7:3:100 苯 并 (e) 芘 * 28.0~35.0 7:9:3:100 苯 并 (a) 芘 * 28.0~35.0 9:11:3:100: 注 : 带 * 号 的 离 子 是 基 峰 离 子 ; 强 度 比 是 和 基 峰 相 比 得 到 的, 按 质 荷 比 大 小 顺 序 排 列 2.2 检 出 限 相 关 系 数 回 收 率 精 密 度 及 样 品 分 析 分 别 取 1.00μL 的 μg/mL 的 混 合 标 准 溶 液 进 行 GC-MS-SIS 分 析, 得 到 线 性 方 程 相 关 系 数 0.01μg/mL 的 标 样 连 续 测 定 3 次, 进 样 量 1μL, 取 其 标 准 偏 差 s, 仪 器 检 出 限 为 3sm/A [5],m 为 每 种 PAHs 实 际 进 入 仪 器 的 质 量,A 为 每 种 PAHs 的 平 均 峰 面 积 平 行 分 析 3 个 基 质 加 标 样 品, 即 在 样 品 前 处 理 时 不 加 生 物 体 样 品, 在 20g 无 水 Na 2SO 4 中 混 入 1mL 0.05μg/mL 的 10 种 PAHs 标 样, 得 到 回 收 率 相 对 标 准 偏 差, 方 法 检 出 限 为 3sc/A, c 为 已 知 加 标 浓 度,A 为 每 种 PAHs 的 平 均 峰 面 积 结 果 见 表 2 从 表 中 可 以 看 出, 基 质 加 标 回 收 率 符 合 分 析 要 求, 样 品 分 析 结 果 可 靠 240

246 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 表 2 方 法 的 相 关 系 数 检 出 限 回 收 率 及 精 密 度 目 标 物 仪 器 检 出 方 法 检 出 限 相 关 系 数 0.05μg ml -1 (n=3) 样 品 分 析 结 果 (ng g -1 ) 限 DL MDL r Recovery RSD 生 物 样 品 A 生 物 样 品 B 生 物 样 品 C 萘 芴 菲 蒽 荧 蒽 芘 屈 苯 并 (a) 苯 并 (e) 苯 并 (a) 注 :- 代 表 未 检 出 3 结 论 本 研 究 采 用 索 式 提 取 - 硅 胶 氧 化 铝 柱 净 化,GC-MS-SIS 检 测 的 方 法 定 量 分 析 了 生 物 体 中 10 种 PAHs, 回 收 率 在 64.9%~97.5% 之 间,RSD 为 4.0%~15.2%, 方 法 检 出 限 小 于 0.6ng g-1, 该 方 法 适 用 于 生 物 样 品 中 PAHs 的 分 析 参 考 文 献 : [1] 陈 皓, 刘 颖, 刘 海 玲, 等. 超 高 效 液 相 色 谱 法 检 测 土 壤 中 的 多 环 芳 烃 [J]. 色 谱,2008, 26(6): [2] 薛 荔 栋, 郎 印 海, 刘 爱 霞, 等. 黄 海 近 岸 日 照 段 表 层 沉 积 物 中 多 环 芳 烃 的 来 源 解 析 研 究 [J]. 海 洋 学 报,2008, 30(6): [3] 黎 晓 霞, 蔡 河 山, 张 珞 平. 厦 门 西 海 域 表 层 沉 积 物 中 多 环 芳 烃 含 量 分 布 及 生 态 风 险 评 价 [J]. 热 带 海 洋 学 报,2008,27(5): [4] 饶 竹, 李 松, 何 淼, 等. 高 效 液 相 色 谱 荧 光 紫 外 串 联 测 定 土 壤 中 16 种 多 环 芳 烃 [J]. 分 析 化 学, 2007,35(7): [5] 田 强 兵. 分 析 化 学 中 检 出 限 和 测 定 下 限 的 探 讨 [J]. 化 学 分 析 计 量,2007,16(3): Discussion on Analysis Methods of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Organisms JIANG Sheng-ping (Research center for modern analysis techniques, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin ) Abstract : An analytical method for Polycyclic aromatic hydrocarbons in organism by chromatography-ma-ss spectrometry was developed. The detection limits for the ten PAHs were0.1 ~ 0.6μg/kg, the linear relations was good, the most of recoveries for PAHs ranged between 64.9% ~ 97.5%, the relative standard deviations(rsds) ranged from4.0% ~ 15.2%. Finally, the developed analytical method has been successfully applied to the determination of PAHs in organism samples. Keywords:organism; polycyclic aromatic hydrocarbons; GC-MS 241

247 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 用 固 相 萃 取 和 色 质 联 用 技 术 分 析 柴 油 组 成 袁 维 ( 中 石 化 股 份 有 限 公 司 天 津 分 公 司 炼 油 部 质 检 车 间 ) 本 文 介 绍 了 利 用 固 相 萃 取 和 色 质 联 用 技 术 分 析 柴 油 组 成 的 方 法, 首 先 利 用 固 相 萃 取 的 方 法 将 柴 油 分 离 成 饱 和 烃 和 芳 烃, 分 别 加 入 等 量 内 标 物 再 分 别 取 样 进 行 气 相 色 谱 和 质 谱 分 析, 通 过 芳 烃 和 饱 和 烃 的 气 相 色 谱 图 计 算 二 者 的 含 量, 由 质 谱 图 得 出 芳 烃 和 饱 和 烃 的 烃 族 组 成, 再 根 据 饱 和 烃 和 芳 烃 的 相 对 含 量, 由 归 一 计 算 法 得 到 柴 油 的 烃 族 组 成 随 着 人 们 环 境 保 护 意 识 的 逐 渐 加 强 以 及 对 车 用 清 洁 燃 料 的 要 求 不 断 提 高, 汽 油 和 柴 油 的 质 量 不 断 升 级, 2010 年 车 用 柴 油 全 部 达 到 国 Ⅲ 标 准 车 用 柴 油 国 Ⅲ 标 准 中 首 次 限 制 了 多 环 芳 烃 的 含 量 不 大 于, 出 口 柴 油 对 多 环 芳 烃 的 含 量 要 求 更 加 苛 刻, 因 此 建 立 柴 油 烃 族 组 成 的 分 析 方 法, 配 合 柴 油 质 量 全 面 升 级 意 义 尤 为 重 要 准 确 测 定 芳 烃 和 多 环 芳 烃 的 含 量 是 油 品 生 产 的 迫 切 要 求, 但 在 油 品 的 生 产 过 程 中, 原 料 及 工 艺 条 件 的 变 化 与 波 动 将 直 接 影 响 油 品 的 组 成, 尽 快 掌 握 油 品 组 成 的 变 化, 及 时 调 整 操 作 条 件 才 能 生 产 出 合 格 的 产 品 首 先 利 用 固 相 萃 取 技 术 使 饱 和 烃 和 芳 烃 分 开, 得 到 各 自 的 分 离 样 品, 然 后 利 用 内 标 归 一 化 定 量 方 式 在 GC-FID 上 进 行 定 量, 得 到 样 品 的 饱 和 烃 和 芳 烃 含 量 的 族 组 成 结 果, 在 GC-MS 上 按 ASTM D2425 方 法 得 到 更 详 细 的 链 烷 单 双 和 多 环 烷 烃 或 芳 烃 的 族 组 成 信 息 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 与 试 剂 HP 7890GC/5973MS, 带 FID 检 测 器 试 剂 : 正 己 烷, 正 戊 烷, 二 氯 甲 烷 ( 均 为 分 析 纯 ), 正 构 三 十 二 烷 ( 纯 度 大 于 99.5%) 1.2 实 验 条 件 GC 工 作 条 件 色 谱 柱 进 样 量 Agilent 19091s-433 毛 细 管 柱 30m 0.25mm 0.25μm 1.0μL 分 流 比 30:1 柱 流 量 2ml/min GC 进 样 口 温 度 300 GC-MS 接 口 温 度 280 GC 柱 箱 温 度 60 1 分 钟 检 测 器 温 度 MS 工 作 条 件 EI EMV 40 /min 分 钟 电 离 方 式 941eV GC-MS 接 口 温 度 280 离 子 源 温 度 实 验 步 骤 固 相 萃 取 分 离 柴 油 饱 和 烃 和 芳 烃 馏 分 利 用 固 相 萃 取 柱 ( 固 定 相 为 改 性 硅 胶 ) 上 加 入 约 0.15ml 柴 油, 依 次 用 正 戊 烷 和 二 氯 甲 烷 冲 洗 固 相 萃 取 柱, 正 戊 烷 萃 取 出 柴 油 的 饱 和 烃 馏 分, 二 氯 甲 烷 萃 取 出 芳 烃 馏 分 溶 剂 用 量 为 经 典 柱 色 谱 的 1/70, 样 品 处 理 时 间 <2min 242

248 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 分 别 进 样 分 析 饱 和 烃 和 芳 烃 馏 分 图 1 芳 烃 分 析 色 谱 图 图 2 芳 烃 分 析 质 谱 图 图 3 饱 和 烃 分 析 色 谱 图 图 4 饱 和 烃 分 析 质 谱 图 2 定 量 计 算 用 内 标 法 先 求 出 饱 和 烃 和 芳 烃 相 对 于 各 自 内 标 的 含 量, 再 将 两 者 进 行 归 一 化 处 理 得 到 最 终 的 分 析 结 果 所 选 内 标 为 高 碳 数 正 构 烷 烃, 如 正 构 三 十 二 烷, 将 其 直 接 溶 解 在 正 戊 烷 或 正 己 烷 中 即 可 得 到 相 应 的 内 标 液 但 内 标 法 操 作 比 较 繁 琐, 需 要 准 确 确 定 样 品 中 所 加 入 的 内 标 物 含 量, 而 本 方 法 为 了 保 证 溶 剂 峰 与 样 品 峰 能 分 开, 选 择 了 低 沸 点 的 烷 烃 做 溶 剂, 所 以 更 增 加 了 内 标 浓 度 确 定 的 困 难 同 时 在 放 置 过 程 中 由 于 低 沸 点 溶 剂 的 挥 发 也 会 造 成 浓 度 的 变 化 243

249 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 为 此, 本 方 法 规 定 色 谱 测 定 时, 在 饱 和 烃 和 芳 烃 溶 液 中 加 入 相 同 浓 度 和 相 同 体 积 的 内 标 液 或 相 同 质 量 的 内 标 物, 即 令 下 式 中 的 mns 等 于 mna, 从 而 使 内 标 定 量 计 算 中 的 和 可 以 互 相 约 掉, 在 求 相 对 含 量 时, 内 标 量 不 参 加 计 算 这 样 一 来, 内 标 液 浓 度 及 在 放 置 过 程 中 浓 度 变 化 对 分 析 结 果 的 影 响 就 被 最 大 限 度 地 减 少 了 饱 和 烃 含 量 =(Asmns/Ans)/[ (Asmns/ Ans)+ ( Aamna/ Ana)] 芳 烃 含 量 =(Aamna/Ana)/[ (Asmns/ Ans)+( Aamna/ Ana)] 式 中 As GC-FID 测 量 饱 和 烃 的 分 析 谱 图 上 饱 和 烃 的 峰 面 积 Aa GC-FID 测 量 芳 烃 的 分 析 谱 图 上 芳 烃 的 峰 面 积 Ans GC-FID 测 量 饱 和 烃 的 分 析 谱 图 上 内 标 峰 的 峰 面 积 Ana GC-FID 测 量 芳 烃 的 分 析 谱 图 上 内 标 峰 的 峰 面 积 mns 色 谱 分 析 用 饱 和 烃 馏 分 中 加 入 的 内 标 物 质 量 mna 色 谱 分 析 用 芳 烃 馏 分 中 加 入 的 内 标 物 质 量 当 进 行 详 细 烃 族 组 成 分 析 时, 只 要 将 饱 和 烃 或 芳 烃 含 量 与 按 ASTM D2425 方 法 得 到 的 各 馏 分 详 细 烃 组 成 归 一 的 结 果 相 乘 即 可 3 精 密 度 分 析 成 品 交 库 柴 油 结 果 见 表 1, 由 表 中 数 据 可 以 看 出 总 饱 和 烃 总 单 环 芳 烃 和 总 芳 烃 的 标 准 偏 差 均 大 于 1, 是 由 于 萃 取 操 作 不 过 关 带 来 的 影 响, 其 他 组 分 的 标 准 偏 差 均 小 于 1 表 1 柴 油 组 成 分 析 结 果 馏 分 烃 类 组 成 测 定 值 均 值 标 准 偏 差 链 烷 烃 一 环 烷 烃 二 环 烷 烃 三 环 烷 烃 总 环 烷 烃 总 饱 和 烃 烷 基 苯 茚 满 或 四 氢 萘 茚 类 总 单 环 芳 烃 萘 萘 类 苊 类 苊 烯 类 总 双 环 芳 烃 三 环 芳 烃 总 芳 烃 胶 质 总 重 量

250 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 超 声 提 取 -GC/MS 测 定 贝 类 产 品 中 的 多 氯 联 苯 周 群 标, 王 向 红, 桑 亚 新, 王 丽, 吉 爽 爽, 叶 静 ( 河 北 农 业 大 学 食 品 科 技 学 院, 保 定 ) 多 氯 联 苯 (polychlorinated biphenyls,pcbs) 是 一 种 典 型 的 持 久 性 有 机 污 染 物, 广 泛 存 在 于 空 气 水 土 壤 和 食 物 中, 多 氯 联 苯 进 入 人 体 后, 有 致 毒 致 癌 性, 能 对 人 类 健 康 危 害 极 大 [1] PCBs 是 斯 德 哥 尔 摩 公 约 中 优 先 控 制 的 12 类 持 久 性 有 机 污 染 物 之 一 包 括 209 种 同 系 物 异 构 体, 具 有 良 好 的 阻 燃 性 和 稳 定 性, 被 广 泛 应 用 于 电 力 液 压 油 阻 燃 剂 等 产 品 中, 由 于 [2] 其 在 自 然 环 境 中 很 难 降 解 因 此, 在 大 气 水 体 土 壤 动 物 组 织 以 及 蛋 类 中 也 有 多 氯 联 苯 检 出 [3] 水 产 品 中 多 氯 联 苯 的 提 取 常 用 索 氏 提 取 法, 但 该 法 所 用 时 间 较 长, 不 利 于 大 批 量 样 品 的 处 理 由 于 技 术 条 件 资 金 投 入 及 其 他 一 些 客 观 因 素 的 制 约, 各 实 验 室 采 用 的 方 法 存 在 一 定 的 差 距 超 声 波 提 取 法 被 认 为 是 分 析 固 体 基 质 较 为 简 单 的 方 法, 在 油 脂 蛋 白 多 糖 和 异 黄 酮 等 提 取 方 面 得 到 了 广 泛 应 用 多 个 研 究 表 明, 超 声 波 提 取 具 有 效 率 高 消 耗 能 量 少 和 不 [4] 会 对 被 提 取 的 物 质 造 成 破 坏 等 优 点 本 研 究 结 合 GB/T 食 品 中 指 示 性 多 氯 联 苯 含 量 的 测 定, 对 秦 皇 岛 水 域 不 同 贝 类 品 种 及 不 同 组 织 中 7 种 指 示 性 PCBs 单 体 进 行 了 测 定, 并 对 样 品 的 前 处 理 方 法 进 行 优 化, 建 立 了 采 用 超 声 提 取, 硫 酸 和 硅 胶 柱 进 行 净 化 的 方 法, 简 化 前 处 理 步 骤, 以 满 足 普 通 实 验 室 对 指 示 性 多 氯 联 苯 的 检 测 要 求 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 与 试 剂 贝 类 样 品 采 于 秦 皇 岛 沿 岸 养 殖 海 域, 采 集 时 间 , 活 体 采 集,-20 冷 藏 ; 浓 硫 酸 ( 分 析 纯 ); 正 己 烷 ( 色 谱 纯 ), 无 水 Na2SO4( 分 析 纯 ), 天 津 科 密 欧 公 司 ; 层 析 硅 胶 (100 目 ):120 过 夜 活 化 ;PCBs 标 准 物 质 10mg/l:PCB 和 180 七 种 混 合 标 准 溶 液 : 德 国 Dr 公 司 1.2 仪 器 及 色 谱 条 件 安 捷 伦 气 相 - 质 谱 联 用 仪 (GC7890A/MS5975C) 配 有 Agilent NIST05.L 图 谱 库 系 统 : 美 国 Agilent 公 司 ;TDL-5 型 离 心 机 : 上 海 飞 鸽 ;SK-1 型 涡 旋 混 匀 器 : 麒 麟 医 仪 ;RE52CS 真 空 旋 转 蒸 发 仪 : 上 海 亚 荣 ;JYL-A010 粉 碎 机 : 山 东 九 阳 ;SK5200H 超 声 仪 : 上 海 科 导 色 谱 条 件 色 谱 柱 :HP-5 石 英 毛 细 管 柱 (30 m 0125 mm 0125μm); 进 样 口 温 度 250 ; 升 温 条 件 :100 保 持 2 min, 以 15 /min 升 至 180, 保 持 0min,3 /min 升 至 240, 保 持 0min, 10 /min 升 至 270, 保 持 2 min 载 气 (He) 恒 流 :1.0ml/min; 不 分 流 进 样 ; 进 样 量 1ul; 后 运 行 :280 (2min) 质 谱 条 件 电 子 轰 击 (EI) 离 子 源 ; 电 子 能 量 70ev; 离 子 源 温 度 :250 ; 传 输 线 温 度 : 标 准 曲 线 的 制 作 245

251 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 将 10mg/l 的 PCBs 标 准 品 用 正 己 烷 分 别 稀 释 成 ng/ml 的 标 准 溶 液 以 浓 度 为 横 坐 标, 峰 面 积 为 纵 坐 标, 自 动 定 量 绘 制 标 准 曲 线 线 性 方 程 及 相 关 系 数 见 表 1 表 1 7 种 PCBs 的 标 准 曲 线 及 其 相 关 系 数 名 称 线 性 方 程 相 关 系 数 r 线 性 范 围 (ug/mg) PCB28 Y=3.778X PCB52 Y=2.598X PCB101 Y=2.614X PCB118 Y=2.336X PCB130 Y=2.112X PCB153 Y=3.084X PCB180 Y=1.729X [5-7] 1.4 样 品 处 理 贝 类 化 冻, 洗 净 泥 沙, 去 除 贝 壳, 粉 碎 机 混 匀 贝 肉 取 样 品 5g 置 于 具 塞 试 管 中, 加 入 3g 无 水 硫 酸 钠, 加 20ml 正 己 烷,45 超 声 60min,3000 rpm 离 心 分 离 5 min, 取 上 清 液 于 梨 形 瓶 中, 重 复 一 次, 合 并 上 清 液, 旋 转 蒸 发 至 干 5ml 正 己 烷 分 两 次 溶 出, 转 入 小 试 管 中, 取 2ml 浓 硫 酸 加 入, 混 匀, 静 置 待 溶 液 分 层 后, 取 上 清 过 硅 胶 柱 (2g 硅 胶, 上 层 覆 盖 2g 无 水 硫 酸 钠 ), 用 30ml 正 己 烷 淋 洗, 收 集 并 浓 缩 洗 脱 液, 将 洗 脱 液 定 容 置 1ml, 供 GC/MS 测 定, 外 标 法 定 量 2 结 果 与 讨 论 2.1 标 准 物 及 样 品 分 析 色 谱 图 丰 度 TIC: D\data.ms 时 间 --> 图 1 PCBs 标 准 样 品 GC/MS 总 离 子 流 图 注 :1 PCB28;2 PCB52;3 PCB101;4 PCB118;5 PCB130;6 PCB153;7 PCB

252 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 丰 度 TIC: 原 料 1.D\data.ms 时 间 --> Time(min) 图 2 海 湾 扇 贝 GC/MS 总 离 子 流 图 注 :1 PCB28;2 PCB52;3 PCB101;4 PCB118;6 PCB 样 品 精 密 度 回 收 率 及 检 测 线 配 制 0.100ug/ml 混 合 标 准 溶 液, 取 1ul 进 样, 平 行 测 定 6 次, 计 算 RSD, 结 果 见 表 2 取 混 匀 的 贝 肉 样 品 5g, 共 6 份, 分 别 加 入 50ng 的 混 合 标 准 溶 液, 按 照 1.4 样 品 处 理 方 法 进 行 处 理 最 低 检 测 限 以 3 倍 信 噪 比 计 算, 结 果 见 表 2 表 2 7 种 PCBs 的 回 收 率 检 出 限 及 精 密 度 (n=6) PCBs 回 收 率 (%) RSD(%) 检 出 限 (ug/kg) PCB % 0.03 PCB % 0.04 PCB % 0.04 PCB % 0.03 PCB % 0.06 PCB % 0.08 PCB % 贝 类 样 品 的 测 定 不 同 品 种 贝 类 中 PCBs 的 含 量 表 3 不 同 贝 类 品 种 中 7 种 PCBs 的 含 量 (ug/kg) 名 称 海 湾 扇 贝 花 蛤 牡 蛎 虾 夷 扇 贝 PCB PCB PCB PCB PCB PCB PCB PCB 总 量 注 : -- 表 示 未 检 出 由 表 3 可 知, 海 洋 贝 类 对 有 机 氯 具 有 较 明 显 的 富 集 作 用 ; 渤 海 湾 秦 皇 岛 养 殖 海 域 采 集 的 247

253 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 不 同 贝 类 样 品 中 PCBs 的 含 量 在 ug/kg, 远 低 于 GB 海 产 食 品 中 多 氯 联 苯 限 量 卫 生 标 准 200ug/kg [8] ; 不 同 贝 类 对 有 机 氯 化 合 物 的 累 积 程 度 有 差 异, 海 湾 扇 贝 和 牡 蛎 中 的 含 量 较 高, 而 花 蛤 和 虾 夷 扇 贝 较 低, 这 可 能 和 贝 类 的 养 殖 期 和 脂 肪 含 量 有 关, 养 殖 期 越 长 其 体 内 富 集 的 PCBs 就 越 多 PCBs 的 脂 溶 性 较 强, 故 其 在 脂 肪 含 量 较 多 的 牡 蛎 中 富 [9-10] 集 也 就 较 多 不 同 贝 类 组 织 中 PCBs 的 含 量 表 4 海 湾 扇 贝 不 同 组 织 中 7 种 PCBs 的 含 量 (ug/kg) 名 称 内 脏 卵 黄 裙 边 贝 柱 PCB PCB PCB PCB PCB PCB PCB PCB 总 量 注 : -- 表 示 未 检 出 由 表 4 可 知, 在 海 湾 扇 贝 的 不 同 组 织 中 均 有 检 出 PCBs, 其 中 以 内 脏 中 的 富 集 量 为 最 多, 高 达 ug/kg, 卵 黄 次 之, 裙 边 和 贝 柱 的 含 量 最 少 因 内 脏 和 卵 黄 中 的 脂 肪 和 卵 磷 脂 较 多, 故 其 含 量 要 远 高 于 裙 边 和 贝 柱, 但 上 述 结 果 与 国 标 GB 相 比 未 有 超 出 限 量 标 准 2.4 实 验 条 件 的 选 择 和 讨 论 提 取 及 净 化 方 法 的 探 讨 样 品 处 理 时 充 分 捣 碎 有 利 于 被 测 物 质 溶 解 和 分 散 在 国 标 GB/T 中 采 用 的 是 索 氏 提 取, 该 法 方 法 繁 杂 耗 时, 且 试 剂 挥 发 较 多 不 利 于 人 体 健 康 而 超 声 提 取 贝 类 中 的 多 氯 联 苯 具 有 快 速 高 效 试 剂 消 耗 少 等 优 点 贝 类 产 品 中 含 有 大 量 的 油 脂 和 蛋 白 质 等 成 分, 测 定 时 应 除 去 这 些 杂 质, 以 免 影 响 测 定 结 果 浓 硫 酸 能 够 使 蛋 白 质 糖 类 等 成 分 变 性 碳 化, 而 Na2SO4- 硅 胶 柱 有 着 较 好 的 净 化 效 果, 使 用 二 者 能 够 达 到 减 少 基 质 干 扰 的 效 果, 实 验 表 明 回 收 结 果 能 达 到 80% 以 上 GC/MS 法 测 定 条 件 的 探 讨 用 标 准 溶 液 进 行 GC/MS 测 定, 确 定 7 种 多 氯 联 苯 单 体 的 保 留 时 间 及 碎 片 峰, 用 各 单 体 保 留 时 间 和 MS 特 征 子 离 子 进 行 定 性, 用 所 选 定 各 单 体 定 量 离 子 进 行 定 量 该 法 本 底 低, 各 单 体 PCBs 不 易 与 干 扰 物 存 发 生 干 扰, 具 有 高 的 选 择 性, 可 将 7 种 PCBs 单 体 进 行 准 确 的 定 性 和 定 量 分 析, 适 于 普 通 实 验 室 使 用 3 结 论 通 过 超 声 优 化 建 立 了 贝 类 海 产 品 的 前 处 理 条 件, 与 国 标 相 比 降 低 了 成 本, 缩 短 了 时 间, 方 法 简 便 快 速 高 效 且 稳 定, 值 得 推 广 该 法 除 了 适 用 于 贝 类 海 产 中 PCBs 的 分 析, 也 可 满 足 对 鱼 虾 蟹 等 其 它 水 产 可 食 部 分 中 PCBs 微 量 残 留 的 分 析 测 定 采 用 GC-MS 法 定 量 测 定 了 渤 海 湾 秦 皇 岛 海 域 不 同 贝 类 样 品 和 不 同 组 织 中 PCBs 的 含 量, 结 果 表 明 牡 蛎 和 海 湾 扇 贝 对 PCBs 的 富 集 能 力 较 强, 可 作 为 沿 海 有 机 氯 污 染 监 测 较 理 想 的 生 248

254 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 物 指 示 种 ; 海 产 贝 柱 中 PCBs 的 含 量 远 低 于 内 脏, 建 议 食 用 时 弃 去 内 脏 本 研 究 表 明 渤 海 湾 秦 皇 岛 海 域 经 济 贝 类 已 受 到 了 PCBs 的 污 染, 虽 然 其 含 量 均 远 低 于 食 用 卫 生 标 准, 但 应 引 起 有 关 部 门 的 注 意, 及 早 防 范, 制 定 相 应 的 管 理 措 施, 使 PCBs 的 污 染 降 到 最 低 参 考 文 献 : [1] 联 合 国 环 境 规 划 署. 环 境 署 倡 导 消 除 持 久 性 有 机 污 染 物 多 氯 联 苯 [R]. 日 内 瓦 : 联 合 国 环 境 规 划 署, [2] 王 玉 飞, 陈 晓 红, 傅 小 红. 气 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 测 定 生 物 样 品 中 的 多 氯 联 苯 和 滴 滴 涕 [J]. 色 谱 2007, 25(1): [3] GB/T 食 品 中 指 示 性 多 氯 联 苯 含 量 的 测 定 [S]. [4] 万 大 娟, 贾 晓 珊, 余 光 辉. 超 声 波 提 取 植 物 性 食 品 中 六 氯 苯 的 研 究. 食 品 科 学,2006,27(12): [5] 张 景 明, 胡 冠 九, 多 氯 联 苯 的 气 相 色 谱 / 质 谱 / 质 谱 法 测 定 [J]. 中 国 环 境 监 测,2003,19(3):5-8 [6] 王 玉 飞, 金 米 聪, 陈 晓 红 海 产 品 中 指 示 性 多 氯 联 苯 单 体 的 GC/MS/MS 法 快 速 定 量 测 定 [J]. 中 国 卫 生 检 验 杂 志,2008,18(8): [7] 王 春 玲, 张 玉 军, 刘 建 平, 等. 超 声 波 对 蜂 胶 中 有 效 成 分 的 提 取 率 影 响 的 研 究. 郑 州 工 程 学 院 学 报, 2003,24(4):28-33 [8] GB/ 海 产 食 品 中 多 氯 联 苯 限 量 卫 生 标 准 [S]. [9] 陈 伟 琪, 张 珞 平, 王 新 红. 厦 门 岛 东 部 和 闽 江 口 沿 岸 经 济 贝 类 中 持 久 性 有 机 氯 农 药 和 多 氯 联 苯 的 残 留 水 平 [J]. 台 湾 海 峡,2001,20(3): [10] 刘 仁 沿, 吴 世 培, 王 斌. 长 江 口 以 北 沿 海 主 要 经 济 贝 类 中 有 机 氯 农 药 和 多 氯 联 苯 的 分 布 及 评 价 [J]. 海 洋 环 境 科 学,1996,15(2): Determination of polychlorinated biphenyls by GC/MS with ultrasound-assisted extraction from shellfish ZHOU Qun-biao, Wang Xiang-hong, SANG Ya-xin, Wang Li, JI Shuang-shuang, YE Jing ( College of Food Science & Technical, Agricultural University of HeBei, Baoding ) Abstract: An efficient extraction method by ultrasound-assisted extraction (UAE) was developed for the extraction of polychlorinated biphenyls (PCB 28,52,101,118,130,153,180) from various shellfish. Analytes were determined by gas chromatography mass spectrometry in selected ion monitoring (SIM) mode. All the samples were extracted by n-hexane and decontaminated by concentrated sulfuric acid. The resulting samples were determined by quantitative detection by comparison to external standards. The average recoveries of seven kinds of PCBs ranged from 80.92% to 93.89% and the lowest detectable limit was ug/kg. The average concentrations of total PCBs were ug/kg in the samples. This method was highly effective in reducing the cost and time for the pretreatment of samples. This method may be applied for the screening and monitoring of shellfish for organic pollutants in coastal waters. Keywords: ultrasound-assisted extraction; GC/MS; shellfish; PCBs 249

255 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 药 物 中 杂 质 鉴 定 新 技 术 MassWorks 顾 鸣, 李 卫 建, 李 宗 华 (1.Cerno Bioscience, 康 州, CT06810, 美 国 ; 2. 北 京 绿 绵 科 技 有 限 公 司, 北 京 ,zonghua_li@lumtech.com.cn) 本 文 介 绍 一 种 用 UPLC 进 行 色 谱 分 离, 单 四 极 质 谱 检 测,MassWorks 数 据 处 理, 鉴 定 药 物 中 杂 质 组 成 的 新 技 术 作 为 一 项 新 技 术,MassWorks 实 现 了 在 低 分 辨 率 质 谱 上 的 精 确 质 量 数 测 定 和 分 子 式 的 准 确 识 别 药 品 中 少 量 的 杂 质 会 大 大 降 低 药 物 的 疗 效 或 造 成 不 良 药 物 反 应, 因 此, 鉴 定 这 些 杂 质 的 组 成, 对 于 监 管 机 构 来 说 就 是 一 项 必 不 可 少 的 工 作 鉴 定 这 些 杂 质, 首 先 需 要 测 定 这 些 它 们 的 元 素 组 成 过 去, 我 们 只 能 借 助 高 分 辨 率 质 谱 ( 诸 如 qtof FT-ICR 或 Orbitrap) 测 定 精 确 质 量 数, 然 后 确 定 这 些 杂 质 的 元 素 组 成 分 子 式 现 在, 我 们 借 助 MassWorks 处 理 技 术, 可 以 在 低 分 辨 率 质 谱 上 测 定 精 确 质 量 数, 然 后 结 合 MassWorks 同 位 素 峰 形 检 索 技 术, 可 以 更 加 准 确 地 测 定 目 标 物 的 分 子 式, 以 准 确 鉴 定 药 物 中 杂 质 的 组 成 1 实 验 辛 伐 他 汀 由 土 曲 霉 菌 发 酵 生 物 合 成, 是 一 种 降 血 脂 药 物, 属 于 一 类 药 品 的 他 汀 类, 用 于 控 制 高 胆 固 醇 血 症, 并 防 止 心 血 管 疾 病 将 市 场 购 买 的 辛 伐 他 汀 药 物, 用 超 高 压 液 相 色 谱 (UPLC)(Waters, Milford, MA) 分 离, 单 四 极 质 谱 仪 (Waters Acquity SQD ) 检 测 质 谱 采 集 方 式 :profile mode; 扫 描 速 度 :1000 amu/s; 扫 描 范 围 :380 to 520 用 MassWorks software (Cerno Bioscience, Danbury) 对 MassLynx 采 集 的 质 谱 数 据 进 行 处 理, 测 定 目 标 物 的 精 确 质 量 数, 并 识 别 目 标 物 的 分 子 式 2 结 果 与 讨 论 图 1 是 样 品 的 总 离 子 流 图, 由 于 采 用 了 UPLC 进 行 分 离, 全 部 成 分 在 9 分 钟 之 内 全 部 出 完,4.4 分 钟 的 主 峰 即 辛 伐 他 汀, 其 前 后 的 小 峰 为 杂 质 峰, 具 体 的 保 留 时 间 见 表 1 图 1 辛 伐 他 汀 药 物 总 离 子 流 图 图 2 辛 伐 他 汀 离 子 校 正 结 果 辛 伐 他 汀 经 ESI 被 离 子 化 产 生 [M+H] + [M+N 4H] + [M+K] + 三 种 离 子, 其 m/z 分 别 为 和 457 由 于 辛 伐 他 汀 的 元 素 组 成 是 已 知 的, 因 此 我 们 以 它 的 离 子 作 为 MassWorks 数 据 处 理 的 内 标, 建 立 校 正 函 数, 对 m/z 和 峰 形 进 行 校 正 图 2 是 MassWorks 处 理 校 正 结 果, 质 量 精 度 和 谱 图 精 度 是 衡 量 校 正 性 能 的 重 要 指 标,3 种 离 子 的 相 对 质 量 误 差 均 小 于 5ppm, 谱 图 精 度 达 到 98%, 如 此 高 的 同 位 素 峰 形 谱 图 精 度, 为 目 标 物 的 校 正 和 同 位 素 峰 形 检 索 元 素 组 成 的 可 靠 性 和 准 确 性, 提 供 了 保 证 将 建 立 的 校 正 函 数 应 用 到 整 个 液 相 色 谱 / 质 谱 数 据, 以 鉴 定 辛 伐 他 汀 杂 质 的 元 素 组 成 检 索 前, 设 定 目 标 物 可 能 包 含 的 元 素 为 C H N O K Cl 和 S, 原 子 数 上 限 分 别 设 定 为 , 下 限 为 0; 质 量 误 差 上 限 为 10 mda 尽 管 大 部 分 杂 质 与 主 成 份 组 成 相 似, 可 能 产 生 [M+H] + [M+N 4H] + [M+K] + 3 种 离 子, 但 由 于 部 分 离 子 的 丰 度 太 低, 我 们 选 择 丰 度 相 对 较 高 的 [M+H] + 或 [M+N4H] + 检 索, 以 识 别 杂 质 的 分 子 式 250

256 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 MassWorks 测 定 结 果 见 表 1, 除 保 留 时 间 为 4.0 分 钟 的 杂 质, 由 于 信 噪 比 低 导 致 谱 图 精 度 相 对 较 差, 结 果 导 致 目 标 物 的 分 子 式 位 于 待 选 分 子 式 ( 共 34 个 ) 的 第 4 位 外 ; 其 余 的 杂 质 均 位 于 各 自 待 选 分 子 式 的 前 两 位, 谱 图 精 度 均 高 于 97.2%, 质 量 误 差 小 于 5.7mDa. 表 1 MassWorks 测 定 的 杂 质 分 子 式 结 果 分 子 式 质 量 /Da 误 差 /mda 相 对 误 差 /ppm 谱 图 精 度 保 留 时 间 排 序 待 选 个 数 C25H44NO C25H40NO C25H41O C24H40NO C24H40NO C26H44NO C25H40NO 在 用 MassWorks 处 理 液 相 色 谱 / 质 谱 数 据, 鉴 定 目 标 物 分 子 式 的 时 候, 我 们 可 以 看 到, 同 时 利 用 质 量 精 度 和 谱 图 精 度 进 行 检 索, 其 效 果 远 高 于 仅 用 质 量 精 度 的 结 果 表 2 和 表 3 列 出 了 这 两 种 方 法 对 辛 伐 他 汀 酸 测 定 的 结 果, 质 量 精 度 结 合 谱 图 精 度 进 行 检 索 时, 辛 伐 他 汀 酸 由 于 其 谱 图 精 度 为 99.4%, 远 高 于 其 它 待 选 分 子 式, 位 于 第 1 位 ; 而 当 仅 利 用 质 量 精 度 进 行 检 索 时, 辛 伐 他 汀 酸 因 其 质 量 误 差 为 1.8mDa, 仅 位 于 待 选 分 子 式 的 第 9 位 因 此, 谱 图 精 度 是 未 知 物 分 子 式 识 别 的 重 要 手 段 表 2 MassWorks 以 质 量 精 度 和 谱 图 精 度 同 时 检 索 结 果 排 序 分 子 式 质 量 /Da 误 差 /mda 相 对 误 差 /ppm 谱 图 精 度 不 饱 和 度 1 C25H41O C22H33N C21H37N6O C26H37N4O C27H37N2O C23H41N4O2S C24H41N2O3S C20H37N8OS C19H37N10S C20H41N2O 表 3 仅 以 质 量 精 度 为 依 据 辛 伐 他 汀 酸 检 索 结 果 排 序 分 子 式 质 量 /Da 误 差 /mda 相 对 误 差 /ppm 谱 图 精 度 不 饱 和 度 1 C22H33N C29H41OS C21H37N6O C21H42N4O3K C20H42N4O4Cl C21H45N2O3S C16H38N10O2Cl C17H38N10OK C25H41O C20H41N2O 结 论 UPLC 串 接 单 四 级 杆 质 谱 采 集 数 据 后, 用 Massworks 对 数 据 进 行 处 理, 通 过 质 量 精 度 和 光 谱 精 度, 可 以 准 确 鉴 定 辛 伐 他 汀 药 物 中 所 有 杂 质 的 组 成 分 子 式 精 确 的 同 位 素 分 布 中 蕴 藏 的 指 纹 信 息, 是 成 功 鉴 定 化 合 物 分 子 式 的 重 要 依 据 单 四 级 杆 的 高 动 态 范 围, 有 助 于 产 生 精 确 的 同 位 素 分 布 UPLC 在 色 谱 上 的 高 分 离 度, 可 以 补 偿 传 统 单 四 级 质 谱 在 质 谱 分 离 的 低 分 辨 因 此, 借 助 新 的 分 子 式 识 别 技 术 Massworks, 单 四 杆 质 谱 可 以 用 来 准 确 地 识 别 药 物 中 杂 质 的 组 成, 且 单 四 杆 质 谱 使 用 方 便, 价 格 便 宜 251

257 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 聚 丙 烯 酸 高 级 酯 的 裂 解 色 谱 质 谱 分 析 研 究 张 红 玲 , 范 国 樑, 徐 海 红, 贾 子 麒, 李 春 漫, 李 国 平 (1. 天 津 大 学 材 料 科 学 与 工 程 学 院, 天 津 ;2. 中 国 石 油 管 道 科 技 研 究 中 心, 河 北 廊 坊 ) 石 油 管 道 运 输 是 目 前 最 经 济 的 石 油 输 送 方 式, 而 降 凝 剂 又 是 提 高 石 油 管 道 运 输 能 力 降 低 输 送 能 耗 和 成 本 的 最 有 效 的 方 法 [1] 对 于 降 凝 剂 产 品 的 成 分 分 析, 国 内 还 没 有 统 一 的 分 析 方 法 和 评 价 标 准, 国 外 也 鲜 见 相 关 研 究 成 果 的 报 道 本 文 应 用 裂 解 气 相 色 谱 - 质 谱 联 机 对 聚 丙 烯 酸 高 级 酯 原 油 降 凝 剂 进 行 定 性 研 究 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 和 试 剂 丙 烯 酸 十 八 酯 ( 工 业 级, 天 津 天 骄 化 工 有 限 公 司 ); 聚 丙 烯 酸 十 八 酯 自 己 合 成 制 备 正 庚 烷 ( 分 析 纯, 天 津 市 河 东 区 红 岩 试 剂 厂 ) 安 捷 伦 6890 气 相 色 谱 ( 美 国 安 捷 伦 公 司 );5973 质 谱 检 测 器 ( 美 国 安 捷 伦 公 司 ); PYROJECTORⅡ 裂 解 器 ( 澳 大 利 亚 SGE 公 司 ); 固 体 进 样 器, 液 体 注 射 器 ( 澳 大 利 亚 SGE 公 司 ) 1.2 实 验 条 件 热 裂 解 器 温 度 为 600 对 样 品 进 行 热 裂 解 ; 气 相 色 谱 进 样 口 温 度 为 300 ; 毛 细 管 色 谱 柱 HP-5MS, 柱 长 为 30m, 内 径 为 0.25mm, 固 定 相 ( 聚 硅 氧 烷 含 5% 苯 基 ) 液 膜 厚 度 为 0.25 um; 气 相 色 谱 程 序 升 温 条 件 为 :50 恒 温 5min,15 /min 的 升 温 速 率 程 序 升 温 至 280, 保 持 280 恒 温 10min, 氦 气 作 载 气, 载 气 模 式 恒 流 模 式 为 1mL/min 的, 分 流 比 为 50:1, 质 谱 检 测 器 离 子 源 温 度 为 230 ; 质 谱 质 量 过 滤 器 温 度 为 150 ; 质 量 扫 描 模 式 为 20amu 至 450amu 2 结 果 通 过 对 裂 解 温 度 的 研 究 确 定 裂 解 温 度 为 600 时, 能 够 较 好 的 反 映 聚 丙 烯 酸 高 级 酯 的 结 构 特 征, 方 便 酯 链 长 度 的 鉴 别 ( 图 1 A) 从 裂 解 产 物 的 气 相 色 谱 质 谱 联 机 分 析 结 果 来 看, 聚 丙 烯 酸 酯 的 热 裂 解 主 要 生 成 的 是 以 直 链 的 端 位 一 烯 二 烯 和 直 链 的 正 构 饱 和 烃 为 主 的 裂 解 产 物, 它 同 聚 乙 烯 塑 料 的 热 裂 解 谱 图 有 着 许 多 的 相 似 之 处 ( 见 图 1B 和 图 2D) 利 用 这 种 相 似 性 成 功 地 解 决 了 聚 丙 烯 酸 高 级 酯 的 碳 链 长 度 的 判 断 研 究 一 般 聚 丙 烯 酸 酯 的 酯 基 碳 链 长 度 是 从 十 几 到 二 十 几, 随 着 它 们 碳 链 的 长 短 变 化 对 降 凝 剂 的 性 质 产 生 很 大 的 影 响, 对 它 的 确 定 十 分 重 要 正 是 由 于 聚 丙 烯 酸 高 级 酯 同 聚 乙 烯 塑 料 都 存 在 较 长 碳 链 的 热 裂 解 过 程, 都 会 产 生 出 相 同 的 相 差 一 个 碳 数 的 系 列 端 位 烯 烃 和 直 链 饱 和 烃 而 聚 乙 烯 的 这 些 特 征 峰 更 容 易 进 行 分 子 量 的 判 断, 更 容 易 确 定 它 们 的 分 子 式 这 就 为 我 们 提 供 了 鉴 别 聚 丙 烯 酸 高 级 酯 的 酯 基 碳 链 长 度 的 方 法 聚 丙 烯 酸 高 级 酯 的 酯 基 碳 链 的 热 裂 解 虽 然 与 聚 乙 烯 相 同, 但 低 碳 数 的 少, 而 高 碳 数 的 裂 解 产 物 在 电 子 轰 击 的 电 离 下 很 难 存 在 分 子 离 子 峰, 这 就 为 对 它 们 直 接 使 用 它 们 的 裂 解 产 物 进 行 酯 基 碳 数 识 别 造 成 了 困 难 同 时 聚 丙 烯 酸 酯 很 获 得 纯 品 的 标 准 样, 它 们 都 是 不 同 高 级 酯 的 共 聚 物, 所 以 采 用 标 准 样 品 的 定 性 方 法 也 不 现 实 作 者 简 介 : 张 红 玲, 女, 山 东 人, 研 究 生 252

258 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 A bundance T im e--> 5.2e+07 5e e+07 A A bundance T IC : Jbxs-600.D 4.6e e e+07 4e e e e e+07 3e e e e e+07 2e e e e e+07 1e T im e--> B T IC : Jbxs-600.D a b 图 时 聚 丙 烯 酸 十 八 酯 的 裂 解 总 离 子 流 图 A bundance 1.6e e e e e e+07 1e C A bundance T IC : ju yixi D e e e d c D 1 2 TIC : ju yixi-600.d T im e--> T im e--> 图 时 聚 乙 烯 (PE) 的 裂 解 总 离 子 流 图 图 2 C 是 在 与 聚 丙 烯 酸 酯 同 样 条 件 下 的 聚 乙 烯 塑 料 的 裂 解 色 谱 的 总 离 子 流 图, 它 的 裂 解 产 物 分 子 可 以 从 几 个 碳 到 三 十 个 碳, 完 全 覆 盖 了 聚 丙 烯 酸 酯 的 裂 解 产 物 的 碳 数, 弥 补 了 不 能 获 得 商 业 纯 品 聚 丙 烯 酸 酯 的 标 准 品 的 问 题, 解 决 了 酯 基 碳 链 长 度 确 定 的 困 难 3 讨 论 应 用 裂 解 色 谱 - 质 谱 联 机 操 作, 解 决 了 对 降 凝 剂 聚 丙 烯 酸 酯 的 结 构 确 认 问 题, 重 点 的 解 决 了 在 不 能 够 获 得 不 同 碳 数 聚 丙 烯 酸 高 级 酯 标 准 样 品 的 情 况 下, 同 过 对 聚 乙 烯 塑 料 的 裂 解 谱 图 的 对 比, 实 现 了 对 聚 丙 烯 酸 酯 的 碳 数 确 定 问 题 参 考 文 献 : [1] 付 雪, 李 丹 东, 于 海 莲 等, 聚 丙 烯 酸 酯 降 凝 剂 的 制 备 及 应 用, 辽 宁 石 油 化 工 大 学 学 报,2006,26( 3). The Analysis of poly (alkyl acrylate) by pyrolysis gas chromatography - mass spectrometry ZHANG Hong-ling 1, FAN Guo-liang 1, XU Hai-hong 2, JIA Zi-qi 2, LI Chun-man 2, LI Guo-ping 2 (1. School of Materials Science and Engineering,Tianjin University, Tianjin ,China; 2. R&D Center of Petro China Pipeline Company, Petro China Company Limited, Langfang , China) Abstract: According to the pyrolyzed substances of polyethylene by pyrolysis gas chromatography - mass spectrometry succeed to resolve branched-chain carbon atoms number distribution of poly(alkyl acrylates). Key words: PY / GC-MS; poly (alkyl acrylate) 253

259 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 聚 丙 烯 酸 十 八 酯 的 热 裂 解 规 律 的 研 究 张 红 玲 1, 范 国 樑 1, 徐 海 红 2, 贾 子 麒 2, 李 春 漫 2, 李 国 平 2 (1. 天 津 大 学 材 料 科 学 与 工 程 学 院, 天 津 ;2. 中 国 石 油 管 道 科 技 研 究 中 心, 河 北 廊 坊 ) 聚 丙 烯 酸 高 级 酯 是 石 油 管 道 输 送 中 使 用 最 多 的 降 凝 剂, 该 降 凝 剂 的 酯 基 碳 链 的 长 短 对 降 凝 效 果 影 响 很 大, 降 凝 剂 中 极 性 基 团 与 长 链 烷 基 的 含 量 达 到 最 佳 比 例, 才 能 获 得 最 佳 的 改 性 效 果 [1-4] 因 此 为 了 对 酯 基 碳 链 的 长 度 给 予 正 确 的 测 定, 这 就 要 求 研 究 聚 丙 烯 酸 酯 在 不 同 温 度 下 的 热 裂 解 产 物 的 变 化 规 律, 确 定 最 佳 的 分 析 条 件 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 和 试 剂 丙 烯 酸 十 八 酯 ( 工 业 级, 天 津 天 骄 化 工 有 限 公 司 ); 聚 丙 烯 酸 十 八 酯 自 己 合 成 制 备 正 庚 烷 ( 分 析 纯, 天 津 市 河 东 区 红 岩 试 剂 厂 ) 安 捷 伦 6890 气 相 色 谱 ( 美 国 安 捷 伦 公 司 );5973 质 谱 检 测 器 ( 美 国 安 捷 伦 公 司 ); PYROJECTORⅡ 裂 解 器 ( 澳 大 利 亚 SGE 公 司 ); 固 体 进 样 器, 液 体 注 射 器 ( 澳 大 利 亚 SGE 公 司 ) 1.2 实 验 条 件 热 裂 解 装 置 温 度 设 为 , 每 隔 50 对 样 品 进 行 热 裂 解 分 析 ; 气 相 色 谱 进 样 口 温 度 为 300 ; 使 用 的 色 谱 柱 长 为 30m, 内 径 为 0.25mm, 固 定 相 ( 聚 硅 氧 烷 类, 含 5% 苯 基 ) 液 膜 厚 度 为 0.25um 的 HP-5MS 毛 细 管 柱 ; 气 相 色 谱 程 序 升 温 条 件 为 :50 恒 温 5min,15 /min 的 升 温 速 率 程 序 升 温 至 280, 保 持 280 恒 温 10min, 氦 气 作 载 气, 载 气 模 式 恒 流 模 式 为 1mL/min 的, 分 流 比 为 50:1, 质 谱 检 测 器 离 子 源 温 度 为 230 ; 质 谱 质 量 过 滤 器 温 度 为 150 ; 质 量 扫 描 模 式 为 20amu 至 450amu 2 结 果 丙 烯 酸 十 八 酯 和 十 八 醇 是 聚 丙 烯 酸 十 八 酯 热 裂 解 产 生 的 最 具 特 征 的 能 够 同 大 多 数 其 它 共 聚 物 区 分 的 特 征 裂 解 产 物, 它 们 对 聚 丙 烯 酸 酯 高 聚 物 结 构 类 型 的 鉴 别 具 有 十 分 重 要 的 作 用, 原 则 上 它 们 的 峰 值 ( 丰 度 ) 越 高 鉴 别 的 可 靠 性 灵 敏 度 也 就 越 高, 从 图 1 图 2 可 以 看 出 当 裂 解 温 度 较 低 时 高 聚 物 的 裂 解 产 物 以 丙 烯 酸 十 八 酯 单 体 和 十 八 醇 为 主, 裂 解 产 物 简 单 易 于 识 别, 但 存 在 的 问 题 是 此 时 裂 解 效 率 低, 裂 解 不 充 分, 对 仪 器 的 影 响 较 大, 同 时 也 出 现 检 测 灵 敏 度 偏 低 的 问 题 随 着 裂 解 温 度 的 升 高 裂 解 效 率 增 加, 裂 解 产 物 也 越 来 越 复 杂, 虽 然 两 S% 12 9 S% T/ T/ 800 图 1 丙 烯 酸 十 八 酯 含 量 随 温 度 的 化 曲 线 图 2 十 八 醇 含 量 随 温 度 的 化 曲 线 个 特 征 裂 解 产 物 的 相 对 比 例 在 整 个 裂 解 产 物 中 有 所 下 降, 但 绝 对 丰 度 值 确 变 化 不 大 当 裂 解 作 者 简 介 : 张 红 玲, 女, 山 东 人, 研 究 生 254

260 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 温 度 超 过 600 以 后, 特 征 峰 的 丰 度 出 现 了 明 显 下 降 的 趋 势, 随 着 裂 解 温 度 继 续 增 高 不 仅 相 对 比 例 下 降 很 大, 而 且 绝 对 丰 度 值 也 出 现 了 加 速 下 降 的 过 程 因 此 热 裂 解 温 度 以 不 超 过 600 度 为 好 由 于 聚 丙 烯 酸 酯 的 酯 基 碳 链 长 度 需 要 使 用 裂 解 产 物 端 位 烯 烃 进 行 判 断, 有 必 要 进 一 步 考 察 十 八 烯 的 裂 解 情 况 图 3 显 示 600 度 时 十 八 烯 的 相 对 比 例 基 本 不 变, 维 持 在 较 高 的 水 平 上, 也 符 合 分 析 检 查 的 要 求 图 4 是 甲 苯 的 变 化 情 况, 虽 然 聚 丙 烯 酸 酯 中 并 不 包 含 任 何 芳 烃 类 化 合 物, 热 裂 解 产 物 中 不 应 该 出 现 芳 香 烃 化 合 物, 但 实 际 中 由 于 裂 解 温 度 的 不 断 升 高, 裂 解 炉 中 的 化 学 反 应 已 经 不 再 是 简 单 的 共 聚 物 断 裂 过 程, 而 是 出 现 了 十 分 复 杂 化 学 反 应, 芳 烃 类 化 合 物 由 于 其 稳 定 的 化 学 结 构, 就 更 容 易 出 现 所 以 过 高 的 裂 解 温 度 会 给 实 验 分 析 带 来 许 多 不 必 要 的 麻 烦 S% 33 S% T/ T/ 800 图 3 十 八 烯 含 量 随 温 度 的 化 曲 线 3 讨 论 图 4 甲 苯 含 量 随 温 度 的 化 曲 线 以 上 面 四 种 化 合 物 为 代 表 研 究 了 聚 丙 烯 酸 酯 在 不 同 裂 解 温 度 中 典 型 裂 解 产 物 的 变 化 情 况 它 们 呈 现 出 完 全 不 同 的 变 化 规 律, 但 都 在 600 度 附 近 显 现 出 明 显 的 转 变, 说 明 该 温 度 是 比 较 重 要 的, 尤 其 是 芳 香 烃 的 出 现 说 明 当 裂 解 温 度 超 过 600 度 以 后 大 量 的 二 次 反 应 产 物 急 剧 增 加 对 聚 丙 烯 酸 酯 的 结 构 鉴 定 产 生 不 好 的 影 响 参 考 文 献 : [1] 邸 进 申, 张 诚, 李 英 杰 等, 原 油 流 动 改 进 剂 的 制 备 及 应 用, 石 油 炼 制 与 化 工,1997,28(8):43. [2] 杨 嘉 玲, 常 景 龙, 对 新 型 降 凝 剂 研 究 的 评 述 [J], 油 气 储 运,1997,16(5):5. [3] 王 丽 鹃, 田 军, 聚 合 物 型 原 油 降 凝 剂 的 作 用 机 理 及 应 用, 精 细 石 油 化 工,1997,5:5. [4] 侯 朝 霞, 马 敬 环, 蒋 薇, 高 凝 原 油 降 凝 剂 的 研 制 和 应 用, 吉 林 化 工 学 院 学 报,2000,17(1):20. The Low of poly (n-octadecane alkyl acrylate) by pyrolysis gas chromatography - mass spectrometry ZHANG Hong-ling 1, FAN Guo-liang 1, XU Hai-hong 2, JIA Zi-qi 2, LI Chun-man 2, LI Guo-ping 2 (1. School of Materials Science and Engineering,Tianjin University, Tianjin ,China; 2. R&D Center of Petro China Pipeline Company, Petro China Company Limited, Langfang , China) Abstract: The study low of pyrolyzed substances of poly (n-octadecane alkyl acrylate) under the different temperature from 400 to 800 with the pyrolysis gas chromatography-mass spectrometry Key words: PY / GC 一 MS; poly (alkyl acrylate) 255

261 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 GC-MS 法 测 定 抑 尘 剂 中 的 甲 醛 乙 醛 含 量 李 静 1, 何 秀 坤 1, 那 顺 2 (1. 中 国 电 子 科 技 集 团 公 司 第 46 研 究 所,300192;2. 安 捷 伦 有 限 公 司, 北 京 办 事 处 ) 本 文 建 立 了 抑 尘 剂 中 甲 醛 乙 醛 含 量 的 衍 生 气 相 色 谱 - 质 谱 联 用 技 术 测 量 方 法, 最 低 检 出 限 甲 醛 小 于 15µg/L, 乙 醛 小 于 50µg/L, 回 收 率 为 85%~100%, 相 对 标 准 偏 差 小 于 5% 1 前 言 对 于 日 常 生 活 影 响 最 大 是 空 气 污 染, 在 美 国 环 境 署 发 布 的 报 告 中 指 出 : 空 气 污 染 92% 为 扬 尘 ( 尤 其 是 PM 的 微 粒 ), 其 来 源 :28% 为 裸 露 面,23% 来 自 建 筑 工 地 由 于 抑 尘 剂 使 用 方 便 效 果 良 好, 喷 洒 一 次 就 可 以 使 自 由 落 尘 和 道 路 遗 留 尘 土 大 量 减 少 因 此, 越 来 越 受 到 了 人 们 的 重 视 抑 尘 剂 是 一 种 人 工 合 成 的 含 水 有 机 乳 化 液, 因 而 对 其 中 所 含 的 有 害 物 质 甲 醛 乙 醛 就 需 要 监 控 检 测 本 文 利 用 甲 醛 乙 醛 在 酸 性 条 件 下 与 2,4- 二 硝 基 苯 肼 衍 生 反 应 生 成 2,4- 二 硝 基 苯 腙, 经 二 氯 甲 烷 萃 取 后, 用 气 相 色 谱 - 质 谱 联 用 技 术 定 性 和 定 量 测 量 该 方 法 具 有 灵 敏 度 高 准 确 简 便 等 特 点 2 实 验 部 分 2.1 仪 器 与 测 试 条 件 PE 公 司 的 Clarus 600 气 相 色 谱 - 质 谱 联 用 仪 ;Elite-5MS 色 谱 柱 30m 0.25mm 0.25µm; 可 控 温 油 浴 装 置 和 震 荡 装 置 色 谱 条 件 : 进 样 口 250 ; 程 序 升 温 过 程 : 柱 初 温 80 保 持 2min, 以 5.min-1 升 至 150 保 持 2min, 再 以 7.min-1 升 至 220 保 持 3min; 载 气 为 高 纯 氦 气 流 速 1.0mL. min-1; 不 分 流 方 式 进 样, 进 样 量 1µL [1] 质 谱 条 件 :GC-MS 接 口 温 度 280, 离 子 源 250, 电 离 方 式 EI, 电 离 能 量 70eV, 光 电 倍 增 管 电 压 500V, 溶 剂 延 迟 8min, 扫 描 质 量 范 围 m/z, 检 测 方 式 SIM, 甲 醛 选 择 离 子 63,79,210m/z; 乙 醛 选 择 离 子 163, 224 m/z 2.2 试 剂 甲 醛 标 物 浓 度 11.2mg/mL; 乙 醛 标 物 浓 度 1.0 mg/ml, 临 用 时 配 制 成 需 要 的 浓 度 2,4- 二 硝 基 苯 肼 溶 液 : 精 确 称 取 g 2,4- 二 硝 基 苯 肼 ( 分 析 纯 ), 溶 解 于 24mL 浓 盐 酸 中, 加 水 定 容 至 100mL 二 氯 甲 烷 ( 色 谱 纯, 经 质 谱 检 测 器 检 测 无 杂 质 后 方 可 使 用 ) 无 水 硫 酸 钠 ( 分 析 纯 ): 经 300 灼 烧 2 小 时, 冷 却 后 贮 存 于 干 燥 器 中 备 用 2.3 样 品 制 备 和 测 定 为 避 免 抑 尘 剂 中 有 机 乳 化 液 的 干 扰, 本 实 验 选 用 蒸 馏 方 法 提 取 样 品 中 的 甲 醛 根 据 样 品 的 含 量, 准 确 移 取 适 量 体 积 的 样 品, 加 20% 磷 酸 5mL, 用 冰 浴 接 受 馏 出 液 并 准 确 定 容, 然 后 用 于 衍 生 后 GC-MS 测 定 [2] 样 品 衍 生 过 程, 移 取 样 液 10mL 加 入 配 制 的 2,4- 二 硝 基 苯 肼 溶 液 1.5mL, 在 60 恒 温 水 浴 中 衍 生 30min, 快 速 冷 却 后 用 5mL 二 氯 甲 烷 分 两 次 萃 取, 用 无 水 硫 酸 钠 脱 水, 用 0.22µm 滤 膜 过 滤 后, 再 用 GC-MS 测 量, 标 样 中 的 甲 醛 乙 醛 衍 生 物 选 择 离 子 流 图 如 图 1 所 示 [3] 256

262 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 图 1 标 样 中 的 甲 醛 乙 醛 衍 生 物 选 择 离 子 流 图 2.4 标 准 曲 线 绘 制 及 标 定 用 水 稀 释 甲 醛 乙 醛 标 样 成 100µg.mL -1, 再 分 别 配 制 甲 醛 系 列 2.0,4.0,6.0,8.0,10.0µg.mL -1, 乙 醛 系 列 标 样 5.0,10.0,15.0,20.0,30.0µg.mL -1 然 后, 按 试 样 操 作 步 骤 进 行 测 定, 测 定 结 果 如 图 2 所 示, 浓 度 与 峰 面 积 线 性 关 系 良 好, 甲 醛 相 关 系 数 分 别 为 r=0.9990,r 2 =0.9980; 乙 醛 相 关 系 数 分 别 为 r=0.9987,r 2 = (a) 甲 醛 标 准 曲 线 257

263 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 3 结 果 与 讨 论 3.1 衍 生 反 应 (b) 乙 醛 标 准 曲 线 图 2 甲 醛 乙 醛 衍 生 物 标 准 曲 线 醛 类 物 质 在 酸 性 介 质 中 能 与 2,4- 二 硝 基 苯 肼 衍 生 反 应 相 应 的 2,4- 二 硝 基 苯 腙, 反 应 式 [4] 如 下 : 图 3 是 甲 醛 乙 醛 与 2,4 二 硝 基 苯 肼 生 成 衍 生 物 2,4- 二 硝 基 苯 腙 的 质 谱 图, 与 标 准 图 谱 的 匹 配 度 达 到 了 95 %, 说 明 甲 醛 乙 醛 与 2,4 二 硝 基 苯 肼 在 此 实 验 条 件 下 能 很 好 地 衍 生 (a) 标 样 中 的 甲 醛 衍 生 物 的 质 谱 图 258

264 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 3.2 衍 生 温 度 的 选 择 (b) 标 样 中 的 乙 醛 衍 生 物 的 质 谱 图 图 3 标 样 中 的 甲 醛 乙 醛 衍 生 物 的 质 谱 图 取 四 支 试 管, 各 加 入 5µg/mL 甲 醛 乙 醛 混 标 10mL, 然 后 加 入 配 制 的 2,4- 二 硝 基 苯 肼 溶 液 1.5mL, 用 震 荡 器 混 合 2min 后, 分 别 在 水 浴 加 热 30min, 然 后 冷 却 到 室 温 后 进 样 检 测 观 察 生 成 的 衍 生 物 峰 面 积 见 表 1, 最 终 选 择 60 水 浴 加 热 30min [5] 3.3 干 扰 实 验 表 1 峰 面 积 随 温 度 变 化 检 测 结 果 衍 生 温 度 甲 醛 衍 生 物 的 峰 面 积 乙 醛 衍 生 物 的 峰 面 积 对 样 品 中 可 能 存 在 的 干 扰 物 质 进 行 了 试 验 实 验 结 果 表 明, 样 品 溶 液 中 可 能 存 在 的 能 衍 生 的 其 它 醛 和 酮, 用 选 择 离 子 测 定 也 不 会 影 响 测 定 结 果, 因 此 本 方 法 不 受 其 它 物 质 干 扰 3.4 精 密 度 回 收 率 检 出 限 在 预 先 处 理 过 不 含 醛 酮 的 蒸 馏 水 中 加 入 5µg.mL -1 甲 醛 乙 醛 标 准 溶 液, 按 与 样 品 相 同 的 处 理 方 法 蒸 馏 后, 进 行 测 定 回 收 率 为 85%~100% 每 个 样 品 重 复 测 定 5 次, 相 对 标 准 偏 差 小 于 5% 最 低 检 出 限 甲 醛 小 于 15µg/L, 乙 醛 小 于 50µg/L 4 结 论 本 文 用 蒸 馏 方 法 处 理 抑 尘 剂 中 甲 醛 乙 醛, 以 2,4- 二 硝 基 苯 肼 为 衍 生 剂, 在 酸 性 介 质 中 与 甲 醛 乙 醛 反 应 生 成 相 应 的 2,4- 二 硝 基 苯 腙, 用 气 相 色 谱 - 质 谱 联 用 技 术 进 行 定 性 和 定 量 测 量 该 方 法 具 有 线 性 范 围 宽, 衍 生 物 稳 定, 抗 干 扰 性 强, 操 作 简 便 等 优 点, 为 抑 尘 剂 中 的 甲 醛 乙 醛 含 量 测 定 提 供 了 技 术 保 证 参 考 文 献 [1] 杨 柳, 王 建 立 等.GC-MS-SIM 法 测 定 水 发 食 品 中 痕 量 甲 醛, 药 物 检 测,2004,21(7):28 [2] 徐 天 源, 林 太 清 等, 水 产 及 水 发 食 品 中 甲 醛 的 气 相 色 谱 法 测 定, 中 国 卫 生 检 验 杂 志,2005,15(1): ( 下 转 第 262 页 ) 259

265 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 利 用 GC-MS 鉴 别 蜂 胶 提 取 物 中 化 学 成 分 高 振 中, 降 升 平, 杨 志 岩 ( 天 津 科 技 大 学 分 析 中 心, 天 津 ) 蜂 胶 (propolis) 是 蜜 蜂 从 植 物 幼 芽 与 树 干 上 采 集 的 树 胶 与 其 上 颚 腺 分 泌 物 和 蜂 蜡 等 混 合 加 工 而 成 的 一 种 具 有 芳 香 气 味 的 胶 状 固 体 物 [1] 蜂 胶 成 分 复 杂, 已 知 成 分 包 括 多 酚 类 ( 黄 酮 酚 酸 及 其 酯 类 ) 萜 类 甾 类 氨 基 酸 及 挥 发 性 物 质, 这 些 物 质 具 有 抗 细 菌 抗 病 毒 抗 炎 抗 癌 清 除 自 由 基 等 功 效, 吴 平 谷 用 不 同 有 机 溶 剂 对 蜂 胶 进 行 分 离, 得 到 蜂 胶 的 香 气 ( 挥 发 油 ) 成 分 主 要 是 醇 醛 酮 及 少 量 酚, 这 些 物 质 具 有 止 咳 平 喘 镇 痛 等 效 果 [2] 本 文 通 过 GC-MS 方 法 对 我 国 七 个 不 同 产 地 的 蜂 胶 进 行 了 挥 发 性 成 分 初 探, 为 蜂 胶 真 伪 鉴 别 提 供 科 学 依 据 中 国 幅 员 辽 阔, 植 被 资 源 和 气 候 条 件 差 异 很 大, 从 而 影 响 不 同 产 地 蜂 胶 的 化 学 成 分 差 异 显 著 [3] [4] [6] 而 蜂 胶 中 的 黄 酮 类 化 合 物 存 在 苯 环 羰 基 等 强 紫 外 吸 收 的 化 学 结 构, 用 高 效 液 相 色 谱 和 紫 外 检 测 器 可 对 蜂 胶 中 的 黄 酮 类 化 合 物 进 行 测 定 [5] 而 液 质 联 用 集 分 析 鉴 定 于 一 体,HPLC 对 黄 酮 类 化 合 物 进 行 分 离 后, 质 谱 仪 即 对 分 离 出 的 物 质 进 行 鉴 定, 是 一 种 高 效 的 分 离 鉴 定 方 法 但 由 于 产 地 不 同 而 造 成 的 非 挥 发 化 学 成 分 差 异 较 大, 目 前 液 质 联 用 鉴 定 方 法 中 还 没 有 对 不 同 产 地 蜂 胶 的 化 学 成 分 建 立 可 靠 的 标 准 谱 库, 很 难 归 纳 出 一 个 统 一 的 标 准 本 文 借 助 GC-MS 强 大 的 谱 库 资 源, 采 用 GC-MS 技 术 对 蜂 胶 中 挥 发 性 物 质 进 行 分 离 鉴 定 [7], 为 研 究 蜂 胶 组 成 提 供 了 新 的 技 术 手 段 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 和 试 剂 气 相 色 谱 质 谱 连 用 仪 3800GC-4000MS ( 美 国 Varian); 试 剂 : 乙 醇 ( 分 析 纯 ), 正 己 烷 ( 色 谱 纯 ) 材 料 : 安 徽 河 南 江 苏 山 东 山 西 四 川 新 疆 七 省 区 蜂 胶 1.2 实 验 方 法 样 品 处 理 取 粗 蜂 胶 样 品 10g, 用 100 ml95% 食 用 酒 精 浸 泡 24 小 时 后 过 滤 再 用 旋 转 蒸 发 仪 除 去 滤 液 中 的 酒 精, 得 到 蜂 胶 粘 稠 液 体 然 后 取 此 蜂 胶 0.1 克, 加 入 10ml 正 己 烷, 充 分 摇 匀 后 进 行 GC-MS 分 析 色 谱 质 谱 条 件 色 谱 柱 :VF-5ht 毛 细 管 柱, mm 0.10μm; 进 样 口 温 度 :300 ; 传 输 线 温 度 :280 ; 分 流 比 :1:20; 载 气 : 氦 气, 流 速 1mL/min; 进 样 量 1μL; 柱 温 : 程 序 升 温, 初 始 温 度 60 ( 保 持 2min), 以 8 /min 升 至 300 ( 保 持 3min) 离 子 源 :EI 源 ; 离 子 阱 温 度 :220 ; 扫 描 方 式 : 全 扫 描 ; 扫 描 质 量 范 围 amu; 检 索 谱 库 名 称 :NIST05 2 结 果 与 讨 论 2.1 蜂 胶 的 GC-MS 总 离 子 流 图 不 同 省 区 蜂 胶 中 挥 发 成 分 的 GC-MS 离 子 流 图 如 图 1 从 图 1 中 可 明 显 看 出 : 蜂 胶 中 挥 发 性 物 质 的 组 成 基 本 相 似 借 助 GC-MS 强 大 的 谱 库, 识 别 出 蜂 胶 中 挥 发 性 组 分 有 黄 酮 酚 基 金 项 目 : 天 津 科 技 大 学 资 助 基 金 作 者 简 介 : 高 振 中 (1956 ) 男 ( 回 ), 讲 师, 学 士 现 从 事 重 金 属 离 子 检 测 工 作 260

266 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 醌 萜 甾 类 等 14 类 79 种 物 质 利 用 峰 面 积 归 一 化 法 计 算 求 得 蜂 胶 中 各 化 学 成 分 的 相 对 百 分 含 量 图 1 七 省 区 蜂 胶 的 GC-MS 总 离 子 流 图 2.2 不 同 产 地 蜂 胶 中 主 要 化 合 物 相 对 含 量 的 分 析 产 地 为 河 南 山 东 山 西 四 川 新 疆 的 蜂 胶 中 松 属 素 含 量 最 高 分 别 是 26.29% 22.90% 21.69% 21.53% 和 26.97% 产 地 为 安 徽 江 苏 两 省 的 蜂 胶 中 柯 因 含 量 最 高 分 别 是, 26.96% 26.34%; 其 次 是 松 属 素, 分 别 为 21.04% 和 21.12% 松 属 素 和 柯 因 同 属 于 黄 酮 类 化 合 物 七 省 区 蜂 胶 中 挥 发 性 化 合 物 相 对 含 量 的 异 同 点 是 : 松 属 素 柯 因 大 黄 酚 的 相 对 含 量 均 处 于 前 三 位 但 是 三 者 的 含 量 顺 序 有 所 不 同 河 南 四 川 新 疆 的 蜂 胶 相 对 含 量 排 序 完 全 相 同, 依 次 为 松 属 素 柯 因 大 黄 酚 这 三 种 成 分 的 含 量 均 占 总 挥 发 物 的 10% 以 上 2.3 蜂 胶 中 有 效 成 分 的 化 学 分 析 : 七 省 区 蜂 胶 中 化 学 物 类 型 共 同 点 是 : 黄 酮 类 物 质 是 蜂 胶 的 主 要 成 分, 占 总 挥 发 性 物 质 的 %, 其 次 是 醌 类 物 质, 占 总 挥 发 性 物 质 的 % 不 同 点 是 : 除 黄 酮 类 醌 类 以 外 其 它 类 型 的 化 合 物 的 存 在 与 产 地 有 关, 例 如 : 河 南 江 苏 山 西 新 疆 的 其 他 成 分 以 萜 类 为 主, 安 徽 山 东 四 川 的 其 他 成 分 以 酚 类 为 主 3 结 论 利 用 GC-MS 联 用 分 析 方 法, 借 助 于 色 谱 的 高 分 辨 能 力 和 质 谱 强 大 谱 库 的 高 识 别 能 力, 可 鉴 别 出 蜂 胶 中 的 大 部 分 挥 发 性 组 分 本 文 利 用 GC-MS 分 析 方 法, 从 七 省 区 蜂 胶 乙 醇 提 取 物 中 分 离 和 鉴 定 出 挥 发 性 物 质, 黄 酮 醌 酚 酯 萜 烯 等 14 大 类, 共 79 种 物 质 七 省 区 蜂 胶 成 分 相 似 度 极 高 : 以 黄 酮 类 的 松 属 素 或 柯 因 的 含 量 为 最 高, 按 化 合 物 的 类 型 来 说, 黄 酮 类 最 多, 其 次 是 醌 类, 另 外 还 含 有 少 量 萜 类 和 酚 类, 而 这 些 萜 类 和 酚 类 含 量 的 变 化 是 区 别 蜂 胶 产 地 的 主 要 依 据 该 项 研 究 的 结 果 为 鉴 定 蜂 胶 产 地 和 有 效 成 分 的 标 准 化 提 供 了 简 便 快 捷 准 确 的 方 法 参 考 文 献 : [1] 符 军 放, 曹 炜, 索 志 荣 等. 高 效 液 相 色 谱 法 识 别 蜂 胶 特 征 组 分 及 定 量 对 比 [J]. 西 北 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 ),2008,36(4): [2] 吴 平 谷, 叶 立 杨. 蜂 胶 有 效 成 分 的 分 离 与 鉴 定 [J]. 卫 生 研 究,2000,29(2):

267 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 [3] Nicola Volpi, Gianluca Bergonzini Analysis of flavonoids from propolis by on-line HPLC electrospray mass spectrometry Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 42 (2006) [4] Jinhui Zhou, Yi Li, Jing Zhao, etc. Geographical traceability of propolis by high-performance liquid-chromatography fingerprints Food Chemistry 108 (2008) [5] 中 国 标 准 出 版 社. 蜂 产 品 标 准 汇 编 [M]. 北 京 : 中 国 标 准 出 版 社, [6] 赵 淑 云, 马 海 燕, 朱 美 玲 等 不 同 产 地 蜂 胶 超 临 界 CO2 萃 取 物 8 种 黄 酮 比 较 研 究 中 国 蜂 业 2006 年 第 57 卷 第 11 期 [7] 盛 文 胜, 余 兰 平, 李 树 岚 等 超 临 界 CO2 萃 取 蜂 胶 气 相 色 谱 / 质 谱 法 分 析 研 究 中 国 蜂 业 2006 年 第 57 卷 第 8 期 5-7. Using in GC-MS distinction propolis extraction chemical composition GAO Zhen-zhong,JIANG Sheng-ping,YANG Zhi-yan (Tianjin Scientific and technical university Analysis center Tianjin , China) Abstract:In the propolis, besides flavonoids, there are terpene, steroid, alkene, etc. In this paper, GC-MS was used to identify the chemical constituents from the ethanol extracted propolis collected by local beekeepers of anhui, henan, jiangsu, shandong, shanxi, sichuan and xinjiang. 79 chemical constituents of 14 category including flavonoids, phenol, quinone. terpene, steroid, etc were identified. The quantity of flavonoids, phenol, quinone and terpene were abundant. Keywords: Propolis; Flavonoids; Chemical constituents; GC-MS ( 上 接 第 259 页 ) [3] 袭 著 革 张 林 等, 甲 醛 乙 醛 丙 烯 醛 衍 生 物 的 特 性 研 究, 上 海 环 境 科 学,1999,18(5): [4] 龚 彩 荣, 宋 崇 林 等,2,4- 二 硝 基 苯 肼 衍 生 反 应 法 测 量 醇 类 燃 料 发 动 机 醛 类 排 放 物 的 研 究, 燃 料 科 学 与 技 术,2007,13(1):15-19 [5] 吕 海 涛, 邓 锐 等. 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 家 用 装 饰 材 料 中 甲 醛 乙 醛 的 含 量, 福 建 分 析 测 试,2009,18 (4):28-30 Determination of Formaldehydea and Acetaldehyde in Dust Suppressant by GC-MS Li Jing 1, He Xiukun 1, Na Shun 2 (1. (1 The 46th Research Institute,CETC,Tianjin ,China; (2. 2 InstrumentsBeijing Representative Office) Abstract: GC-MS with derivation was described for the determination of Formaldehyde and Acetaldehyde in Dust Suppressant. The detection limit was 5g/L and 50 g/l.the recoveris were 85%-100%.The relative standard deviations(rsds) of contents of formaldehyde and Acetaldehyde was below 5%. Key words: GC-MS ; Derivation; Dust Suppressant; Formaldehyde; Acetaldehyde 262

268 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 二 维 液 相 色 谱 质 谱 联 用 方 法 分 析 人 血 清 中 的 磷 脂 类 化 合 物 * 李 珉, 聂 洪 港, 白 玉, 刘 虎 威 ( 北 京 分 子 科 学 国 家 实 验 室, 生 物 有 机 与 分 子 工 程 教 育 部 重 点 实 验 室, 北 京 大 学 化 学 与 分 子 工 程 学 院 分 析 化 学 研 究 所, 北 京,100871) 磷 脂 是 生 物 体 内 一 类 重 要 的 物 质, 他 们 是 生 物 膜 的 主 要 组 成 部 分, 参 与 脂 类 化 合 物 的 体 内 代 谢 过 程 和 信 号 传 导 过 程 ; 生 物 体 内 或 细 胞 膜 磷 脂 成 分 的 改 变 与 生 物 体 的 生 理 病 理 状 态 密 切 相 关 因 此, 准 确 分 析 生 物 体 内 磷 脂 成 分 能 够 为 临 床 诊 断 与 疾 病 监 测 提 供 依 据 磷 脂 类 化 合 物 主 要 由 多 元 醇 骨 架 极 性 头 部 和 疏 水 尾 部 三 部 分 组 成, 根 据 多 元 醇 骨 架 的 不 同 可 以 分 为 甘 油 磷 脂 和 鞘 磷 脂 两 大 类 甘 油 磷 脂 是 以 甘 油 作 为 磷 脂 骨 架, 它 的 甘 油 骨 架 C1 和 C2 位 被 脂 肪 酸 酯 化, 形 成 长 链 脂 肪 酸 的 疏 水 尾 部 C3 位 被 磷 酸 酯 化, 同 时 磷 酸 会 进 一 步 被 另 一 极 性 醇 酯 化, 形 成 磷 脂 的 极 性 头 部 根 据 极 性 头 部 的 不 同 甘 油 磷 脂 可 以 分 为 不 同 的 类 别, 如 磷 脂 酰 胆 碱 磷 脂 酰 乙 醇 胺 磷 脂 酰 甘 油 磷 脂 酰 肌 醇 磷 脂 酰 丝 氨 酸 等 等 鞘 磷 脂 以 鞘 氨 醇 为 骨 架, 由 鞘 氨 醇 脂 肪 酸 和 磷 酰 胆 碱 ( 少 数 是 磷 酰 乙 醇 胺 ) 组 成 [1] 在 目 前 分 离 分 析 磷 脂 类 化 合 物 的 方 法 中 以 液 相 色 谱 质 谱 联 用 技 术 的 灵 敏 度 最 高, 抗 干 扰 能 力 最 好, 同 时 通 过 多 级 质 谱 技 术 能 够 对 磷 脂 分 子 进 行 鉴 定 [2] 而 分 离 分 析 磷 脂 类 化 合 物 的 两 种 液 相 色 谱 方 法 -- 正 相 液 相 色 谱 (NPLC) 和 反 相 液 相 色 谱 (RPLC) 的 单 独 使 用 都 无 法 达 到 最 佳 的 分 离 效 果,NPLC 方 法 是 针 对 极 性 头 部 不 同 分 离 磷 脂 的 不 同 类 别 [3],RPLC 方 法 是 针 对 脂 肪 酸 链 的 不 同 分 离 磷 脂 的 不 同 分 子 种 属 [4] 因 此, 采 用 将 NPLC 和 RPLC 偶 联 的 二 维 液 相 色 谱 方 法, 是 可 以 得 到 更 好 的 分 离 效 果, 更 多 的 磷 脂 分 子 信 息 本 文 采 用 二 维 液 相 色 谱 - 电 喷 雾 离 子 阱 质 谱 联 用 (2-D HPLC-ESI-MS) 的 方 法, 对 人 血 清 中 的 磷 脂 类 化 合 物 进 行 分 离 ( 如 图 1), 并 且 对 每 个 检 出 的 磷 脂 组 分 进 行 了 结 构 确 认, 并 对 每 一 类 磷 脂 成 分 在 ESI-MS 条 件 下 的 碎 裂 机 制 进 行 了 讨 论 Intens. x 参 考 文 献 ( 略 ) Time [min] 图 1 2D HPLC-ESI-MS 方 法 分 析 磷 脂 类 化 合 物 总 离 子 流 色 谱 图 国 家 自 然 科 学 基 金 (NO , No , No ) 资 助 项 目 * 通 讯 联 系 人 : hwliu@pku.edu.cn 263

269 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 分 子 蒸 馏 提 取 紫 苏 油 蒸 出 物 的 GC-MS 分 析 杨 志 岩, 降 升 平, 高 振 中 ( 天 津 科 技 大 学 分 析 中 心, 天 津 ) 紫 苏, 为 唇 形 科 一 年 生 草 本 植 物, 又 名 回 回 苏 红 苏 红 紫 苏 赤 苏 苏 子 等 具 有 特 异 的 芳 香, 我 国 栽 培 极 广, 主 要 用 于 药 用 油 用 香 料 食 用 等 方 面, 其 叶 梗 果 均 可 入 药, 嫩 叶 可 生 食 作 汤, 茎 叶 可 淹 渍 入 药 其 性 温, 味 辛, 可 解 表 散 寒, 行 气 和 胃, 用 于 风 寒 感 冒 咳 嗽 呕 恶 妊 娠 呕 吐 鱼 蟹 中 毒 等 症 现 代 药 理 研 究 表 明 : 紫 苏 还 具 有 降 血 压 降 血 脂 抑 制 血 小 板 凝 集 抗 血 栓 抗 衰 老 减 肥 抗 过 敏 性 炎 症 增 强 学 习 记 忆 预 防 癌 变 和 抑 制 肿 瘤 细 胞 转 移 等 功 能 具 有 很 高 的 研 究 及 应 用 价 值 本 实 验 通 过 分 子 蒸 馏 分 离 紫 苏 油 中 的 挥 发 物, 并 通 过 GC-MS 进 行 化 学 成 分 鉴 别 1. 实 验 部 分 1.1 仪 器 与 试 剂 分 子 蒸 馏 设 备 : 微 量 物 质 富 集 器 ( 天 津 科 技 大 学 现 代 分 析 技 术 研 究 中 心 研 发 制 造 ); 气 相 色 谱 - 质 谱 联 用 仪 :GC/MS-4000MS 型, 美 国 瓦 里 安 技 术 有 限 公 司 ; 粗 紫 苏 油 : 购 于 市 场 ; 无 水 乙 醇 : 分 析 纯 ; 正 己 烷 : 分 析 纯 1.2 实 验 条 件 紫 苏 油 挥 发 物 的 分 离 提 取 条 件 分 子 蒸 馏 仪 器 控 制 参 数 : 冷 凝 温 度 设 置 为 ; 一 级 温 度 90, 绝 对 压 力 30 kpa; 二 级 温 度 100, 绝 对 压 力 3Pa; 一 级 进 料 速 度 10mL/min; 二 级 进 料 速 度 5 ml/min 将 200ml 紫 苏 油 样 品 放 置 在 进 样 口 处, 样 品 由 蠕 动 泵 带 入 各 级 分 子 蒸 馏 装 置 中, 分 别 收 集 蒸 馏 后 的 馏 分 紫 苏 油 挥 发 物 的 化 学 成 分 分 析 条 件 气 相 色 谱 条 件 : 色 谱 柱 :VF-5ms(30 m 0.25 mm 0.25 mm); 样 口 温 度 :280.0 ; 载 气 : 高 纯 氦 ; 柱 流 量 :1.0 ml/min; 分 流 比 :100..1; 进 样 量 :1 μl; 程 序 升 温 : 起 始 温 度 60, 保 持 2min, 以 7 /min 升 至 250, 然 后 以 10 /min 升 至 280, 保 持 5min 质 谱 条 件 : 电 离 方 式 :EI; 电 子 能 量 :70 ev; 接 口 温 度 :280 ; 离 子 源 温 度 :220 ; 溶 剂 延 迟 :3 min; 扫 描 范 围 :45~500 amu 样 品 的 配 制 : 分 子 蒸 馏 馏 出 样 品 用 乙 醇 稀 释 100 倍 后, 取 液 体 1μL 注 入 仪 器 进 行 分 析 2 实 验 结 果 2.1 紫 苏 油 挥 发 物 的 分 离 纯 化 紫 苏 油 中 挥 发 性 化 学 成 分 分 离 富 集 的 方 法 是 : 将 200mL 紫 苏 油 经 二 级 分 子 蒸 馏 处 理, 得 到 0.2ml 馏 分, 收 率 为 0.1% 2.2 紫 苏 油 的 化 学 成 分 分 析. 将 分 子 蒸 馏 后 收 集 的 馏 分, 用 无 水 乙 醇 稀 释 100 倍, 进 行 GC-MS 化 学 成 分 分 析, 图 -1 为 总 离 子 流 264

270 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 图 -1 紫 苏 油 蒸 出 物 的 总 离 子 流 色 谱 图 利 用 NIST05 质 谱 库 对 各 色 谱 峰 进 行 检 索, 根 据 质 谱 数 据 相 对 保 留 时 间 和 有 关 参 考 文 献, 确 认 紫 苏 油 中 各 化 学 成 分 按 照 峰 面 积 归 一 法 进 行 定 量 分 析, 得 出 其 中 各 化 学 成 分 的 相 对 质 量 分 数 在 紫 苏 油 分 子 蒸 馏 的 馏 分 中 共 检 出 36 种 化 合 物, 占 总 峰 面 积 的 %, 其 主 要 成 分 是 芳 姜 黄 酮 ( 35.55% ), 其 次 是 (E,E)-3,7- 二 甲 基 -10-(1- 甲 基 亚 乙 基 )-3,7- 环 癸 二 烯 -1- 酮 (10.070% ) 3 结 果 与 讨 论 本 实 验 用 分 子 蒸 馏 法 分 离 纯 化 紫 苏 油 中 挥 发 性 成 分, 收 率 为 0.1% 文 献 报 道, 紫 苏 的 成 熟 果 实, 即 紫 苏 子 中 所 富 含 α- 亚 麻 酸 等 脂 肪 酸 实 验 表 明, 这 些 脂 肪 酸 均 以 甘 油 脂 的 形 式 存 在, 不 能 通 过 分 子 蒸 馏 方 法 蒸 出 分 子 蒸 馏 蒸 出 物, 经 GC-MS 分 离 鉴 定 出 36 种 化 合 物 相 对 于 总 挥 发 而 言, 主 要 成 分 芳 姜 黄 酮 占 35.55%, (E,E)-3,7- 二 甲 基 -10-(1- 甲 基 亚 乙 基 )-3,7- 环 癸 二 烯 -1- 酮 占 %,Α- 姜 黄 烯 占 4.318%, 亚 麻 酸 乙 酯 占 7.555%, 姜 黄 新 酮 占 7.988% 等 天 津 科 技 大 学 现 代 分 析 技 术 研 究 中 心 研 发 制 造 的 微 量 物 质 富 集 器, 能 够 富 集 油 脂 中 微 量 的 有 机 挥 发 物 紫 苏 挥 发 油 中 化 学 成 分 的 分 析 结 果, 为 进 一 步 开 发 紫 苏 挥 发 油 在 医 疗 食 品 环 境 等 多 方 面 的 应 用 提 供 了 新 的 信 息, 具 有 重 要 的 应 用 价 值 参 考 文 献 [1] 庄 云, 马 尧 紫 苏 子 油 提 取 方 法 比 较 研 究 [J] 安 徽 农 业 科 学,Journal of Anhui Agri. Sci. 2008,36 (33) :14574, [2] 李 天 祥, 朱 静, 曾 祥 钦, 王 静 康 分 子 蒸 馏 分 离 超 临 界 CO2 萃 取 的 米 槁 精 油 及 其 成 分 分 析 [J] 精 细 化 工 第 24 卷 第 10 期 2007 年 10 月. [3] 刘 信 平, 张 弛, 余 爱 农, 刘 应 煊, 谭 志 伟, 田 大 听 紫 苏 挥 发 活 性 化 学 成 分 研 究 [J] 时 珍 国 医 国 药 2008 年 第 19 卷 第 8 期. The molecular distillation extraction distils of perillartine oil by GC-MS analysis YANG- Zhiyan, JIANG -Shengping, GAO- Zhenzhong (Tianjin Scientific and technical university Analysis center Tianjin , China) Abstract: Object: to isolate and purify volatile oil from perillartine. Methed: volatile oil of perillartine.methed was isolated and purified by molecular distillation,and the composition was analysed by GC-MS. Result: Volatile oil of perillartine was extracted under 3Pa 90 condition,and the composition was analysed as 36 compounds by GC-MS. Conclusion: Molecular distillation was capable of isolating and purifying volatile oil from perillartine.,and GC-MS can analyze the composition very well. key words:perillartine molecular distillation isolate and purificate GC-MS 265

271 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 应 用 QTRAP TM 串 联 质 谱 仪 分 析 和 鉴 定 中 药 有 效 成 分 张 克 荣 (AB SCIEX 北 京 代 表 处, 北 京 ) 中 草 药 成 分 分 析 是 复 杂 和 困 难 的 一 项 工 作, 本 文 利 用 QTRAP TM 质 谱 仪 特 有 的 扫 描 功 能, 以 肉 苁 蓉 为 例, 寻 找 出 中 药 有 效 成 分 鉴 定 的 最 佳 有 效 方 案 中 草 药 成 分 分 析 是 复 杂 和 困 难 的 一 项 工 作, 其 化 学 成 分 是 中 药 发 挥 药 效 作 用 的 物 质 基 础, 是 实 现 中 药 现 代 化 的 关 键 所 在 搞 清 楚 中 药 物 质 基 础 有 利 于 揭 示 中 药 的 作 用 机 制 方 剂 的 配 伍 规 律, 对 制 订 药 材 种 植 GAP 标 准 及 中 药 产 品 质 量 标 准 优 化 制 剂 工 艺 实 现 中 药 现 代 化 和 国 际 化 具 有 重 要 意 义 QTRAP TM 质 谱 仪 是 新 一 代 液 质 联 用 串 联 质 谱 技 术, 其 独 特 之 处 在 于 同 时 具 备 了 完 整 的 三 重 四 极 杆 的 质 谱 特 点, 以 及 线 性 离 子 阱 的 功 能, 在 离 子 阱 模 式 下,QTRAP TM 的 MS/MS 谱 的 灵 敏 度 比 常 规 的 三 重 四 极 杆 型 高 出 二 个 数 量 级 以 上, 同 时 还 将 两 者 的 扫 描 功 能 巧 妙 的 结 合 起 来, 实 现 串 联 四 极 杆 - 线 性 离 子 阱 的 迅 速 切 换 通 过 选 择 母 离 子 扫 描 和 中 性 丢 失 扫 描 等 来 发 现 中 药 有 效 成 分 组, 得 到 更 丰 富 的 MS/MS 定 性 数 据 因 此,QTRAP TM 质 谱 仪 兼 有 定 性 和 定 量 分 析 的 功 能, 且 具 有 很 多 特 有 的 杆 - 阱 的 新 型 扫 描 方 式, 使 得 QTRAP TM 串 联 质 谱 仪 在 中 药 成 分 鉴 定 分 析 药 物 筛 选 以 及 代 谢 物 定 性 及 定 量 分 析 蛋 白 定 量 和 生 物 标 志 物 验 证 等 方 面 发 挥 巨 大 作 用 肉 苁 蓉 (Cistanche) 是 常 用 中 药 之 一, 肉 苁 蓉 中 具 有 药 效 的 主 要 化 学 成 分 为 苯 乙 醇 苷 化 合 物, 本 文 应 用 QTRAP TM 质 谱 技 术 研 究 了 肉 苁 蓉 中 苯 乙 醇 苷 类 成 分 1. 试 验 部 分 1.1 仪 器 和 试 剂 所 用 试 剂 均 为 色 谱 纯 ; 毛 蕊 花 糖 苷 (Acteoside) 和 松 果 菊 苷 (Echinacoside) 标 准 品, 以 及 肉 苁 蓉 70% 乙 醇 提 取 物 为 中 山 大 学 提 供 试 验 在 AB SCIEX 3200QTRAP TM LC-MS/MS 上 完 成, 液 相 为 岛 津 公 司 LC-20A, 色 谱 柱 :Atlantis dc18 5um 2.1*150mm 2. QTRAP 试 验 方 法 苯 乙 醇 苷 化 合 物 结 构 由 3 部 分 组 成, 即 咖 啡 酸 苯 乙 醇 苷 元 糖 苯 乙 醇 苷 类 化 合 物 在 负 离 子 模 式 下, 具 有 一 些 独 特 的 碎 裂 方 式 和 碎 片, 比 如 :m/z 461, m/z161 特 征 碎 片 离 子 ; 中 性 丢 失 糖 m/z 162 普 通 串 联 质 谱 难 以 从 复 杂 中 草 药 体 系 中 发 现 这 类 结 构 化 合 物, 更 难 于 获 得 它 们 的 MS/MS 图 谱 做 结 构 鉴 定 利 用 QTRAP 独 特 扫 描 方 式, 结 合 其 结 构 特 征, 我 们 采 用 母 离 子 扫 描 (Prec) 和 中 性 丢 失 (NL) 扫 描 筛 查, 并 实 时 切 换 到 离 子 阱 的 二 级 扫 描, 很 好 的 发 现 和 鉴 定 了 苯 乙 醇 苷 类 的 化 合 物, 并 比 较 了 母 离 子 扫 描 和 中 性 丢 失 扫 描 的 灵 敏 度 2.1 Prec-EPI 方 法 ( 母 离 子 扫 描 切 换 至 增 强 子 离 子 扫 描 ) 通 过 母 离 子 扫 描 m/z 461, m/z 161, 如 果 发 现 特 征 的 离 子, 仪 器 自 动 切 换 到 增 强 子 离 子 扫 描, 即 线 性 离 子 阱 的 高 灵 敏 度 子 离 子 扫 描, 快 速 得 到 所 有 发 现 离 子 的 高 品 质 MS/MS 质 谱 图, 进 行 结 构 鉴 定 2.2 NL-EPI( 中 性 丢 失 扫 描 切 换 至 增 强 子 离 子 扫 描 ) 266

272 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 通 过 中 性 丢 失 NL 162 扫 描, 如 果 发 现 特 征 性 的 离 子, 仪 器 自 动 切 换 到 增 强 子 离 子 扫 描, 快 速 得 到 高 品 质 的 MS/MS 质 谱 图, 进 行 结 构 鉴 定 3 结 果 和 讨 论 3.1 结 果 使 用 QTRAP 特 有 的 扫 描 技 术, 根 据 特 征 性 扫 描 方 式 Prec 和 NL 去 发 现 苯 乙 醇 苷 类 化 合 物, 并 实 时 获 得 它 们 的 MS/MS 质 谱 图, 结 合 具 有 相 似 结 构 的 标 准 品 毛 蕊 花 糖 苷 (Acteoside) 和 松 果 菊 苷 (Echinacoside) 的 MS/MS 质 谱 图, 进 行 结 构 比 较 和 推 演, 共 鉴 定 出 9 种 主 要 的 苯 乙 醇 苷 类 成 分 图 1 为 具 有 代 表 性 的 苯 乙 醇 苷 类 成 分 松 果 菊 苷 (Echinacoside) 的 结 构 及 裂 解 特 征 m/z 161 的 碎 片 是 m/ z 179 脱 水 得 到,m/z 为 m/z 153 脱 水 所 得,m/z m/z 分 别 为 m/z 进 一 步 丢 失 脱 氧 六 碳 糖 基 (146amu) 和 一 个 咖 啡 酰 基 (162amu) 所 得 所 鉴 定 的 各 种 成 分 的 分 子 量 及 MS/MS 碎 片 信 息 见 表 1 图 1 松 果 菊 苷 (Echinacoside) 结 构 及 在 负 离 子 模 式 下 裂 解 特 征 表 1 肉 苁 蓉 提 取 物 QTRAP TM LC-MS/MS 分 析 结 果 编 号 RT(min) m/z MS/MS 主 要 的 碎 片 离 子 推 测 可 能 的 化 合 物 名 称 , Decaffeoylacteoside , 161.0, Cistanoside F , 161.0, 179.0, 315.1, 461.2, 477.2, Echinacoside , 161.0, 179.0, 315.1, Acteoside , 161.0, 179.0, 315.1, Cisacteoside , 161.0, 179.0, 315.1, Isoacteoside , 161.0, Kankanoside G , 161.0, 179.0, 315.1, 461.3, acetylacteoside , Osmanthuside 267

273 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 我 们 比 较 了 Prec-EPI 和 NL-EPI 的 质 量 色 谱 图, 发 现 前 者 的 灵 敏 度 明 显 高 于 后 者, 理 论 上 讲 中 性 丢 失 扫 描 应 该 发 现 6 种 成 分, 但 实 验 结 果 只 发 现 了 两 种 含 量 较 高 的 成 分, 我 们 推 断 可 能 是 由 于 中 性 丢 失 糖 分 子 的 负 离 子 扫 描 模 式 灵 敏 度 较 差 所 致 代 表 性 图 谱 见 图 2 PREC m/z 总 离 子 流 色 谱 图 PREC-EPI MS/MS 质 谱 图 用 于 结 构 解 析 NL m/z 162 总 离 子 流 色 谱 图 NL-EPI MS/MS 质 谱 图 用 于 结 构 解 析 图 2 一 次 进 行 分 析, 所 得 的 PREC-EPI( 左 上 ),NL-EPI( 左 下 ) 色 谱 图 ( 通 过 PREC,NL 扫 描 可 以 获 得 化 合 物 分 子 量 信 息,EPI 扫 描 得 到 所 测 得 的 化 合 物 的 二 级 碎 片, 进 行 结 构 鉴 定 ) 3.2 结 论 如 何 从 中 草 药 复 杂 体 系 中 快 速 发 现 和 鉴 定 有 效 成 分 的 结 构, 是 极 具 挑 战 性 的 工 作, QTRAP TM 型 质 谱 仪 独 特 的 扫 描 模 式 - 高 的 灵 敏 度 和 特 异 性 Prec-EPI 和 NL-EPI, 让 大 海 捞 针 得 以 实 现 本 文 采 用 QTRAP TM 质 谱 仪 有 效 分 析 了 肉 苁 蓉 中 的 苯 乙 醇 苷 类 化 合 物, 在 负 离 子 模 式 下, 根 据 一 些 特 征 的 中 性 碎 片 (NL 162) 的 丢 失 和 特 征 性 的 碎 片, 产 生 m/z 161, m/z461, 可 以 快 速 鉴 定 出 这 些 化 合 物, 并 根 据 所 得 的 二 级 MS/MS 质 谱 图 推 测 出 其 分 子 结 构 实 验 结 果 表 明 :QTRAP TM 质 谱 仪 十 分 适 合 于 中 草 药 成 分 分 析, 其 数 据 简 单, 灵 敏 度 高, 特 异 性 强, 节 约 时 间 268

274 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 质 谱 鉴 定 激 酶 中 低 丰 度 蛋 白 修 饰 的 研 究 朱 金 蕾 张 锴 ( 南 开 大 学 化 学 学 院, 天 津 ) 蛋 白 激 酶 是 一 类 十 分 重 要 的 蛋 白 质 翻 译 后 修 饰 催 化 酶, 介 导 着 许 多 重 要 蛋 白 质 的 磷 酸 化 修 饰, 在 细 胞 信 号 级 联 放 大 转 导 基 因 表 达 和 酶 活 性 调 控 等 生 物 学 过 程 中 发 挥 功 能 大 量 的 研 究 证 明, 在 肿 瘤 的 发 生 发 展 中, 蛋 白 激 酶 特 别 是 酪 氨 酸 蛋 白 激 酶 发 挥 着 十 分 重 要 的 作 用, 而 成 为 许 多 抗 肿 瘤 药 物 的 靶 点 [1] 以 往 人 们 普 遍 认 为, 激 酶 参 与 肿 瘤 的 发 生 发 展 仅 与 其 异 常 蛋 白 质 磷 酸 化 修 饰 活 性 相 关 然 而 最 近 的 研 究 发 现 尽 管 肿 瘤 的 发 生 与 某 些 激 酶 的 表 达 异 常 显 著 相 关, 但 仅 仅 阻 断 某 些 激 酶 活 性 在 大 多 数 肿 瘤 患 者 身 上 并 未 导 致 明 显 的 临 床 效 果, 暗 示 激 酶 这 类 生 物 大 分 子 在 肿 瘤 中 可 能 还 存 在 着 其 它 的 非 磷 酸 化 修 饰 以 及 功 能 表 现 形 式 而 这 些 翻 译 后 修 饰 含 量 低 组 成 复 杂 丰 度 差 异 大, 其 检 测 是 生 物 分 析 技 术 面 临 的 挑 战 本 文 我 们 以 激 酶 中 多 种 低 丰 度 修 饰 为 目 标, 将 蛋 白 标 签 融 合 技 术 与 Shotgun 技 术 相 结 合, 探 索 系 统 研 究 激 酶 中 各 种 翻 译 后 修 饰 的 新 方 法 1. 研 究 方 法 我 们 以 酵 母 菌 中 的 几 种 重 要 功 能 性 激 酶 为 先 导 目 标 模 式, 通 过 基 因 融 合 技 术, 将 标 签 蛋 白 DNA 分 别 嵌 入 目 标 激 酶 的 DNA 序 列, 并 在 酵 母 菌 中 过 表 达 然 后, 利 用 标 签 蛋 白 与 固 定 相 的 特 异 性 亲 和 作 用, 将 细 胞 中 的 目 标 激 酶 富 集 提 纯 再 采 用 凝 胶 蛋 白 电 泳 分 离, 进 一 步 分 离 蛋 白 并 确 定 激 酶 的 表 达 质 量 通 过 胶 内 酶 解 技 术, 将 激 酶 酶 解 成 多 肽, 采 用 Nano-LC/MS/MS 分 析 和 蛋 白 信 息 化 检 索, 探 索 活 体 细 胞 中 激 酶 的 多 种 修 饰 形 式, 研 究 低 丰 度 蛋 白 质 修 饰 的 鉴 定 方 法 2. 结 果 与 讨 论 利 用 标 签 蛋 白 融 合 以 及 亲 和 富 集 技 术, 我 们 能 够 快 速 准 确 有 效 的 将 激 酶 蛋 白 从 细 胞 中 提 取, 通 过 质 谱 的 分 析, 可 以 确 定 提 取 的 激 酶 保 持 了 多 种 蛋 白 异 构 体 形 式, 能 够 较 完 整 的 表 征 蛋 白 的 特 征 和 多 肽 序 列 的 精 细 结 构 借 助 于 蛋 白 质 软 件 技 术 和 质 谱 解 析, 该 方 法 测 定 的 蛋 白 的 多 肽 序 列 覆 盖 率 高, 通 过 二 级 质 谱 解 析 和 液 相 色 谱 保 留 时 间 的 比 较, 我 们 在 鉴 定 激 酶 中 多 种 磷 酸 化 位 点 的 同 时, 在 某 些 激 酶 位 点 上 发 现 了 乙 酰 化 和 甲 基 化 修 饰, 这 些 修 饰 位 点 尚 未 见 文 献 报 道 联 合 生 物 信 息 学 工 具, 二 级 质 谱 的 裂 解 碎 片 和 一 级 质 谱 母 峰 的 信 息 分 析, 以 及 色 谱 保 留 性 质, 我 们 进 一 步 发 现 了 几 个 氨 基 酸 残 基 上 的 质 量 偏 移, 这 些 质 量 偏 移 与 已 知 的 修 饰 不 同, 也 排 除 了 基 因 突 变 和 处 理 过 程 中 化 学 反 应 的 可 能, 这 预 示 着 可 能 是 一 些 新 的 修 饰 形 式 3. 小 结 通 过 联 合 标 签 蛋 白 融 合 技 术 和 Shotgun 策 略, 我 们 探 索 了 快 速 鉴 定 激 酶 中 多 种 低 丰 度 蛋 白 修 饰 形 式 的 方 法, 并 成 功 的 在 激 酶 上 鉴 定 了 未 见 报 道 的 甲 基 化 和 乙 酰 化 修 饰 形 式, 同 时 发 现 了 一 些 潜 在 的 蛋 白 修 饰 形 式 我 们 的 研 究 的 结 果 预 示 激 酶 这 类 重 要 的 蛋 白 生 物 酶 可 能 存 在 着 更 为 复 杂 的 修 饰 形 势 和 生 物 功 能 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 ( ) zhangkai@nankai.edu.cn 269

275 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 Relative Abundance Relative Abundance Relative Abundance Relative Abundance 100 b7 y b5 b b12 b7-h 2 O y9 A b3 b4-h 2 O y b5-h 2 O b6-h 2 O b8 y10 b y2 b y4 b11 y y12 b m/z 100 y8 b6-h 2 O b5-h 2 O b b7-h 2 O b7 y9 y b y10 b13 y2 y3 b6 b8 y y4 b4 y b B m/z y8 y5 y12 ++ M ++ -NH S E I D T A N F D Q E F T y6 Me K y7 y9 C b y11 y3 y y10 b b8 b b b b9 b11 b12 b13 y y m/z y S E I D T A N F D Q E F T K y6 y D ++ y y4 M ++ -NH 3 y y10 y11 y12 b b y b3 b y5 b9 b12 y b11 b b b 图 1 参 考 文 献 y 甲 基 化 多 肽 的 二 级 质 谱 谱 图 E A A A A A Y G P D T D I P Me R E A A A A A Y G P D T D I P R m/z [1] J. Baselga, Targeting tyrosine kinases in cancer: The second wave. Science,2006, 312, Identification of non-phosphorylation post-translational modifications in yeast kinases by mass spectrometry ZHU Jinlei,ZHANG Kai Department of Chemistry, Nankai University, Tianjin , PR China Abstract: A few protein post-translational modifications (PTMs), such as phosphorylation and ubiquitination, are known to be critical in regulation of protein kinase activities. However, the roles of other PTMs have not been extensively studied in kinases. Development of a comprehensive description of all types of PTMs and discovering novel in vivo PTMs in low abundance represent major analytical challenges. Toward this goal, we have developed a strategy for systematic and accurate identification of the full-spectrum of PTMs in yeast protein kinases. Our strategy involves isolation of GST-fused kinase proteins, mass spectrometry analysis, and unrestrictive PTM identification by PTMap algorithm. Among the purified yeast kinases, we identified some different types of PTMs, among which are some novel mass shifts that have not been previously reported, likely representing novel PTMs. These results represent a significant expansion of our current understanding of PTMs in kinases and suggest highly complex regulation of kinase function. Keywords: protein post-translational modifications, PTMap, kinase, mass spectrometry 270

276 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 利 用 固 相 萃 取 和 色 质 联 用 技 术 分 析 柴 油 组 成 袁 维 ( 中 石 化 股 份 有 限 公 司 天 津 分 公 司 炼 油 部 质 检 车 间, ) 本 文 介 绍 了 利 用 固 相 萃 取 和 色 质 联 用 技 术 分 析 柴 油 组 成 的 方 法, 首 先 利 用 固 相 萃 取 的 方 法 将 柴 油 分 离 成 饱 和 烃 和 芳 烃, 分 别 加 入 等 量 内 标 物 再 分 别 取 样 进 行 气 相 色 谱 和 质 谱 分 析, 通 过 芳 烃 和 饱 和 烃 的 气 相 色 谱 图 计 算 二 者 的 含 量, 由 质 谱 图 得 出 芳 烃 和 饱 和 烃 的 烃 族 组 成, 再 根 据 饱 和 烃 和 芳 烃 的 相 对 含 量, 由 归 一 计 算 法 得 到 柴 油 的 烃 族 组 成 1 前 言 随 着 人 们 环 境 保 护 意 识 的 逐 渐 加 强 以 及 对 车 用 清 洁 燃 料 的 要 求 不 断 提 高, 汽 油 和 柴 油 的 质 量 不 断 升 级, 2010 年 车 用 柴 油 全 部 达 到 国 Ⅲ 标 准 车 用 柴 油 国 Ⅲ 标 准 中 首 次 限 制 了 多 环 芳 烃 的 含 量 不 大 于, 出 口 柴 油 对 多 环 芳 烃 的 含 量 要 求 更 加 苛 刻, 因 此 建 立 柴 油 烃 族 组 成 的 分 析 方 法, 配 合 柴 油 质 量 全 面 升 级 意 义 尤 为 重 要 准 确 测 定 芳 烃 和 多 环 芳 烃 的 含 量 是 油 品 生 产 的 迫 切 要 求, 但 在 油 品 的 生 产 过 程 中, 原 料 及 工 艺 条 件 的 变 化 与 波 动 将 直 接 影 响 油 品 的 组 成, 尽 快 掌 握 油 品 组 成 的 变 化, 及 时 调 整 操 作 条 件 才 能 生 产 出 合 格 的 产 品 2 方 法 原 理 首 先 利 用 固 相 萃 取 技 术 使 饱 和 烃 和 芳 烃 分 开, 得 到 各 自 的 分 离 样 品, 然 后 利 用 内 标 归 一 化 定 量 方 式 在 GC-FID 上 进 行 定 量, 得 到 样 品 的 饱 和 烃 和 芳 烃 含 量 的 族 组 成 结 果, 在 GC-MS 上 按 ASTM D2425 方 法 得 到 更 详 细 的 链 烷 单 双 和 多 环 烷 烃 或 芳 烃 的 族 组 成 信 息 3 实 验 部 分 3.1 仪 器 与 试 剂 HP 7890GC/5973MS, 带 FID 检 测 器 试 剂 : 正 己 烷, 正 戊 烷, 二 氯 甲 烷 ( 均 为 分 析 纯 ), 正 构 三 十 二 烷 ( 纯 度 大 于 99.5%) 3.2 实 验 条 件 GC 工 作 条 件 色 谱 柱 进 样 量 Agilent 19091s-433 毛 细 管 柱 30m 0.25mm 0.25μm 1.0μL 分 流 比 30:1 柱 流 量 2ml/min GC 进 样 口 温 度 300 GC-MS 接 口 温 度 280 GC 柱 箱 温 度 60 1 分 钟 检 测 器 温 度 MS 工 作 条 件 40 /min 分 钟 271

277 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 EI EMV 电 离 方 式 941eV GC-MS 接 口 温 度 280 离 子 源 温 度 实 验 步 骤 固 相 萃 取 分 离 柴 油 饱 和 烃 和 芳 烃 馏 分 利 用 固 相 萃 取 柱 ( 固 定 相 为 改 性 硅 胶 ) 上 加 入 约 0.15ml 柴 油, 依 次 用 正 戊 烷 和 二 氯 甲 烷 冲 洗 固 相 萃 取 柱, 正 戊 烷 萃 取 出 柴 油 的 饱 和 烃 馏 分, 二 氯 甲 烷 萃 取 出 芳 烃 馏 分 溶 剂 用 量 为 经 典 柱 色 谱 的 1/70, 样 品 处 理 时 间 <2min 分 别 进 样 分 析 饱 和 烃 和 芳 烃 馏 分 图 1 芳 烃 分 析 色 谱 图 图 2 芳 烃 分 析 质 谱 图 图 3 饱 和 烃 分 析 色 谱 图 图 4 饱 和 烃 分 析 质 谱 图 272

278 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 4 定 量 计 算 采 用 内 标 与 归 一 相 结 合 的 方 式 来 计 算 饱 和 烃 和 芳 烃 的 相 对 含 量 用 内 标 法 先 求 出 饱 和 烃 和 芳 烃 相 对 于 各 自 内 标 的 含 量, 再 将 两 者 进 行 归 一 化 处 理 得 到 最 终 的 分 析 结 果 所 选 内 标 为 高 碳 数 正 构 烷 烃, 如 正 构 三 十 二 烷, 将 其 直 接 溶 解 在 正 戊 烷 或 正 己 烷 中 即 可 得 到 相 应 的 内 标 液 但 内 标 法 操 作 比 较 繁 琐, 需 要 准 确 确 定 样 品 中 所 加 入 的 内 标 物 含 量, 而 本 方 法 为 了 保 证 溶 剂 峰 与 样 品 峰 能 分 开, 选 择 了 低 沸 点 的 烷 烃 做 溶 剂, 所 以 更 增 加 了 内 标 浓 度 确 定 的 困 难 同 时 在 放 置 过 程 中 由 于 低 沸 点 溶 剂 的 挥 发 也 会 造 成 浓 度 的 变 化 为 此, 本 方 法 规 定 色 谱 测 定 时, 在 饱 和 烃 和 芳 烃 溶 液 中 加 入 相 同 浓 度 和 相 同 体 积 的 内 标 液 或 相 同 质 量 的 内 标 物, 即 令 下 式 中 的 mns 等 于 mna, 从 而 使 内 标 定 量 计 算 中 的 和 可 以 互 相 约 掉, 在 求 相 对 含 量 时, 内 标 量 不 参 加 计 算 这 样 一 来, 内 标 液 浓 度 及 在 放 置 过 程 中 浓 度 变 化 对 分 析 结 果 的 影 响 就 被 最 大 限 度 地 减 少 了 饱 和 烃 含 量 =(Asmns/Ans)/[ (Asmns/ Ans)+ ( Aamna/ Ana)] 芳 烃 含 量 =(Aamna/Ana)/[ (Asmns/ Ans)+( Aamna/ Ana)] 式 中 As GC-FID 测 量 饱 和 烃 的 分 析 谱 图 上 饱 和 烃 的 峰 面 积 ;Aa GC-FID 测 量 芳 烃 的 分 析 谱 图 上 芳 烃 的 峰 面 积 ;Ans GC-FID 测 量 饱 和 烃 的 分 析 谱 图 上 内 标 峰 的 峰 面 积 ;Ana GC-FID 测 量 芳 烃 的 分 析 谱 图 上 内 标 峰 的 峰 面 积 ;mns 色 谱 分 析 用 饱 和 烃 馏 分 中 加 入 的 内 标 物 质 量 ;mna 色 谱 分 析 用 芳 烃 馏 分 中 加 入 的 内 标 物 质 量 当 进 行 详 细 烃 族 组 成 分 析 时, 只 要 将 饱 和 烃 或 芳 烃 含 量 与 按 ASTM D2425 方 法 得 到 的 各 馏 分 详 细 烃 组 成 归 一 的 结 果 相 乘 即 可 5 精 密 度 分 析 成 品 交 库 柴 油 结 果 见 表 1, 由 表 中 数 据 可 以 看 出 总 饱 和 烃 总 单 环 芳 烃 和 总 芳 烃 的 标 准 偏 差 均 大 于 1, 是 由 于 萃 取 操 作 不 过 关 带 来 的 影 响, 其 他 组 分 的 标 准 偏 差 均 小 于 1 表 1 柴 油 组 成 分 析 结 果 馏 分 烃 类 组 成 测 定 值 均 值 标 准 偏 差 链 烷 烃 一 环 烷 烃 二 环 烷 烃 三 环 烷 烃 总 环 烷 烃 总 饱 和 烃 烷 基 苯 茚 满 或 四 氢 萘 茚 类 总 单 环 芳 烃 萘 萘 类 苊 类 苊 烯 类 总 双 环 芳 烃 三 环 芳 烃 总 芳 烃 胶 质 总 重 量

279 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 离 子 液 体 辅 助 诺 氟 沙 星 分 子 印 迹 整 体 柱 的 制 备 及 性 能 考 察 孙 祥 丽 1, 刘 烜 2, 何 锡 文 1, 陈 朗 星 1*, 张 玉 奎 1, 3 (1. 南 开 大 学 化 学 学 院, 天 津 ;2. 天 津 出 入 境 检 验 检 疫 局 动 植 物 与 食 品 检 测 中 心 ; 3. 中 科 院 大 连 化 学 物 理 研 究 所, 大 连 ) 喹 诺 酮 类 (quinolones,qns) 抗 菌 药 是 指 人 工 合 成 的 含 有 4- 喹 酮 母 核 的 一 类 广 谱 抗 微 生 物 药. 根 据 喹 诺 酮 类 抗 菌 药 药 理 机 制, 该 药 物 极 易 造 成 高 浓 度 的 组 织 材 料 残 留 如 何 从 复 杂 样 品 中 检 测 出 喹 诺 酮 残 留 已 经 成 为 食 品 安 全 检 测 工 作 中 重 要 的 研 究 课 题, 其 中 样 品 的 前 处 理 是 动 物 源 性 食 品 中 抗 生 素 残 留 检 测 中 的 关 键 步 骤 固 相 萃 取 (solid-phase extraction,spe) 是 近 年 来 迅 速 发 展 起 来 的 专 门 用 于 样 品 纯 化 和 浓 缩 的 一 项 技 术, 也 是 目 前 抗 生 素 残 留 检 测 中 样 品 前 处 理 中 的 主 流 技 术 其 中 以 分 子 印 迹 聚 合 物 作 为 填 料 的 分 子 印 迹 固 相 萃 取 技 术 (molecular imprinting solid-phase extraction,mispe) 以 其 高 度 的 特 异 性 选 择 性 和 快 速 简 洁 的 优 势, 已 成 为 当 前 国 际 上 最 先 进 最 受 关 注 的 痕 量 样 品 富 集 和 提 取 方 法 之 一 本 文 以 诺 氟 沙 星 为 模 板, 甲 基 丙 烯 酸 为 功 能 单 体, 乙 二 醇 二 甲 基 丙 烯 酸 酯 为 交 联 剂, 首 次 在 离 子 液 体 中 原 位 合 成 了 诺 氟 沙 星 分 子 印 迹 整 体 柱, 过 程 如 图 1 所 示 并 以 同 样 方 法 合 成 了 非 印 迹 整 体 柱, 并 在 普 通 致 孔 剂 中 制 备 了 印 迹 整 体 柱 作 为 比 较 如 图 2 所 示, 在 相 同 条 件 下, 模 板 在 印 迹 柱 上 的 保 留 均 强 于 非 印 迹 柱, 同 时 离 子 液 体 中 制 备 的 印 迹 柱 对 模 板 有 更 好 的 保 留 Absorbances / mau Time / min 图 1 图 2 参 考 文 献 [1] Wulff, G., Angew. Chem. Int. Ed. 1995, 34, [2] Yan, H. Y., Qiao, F. X., Row, K. H., Anal. Chem. 2007, 79, [3] Sun, X. L., He, X. W., Zhang, Y. K., Chen, L. X., Talanta 2009, 79, 陈 朗 星 lxchen@nankai.edu.cn, 本 文 由 973 项 目 基 金 (No. 2007CB914100) 资 助 274

280 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 磺 胺 甲 噁 唑 印 迹 纳 米 硅 球 的 制 备 及 其 与 传 统 分 子 印 迹 聚 合 物 的 比 较 高 瑞 霞 1, 苏 晓 倩 1, 陈 朗 星 1, 何 锡 文 1, 张 玉 奎 1, 2 (1. 南 开 大 学 化 学 学 院,300071, 天 津 ; 2. 中 国 科 学 院 大 连 化 学 物 理 研 究 所,116023, 大 连 ) 摘 要 : 本 文 以 二 氧 化 硅 (SiO2) 纳 米 球 为 载 体, 以 磺 胺 甲 噁 唑 (SMO) 为 模 板 分 子, 乙 腈 为 溶 剂, 丙 烯 酰 胺 (AA) 为 功 能 单 体, 乙 二 醇 二 甲 基 丙 烯 酸 酯 (EDGMA) 为 交 联 剂, 偶 氮 二 异 丁 腈 (AIBN) 为 引 发 剂, 通 过 表 面 印 迹 技 术 制 备 了 磺 胺 类 药 物 的 印 迹 聚 合 物 和 非 印 迹 聚 合 物 同 时, 通 过 传 统 分 子 印 迹 方 法 合 成 聚 合 物, 将 两 种 聚 合 物 加 以 比 较 以 纳 米 硅 球 为 载 体, 用 表 面 印 迹 技 术 合 成 的 聚 合 物 相 比 较 于 用 传 统 分 子 印 迹 方 法 合 成 的 聚 合 物 对 模 板 分 子 有 较 快 的 结 合 速 率 较 大 的 吸 附 容 量 较 高 的 印 迹 因 子 和 选 择 性 因 子, 如 下 图 1 所 示 关 键 词 : 纳 米 硅 球 分 子 印 迹 聚 合 物 吸 附 磺 胺 类 药 物 A d so r p tio n c a (m p a g c ity -1 g ) O r i g i n P r o 8 E v a l u a t i o n O r i g i n P r o 8 E v a l u a t i o n im p rin ted n o n -im p rin ted O r i g i n P r o 8 E v a l u a t i o n O r i g i n P r o 8 E v a l u a t i o n O r i g i n P r o 8 E v a l u a t i o n O r i g i n P r o 8 E v a l u a t i o n O r i g i n P r o 8 E v a l u a t i o n O r i g i n P r o 8 E v a l u a t i o n O r i g i n P r o 8 E v a l u a t i o n O r i g i n P r o 8 E v a l u a t i o n O r i g i n P r o 8 E v a l u a t i o n O r i g i n P r o 8 E v a l u a t i o n A B 图 1 印 迹 和 非 印 迹 聚 合 物 的 吸 附 容 量 以 纳 米 硅 球 为 载 体, 用 表 面 印 迹 技 术 合 成 的 聚 合 物 (A), 用 传 统 分 子 印 迹 的 方 法 合 成 的 聚 合 物 (B). 参 考 文 献 : [1] Huiqi Zhang, Lei Ye, J. Mol. Recognit, 2006, 19, [2] Jinxing He, Shuo Wang, Guozhen Fang, Huaping Zhu, J. Agric. Food Chem, 2008, 56, 基 金 项 目 : 组 合 分 子 印 迹 技 术 应 用 于 农 产 品 中 禁 用 抗 生 素 的 分 离 和 检 测 ( 国 家 自 然 科 学 基 金,No ) 作 者 简 介 : 陈 朗 星 (1965- ), 男, 教 授, 研 究 方 向 : 分 子 印 迹,Tel: , lxchen@nankai.edu.cn. 275

281 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 氯 霉 素 分 子 印 迹 整 体 柱 的 制 备 及 其 在 色 谱 分 离 中 的 应 用 林 冬, 孙 祥 丽, 苏 晓 倩, 陈 朗 星 ( 南 开 大 学 化 学 学 院, 天 津,300071) 氯 霉 素 是 一 种 广 谱 性 抗 生 素, 广 泛 应 用 于 畜 牧 业 水 产 业 等, 但 其 对 人 体 毒 副 作 用 极 大, 可 引 发 人 体 骨 髓 障 碍 性 贫 血 症, 是 国 家 明 令 禁 止 使 用 的 药 品 因 此, 为 保 证 食 品 安 全, 亟 待 寻 求 对 氯 霉 素 类 抗 生 素 的 分 离 检 测 方 法 然 而, 抗 生 素 类 的 残 留 浓 度 低, 且 样 品 基 体 成 分 复 杂, 样 品 前 处 理 繁 琐, 所 以 需 寻 求 具 有 专 一 特 异 选 择 的 前 处 理 方 法 分 子 印 迹 技 术 可 很 好 地 解 决 这 类 问 题, 分 子 印 迹 聚 合 物 具 有 三 维 立 体 空 穴 结 构, 可 以 特 异 性 地 选 择 吸 附 所 需 分 子, 在 样 品 前 处 理 过 程 中 十 分 重 要 本 实 验 采 用 的 是 在 整 体 柱 中 原 位 聚 合 聚 合 物 整 体 柱 是 近 年 来 发 展 迅 速 的 一 种 具 有 传 质 速 率 快 稳 定 性 好 制 备 简 单 等 多 项 优 点 的 色 谱 固 定 相 本 实 验 以 热 引 发 原 位 聚 合 法 在 不 锈 钢 柱 中 合 成 了 以 甲 基 丙 烯 酰 胺 乙 二 醇 二 甲 基 丙 烯 酸 酯 (EGDMA) 为 基 质 的 印 迹 聚 合 物 整 体 柱 此 过 程 中 以 绿 色 溶 剂 离 子 液 体 [BMIm]BF4 为 致 孔 剂, 通 过 电 镜 表 征 可 知, 制 得 了 相 比 传 统 混 合 致 孔 剂 更 加 均 匀 饱 满 的 聚 合 物 连 接 液 相 色 谱 仪 检 测, 模 板 分 子 与 竞 争 物 四 环 素 基 线 分 离 良 好, 分 离 度 为 2.103, 对 模 板 的 吸 附 量 可 达 到 7.91mg/g uv min 图 1 印 迹 聚 合 物 对 氯 霉 素 的 等 温 吸 附 曲 线 图 2 模 板 分 子 氯 霉 素 与 竞 争 分 子 四 环 素 在 分 子 印 迹 整 体 柱 上 的 分 离 色 谱 图 参 考 文 献 : [1] Georges Guiochon, Journal of Chromatography A, 1168 (2007) [2] 马 娟 娟, 王 新 龙, 许 兴 友, 功 能 高 分 子 学 报,2005,18(1): [3] Xiangli Sun, Xiwen He, Yukui Zhang, Langxing Chen,Talanta 79 (2009) 基 金 项 目 :973 基 金 (2007CB914100) 资 助 项 目 276

282 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 制 备 大 孔 硼 酸 亲 和 整 体 柱 用 于 糖 蛋 白 分 离 杨 帆 1 1 1, 2 1, 何 锡 文, 张 玉 奎, 陈 朗 星 (1. 南 开 大 学 化 学 学 院, 天 津 ; 2. 中 国 科 学 院 大 连 化 学 物 理 研 究 所, 大 连 ) 作 为 蛋 白 质 组 学 的 一 个 重 要 分 支, 糖 蛋 白 质 组 学 已 经 成 为 目 前 蛋 白 质 组 学 领 域 的 一 个 研 究 热 点 糖 蛋 白 广 泛 存 在 于 生 物 体 内, 与 生 物 体 的 正 常 生 理 功 能 有 着 紧 密 联 系 对 于 糖 蛋 白 的 研 究 具 有 十 分 重 要 的 生 物 学 意 义 和 临 床 应 用 价 值 糖 蛋 白 组 学 研 究 的 首 要 问 题 是 对 糖 蛋 白 / 糖 肽 的 有 效 分 离 与 富 集 硼 酸 亲 和 色 谱 (boronate affinity chromatography, BAC), 是 一 种 有 效 的 提 纯 糖 蛋 白 的 方 法 硼 酸 基 团 在 碱 性 条 件 下, 与 带 有 顺 式 二 羟 基 (cis-diol) 基 团 的 物 质 共 价 结 合, 形 成 稳 定 的 五 或 六 元 环 酯 结 构 ; 在 酸 性 条 件 下 则 可 逆 的 解 离 利 用 这 种 可 逆 的 性 质, 硼 酸 基 团 可 以 有 效 的 对 含 有 顺 式 二 醇 的 物 质, 例 如 糖 类,RNA, 核 苷, 糖 肽 和 糖 蛋 白 进 行 分 离 和 提 纯 整 体 柱, 又 称 为 整 体 固 定 相, 是 一 种 用 有 机 或 无 机 聚 合 方 法 在 色 谱 柱 中 进 行 原 位 聚 合 的 连 续 床 固 定 相 这 种 色 谱 柱 制 备 方 法 简 单, 易 于 改 性, 采 用 原 位 聚 合 方 法 制 得, 比 常 规 填 充 柱 具 有 更 好 的 多 孔 性 和 渗 透 性, 具 有 传 质 快 柱 效 高 的 优 点 调 节 合 适 的 比 例 可 以 制 得 含 有 介 孔 或 大 孔 的 整 体 柱, 实 现 对 生 物 大 分 子 的 高 通 量 高 柱 效 的 分 离 和 分 析, 并 且 具 有 良 好 的 稳 定 性 本 课 题 制 备 了 一 种 新 型 的 大 孔 硼 酸 亲 和 聚 合 物 整 体 柱, 用 于 对 糖 蛋 白 的 选 择 性 捕 获 和 分 离 制 备 简 单, 采 用 一 步 合 成 研 究 中 我 们 使 用 含 有 硼 酸 基 团 的 3- 丙 烯 酰 胺 基 苯 硼 酸 (AAPBA) 作 为 功 能 单 体,EDMA 作 为 交 联 剂, 在 AIBN 的 引 发 下 在 不 锈 钢 管 柱 中 原 位 聚 合 制 得 大 孔 级 硼 酸 亲 和 整 体 柱 实 验 中 我 们 优 化 了 整 体 柱 的 制 备 条 件, 并 系 统 的 对 整 体 柱 的 形 态, 孔 径 分 布 进 行 了 表 征 制 得 的 大 孔 硼 酸 亲 和 整 体 柱 可 以 有 效 的 捕 获 带 有 cis-diol 基 团 的 糖 蛋 白, 实 现 对 糖 蛋 白 的 有 效 快 速 分 离 参 考 文 献 : [1] X.D. Geng, C.Z. Wang, J. Chromatogr., B 2007, 849, [2] Smith, N.W.; Jiang, Z.J. J. Chromatogr. A 2008, 1184, [3] Svec, F.; Huber, C.G. Anal. Chem. 2006, 78, 基 金 (2007CB914100) 资 助 项 目 277

283 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 苯 硼 酸 修 饰 阳 离 子 交 换 整 体 柱 的 制 备 及 在 蛋 白 质 分 离 复 性 中 的 应 用 孙 祥 丽 1, 林 冬 1, 何 锡 文 1, 张 玉 奎 1, 2, 陈 朗 星 1 (1. 南 开 大 学 化 学 学 院, 天 津 ;2. 中 国 科 学 院 大 连 化 学 物 理 研 究 所, 大 连 ) 整 体 柱 是 近 年 来 发 展 迅 速 的 一 种 具 有 传 质 速 率 快 稳 定 性 好 制 备 简 单 等 多 项 优 点 的 色 谱 固 定 相 离 子 交 换 色 谱 (ion exchange chromatography,iec) 是 生 物 大 分 子 色 谱 分 离 中 很 重 要 的 一 类 方 法, 比 较 常 用 的 阳 离 子 离 子 交 换 功 能 基 有 磺 酸, 羧 酸 和 磷 酸 基 团 硼 酸 修 饰 的 固 定 相 一 般 应 用 于 糖 类 化 合 物 或 糖 蛋 白 的 分 离, 其 离 子 交 换 性 能 还 未 有 详 细 研 究 本 文 首 先 以 热 引 发 原 位 聚 合 法 合 成 了 以 甲 基 丙 烯 酸 (MAA) 乙 二 醇 二 甲 基 丙 烯 酸 酯 (EGDMA) 为 基 质 的 整 体 骨 架, 然 后 在 其 表 面 修 饰 间 氨 基 苯 硼 酸 (APBA) 使 基 质 表 面 带 有 负 电 荷 从 而 制 得 阳 离 子 交 换 整 体 柱 用 该 柱 成 功 实 现 了 对 5 种 蛋 白 质 的 分 离, 并 以 普 通 流 动 相 和 氧 化 还 原 流 动 相 分 别 考 察 了 脲 变 性 盐 酸 胍 变 性 SDS 变 性 的 RNase A 在 APBA 柱 上 的 重 折 叠 行 为, 酶 活 力 测 试 显 示 本 文 采 用 的 蛋 白 折 叠 液 相 色 谱 法 是 普 通 稀 释 法 复 性 效 率 的 4-8 倍, 荧 光 光 谱 和 圆 二 色 光 谱 测 定 也 证 实 了 RNase A 在 APBA 柱 上 的 正 确 折 叠 图 1 显 示 三 种 变 性 后 的 RNase A 在 以 蛋 白 折 叠 液 相 色 谱 法 (PFLC) 复 性 时 与 活 性 RNaseA 的 色 谱 对 照 图, 图 2 显 示 了 三 种 变 性 RNase A 及 分 别 被 PFLC 法 复 性 后 的 RNaseA 与 活 性 RNaseA 的 荧 光 光 谱 对 照 图 Absorbance 0-40 Fluorescence t/min wavelength (nm) 图 1 活 性 及 三 种 变 性 RNase A 在 APBA 柱 上 色 谱 图 图 2 活 性 三 种 变 性 RNase A 及 分 别 被 PFLC 法 复 性 后 的 RNaseA 的 荧 光 光 谱 图 参 考 文 献 : [1] X.D. Geng, C.Z. Wang, J. Chromatogr., B 2007, 849, [2] Smith, N.W.; Jiang, Z.J. J. Chromatogr. A 2008, 1184, [3] Svec, F.; Huber, C.G. Anal. Chem. 2006, 78,

284 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 点 击 化 学 修 饰 疏 水 有 机 聚 合 物 整 体 柱 的 制 备 及 其 在 蛋 白 质 分 离 中 的 应 用 孙 祥 丽 , 2, 林 冬, 何 锡 文, 陈 朗 星, 张 玉 奎 摘 要 (1. 南 开 大 学 化 学 学 院, 天 津 ; 2. 中 科 院 大 连 化 学 物 理 研 究 所, 大 连 ) 色 谱 柱 是 整 个 色 谱 系 统 的 核 心, 如 何 提 高 柱 效 是 人 们 一 直 关 心 的 问 题 整 体 柱 (monolithic column) 是 吸 取 了 无 孔 填 料 和 膜 的 快 速 分 离 能 力 及 HPLC 多 孔 填 料 的 高 容 量, 又 没 有 增 加 柱 阻 力 这 几 方 面 的 优 点 而 发 展 起 来 的 一 种 新 型 高 效 液 相 色 谱 填 料 与 传 统 的 填 充 柱 相 比, 整 体 柱 具 有 以 下 优 点 : (1) 整 个 床 层 高 度 均 匀, 分 辨 率 高 ; (2) 可 在 高 流 速 下 操 作 ; (3) 制 备 成 本 低 ; (4) 使 用 寿 命 长, 稳 定 性 好 ; (5) 简 化 了 介 质 的 衍 生 ; (6) 分 辨 率 吸 附 容 量 流 速 都 可 通 过 改 变 制 备 过 程 中 单 体 溶 液 的 组 成 来 调 节 点 击 化 学 (click chemistry) 的 概 念 最 早 是 2001 年 诺 贝 尔 化 学 奖 获 得 者 美 国 化 学 家 Sharpless 提 出 的 一 种 快 速 合 成 大 量 化 合 物 的 新 方 法, 是 继 组 合 化 学 之 后 又 一 给 传 统 有 机 合 成 化 学 带 来 重 大 革 新 的 合 成 技 术 本 文 将 整 体 柱 与 点 击 化 学 的 优 点 有 机 结 合, 利 用 高 选 择 性 高 效 率 的 点 击 化 学 对 整 体 柱 进 行 表 面 修 饰, 从 而 得 到 疏 水 有 机 整 体 固 定 相 如 图 1 所 示, 首 先 利 用 可 click 化 的 单 体 与 交 联 剂 聚 合 得 到 带 有 端 基 炔 的 整 体 骨 架, 然 后 利 用 一 价 铜 催 化 的 1,3- 偶 极 环 加 成 反 应 将 叠 氮 化 的 两 种 烷 烃 长 链 修 饰 在 该 骨 架 表 面 图 2 为 修 饰 前 后 的 整 体 柱 对 5 种 蛋 白 的 分 离 性 能 比 较, 可 以 看 出 随 着 疏 水 性 能 的 提 高, 固 定 相 对 5 种 蛋 白 的 分 离 能 力 也 随 之 增 强 图 1 图 2 参 考 文 献 1. H.C. Kolb, M.G. Finn, K.B. Sharpless, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40 (2001) N.W. Smith, Z.J. Jiang, J. Chromatogr. A 1184 (2008) M.D. Slater, J.M.J. Fréchet, F. Svec, J. Sep. Sci. 32 (2009) 陈 朗 星 lxchen@nankai.edu.cn, 本 文 由 973 项 目 基 金 (No. 2007CB914100) 资 助 279

285 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 转 铁 蛋 白 分 子 印 迹 颗 粒 的 制 备 及 应 用 * 李 沁 然, 刘 晋 湘, 杨 开 广, 张 丽 华, 梁 振, 单 亦 初, 张 玉 奎 ( 中 国 科 学 院 大 连 化 学 物 理 研 究 所, 国 家 色 谱 研 究 分 析 中 心, 大 连,116023) 在 自 然 界 中, 生 物 体 内 的 化 学 反 应 都 可 以 看 作 是 分 子 识 别 的 过 程 分 子 印 迹 就 是 仿 生 生 物 体 内 抗 原 一 抗 体 的 理 念, 在 人 工 材 料 上 制 备 特 异 识 别 位 点 的 技 术 与 天 然 抗 体 相 比, 分 子 印 迹 材 料 具 有 更 高 的 环 境 耐 受 性 制 备 成 本 较 低 可 重 复 使 用 等 优 势 在 蛋 白 质 分 子 印 迹 的 研 究 当 中, 常 使 用 在 基 质 材 料 表 面 制 备 识 别 位 点 的 方 法, 即 表 面 印 迹 方 法 相 对 传 统 印 迹 方 法, 该 方 法 模 板 利 用 率 高 位 点 易 暴 露 传 质 速 度 快, 故 近 年 来 得 到 较 好 的 发 展 本 研 究 采 用 纯 硅 胶 颗 粒 为 基 质, 先 将 牛 血 清 转 铁 蛋 白 (apo-transferrin) 吸 附 到 硅 球 的 微 孔 内 ; 然 后 将 聚 合 溶 液 通 入 到 硅 球 内, 封 闭 进 行 聚 合 反 应 ; 聚 合 反 应 结 束 后, 用 NH4HF2 溶 液 刻 蚀 掉 硅 球, 形 成 分 子 印 迹 颗 粒 实 验 结 果 表 明, 使 用 制 备 得 到 的 MIP 印 迹 颗 粒 对 四 种 标 准 蛋 白 的 混 合 溶 液 进 行 处 理 后, 模 板 蛋 白 牛 血 清 转 铁 蛋 白 几 乎 被 全 部 吸 附 ; 而 其 他 非 模 板 蛋 白 的 非 特 异 性 吸 附 量 很 低 合 成 过 程 中 不 加 模 板 蛋 白 的 对 照 组 材 料 (NIP) 对 于 模 板 蛋 白 的 吸 附 量 也 远 低 于 MIP 材 料 相 应 的 吸 附 量, 如 图 1 所 示 对 于 模 板 蛋 白, 其 印 迹 因 子 (MIP/NIP) 可 以 达 到 1.6 以 上 结 果 说 明, 印 迹 颗 粒 材 料 对 模 板 分 子 具 有 较 好 的 选 择 性 识 别 能 力, 可 有 望 应 用 于 蛋 白 质 组 学 HPLC-MS 分 析 中 样 品 前 处 理 环 节 对 血 浆 样 品 高 丰 度 蛋 白 血 清 转 铁 蛋 白 的 选 择 性 去 除 图 1 4 种 标 准 蛋 白 混 合 溶 液 经 印 迹 材 料 处 理 前 后 溶 液 中 各 种 蛋 白 的 相 对 含 量 280

286 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 蛋 白 质 印 迹 材 料 制 备 及 其 识 别 性 能 研 究 邓 启 良 1,2, 刘 晋 湘 2, 梁 振 2, 张 丽 华 2, 张 玉 奎 2 (1. 天 津 科 技 大 学 理 学 院, 天 津 ; 2. 中 国 科 学 院 大 连 化 学 物 理 研 究 所 国 家 色 谱 研 究 分 析 中 心, 大 连 ) 蛋 白 识 别 材 料 在 分 离 科 学 化 学 及 生 物 传 感 器 以 及 医 药 等 领 域 都 有 重 要 应 用 价 值 分 子 印 迹 是 近 年 发 展 起 来 的 人 工 合 成 分 子 识 别 材 料 技 术 其 分 子 识 别 性 能 是 基 于 结 合 位 点 与 模 板 分 子 在 尺 寸 大 小 形 状 和 功 能 基 团 排 列 等 方 面 的 相 互 匹 配 针 对 小 分 子 合 成 的 印 迹 材 料 已 经 广 泛 地 应 用 于 分 离 催 化 和 传 感 器 等 领 域 但 是, 以 蛋 白 质 为 模 板 分 子 制 备 分 子 识 别 材 料 仍 然 是 一 项 艰 巨 的 任 务 本 文 以 猪 血 清 白 蛋 白 为 模 板 分 子 甲 基 丙 烯 酰 胺 甲 基 丙 烯 酸 为 功 能 单 体, 哌 嗪 双 丙 烯 酰 胺 为 交 联 剂 制 备 了 印 迹 材 料, 所 制 备 的 材 料 用 于 蛋 白 混 合 液 中 模 板 蛋 白 的 选 择 性 识 别 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 和 试 剂 甲 基 丙 烯 酸, 过 硫 酸 铵 和 N,N,N,N - 四 甲 基 乙 二 胺 (TEMED) 购 自 Acros 公 司 (Morris Plains, New Jersey) 甲 基 丙 烯 酰 胺 购 自 Fluka 公 司 (Buchs Switzerland) 丙 烯 酰 胺, 哌 嗪 双 丙 烯 酰 胺, 溶 菌 酶 (lysozyme) 与 细 胞 色 素 C(cytochrome C) 购 自 Sigma 公 司 (St. Louis, MO) 高 效 液 相 色 谱 (HPLC)( 岛 津 LC20AD, 紫 外 / 可 见 检 测 器 SPD20A) 1.2 PSA 分 子 印 迹 聚 合 物 及 空 白 聚 合 物 的 制 备 首 先 将 哌 嗪 双 丙 烯 酰 胺 甲 基 丙 烯 酰 胺 甲 基 丙 烯 酸 和 猪 血 清 白 蛋 白 溶 于 磷 酸 缓 冲 溶 液 (10mM,pH6.5) 中 然 后 依 次 加 入 过 硫 酸 铵 (10%, W/V) 和 TEMED, 反 应 24h 再 用 10%SDS(W/V) + 10% 乙 酸 (V/V) 溶 液 浸 泡 5h, 冲 洗 掉 蛋 白 质 模 板 最 后, 用 水 冲 洗 三 次, 去 除 SDS, 聚 合 物 晾 干 后 备 用 空 白 聚 合 物 的 合 成 除 不 加 模 板 分 子 外, 其 它 条 件 与 印 迹 聚 合 物 的 制 备 相 同 2 结 果 图 1 聚 合 物 对 蛋 白 质 的 识 别 能 力 a. 原 始 溶 液 ;b. 非 印 迹 聚 合 物 吸 附 后 溶 液 ;c. 印 迹 聚 合 物 吸 附 后 溶 液 本 研 究 中 我 们 以 细 胞 色 素 C, 核 糖 核 酸 酶 B, β- 乳 球 蛋 白 为 竞 争 蛋 白 与 猪 血 清 白 蛋 白 一 起 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 ( ) 作 者 简 介 : 邓 启 良 (1974-), 男, 山 西 人, 副 教 授, yhdql@tust.edu.cn 281

287 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 组 成 蛋 白 质 混 合 液, 以 制 备 印 迹 聚 合 物 模 拟 抗 体 用 于 选 择 性 识 别 模 板 蛋 白, 由 图 1 结 果 可 以 看 出, 经 过 非 印 迹 聚 合 物 吸 附 后, 溶 液 中 残 留 的 四 种 蛋 白 质 浓 度 与 原 始 溶 液 相 比, 并 没 有 发 生 明 显 变 化 ; 这 说 明 非 印 迹 聚 合 物 对 四 种 蛋 白 质 的 吸 附 量 均 很 小 经 过 印 迹 聚 合 物 吸 附 后 的 溶 液 中, 三 种 竞 争 蛋 白 质 的 浓 度 没 有 明 显 变 化, 而 猪 血 清 白 蛋 白 的 浓 度 明 显 减 小 ; 结 果 表 明 印 迹 聚 合 物 对 模 板 蛋 白 表 现 出 高 亲 和 性 和 特 异 性, 可 以 从 蛋 白 混 合 物 中 识 别 出 猪 血 清 白 蛋 白 ; 而 非 印 迹 聚 合 物 则 不 能 从 蛋 白 混 合 物 中 有 效 地 识 别 猪 血 清 白 蛋 白 由 于 蛋 白 的 同 源 性, 该 材 料 对 人 血 清 白 蛋 白 也 表 现 出 较 好 的 识 别 性 能, 已 初 步 应 用 于 人 血 清 中 白 蛋 白 的 去 处 参 考 文 献 : [1] N. W. Turner, C. W. Jeans, K. R. Brain, C. J. Allender, V. Hlady, D. W. Britt, From 3D to 2D: A Review of the Molecular Imprinting of Proteins. Biotechnol. Prog. 2006, 22, [2] A. Rachkov, N. Minoura, Towards molecularly imprinted polymers selective to peptides and proteins. The epitope approach. Biochim. Biophys. Acta, 2001, 1544, 255~266. [3] M. Quaglia, K. Chenon, A. J. Hall, E. De Lorenzi, B. Sellergren, Target Analogue Imprinted Polymers with Affinity for Folic Acid and Related Compounds. J. Am. Chem. Soc., 2001, 123, 2146~2154. [4] P. Manesiotis, A. J. Hall, J. Courtois, K. Irgum, B. Sellergren, An Artificial Riboflavin Receptor Prepared by a Template Analogue Imprinting Strategy. Angew. Chem. Int. Ed., 2005, 44, Preparation of Protein Imprinted Materials and Its Recognition Properties DENG Qi-liang 1,2, LIU Jin-xiang 2, LIANG, Zhen 2, ZHANG Li-hua 2, ZHANG Yu-kui 2 (1.Department of Sciences, Tianjin University of Science &Technology, Tianjin, ; 2. National Chromatographic R. &. A. Center, Dalian Institute of Chemical Physics, the Chinese Academic of Sciences, Dalian ,) Abstract: In this work, an analogue protein of human serum albumin, porcine serum albumin, was chosen as the template to prepare imprinted material. The resulted material, in principle, could recognize human serum albumin due to the both proteins homologue. The selectivity and specificity to template was first investigated. The materials were evaluated as the stationary phase of SPE. The results indicated that the imprinted materials could recognize the template protein from a mixture of four proteins (porcine serum albumin; cytochrome C; ribonuclease B and β -lactoglobulin), which could not been accomplished by non-imprinted materials prepared in parallel. The recognition mechanism indicated that the formation of multiple hydrogen bonds and the template proteins - complementary shape of the imprinting cavities created during the imprinting process provided specific recognition toward the template protein. Keywords: Molecularly Imprinted Polymers, Protein, Proteome 282

288 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 一 种 新 的 非 平 衡 传 质 模 型 对 柱 内 外 色 谱 峰 形 的 描 述 张 兴 华, 李 笑 玮, 孙 志 豪 ( 天 津 大 学 材 料 学 院, 天 津 ) 本 文 提 出 了 一 种 新 的 考 虑 了 溶 质 在 流 动 相 和 固 定 相 两 相 之 间 存 在 传 质 阻 力 的 非 平 衡 塔 板 理 论 模 型 该 模 型 认 为 溶 质 在 两 相 间 的 不 平 衡 传 质 过 程 必 须 遵 循 Fick 扩 散 定 律, 即 C=DN *(Cequ-Ccur), 传 递 的 方 向 受 浓 度 差 值 的 正 负 符 号 决 定 如 果 假 定 DN 对 两 相 间 的 所 有 不 同 的 浓 度 差 值 都 是 相 同 的 数 值 (0-1 之 间 ), 且 塔 板 高 度 不 变 ( 记 作 Hnon), 这 样 确 定 的 非 平 衡 塔 板 模 型 称 之 为 非 平 衡 传 质 模 型 本 文 借 助 于 计 算 机 程 序 用 该 理 论 作 为 指 导 模 拟 出 的 柱 内 外 色 谱 峰 形 的 变 化 1 前 言 为 了 解 释 色 谱 分 离 过 程, 马 丁 [1] 等 提 出 塔 板 理 论, 假 设 色 谱 柱 包 含 若 干 塔 板, 且 在 每 块 塔 板 上 溶 质 在 两 相 之 间 可 以 实 现 完 美 平 衡 在 大 多 数 学 者 看 来 这 种 假 设 的 平 衡 是 在 等 高 的 塔 板 上 瞬 间 完 成 的, 而 在 实 际 的 色 谱 分 离 过 程 中 由 于 流 动 相 流 动 速 度 分 离 组 分 的 种 类 色 谱 柱 品 质 等 一 系 列 因 素 的 影 响, 这 种 在 等 板 高 的 柱 长 上 完 成 平 衡 分 配 是 不 切 实 际 的 许 多 学 者 一 直 在 强 调 随 着 流 动 相 线 速 度 的 增 加 溶 质 在 两 相 间 的 传 质 越 来 越 偏 离 理 想 平 衡 分 配 的 情 况, 塔 板 理 论 对 流 出 曲 线 的 峰 形 描 述 也 越 来 越 偏 离 实 际 情 况, 所 以 要 对 塔 板 理 论 不 平 衡 分 配 过 程 进 行 修 正, 这 种 修 正 我 们 称 之 为 非 平 衡 塔 板 模 型, 例 如 Su-Cheng Pai[2] 的 包 矩 阵 模 型, 不 幸 的 是 该 模 型 由 于 k 在 基 本 假 设 上 存 在 着 错 误, 它 实 际 上 并 不 是 真 正 的 不 平 衡 塔 板 模 型, 而 只 是 一 个 改 变 了 容 量 因 子 k 计 算 方 法 的 经 典 塔 板 理 论 在 理 论 研 究 中 大 多 数 学 者 认 为 非 平 衡 塔 板 理 论 能 更 好 地 与 实 际 色 谱 分 离 过 程 相 符, 但 是 目 前 所 提 出 的 非 平 衡 理 论 通 常 借 助 于 偏 微 分 计 算, 这 类 非 平 衡 理 论 尽 管 科 学 严 谨 但 是 失 去 了 塔 板 理 论 简 洁 直 观 的 优 势, 本 文 正 是 从 传 质 的 角 度 提 出 了 一 个 真 正 的 非 平 衡 塔 板 理 论 非 平 衡 传 质 模 型, 该 模 型 保 留 了 塔 板 理 论 简 洁 直 观 的 优 势, 而 重 要 的 是 不 失 计 算 的 精 确 性 本 文 新 提 出 的 非 平 衡 传 质 模 型 模 拟 出 柱 内 外 色 谱 峰 形 的 变 化, 并 对 得 出 的 峰 形 对 称 性 问 题 进 一 步 讨 论 2 理 论 根 据 Adolf Fick 扩 散 第 一 定 律 : J = D A AB( dc z A / d ) (1) 不 论 从 形 式 还 是 理 论 上, 菲 克 定 律 与 溶 质 在 某 一 相 间 传 质 都 极 为 相 似, 这 也 奠 定 了 本 文 基 于 菲 克 定 律 提 出 的 新 的 非 平 衡 塔 板 理 论 的 坚 实 理 论 基 础, 对 于 这 一 理 论 形 态 的 结 合 至 今 还 未 曾 见 报 道 由 于 溶 质 在 两 相 中 分 配 时 存 在 着 传 质 阻 力, 许 多 作 者 都 将 认 为 这 一 点 不 可 忽 略 文 献 中, 处 理 动 力 学 传 递 过 程 中 的 浓 度 变 化 率 大 多 数 与 Georges Guiochona[3] 一 样, 即, 283

289 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 qi = k f, i ( qi qi ) (2) t q 这 里, i 是 浓 度 变 化 率, q i 是 平 衡 浓 度, q i 是 实 际 浓 度, q i q i 被 认 为 是 驱 动 力 t 不 难 发 现 这 种 偏 微 分 方 法 在 动 力 学 传 递 过 程 的 处 理 与 本 文 基 于 菲 克 定 律 得 出 的 非 平 衡 塔 板 理 论 浓 度 差 作 为 传 质 动 力 的 方 法 实 质 上 是 一 致 的, 只 是 理 论 出 发 点 不 一 样 经 计 算 得 出, 在 塔 板 的 某 一 相 中, mnon = DN * (mequ-mcur) + mcur (3) 这 里,mcur 是 传 质 前 目 前 相 中 的 溶 质 质 量,mnon 是 不 平 衡 传 质 后 相 中 溶 质 的 质 量,mequ 为 理 论 上 平 衡 传 质 后 相 中 溶 质 的 质 量 无 论 通 过 质 量 还 是 浓 度 变 化 传 质 的 本 质 是 一 样 的, 本 文 通 过 质 量 变 化 模 拟 溶 质 的 流 动 及 峰 形 变 化 整 个 过 程 可 以 用 下 表 来 描 述 : 表 1 不 平 衡 传 质 系 数 DN=0.5 时 非 平 衡 传 质 模 型 模 拟 过 程 assumed m=1, k'=2, DN=0.5 Plate number ( n ) jump number=0 distribution jump number=1 distribution jump number=2 solid mobile solid (0.667) 0 0 mobile (0.333) 0 0 solid mobile solid (0.2223) (0.4443) 0 mobile (0.1112) (0.2222) 0 solid mobile solid (0.1853) ( ) ( ) distribution mobile (0.0926) ( ) ( ) (jump number 栏 是 模 拟 每 次 流 动 相 跳 跃 过 程, 数 据 是 跳 跃 后 相 应 塔 板 上 两 相 的 溶 质 质 量,distribution 栏 括 号 外 的 数 据 是 当 不 平 衡 传 质 系 数 DN =0.5 时, 相 应 塔 板 上 两 相 分 配 后 的 溶 质 质 量, 括 号 内 的 数 据 是 理 想 分 配 完 全 平 衡 时 相 应 塔 板 上 两 相 的 溶 质 质 量 ) 3 非 平 衡 传 质 模 型 对 柱 内 外 色 谱 峰 形 的 描 述 3.1 调 整 参 数 DN 值 和 k 值 模 拟 出 的 柱 内 峰 形 变 化 E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E 图 1 同 一 k 值 不 同 DN 值 的 柱 内 色 谱 峰 形 曲 线 图 ( 假 定 塔 板 数 为 块, 分 别 为 k =0.2,1 时 的 柱 内 峰 形 曲 线, 在 每 张 图 中 峰 形 曲 线 非 平 衡 传 质 系 数 从 下 到 上 分 别 为 DN=0.2,0.5,0.8,1) 284

290 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 E E E E E E E E E E E E E E E 图 2 同 一 k 值 不 同 DN 值 的 柱 外 色 谱 峰 形 曲 线 图 ( 注 释 同 图 1) 在 图 1 和 图 2 中, 同 一 k 值 下, 峰 位 值 不 变, 说 明 DN 不 会 影 响 溶 质 的 保 留 本 质 但 是 同 时 峰 高 变 化 比 较 明 显, 随 着 DN 值 的 减 小, 峰 高 值 降 低 这 是 因 为 DN 值 越 小, 同 一 块 塔 板 上 溶 质 分 配 的 越 少, 更 倾 向 于 保 留 在 原 相 中 不 进 行 分 配, 从 而 会 造 成 峰 高 值 降 低, 同 时 分 配 的 不 完 全 使 得 谱 带 展 宽 每 张 图 中 均 有 DN=0.2 时 峰 高 最 小, 展 宽 最 严 重, 反 映 出 色 谱 柱 柱 效 下 降, 等 同 于 色 谱 柱 分 离 的 理 论 塔 板 数 下 降 3.2 峰 形 拖 尾 程 度 变 化 规 律 这 里 采 用 面 积 法 来 讨 论 峰 形 不 对 称 程 度 系 数 cacy(coefficient of asymmetry), 所 谓 不 对 称 程 度 系 数 是 峰 顶 点 左 侧 区 域 的 面 积 和 右 侧 区 域 的 面 积 之 差 与 总 峰 面 积 的 比 值, 即 c acy Al Ar = Al + Ar (4) 表 2 非 平 衡 传 质 模 型 对 柱 内 峰 形 不 对 称 程 度 系 数 值 的 计 算 cacy(%) k =0.25 k =0.50 k =1.00 k =2.00 k =4.00 DN= n=5000 DN= DN= DN= DN= n=10000 DN= DN= DN= 由 表 2 可 知, 同 一 塔 板 数 情 况 下, 当 k =1 时, 不 论 DN 如 何 取 值 cacy=0, 柱 内 峰 形 永 远 为 对 称 峰 同 一 DN 值 时, 当 k >1 时,cacy<0, 峰 为 拖 尾 峰, 随 着 k 值 的 增 大,cacy 值 逐 渐 降 低, 说 明 峰 的 拖 尾 程 度 增 大 ; 当 k <1 时,cacy>0, 峰 为 伸 舌 峰, 随 着 k 值 的 减 小,cacy 值 逐 渐 增 加, 说 明 峰 的 拖 尾 程 度 在 增 大, 这 一 点 与 范 国 樑 [4] 等 得 出 的 结 论 一 致 当 k 取 值 相 同 时, 随 着 DN 取 值 的 减 小,cacy 的 绝 对 值 逐 渐 增 大, 表 明 峰 的 不 对 称 程 度 在 加 大 这 是 因 为 随 着 DN 取 值 的 减 小 溶 质 传 质 的 不 平 衡 性 加 剧, 这 必 将 造 成 峰 形 曲 线 最 高 点 两 侧 浓 度 差 值 的 放 大, 使 得 峰 形 的 不 对 称 程 度 加 重 此 外, 同 一 塔 板 总 数 n 的 条 件 下, 随 着 DN 的 减 小, 使 得 柱 效 降 低, 造 成 峰 的 不 对 称 程 度 加 大 还 应 该 注 意 到 一 点,k 1=0.25 和 k 2=4,k 1=0.5 和 k 2=2 的 cacy 分 别 互 为 相 反 数, 则 说 明 其 中 两 峰 形 呈 镜 面 对 称 关 系, 进 一 步 用 数 据 证 明 了 k 1* k 2=1 时 峰 形 关 于 横 坐 标 x=n/2 的 对 称 分 布, 这 一 点 可 以 在 数 学 上 是 可 以 证 明 的 285

291 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 表 3 非 平 衡 传 质 模 型 对 柱 外 峰 形 不 对 称 程 度 系 数 值 的 计 算 cacy(%) k =0.25 k =0.50 k =1.00 k =2.00 k =4.00 DN= n=5000 DN= DN= DN= DN= n=10000 DN= DN= DN= 由 表 3 可 知, 不 论 参 数 k 和 DN 如 何 取 值 均 有 cacy<0, 说 明 流 出 曲 线 均 为 拖 尾 峰, 当 DN 值 相 同 时, 随 着 k 值 的 增 大,cacy 值 逐 渐 减 小, 可 见 峰 的 拖 尾 程 度 逐 渐 降 低, 这 一 点 可 以 通 过 范 国 樑 [4] 等 的 柱 出 口 效 应 给 出 很 好 的 解 释 此 外,DN 值 对 柱 外 峰 形 的 影 响 与 柱 内 相 似 4 结 论 本 文 基 于 菲 克 定 律 提 出 了 一 种 新 的 非 平 衡 塔 板 理 论 非 平 衡 传 质 模 型, 借 助 于 计 算 机 程 序 能 很 好 地 模 拟 出 柱 内 外 色 谱 峰 形 的 变 化 : 柱 内 存 在 伸 舌 峰, 对 称 峰 和 拖 尾 峰 三 种 峰 形 ; 柱 外 的 峰 形 均 为 拖 尾 峰 该 模 型 保 留 了 塔 板 理 论 简 洁 直 观 的 优 势, 而 重 要 的 是 不 失 计 算 的 精 确 性, 这 一 点 无 疑 在 某 种 程 度 上 拓 宽 了 塔 板 理 论 的 使 用 范 围, 对 以 后 非 平 衡 模 型 的 研 究 具 有 一 定 的 借 鉴 意 义 参 考 文 献 [1] A.J.P. Martin, R.L.M. Synge, Biochem. J. 35 (1941) [2] Su-Cheng Pai. Journal of Chromatography A. J. 988 (2003) [3] Georges Guiochon. Journal of Chromatography A. J. 965 (2002) [4] 范 国 樑, 宋 崇 林, 周 维 义 等. 分 析 化 学 研 究 简 报. J. 29 (2001) A new non-equilibrium mass transfer model for describing of peak shapes both inside and outside chromatographic column ZHANG Xing-hua LI Xiao-wei (The School of Material Science and Engineer, Tianjin University, Tianjin , China) Abstract: A new non-equilibrium plate model in which mass transfer resistance of the solute between the mobile phase and stationary phase is considered has been presented. This model is considered that the process of unbalanced mass transfer between two phases must follow Fick's diffusion law, viz. C=DN*(Cequ-Ccur),in which the direction of mass transfer is accordance with positive/negative sign of the concentration difference. If DN are the same values toward all the different concentration difference in two phases, and the plate height Hnon is kept unchanged, such a non-equilibrium plate model is called non-equilibrium mass transfer model. In this paper, basing on this new theory, changes of peak shapes both inside and outside chromatographic column are simulated with the aid of computer programs. Key words: Non-equilibrium plate theory; Fick's diffusion law; Non-equilibrium mass transfer model; Peak shapes 286

292 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 非 平 衡 塔 板 理 论 和 经 典 塔 板 理 论 在 描 述 色 谱 峰 形 方 面 的 定 性 比 较 张 兴 华, 李 登 科, 王 伟 ( 天 津 大 学 材 料 学 院, 天 津 ) 本 文 重 新 认 识 了 经 典 塔 板 理 论 并 提 出 了 一 种 新 的 非 平 衡 塔 板 理 论 非 平 衡 传 质 模 型, 同 时 比 较 了 非 平 衡 传 质 模 型 和 经 典 平 衡 塔 板 理 论 在 描 述 柱 内 外 色 谱 峰 形 方 面 的 区 别 程 度 通 过 峰 形 的 不 对 称 度, 峰 形 重 合 度 和 峰 形 浓 度 分 布 比 等 计 算 结 果 表 明, 二 者 在 描 述 色 谱 峰 形 上 是 没 有 差 异 的 1 前 言 塔 板 理 论 最 早 是 由 Martin 等 [1] 提 出, 他 们 假 设 : 色 谱 柱 包 含 若 干 塔 板, 且 在 每 块 塔 板 上 溶 质 在 两 相 之 间 可 以 实 现 完 美 平 衡 他 们 进 一 步 指 出 这 种 完 全 平 衡 在 色 谱 柱 任 何 一 点 上 都 是 无 法 建 立 的, 但 是 却 可 以 将 色 谱 柱 划 分 为 这 样 的 一 系 列 的 薄 层, 使 每 一 薄 层 相 当 于 一 个 理 论 塔 板, 这 样 每 一 薄 层 的 高 度 就 被 称 为 一 块 理 论 塔 板 的 等 效 高 度 (H.E.T.P.), 而 溶 质 通 过 这 样 的 一 块 理 论 塔 板 时 可 以 认 为 溶 质 是 以 平 均 浓 度 而 完 全 实 现 了 平 衡 对 于 这 一 点 却 没 有 引 起 我 们 的 足 够 重 视, 许 多 学 者 都 认 为 在 塔 板 理 论 中 的 塔 板 高 度 的 划 分 带 有 任 意 性 [2], 其 实 质 上 并 不 是 这 样, 更 不 是 很 多 学 者 从 塔 板 理 论 的 假 设 中 得 出 的 板 高 必 须 是 相 等 的 结 论, 因 为 马 丁 说 只 是 为 了 简 化 计 算 才 作 出 等 板 高 的 假 设, 而 在 今 天 计 算 能 力 高 度 发 达 的 今 天 我 们 没 有 必 要 这 样 简 化, 完 全 可 以 还 原 为 非 等 板 高 只 要 在 一 段 色 谱 柱 区 域 内 溶 质 以 平 衡 浓 度 达 到 平 衡 时, 就 可 以 看 作 为 一 块 板 高, 这 样 可 以 把 板 高 理 解 为 达 到 统 计 意 义 上 的 平 衡 所 需 的 色 谱 柱 长 度 在 相 等 板 高 的 基 础 上, 随 着 流 动 相 流 动 速 率 的 增 大 溶 质 在 两 相 中 的 分 配 越 来 越 偏 离 理 想 的 平 衡 分 配, 这 就 促 使 许 多 学 者 一 直 在 探 寻 着 非 平 衡 塔 板 模 型, 比 如 Su-Cheng Pai[3] 的 包 矩 阵 模 型, 遗 憾 的 是 他 在 基 础 假 设 上 存 在 着 错 误, 并 没 有 达 到 非 平 衡 塔 板 模 型 效 果 本 文 立 足 于 非 平 衡 塔 板 理 论 的 特 点, 根 据 菲 克 定 律, 提 出 了 一 种 新 的 非 平 衡 塔 板 理 论, 这 里 称 之 为 非 平 衡 传 质 模 型 本 文 在 两 个 理 论 在 描 述 色 谱 峰 形 方 面 比 较 了 特 定 参 数 下 的 峰 形 不 对 称 度, 峰 形 重 合 度 和 峰 形 浓 度 分 布 比 等 计 算 结 果, 可 见 在 描 述 色 谱 峰 形 方 面 二 者 是 没 有 差 异 的 2 两 个 理 论 在 峰 形 描 述 上 的 定 性 比 较 2.1 峰 形 不 对 称 度 的 比 较 由 于 模 拟 出 柱 内 柱 外 曲 线 具 有 相 似 性, 因 此 本 文 仅 对 柱 外 曲 线 加 以 说 明 ( 下 同 ) 由 表 1,2,3 可 知, 当 平 衡 塔 板 理 论 中 的 参 数 和 非 平 衡 传 质 模 型 的 参 数 所 得 到 峰 形 曲 线 相 似 性 极 高, 对 于 这 一 点 我 们 可 以 定 性 看 出 只 要 两 个 参 数 满 足 一 定 关 系 式, 必 将 可 以 把 两 个 理 论 等 同 起 来 287

293 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 表 1 两 个 理 论 模 拟 出 的 柱 外 流 出 曲 线 不 对 称 度 计 算 结 果 的 对 比 (%) 塔 板 数 参 数 k = 0.25 k = 0.5 k = 1 k = 4 NE= n=5000 DN=2/ NE= DN=2/ NE= n=10000 DN=2/ NE= DN=2/ c A l A r = Α l + A r < 注 > 不 对 称 度 计 算 式 : a cy 0 0, 即 峰 顶 点 左 侧 区 域 的 面 积 和 右 侧 区 域 的 面 积 之 差 与 总 峰 面 积 的 比 值 2.2 峰 形 浓 度 分 布 比 的 比 较 表 2 两 个 理 论 模 拟 出 的 柱 外 流 出 曲 线 峰 形 浓 度 分 布 比 计 算 结 果 的 对 比 塔 板 数 参 数 k = 0.5 k = 1 k = 2 k = 4 NE=2(i=600) DN=2/3(i=600) n=5000 标 准 值 (i=600) NE=4(i=300) DN=2/5(i=300) 标 准 值 (i=300) NE=2(i=600) DN=2/3(i=600) n=10000 标 准 值 (i=600) NE=4(i=300) DN=2/5(i=300) 标 准 值 (i=300) i < 注 > 计 算 标 准 值 的 公 式 : n ' 2.3 峰 形 重 合 度 的 比 较 T 1 T ' n 1 2 k i 1 + k '

294 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 表 3 两 个 理 论 模 拟 出 的 柱 外 流 出 曲 线 重 合 度 计 算 结 果 的 对 比 ( ) 塔 板 数 参 数 k = 0.5 k = 1 k = 2 k = 4 n=5000 n=10000 NE=2 DN=2/3 NE=4 DN=2/5 NE=2 DN=2/3 NE=4 DN=2/ < 注 > A1 A2 A1 A2 δ A A = 1 2 A, 这 里 A1,A2 分 别 是 两 个 峰 形 的 面 积, A 1 2 A1 A2 和 分 别 是 两 个 峰 面 积 的 并 集 和 交 集 3 结 论 平 衡 塔 板 理 论 和 非 平 衡 塔 板 理 论 一 直 倍 受 色 谱 理 论 研 究 者 的 关 注, 本 文 对 两 种 理 论 做 了 深 层 次 地 探 索 和 研 究 在 对 色 谱 的 柱 内 外 峰 形 描 述 的 比 较 过 程 中 ( 本 文 以 柱 外 峰 形 为 例 ) 发 现 在 某 些 参 数 下, 所 模 拟 出 的 峰 形 相 似 性 极 高, 说 明 两 个 理 论 是 没 有 差 异 的 但 是, 至 于 两 个 理 论 参 数 之 间 存 在 着 什 么 样 的 定 量 的 数 学 关 系 还 仍 然 有 待 于 探 索 参 考 文 献 [1] A.J.P. Martin, R.L.M. Synge. Biochem. J. 35 (1941) [2] Georges Guiochon. Journal of Chromatography A. J. 965 (2002) [3] Su-Cheng Pai. Journal of Chromatography A. J. 988 (2003) [4] 范 国 樑, 宋 崇 林, 周 维 义 等. 分 析 化 学 研 究 简 报. J. 29 (2001) A comparison of between a new non-equilibrium plate theory and classical plate theory reconsidered in describing peaks shape ZHANG Xing-hua LI Deng-ke (The School of Material Science and Engineer, Tianjin University, Tianjin , China) Abstract: In this paper, classical plate theory is reconsidered and a new non-equilibrium plate model- non-equilibrium mass transfer model is presented, then difference of peak shapes that are respectively described by two theories is compared. Finally, it is conclude that, there is no difference between two theory in describing peak shapes by the calculation results of coefficient of asymmetry, concentration ratio of peak shape and contact ratio. Key words: Classical plate theory; Non-equilibrium plate model; Non-equilibrium diffusion model; Peak shapes 289

295 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 非 平 衡 塔 板 理 论 和 经 典 塔 板 理 论 在 描 述 色 谱 峰 形 方 面 的 数 学 关 系 的 定 量 研 究 张 兴 华, 敖 敏 ( 天 津 大 学 材 料 学 院, 天 津 ) 本 文 对 新 的 非 平 衡 塔 板 理 论 ( 非 平 衡 传 质 模 型 ) 和 经 典 塔 板 理 论 在 描 述 色 谱 峰 形 方 面 的 数 学 关 系 作 了 定 量 研 究, 最 后 得 出 结 论 : 如 果 非 平 衡 扩 散 系 数 DN 同 折 合 塔 板 系 数 NE 之 间 存 在 数 学 关 系 式 :NE=2/DN-1 时, 二 者 在 描 述 色 谱 峰 形 上 是 没 有 差 异 的 1 DN 和 NE 数 学 关 系 的 推 倒 在 用 新 的 非 平 衡 塔 板 理 论 ( 非 平 衡 传 质 模 型 ) 与 经 典 塔 板 理 论 [1] 在 模 拟 峰 形 的 过 程 中 发 现, 当 两 个 理 论 的 参 数 DN 和 NE 取 为 某 组 对 应 数 值 时, 所 得 到 的 峰 形 重 合 性 极 好 以 此 为 原 则, 在 固 定 其 中 一 个 参 数 时 不 断 调 整 另 一 个 参 数 取 值, 经 过 数 次 逼 近, 使 得 两 个 峰 形 的 重 合 性 在 感 官 程 度 上 达 到 最 大 程 度 的 重 合, 此 时 记 录 下 这 组 对 应 的 参 数 取 值 表 1 峰 形 重 合 时 参 数 DN 和 NE 的 取 值 k =1 NE DN k =5 NE DN 表 1 列 出 了 在 取 定 DN 值 不 断 调 整 NE 取 值, 使 得 峰 形 达 到 最 大 程 度 重 合 时 对 应 的 参 数 取 值, 可 以 看 出 k =1 和 k =5 所 得 到 的 对 应 参 数 对 不 变, 可 此 可 以 证 明 k 对 DN 和 NE 之 间 的 关 系 是 没 有 影 响 的 此 外, 此 时 对 应 的 参 数 对 是 在 是 在 感 官 程 度 上 达 到 峰 形 重 合 度 最 大 的 情 况 下 得 到, 所 以 与 精 确 的 NE 值 对 DN 值 的 参 数 对 会 存 在 着 一 定 的 误 差 图 1 为 NE 值 对 DN 值 的 曲 线 作 图, 可 以 得 出 随 着 DN 值 的 不 断 增 大,NE 值 成 下 降 的 趋 势 同 时, 由 Van Deemter 方 程 [2] 可 知, 当 分 离 达 到 最 佳 条 件 时, 传 质 达 到 平 衡 所 需 的 板 高 最 小, 此 时 分 离 的 柱 效 最 高, 而 实 际 情 况 下, 这 是 不 可 能 达 到 的, 板 高 的 增 大 会 造 成 柱 效 下 降, 谱 峰 展 宽 这 时 板 高 的 增 大 过 程 正 是 本 文 中 折 合 塔 板 数 NE 取 值 增 大 的 过 程, 从 峰 的 不 对 称 性 以 及 峰 高 下 降 等 现 象 也 证 实 了 这 个 过 程 中 柱 效 是 在 不 断 下 降 的 在 用 非 平 衡 扩 散 模 型 模 拟 峰 形 变 化 时, 我 们 注 意 到 随 着 参 数 DN 取 值 的 减 小, 溶 质 参 与 分 配 的 质 量 减 少, 也 会 使 得 峰 形 展 宽 以 及 峰 的 不 对 称 性 增 强, 这 也 是 一 个 柱 效 下 降 的 过 程 显 然, 当 DN 和 NE 取 值 均 为 1 的 时 候, 是 完 全 等 同 的 理 想 的 经 典 塔 板 理 论 此 时, 随 着 DN 的 减 小 与 NE 的 增 大 对 峰 形 趋 势 的 影 响 是 相 同 的, 都 是 引 起 峰 高 降 低 和 不 对 称 度 加 大, 同 时 是 个 柱 效 下 降 的 过 程 可 见, 两 个 参 数 存 在 一 种 负 相 关 的 关 系 鉴 于 图 1 所 反 映 的 NE 值 对 DN 值 的 曲 线 趋 势 以 及 以 上 理 论 分 析 得 出 的 的 参 数 对 负 相 关 关 系, 对 NE 与 DN 的 倒 数 作 回 归 分 析, a N E = b D N 290

296 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 y = x 图 1 NE 关 于 DN 的 回 归 分 析 图 2 NE 关 于 DN 倒 数 的 回 归 分 析 图 由 图 2 得 出 NE 关 于 DN 倒 数 之 间 是 一 种 线 性 关 系, 其 中 a= ,b= , 即 回 归 式 为, N E = (1) D N 当 随 着 参 数 对 数 不 断 增 加 时 发 现 a 的 取 值 更 接 近 于 2,b 的 取 值 更 接 近 于 1, 因 此 上 式 简 化 式 为, 2 N E = 1 (2) D 2 简 化 式 的 证 明 N 表 2 回 归 式 与 简 化 式 偏 差 百 分 数 的 比 较 NE ( E% ) DN( 对 应 值 ) DN( 回 归 式 ) DN( 简 化 式 ) 回 归 式 偏 差 (E%) 简 化 式 偏 差 (E%) < 注 > 回 归 式 偏 差 E% 为 DN( 回 归 式 ) 与 DN( 对 应 值 ) 的 差 值 所 占 DN( 对 应 值 ) 的 百 分 数, 回 归 式 偏 差 同 理 由 表 2 可 知, 简 化 式 总 的 偏 差 ( E% ) 更 小, 即 用 简 化 式 所 求 得 的 DN 值 更 接 近 于 感 官 达 到 峰 形 重 合 度 最 大 时 对 应 的 DN( 对 应 值 ), 由 此 说 明 将 回 归 式 作 以 上 简 化 是 合 理 的 3 用 简 化 式 得 到 的 参 数 对 的 峰 形 重 合 度 2.00E E E E E E E E E E E 图 3 用 简 化 式 得 到 的 参 数 对 模 拟 出 的 的 柱 外 峰 形 重 合 程 度 291

297 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 图 3 中 的 蓝 色 峰 形 曲 线 是 用 平 衡 塔 板 理 论 通 过 改 变 板 高 NE 变 化 模 拟 出 的 柱 外 峰 形 曲 线, 从 上 往 下 依 次 是 NE=20,25,40,50; 红 色 峰 形 曲 线 是 用 非 平 衡 传 质 模 型 通 过 改 变 不 平 衡 传 质 系 数 DN 模 拟 出 的 柱 外 峰 形 曲 线, 从 上 到 下 依 次 是 DN = , , , , 且 以 上 所 有 峰 形 曲 线 均 是 在 n=5000,k = 1 时 得 到 的 对 以 上 四 组 图 形 计 算 曲 线 的 重 合 度 分 别 为 (* 10-5 ):1.15,1.25,1.19,1.12, 可 以 看 出 即 使 在 传 质 极 端 不 平 衡 的 条 件 下, 只 要 满 足 简 化 式 4-2 对 应 的 参 数 对 所 模 拟 出 的 峰 形 重 合 的 精 确 性 仍 然 极 高, 同 时 这 也 证 明 了 式 4-2 的 准 确 性, 能 通 过 简 单 的 数 学 转 换 很 好 地 把 两 个 理 论 等 效 起 来 4 结 论 本 文 对 新 的 非 平 衡 塔 板 理 论 ( 非 平 衡 传 质 模 型 ) 和 经 典 塔 板 理 论 在 描 述 色 谱 峰 形 方 面 的 定 量 数 学 关 系 作 了 研 究, 在 对 色 谱 的 柱 内 外 峰 形 描 述 的 比 较 过 程 中 ( 本 文 以 柱 外 峰 形 为 例 ) 推 导 出 当 两 个 理 论 中 的 参 数 满 足 NE=2/DN-1 时, 所 模 拟 出 的 峰 形 重 合 度 极 高, 说 明 此 时 两 个 理 论 是 完 全 等 效 的 有 了 这 个 数 学 表 达 式, 可 以 将 两 个 理 论 作 任 意 转 换, 这 一 点 无 疑 是 对 马 丁 的 塔 板 理 论 中 关 于 传 质 平 衡 问 题 和 板 高 高 度 问 题 一 个 很 好 的 证 明 和 补 充 同 时 遵 循 这 个 转 换 的 原 则, 在 实 际 工 作 中 完 全 可 以 用 平 衡 的 塔 板 理 论 代 替 非 平 衡 塔 板 理 论, 这 一 点 必 将 给 研 究 工 作 带 来 极 大 的 便 利 参 考 文 献 [1] A.J.P. Martin, R.L.M. Synge. Biochem. J. 35 (1941) [2] J.J. van Deemter, F.J. Zuiderweg, A. Klinkenberg, Chem.Eng. Sci. 5 (1956) A quantitative study of mathematic relationship between a new non-equilibrium plate theory and classical plate theory in describing chromatographic peak shapes ZHANG Xing-hua AO Min (The School of Material Science and Engineer, Tianjin University, Tianjin , China) Abstract: In this paper, the relationship between a new non-equilibrium plate model (non-equilibrium mass transfer model) and classical plate theory in describing chromatographic peak shapes is quantitatively studied. Finally, it is concluded that, if there is a mathematical relationship between non-equilibrium mass transfer coefficient DN and the number of equivalent plate NE : NE=2/DN-1,there is no difference between two theory in describing peak shapes. Key words: Classical plate theory; Non-equilibrium plate model; Non-equilibrium mass transfer model; Peak shapes 292

298 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 在 线 速 度 改 变 的 条 件 下 塔 板 理 论 对 柱 内 外 色 谱 峰 形 的 描 述 张 兴 华 ( 天 津 大 学 材 料 学 院, 天 津 ) 本 文 通 过 速 率 理 论 在 不 同 的 线 速 度 下 确 定 了 变 化 的 板 高, 并 把 这 样 得 到 的 板 高 用 到 经 典 塔 板 理 论 中, 以 此 模 拟 出 柱 内 外 峰 形 变 化 1 前 言 塔 板 理 论 最 早 是 由 Martin 等 [1] 提 出, 他 们 假 设 : 色 谱 柱 包 含 若 干 塔 板, 且 在 每 块 塔 板 上 溶 质 在 两 相 之 间 可 以 实 现 完 美 平 衡 他 们 进 一 步 指 出 这 种 完 全 平 衡 在 色 谱 柱 任 何 一 点 上 都 是 无 法 建 立 的, 但 是 却 可 以 将 色 谱 柱 划 分 为 这 样 的 一 系 列 的 薄 层, 使 每 一 薄 层 相 当 于 一 个 理 论 塔 板, 这 样 每 一 薄 层 的 高 度 就 被 称 为 一 块 理 论 塔 板 的 等 效 高 度 (H.E.T.P.) 但 是 马 丁 只 是 这 样 定 性 地 给 出 了 理 论 塔 板 高 度 的 定 义, 并 没 有 指 出 实 际 的 塔 板 高 度 是 受 哪 些 因 素 影 响 的 范 蒂 姆 特 [2] 在 速 率 理 论 中 具 体 地 指 出 了 影 响 板 高 的 一 系 列 因 素, 这 一 点 无 疑 是 对 塔 板 理 论 关 于 板 高 变 化 的 一 个 很 好 的 补 充 本 文 通 过 Van Deemter 方 程 中 线 速 度 的 变 化 得 到 变 化 的 板 高 值, 借 助 于 电 脑 程 序 把 得 到 的 板 高 值 嫁 接 到 经 典 塔 板 理 论 上, 以 此 来 模 拟 柱 内 外 色 谱 峰 形 的 变 化 2 理 论 由 简 化 的 Van Deemter 方 程 [2], B H ( u) = A + + Cu (1) u 这 里 的 u 为 平 均 线 速 度 A,B,C 均 为 常 数 Van Deemter 方 程 可 知, 当 平 均 线 速 度 改 变 时, 必 将 引 起 板 高 的 改 变, 且 u 取 一 定 数 值 时 存 在 一 个 最 小 的 理 想 板 高 值 由 塔 板 理 论 可 知, 板 高 的 改 变 影 响 组 分 在 塔 板 上 的 平 衡 分 配, 必 将 造 成 柱 效 的 变 化 本 文 对 Van Deemter 方 程 曲 线 的 右 半 枝 作 了 研 究, 线 速 度 u 的 增 加 必 将 造 成 板 高 的 增 大, 通 过 电 脑 程 序 改 变 线 速 度 u 的 取 值 最 终 模 拟 出 柱 内 外 峰 形 变 化 3 线 速 度 改 变 的 塔 板 理 论 对 柱 内 外 色 谱 峰 形 的 描 述 3.1 不 同 参 数 H(u) 值 和 k 值 模 拟 出 的 柱 内 外 峰 形 变 化 1.80E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E 图 1 同 一 k 值 不 同 H(u) 值 的 柱 内 色 谱 峰 形 曲 线 图 ( 假 设 总 塔 板 数 n 为 10000, 分 别 为 k =0.5,1 时 的 柱 内 峰 形 曲 线 在 每 张 图 中 峰 形 曲 线 的 折 合 塔 板 数 从 上 到 下 分 别 为 H(u)=1,2,4,10) 293

299 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 1.00E E E E E E E E E E E E E E E E E E E 图 2 同 一 k' 值 不 同 H(u) 值 的 柱 外 色 谱 峰 形 曲 线 图 ( 注 释 同 图 1) 在 图 1 和 图 2 中, 同 一 k 值 下,H(u) 的 增 大, 所 模 拟 出 的 峰 形 峰 高 变 小, 同 时 峰 的 展 宽 加 大 此 时, 是 由 于 线 速 的 增 大 引 起 塔 板 高 度 的 增 大, 使 得 组 分 在 塔 板 上 分 配 的 的 不 平 衡 加 剧, 造 成 柱 效 的 下 降 3.2 峰 形 拖 尾 程 度 变 化 规 律 这 里 采 用 面 积 法 来 讨 论 峰 形 不 对 称 程 度 系 数 cacy(coefficient of asymmetry), 所 谓 不 对 称 程 度 系 数 是 峰 顶 点 左 侧 区 域 的 面 积 和 右 侧 区 域 的 面 积 之 差 与 总 峰 面 积 的 比 值, 即 Al Ar cacy = (2) Α l + Ar 由 表 1 可 知, 首 先, 柱 内 存 在 着 伸 舌 峰, 对 称 峰 和 拖 尾 峰 三 种 峰 形, 这 一 点 与 范 国 樑 [3] 等 得 出 的 结 论 一 致 其 次, 同 一 塔 板 总 数 n 的 条 件 下, 随 着 H(u) 的 增 大, 造 成 峰 的 不 对 称 程 度 加 大, 这 一 点 是 由 于 程 序 中 给 定 的 线 速 度 u 增 大 的 引 起 的 还 应 该 注 意 到 一 点,k 1=0.25 和 k 2=4,k 1=0.5 和 k 2=2 的 cacy 分 别 互 为 相 反 数, 则 说 明 其 中 两 峰 形 呈 镜 面 对 称 关 系, 进 一 步 用 数 据 证 明 了 k 1* k 2=1 时 峰 形 关 于 横 坐 标 x=n/2 的 对 称 分 布, 这 一 点 可 以 在 数 学 上 是 可 以 证 明 的 表 1 平 衡 塔 板 理 论 对 柱 内 峰 形 不 对 称 程 度 系 数 值 的 计 算 cacy(%) k =0.25 k =0.50 k =1.00 k =2.00 k =4.00 H(u) = n=5000 H(u) = H(u) = H(u) = H(u) = n=10000 H(u) = H(u) = H(u) = 由 表 2 可 知, 不 论 参 数 k 和 H(u) 如 何 取 值, 均 有 cacy<0, 说 明 所 得 的 峰 形 均 为 拖 尾 峰, 当 H(u) 值 相 同 时, 随 着 k 值 的 增 大,cacy 值 逐 渐 减 小, 可 见 峰 的 拖 尾 程 度 逐 渐 降 低, 这 一 点 可 以 通 过 范 国 樑 [3] 等 的 柱 出 口 效 应 给 出 很 好 的 解 释 294

300 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 表 2 平 衡 塔 板 理 论 对 柱 外 峰 形 不 对 称 程 度 系 数 值 的 计 算 cacy(%) k =0.25 k =0.50 k =1.00 k =2.00 k =4.00 H(u) = n=5000 H(u) = H(u) = H(u) = H(u) = n=10000 H(u) = H(u) = H(u) = 结 论 本 文 以 速 率 理 论 为 指 导, 通 过 改 变 平 均 线 速 度 u 值 得 到 变 化 的 板 高 值 H(u), 并 在 该 板 高 前 提 下 借 助 于 电 脑 程 序 通 过 塔 板 理 论 模 拟 出 柱 内 外 色 谱 柱 峰 形 变 化, 并 对 得 到 的 峰 形 进 行 了 对 称 性 的 讨 论, 得 出 结 论 : 在 柱 内 存 在 伸 舌 峰, 对 称 峰 和 拖 尾 峰 三 种 峰 形 ; 在 柱 外 的 色 谱 峰 形 都 为 拖 尾 峰 本 文 是 对 速 率 理 论 和 塔 板 理 论 的 有 效 结 合, 可 以 清 晰 地 看 出 线 速 度 是 如 何 应 该 色 谱 峰 形 变 化 的 参 考 文 献 [1] A.J.P. Martin, R.L.M. Synge, Biochem. J. 35 (1941) [2] J.J. van Deemter, F.J. Zuiderweg, A. Klinkenberg, Chem.Eng. Sci. 5 (1956) [3] 范 国 樑, 宋 崇 林, 周 维 义 等. 分 析 化 学 研 究 简 报. J. 29 (2001) Plate theory for describing of peak shapes both inside and outside chromatographic column in the condition of various line velocities ZHANG Xing-hua (The School of Material Science and Engineer, Tianjin University, Tianjin , China) Abstract: The changed plate length is determined by the conditions of various line velocity which is determined by rate theory, and such plates are used in the classical plate theory for simulating peak shapes both inside and outside chromatographic column with the aid of computer programs. Key words: Velocity theory, Plate theory, Plate length, Peak shapes 295

301 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 有 机 无 机 复 合 聚 合 物 整 体 柱 的 制 备 及 其 在 分 离 蛋 白 中 的 应 用 杨 更 亮 1, 2, 白 立 改 1, 2 (1. 河 北 省 药 物 质 量 研 究 与 控 制 重 点 实 验 室, 河 北 保 定 ;2. 河 北 大 学 药 学 院, 河 北 保 定 ) 近 年 来, 高 效 液 相 色 谱 方 法 (HPLC) 在 分 离 分 析 领 域 中 扮 演 着 越 来 越 重 要 的 角 色 而 其 中, 色 谱 柱 是 整 个 色 谱 系 统 的 核 心, 聚 合 物 整 体 柱 的 开 发 和 应 用 弥 补 了 传 统 的 填 充 柱 的 诸 多 缺 点 目 前 所 报 道 的 聚 合 物 整 体 柱 虽 然 对 蛋 白 质 也 具 有 较 好 的 分 离 能 力, 但 是 聚 合 物 的 结 构 难 以 控 制 均 匀, 且 聚 合 完 成 后 需 要 进 行 进 一 步 的 修 饰, 步 骤 繁 琐, 耗 时 耗 力 [1,2] 本 文 给 出 了 一 种 新 型 有 机 无 机 复 合 聚 合 物 整 体 柱 的 制 备 方 法, 该 制 备 过 程 利 用 原 子 转 移 自 由 基 聚 合 (ATRP) 机 理 进 行 聚 合, 可 以 通 过 改 变 单 体 引 发 剂 以 及 催 化 剂 的 比 例 来 控 制 自 由 基 的 活 性, 从 而 获 得 结 构 均 匀 的 聚 合 物 实 验 表 明 聚 合 完 成 后 无 需 再 进 行 修 饰 即 可 对 蛋 白 质 进 行 快 速 分 离 分 析 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 和 试 剂 安 捷 伦 1100 系 列 高 效 液 相 色 谱 仪 ( 安 捷 伦 公 司, 美 国 ); 乙 烯 基 酯 树 脂 由 双 酚 A 缩 水 甘 油 醚 制 备 而 得 ; 十 二 醇 亚 硫 酸 氢 钠 氯 化 亚 铁 四 氯 化 碳 ( 天 津 市 科 密 欧 化 学 试 剂 有 限 公 司 ); 所 有 试 剂 均 为 分 析 纯, 实 验 中 所 用 水 均 为 三 次 蒸 馏 水 1.2 聚 合 物 整 体 柱 的 制 备 将 乙 烯 基 酯 树 脂 四 氯 化 碳 十 二 醇 氯 化 亚 铁 亚 硫 酸 氢 钠 和 水 按 一 定 比 例 加 入 试 管 中, 超 声 混 匀, 倾 倒 于 不 锈 钢 色 谱 柱 管 中, 于 70 反 应 24 小 时, 反 应 完 成 后 以 甲 醇 在 线 冲 洗 24 小 时 以 除 去 致 孔 剂 和 其 他 未 反 应 完 全 的 可 溶 物 即 得 到 有 机 无 机 复 合 物 整 体 柱 1.3 聚 合 物 整 体 柱 作 为 HPLC 的 固 定 相 对 人 免 疫 球 蛋 白 的 分 离 本 实 验 对 人 血 浆 中 的 人 免 疫 球 蛋 白 进 行 了 分 离 自 制 整 体 柱 : mm i.d.; 检 测 波 长 :280 nm; 流 速 :1.0 ml/min 流 动 相 的 选 择 分 别 考 察 了 缓 冲 盐 的 种 类 和 浓 度 以 及 ph 值 对 人 免 疫 球 蛋 白 (IgG) 在 该 整 体 柱 上 的 保 留 行 为 的 影 响 人 血 浆 中 人 免 疫 球 蛋 白 的 分 离 以 自 制 的 有 机 无 机 复 合 物 整 体 柱 B( mm i.d.) 为 固 定 相, 分 别 以 水 和 磷 酸 氢 二 钠 水 溶 液 为 流 动 相 进 行 梯 度 洗 脱, 对 人 血 浆 中 的 人 免 疫 球 蛋 白 进 行 分 离, 并 与 本 实 验 室 之 前 制 备 的 聚 乙 烯 基 酯 树 脂 整 体 柱 A( mm i.d.) 对 人 血 浆 中 的 人 免 疫 球 蛋 白 的 分 离 进 行 了 对 比 2 结 果 2.1 聚 合 物 整 体 柱 制 备 条 件 的 优 化 通 过 改 变 单 体 引 发 剂 催 化 剂 的 比 例, 制 得 一 系 列 不 同 条 件 下 的 聚 合 物 整 体 柱, 并 分 别 利 用 傅 里 叶 红 外 光 谱 和 电 子 扫 描 电 镜 对 上 述 聚 合 物 进 行 了 官 能 团 的 确 定 及 聚 合 物 形 态 结 构 的 确 定 红 外 吸 收 谱 图 结 果 表 明 : 改 变 单 体 引 发 剂 催 化 剂 的 比 例 对 聚 合 物 的 官 能 团 基 本 无 影 响, 且 1510 cm -1 显 示 苯 环 的 振 动,1725 cm -1 处 是 酯 羰 基 的 强 吸 收 带,2960 cm -1 处 红 296

302 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 外 吸 收 峰 为 聚 合 物 中 -CH2- 的 C-H 的 伸 缩 振 动 图 1 聚 合 物 整 体 柱 的 红 外 扫 描 图 而 扫 描 电 镜 结 果 则 表 明 : 改 变 单 体 引 发 剂 催 化 剂 的 比 例 对 聚 合 物 的 形 态 结 构 则 影 响 较 大 : 可 以 由 颗 粒 堆 积 致 孔 (e,g) 甚 至 无 孔 (d) 到 基 本 具 备 骨 架 结 构 (f) 的 聚 合 物 其 红 外 光 谱 图 如 图 1 所 示, 扫 描 电 镜 图 如 图 2 所 示 图 2 聚 合 物 整 体 柱 的 SEM 结 构 表 征 图 2.2 有 机 - 无 机 复 合 聚 合 物 整 体 柱 对 人 血 浆 中 IgG 的 分 离 色 谱 图 人 血 浆 中 人 免 疫 球 蛋 白 的 分 离 如 图 3 所 示 由 图 可 知 以 自 制 的 有 机 无 机 复 合 聚 合 整 体 柱 无 需 进 行 化 学 修 饰 作 为 HPLC 的 固 定 相, 即 可 以 实 现 对 人 血 浆 中 人 免 疫 球 蛋 白 的 快 速 高 效 的 分 离 而 以 前 报 道 的 聚 乙 烯 基 酯 树 脂 整 体 柱 [3, 4] 不 经 化 学 修 饰 则 对 人 血 浆 中 的 人 免 疫 球 297

303 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 蛋 白 无 分 离 能 力 3 讨 论 该 聚 合 物 整 体 柱 的 制 备 利 用 了 原 子 转 移 自 由 基 聚 合 (ATRP) 的 原 理, 并 首 次 采 用 四 氯 化 碳 和 亚 硫 酸 氢 钠 为 有 机 - 无 机 联 合 引 发 剂 引 发 聚 合, 改 善 了 传 统 的 原 位 图 3 人 血 浆 中 免 疫 球 蛋 白 的 色 谱 分 离 图 (B: 有 机 无 机 复 自 由 基 聚 合 的 链 转 移 链 终 止 所 导 致 的 分 子 合 聚 合 物 整 体 柱,A: 聚 乙 烯 基 酯 树 脂 聚 合 物 整 体 柱 ) 量 分 布 范 围 宽 聚 合 物 不 均 匀 等 缺 点, 改 善 了 聚 合 物 整 体 柱 的 颗 粒 堆 积 致 孔, 得 到 了 具 有 较 为 均 匀 的 骨 架 结 构 的 有 机 无 机 复 合 聚 合 物 整 体 柱, 且 无 需 再 经 过 化 学 修 饰 即 可 对 蛋 白 进 行 快 速 高 效 的 分 离 分 析 参 考 文 献 [1] F. Svec, E.C. Peters, D. Sykora, J.M.J. Frechet, J. Chromatogr. A, 2000, 3: 887. [2] L.T. Arenas, T. A. S. Aguirre, A. Langaro etc., Polymer 2003, 44: [3] L. G. Bai, H. Y. Liu, G. L. Yang etc., Chinese journal of chemistry, 2008, 26 (11): [4] G. L. Yang, H. Y. Liu, L. G. Bai etc. microporous and mesoporous materials, 2008, 112: Preparation of a Novel Hybrid Organic-Inorganic Monolith for the Separation of IgG from Human Plasma by HPLC Geng-liang Yang 1, 2 Li-gai Bai 1, 2 (1: Key Laboratory of Pharmaceutical Quality Control of Hebei Province, 2: Pharmaceutical Sciences college of Hebei University, Baoding, Hebei, , China) Abstract: Recently, high performance liquid chromatography (HPLC) has played a very important role in the area of separation and analysis. Chromatographic column is the core of the system. The devolopment and application of polymeric monolithic column offset the defects of traditional packed column. The disadvantage from the reported monolith previously is the pores which are created by accumulation of particles and the structure. Nevertheless, the previous monolith needs to be modified by chemical method when used as HPLC stationary phase to separate protein which is very cockamamie and time-consuming. A novel hybrid organic-inorganic monolith has been prepared by atom transfer radical polymerization (ATRP) in the current work. The optimization condition which was realized by changing the ratio of monomer, initiator and catalyst can lead a uniform skeleton structure. According to the result, the hybrid organic-inorganic monolith can be used as HPLC stationary phase without being modified to separate IgG from human plasma in a short time. Key words: Organic-inorganic monolith; Vinyl ester resin; HPLC; IgG ELSD 简 介 及 在 生 物 碱 成 分 分 析 中 的 应 用 赵 辉 1 3, 亓 晖 2, 朱 元 元 298

304 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 ( 南 开 大 学 药 学 院, 天 津 ) 高 效 液 相 色 谱 (High Performance Liquid Chromatography, 简 称 HPLC) 已 经 在 化 学, 生 化, 药 物, 环 保 及 工 业 分 析 中 普 遍 使 用, 所 分 析 的 样 品 范 围 也 越 来 越 广 高 效 液 相 色 谱 以 其 灵 敏 快 捷 操 作 方 便, 适 用 范 围 广 等 优 点, 已 经 广 泛 应 用 于 中 药 的 有 效 成 分 含 量 测 定 组 分 分 析 指 纹 图 谱 等 方 面 检 测 器 是 液 相 色 谱 仪 的 关 键 部 件 之 一, 高 效 液 相 色 谱 检 测 器 中 除 了 最 常 用 的 紫 外 检 测 器 之 外, 还 有 荧 光 检 测 器, 示 差 折 光 检 测 器, 蒸 发 光 散 射 检 测 器, 质 谱 检 测 器, 极 谱 检 测 器, 核 磁 共 振 检 测 器 等, 本 文 主 要 介 绍 蒸 发 光 检 测 器 的 应 用 1 蒸 发 光 检 测 器 (Evaporative Light Scattering Detect,ELSD) 简 介 1.1 ELSD 的 工 作 原 理 在 辅 助 气 体 作 用 下, 将 流 动 相 雾 化, 形 成 的 液 雾 ( 雾 珠 ) 通 过 加 热 而 蒸 发, 此 时 溶 解 在 流 动 相 中 不 易 挥 发 的 样 品 即 形 成 颗 粒 物, 这 些 颗 粒 物 由 辅 助 气 体 推 动 进 入 光 束 通 道, 造 成 光 束 散 射 通 过 测 定 散 射 光 的 强 度 即 可 预 测 样 品 颗 粒 的 数 量, 从 而 测 定 样 品 浓 度 1.2 ELSD 的 基 本 结 构 : 依 据 ELSD 的 设 计 原 理,ELSD 的 结 构 由 三 大 部 分 组 成 : 即 雾 化 雾 珠 处 理, 蒸 发 和 散 射 光 检 测 蒸 发 光 散 射 检 测 器 运 行 分 为 3 个 过 程 : 雾 化 过 程, 即 用 惰 性 气 体 或 纯 净 空 气 将 色 谱 柱 的 流 出 物 雾 化 ; 蒸 发 过 程, 即 在 加 热 的 漂 移 管 中 将 色 谱 柱 流 出 物 中 的 流 动 相 挥 发, 只 剩 下 挥 发 性 较 小 的 被 检 物 质 的 粒 子 ; 检 测 过 程, 即 测 定 不 挥 发 性 粒 子 对 光 的 散 射, 记 录 其 光 散 射 信 号 [ 1,2 ] 1.3 ELSD 的 特 点 1. 雾 化 气 流 的 纯 度 和 压 力 会 影 响 检 测 器 的 信 噪 比 2. 不 能 使 用 不 易 挥 发 的 物 质 来 调 节 流 动 相 的 ph 值 ; 可 以 通 过 蒸 发 温 度 的 调 节 来 使 比 被 测 物 质 沸 点 低 的 组 分 蒸 发 ; 在 不 能 使 被 测 物 质 蒸 发 的 前 提 下, 温 度 越 高, 流 动 相 蒸 发 越 完 全, 色 谱 图 基 线 越 好 信 噪 比 越 高 3. 检 测 光 散 射 变 化, 所 有 进 入 到 散 射 池 的 物 质 都 可 被 检 测, 而 且 响 应 值 只 与 物 质 的 量 ( 质 量 ) 有 关 4. 浓 度 跟 峰 面 积 不 成 线 性, 分 别 取 自 然 对 数 后 成 线 性 2 HPLC-ELSD 在 生 物 碱 成 分 分 析 中 的 应 用 中 药 的 化 学 成 分 复 杂, 有 的 中 药 成 分 不 存 在 紫 外 吸 收 或 仅 在 紫 外 末 端 有 吸 收 另 外 由 于 色 谱 分 离 的 困 难 以 及 流 动 相 带 来 的 干 扰, 使 用 传 统 的 紫 外 检 测 器 对 其 进 行 定 性 定 量 分 析 十 分 困 难 ELSD 在 某 种 程 度 上 弥 补 了 这 方 面 的 不 足, 被 广 泛 的 应 用 于 皂 苷 类 成 分 糖 类 成 分 内 酯 类 成 分 部 分 生 物 碱 类 成 分 以 及 其 他 一 些 成 分 的 分 析, 以 及 中 药 指 纹 图 谱 研 究 药 代 动 力 学 研 究, 并 且 取 得 了 满 意 的 结 果 本 文 就 其 在 生 物 碱 成 分 分 析 中 的 应 用 作 简 要 陈 述 李 松 林 [3] 等 采 用 HPLC-ELSD 法 建 立 了 伊 犁 贝 母 中 西 贝 素 和 西 贝 素 苷 的 检 测 法, 色 谱 条 件 :Kromasil C18 色 谱 柱 (200mm x4.6 mm,5µm); 流 动 相 : 乙 腈 : 水 : 三 乙 胺 (71:29: 0.03,V/V/V), 流 速 1.0 ml/min;elsd 参 数 : 漂 移 管 温 度 88, 氮 气 流 速 2.38 L/min 作 者 简 介 : 赵 辉 (1987-), 女, 山 东 人, 硕 士 研 究 生, zhhbluesea@126.com 通 讯 联 系 人 : 朱 元 元, 女, 副 教 授, zhuyy@nankai.edu.cn [4] 张 盛 等 建 立 该 法 测 定 藜 芦 中 的 介 藜 芦 碱 和 藜 芦 胺 含 量 的 方 法, 并 对 4 种 藜 芦 属 药 材 样 品 进 行 了 测 定, 色 谱 条 件 :Kromasil C18 柱 (250mmx4.6mm,5µm ); 流 动 相 : 乙 腈 :0.1% 三 氟 乙 酸 水 溶 液 梯 度 洗 脱 ; 流 速 0.8 ml/min, 柱 温 35 o C;ELSD 参 数 : 漂 移 管 温 度 98, 载 气 流 速 2.2 L/min 299

305 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 Song [5] 等 人 利 用 HPLC-ELSD 方 法, 以 乙 腈 ( % 三 乙 胺 ): 甲 醇 : 水 (66. 5:3.5:30;V/V/V) 为 流 动 相 在 反 相 C8 柱 上, 实 现 了 贝 母 类 药 材 中 6 种 异 甾 族 生 物 碱 的 分 离 和 测 定, 得 到 了 良 好 的 重 现 性 和 准 确 度 我 们 利 用 ELSD, 以 色 谱 柱 :Hypersil SCX 柱 (250 mm 10.0 mm,5 μm); 流 动 相 : 水 - 冰 醋 酸 - 氨 水 (1000:0.25:0.25;V/V/V); 流 速 :3.0ml/min 为 条 件, 成 功 分 离 出 蚕 沙 中 的 甜 菜 碱 及 DNJ 等 生 物 碱 成 分 3 蒸 发 光 检 测 器 的 缺 点 ELSD 用 来 测 定 那 些 不 能 用 紫 外 检 测 器 检 测 的 组 分, 对 紫 外 检 测 器 是 很 重 要 的 补 充 但 其 在 应 用 方 面 还 存 在 一 些 问 题, 对 关 于 影 响 ELSD 检 测 各 种 参 数 的 选 择, 以 及 流 动 相 中 修 饰 剂 对 物 质 响 应 值 的 改 变 等 的 问 题 还 没 有 系 统 结 论, 另 外 其 准 确 性 与 紫 外 检 测 器 相 比, 其 结 果 的 准 确 度 和 重 现 性 有 待 于 进 一 步 的 提 高, 此 外 ELSD 价 格 昂 贵 并 且 使 用 不 便, 需 要 配 置 高 压 氮 气 或 空 气, 且 实 验 中 产 生 废 气 有 害 这 些 缺 点 限 制 了 ELSD 更 广 泛 的 使 用 4 结 论 HPLC-ELSD 法 虽 有 一 些 缺 点, 但 不 可 否 认 它 适 合 分 析 成 分 复 杂 的 中 药, 其 主 要 取 决 ELSD 检 测 器 的 突 出 优 势, 即 高 效 灵 敏, 不 受 流 动 相 系 统 温 度 变 化 的 影 响, 基 线 稳 定 性 好, 有 利 于 对 成 分 复 杂 的 中 药 检 测, 特 别 适 用 于 无 紫 外 吸 收 或 紫 外 末 端 吸 收 的 样 品 以 及 挥 发 性 低 于 流 动 相 的 任 何 组 分 因 此, 其 对 所 有 非 挥 发 组 分 都 可 产 生 响 应, 应 用 范 围 十 分 广 泛 随 着 ELSD 检 测 技 术 和 仪 器 本 身 的 不 断 完 善, 相 信 会 在 中 药 成 分 分 析 中 起 到 越 来 越 重 要 的 作 用 参 考 文 献 : [1] A Stolyhwo, H Colin, G Guiochon. Use of Light Scattering as a Detector Principle in Liquid Chromatography[J]. J Chromatogr,1983,265 :1. [2] A Stolyhwo. Study of the Qualitative and Quantitative Propertiesof the Light Scattering Detector[J]. J Chromatogr, 1984,288 :253. [3] 李 松 林, 李 萍, 曾 令 杰. 伊 犁 贝 母 中 西 贝 素 和 西 贝 素 苷 的 高 效 液 相 色 谱 蒸 发 光 散 射 检 测 法 [J]. 药 学 学 报,2001,36(4): [4] 张 盛, 周 剑 侠, 寿 清 耀 等. 高 效 液 相 色 谱. 蒸 发 光 散 射 检 测 法 测 定 藜 芦 中 的 介 藜 芦 碱 和 藜 芦 胺 [J]. 色 谱,2008,26(1): [5] Song L L, Ge L, Shun W C, et al. Determination of the Isoteroidal Alkaloids in Bulbs of Fritillaria by High performance Liquid Chromatography with Evaporative Light Scattering Detection[J]. J Chromatogr A, 2001,909 :207. The introduction of HPLC-ELSD and the application in alkaloids Zhao Hui, Qi Hui, ZhuYuanyuan* (College of Pharmacy,Nankai University,Tianjin ,China) Abstract:This article describes the working principle,structure determination, and the advantages and disadvantages of HPLC-ELSD.HPLC-ELSD plays an important role in the analysis of alkaloids in traditional Chinese medicine and it is a very useful analytical method Keywords: HPLC-ELSD; analysis; alkaloids 离 子 液 体 在 色 谱 领 域 的 应 用 张 静 1, 寇 登 民 2 300

306 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 (1. 天 津 北 辰 区 产 品 质 量 技 术 监 督 检 验 所, 天 津 ;2. 南 开 大 学 化 学 学 院, 天 津 ) 1 引 言 离 子 液 体 是 指 在 室 温 及 临 近 温 度 下 完 全 由 离 子 组 成 的 有 机 液 体 物 质, 是 一 类 新 型 的 软 介 [1] 质 和 功 能 材 料 由 于 离 子 液 体 可 以 根 据 需 要 设 计 其 阴 阳 离 子 的 组 成 并 改 变 其 取 代 基, 进 而 改 变 其 性 能, 在 一 定 程 度 上 实 现 人 为 设 计, 进 而 符 合 化 学 学 科 各 个 方 向 的 研 究 需 要, 在 有 机 [2,3] 化 学 催 化 化 学 电 化 学 萃 取 分 离 等 领 域 有 了 一 定 程 度 的 应 用, 并 且 已 经 渗 透 到 功 能 材 料 能 源 环 境 和 生 命 科 学 等 学 科 离 子 液 体 一 般 是 由 特 定 的, 体 积 相 对 较 大 的 有 机 阳 离 子 和 体 积 较 小 的 无 机 阴 离 子 构 成, 大 体 可 以 分 为 AlCl3 型 离 子 液 体 非 AlCl3 型 离 子 液 体 和 其 它 特 殊 类 型 的 离 子 液 体 最 常 见 的 阳 离 子 有 烷 基 铵 盐 烷 基 磷 酸 盐 吡 啶 离 子 咪 唑 离 子 等 ; 阴 离 子 有 卤 素 离 子 含 F,P, S 的 离 子 等 特 殊 功 能 化 离 子 液 体 是 针 对 某 一 性 能 或 应 用 设 计 的 具 有 特 殊 官 能 团 或 取 代 基 的 离 子 液 体 离 子 液 体 的 特 点 有 : 蒸 汽 压 低, 不 易 挥 发 ; 液 体 状 态 温 度 范 围 广 ; 不 可 燃 稳 定 性 好 ; 离 子 导 电 率 高 电 化 学 窗 口 宽 ; 对 有 机 物 无 机 物 都 有 良 好 的 溶 解 性, 使 许 多 化 学 反 应 得 以 在 均 相 中 完 成, 且 反 应 器 体 积 大 为 减 小 ; 密 度 大, 与 许 多 溶 剂 不 互 溶 而 且 离 子 液 体 的 可 设 计 性 使 其 成 为 特 殊 的 固 体 液 体. 从 理 论 上 讲, 可 以 有 超 过 万 亿 种 高 性 能 的 离 子 液 体, 这 些 特 殊 性 质 的 存 在 使 其 在 化 学 材 料 学 及 生 命 科 学 中 的 应 用 成 为 可 能 离 子 液 体 所 具 有 的 [4,5] 热 稳 定 性 低 挥 发 性 等 特 点 使 其 在 分 析 化 学 中 具 有 潜 在 的 应 用 前 景 2 在 色 谱 领 域 中 的 应 用 离 子 液 体 是 气 相 色 谱 的 良 好 的 固 定 相, 是 因 为 它 具 有 高 的 粘 度 高 的 热 稳 定 性 几 乎 无 [6,7 蒸 气 压 以 及 对 色 谱 柱 良 好 的 润 湿 性 Armstrong 等 ] 最 早 将 离 子 液 体 1- 丁 基,3- 甲 基 咪 唑 氯 化 物 ([BMIM]Cl) 和 [BMIM]PF6 作 为 气 相 色 谱 固 定 相, 与 角 鲨 烷 等 传 统 固 定 相 进 行 了 比 较, 并 测 定 了 正 烷 烃 取 代 烷 烃 芳 香 烃 醛 酮 酰 胺 胺 酚 羧 酸 等 物 质 的 保 留 因 子 结 果 表 明, 离 子 液 体 作 为 固 定 相 表 现 出 双 重 性 质 对 于 非 极 性 物 质 如 烃 类, 保 留 因 子 小, 但 选 择 性 好, 离 子 液 体 的 行 为 类 似 非 极 性 固 定 相 ; 对 于 给 出 质 子 的 物 质 如 醇 类, 保 留 时 间 长, 离 子 液 体 的 行 为 类 似 极 性 固 定 相, 因 此 既 可 以 分 析 正 烷 烃, 也 可 以 分 析 醇 类 ; 他 们 还 以 含 有 手 性 中 心 的 离 子 液 体 作 为 固 定 相 应 用 于 亚 砜 环 氧 化 物 等 手 性 对 映 体 的 分 离 研 究 [8] 但 是 离 子 液 体 阴 离 子 部 分 的 不 同 也 会 影 响 其 作 为 固 定 相 的 选 择 性 和 增 溶 能 力 离 子 液 体 在 液 相 色 谱 的 应 用 中, 既 可 以 作 为 流 动 相, 也 可 以 作 为 流 动 相 改 性 剂 或 者 固 定 相 Zhang 等 [9] 采 用 含 离 子 液 体 0.054%~0.869%( 体 积 分 数 ) 的 水 溶 液 作 为 流 动 相, 反 相 高 效 液 相 色 谱 法 分 离 多 巴 胺 儿 茶 酚 胺 肾 上 腺 素 去 甲 基 肾 上 腺 素 的 混 合 物, 具 有 良 好 的 对 称 峰 形 和 线 性 范 围 Kaliszan 等 [10] 用 二 烷 基 咪 唑 型 离 [11] 将 1- 烷 基,3- 甲 基 咪 唑 基 型 离 子 液 体 用 作 流 动 相 添 加 剂, 考 察 了 具 有 不 同 烷 基 碳 链 的 咪 唑 阳 离 子 和 不 同 种 类 阴 离 子 的 离 子 液 体 对 核 苷 酸 和 生 物 碱 分 离 的 影 响, 在 不 添 加 任 何 挥 发 性 有 机 溶 剂 条 件 下, 仅 用 mmol/l 级 的 离 子 液 体 水 溶 液 即 可 对 核 苷 酸 生 物 碱 进 行 快 速 而 高 效 的 分 离, 有 效 地 改 善 了 碱 类 化 合 物 分 离 中 常 见 的 谱 峰 拖 尾 现 象 Berthod[12] 讨 论 了 离 子 液 体 作 为 逆 流 色 谱 的 固 定 相 和 流 动 相 的 应 用 前 景, 将 有 机 溶 剂 / 离 子 液 体 / 水 的 混 合 液 体 作 为 流 动 相 可 以 有 效 降 低 流 动 相 的 粘 度, 进 而 用 于 逆 流 色 谱 的 检 测 Qiu 等 [13 将 1,3- 二 烷 基 咪 唑 离 子 液 体 修 饰 硅 胶 作 为 固 定 相 用 于 液 体 色 谱 柱, 对 I - Br - 等 无 机 阴 离 子 和 酸 类 有 机 阴 离 子 胺 类 核 苷 酸 类 化 合 物 可 以 进 行 有 效 的 分 离 Xiao 等 [14] 将 离 子 液 体 用 作 高 效 液 相 色 谱 流 动 相 添 加 剂 成 功 分 离 了 联 苯 胺 苄 胺 N- 乙 基 苯 胺 等 不 同 胺 类 物 质, 并 考 察 了 离 子 液 体 的 种 类 和 性 质 对 分 离 效 果 的 影 响 但 是 离 子 液 体 的 黏 度 较 大, 影 响 其 作 为 流 动 相 的 效 果, 离 子 液 体 对 紫 外 光 有 一 定 的 吸 收, 进 而 限 制 了 紫 外 光 度 检 测 器 的 使 用 301

307 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 3 在 毛 细 管 电 泳 中 的 应 用 离 子 液 体 也 可 用 于 毛 细 管 电 泳 (CE) 由 于 其 导 电 率 高, 可 作 为 流 动 相 电 解 质 添 加 剂 用 于 无 水 溶 液 毛 细 管 电 泳 的 分 离 或 毛 细 管 电 泳 的 背 景 电 解 质 Vaher 等 [15] 将 不 同 离 子 液 体 作 为 添 加 剂 在 非 水 毛 细 管 电 泳 中 分 离 路 易 氏 酸 和 多 酚 类 化 合 物, 考 察 了 离 子 液 体 的 种 类 浓 度 以 及 流 动 相 甲 醇 和 乙 醇 的 不 同 比 例 对 分 离 的 影 响, 认 为 乙 腈 在 离 子 液 体 阴 离 子 与 样 品 分 子 之 间 起 到 了 复 共 轭 作 用 而 使 样 品 得 以 分 离 Qin 等 [16] 将 1,3- 二 烷 基 咪 唑 型 离 子 液 体 涂 覆 在 硅 胶 上 做 成 毛 细 管 电 泳 柱, 在 较 宽 的 ph 范 围 内 考 察 了 它 对 一 系 列 阳 离 子 如 K+ Na+ Li+ Ca2+ Mg2+ 和 Ba2+ 的 分 离 效 果, 并 进 一 步 应 用 于 人 尿 样 品 中 NH+4 和 红 酒 中 阳 离 子 的 检 测, 经 离 子 液 体 涂 覆 的 毛 细 管 具 有 较 好 的 稳 定 性, 能 连 续 使 用 80 h 以 上 Yanes 等 [17] 用 CE 考 察 了 50~300 mmol/l 咪 唑 类 离 子 液 体 作 为 流 动 相, 用 于 葡 萄 籽 提 取 物 中 多 酚 类 化 合 物 的 分 离 与 检 测 Jiang 等 [18] 利 用 烷 基 咪 唑 型 离 子 液 体 解 决 了 蛋 白 质 在 毛 细 管 壁 的 吸 附, 采 用 30~ 110 mmol/l [C2MIM]BF4 作 为 流 动 相, 可 以 对 多 种 碱 性 蛋 白 质 的 混 合 物 进 行 分 离 与 检 测 Qin 等 [19] 将 离 子 液 体 修 饰 毛 细 管 内 壁 用 于 DNA 的 分 离, 可 以 对 分 子 量 在 72~1353 bp 的 11 种 DNA 片 段 进 行 分 离 Qi 等 [20] 利 用 1- 丁 基 3- 甲 基 咪 唑 四 氟 硼 酸 盐 ([BMIM]BF4) 与 β- 环 糊 精 的 混 合 液 作 为 毛 细 管 电 泳 的 流 动 相, 用 于 中 草 药 中 蒽 醌 类 物 质 的 分 离 与 分 析 总 之, 将 离 子 液 体 固 定 在 毛 细 管 表 面 可 以 有 效 地 减 少 吸 附 量 和 电 渗 流, 提 高 分 离 效 率 和 重 现 性 总 之, 离 子 液 体 在 色 谱 领 域 中 的 应 用, 必 将 引 起 色 谱 领 域 的 又 一 次 新 的 飞 跃 参 考 文 献 [1] Li Ru Xiong( 李 汝 雄 ). Green Solvent the Synthesis and Application of Ionic Liquid( 绿 色 溶 剂 离 子 液 体 的 合 成 与 应 用 ). Beijing ( 北 京 ): Chemical Industry Press( 化 学 工 业 出 版 社 ), 2003:20~21 [2 ] Hiroyuki O. Electrochemical Aspects of Ionic Liquids, New Jersey: John Wiley & Sons, Inc, 2005 [3] Wesserscheid P, Welton T. Ionic Liquids in Systhesis, Weinhein:Wiley VCH, 2002 [4] Liu J F, Jonsson J A, Jiang G B. Trend Anal. Chem., 2005, 24(1): 20~27 [5] Baker G A, Baker S N, Pandey S, Bright F V. Analyst, 2005, 130: 800~808 [6] Armstrong D W, He L F, Liu Y S. Anal. Chem., 1999, 71: 3873~3876 [7] Berthod A, He L F, Armstrong D W. Chromatographia, 2001, 53: 63~68 [8] Ding J, Welton T, Armstrong D W. Anal. Chem., 2005, 77: 6453~6462 [9] Zhang W Z, He L J, Liu X. Anal. Lett., 2003, 36: 827~838 [10] Kaliszan R, Marszall M P, Markuszewski M J, Baczek T, Pernak J. J. Chromatogr. A, 2004, 1030:263~271. [11] He L J, Zhang W Z, Zhao L, Liu X, Jiang S X. J. Chromatogr. A, 2003, 1007: 39~45 [12] Berthod A, Carda Broch S. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol., 2003, 26: 1493~1508 [13] Qiu H D, Jiang S X, Liu X. J. Chromatogr. A, 2006, 1103: 267~270 [14] Xiao X H, Zhao L, Liu X, Jiang S X. Anal. Chim. Acta, 2004, 519(2): 207~211 [15] Vaher M, Koel M, Kaljurand M. Chromatographia, 2001, 53: 302~306 [16] Qin W D, Wei H P, Li S F Y. J. Chromatogr. A, 2002, 979: 27~32 [17] anes E G, Gratz S R, Baldwin M J, Robinson S E, Stalcup A M. Anal. Chem., 2001, 73: 3838~3844 [18] Jiang T F, Gu Y L, Liang B, Li J B, Shi Y P, Ou Q Y. Anal. Chim. Acta, 2003, 479(2): 249~254 [19] Qin W, Li S F Y. Analyst, 2003, 128: 37~41 [20] Qi S D, Cui S Y, Chen X G, Hu Z D. J. Chromatogr. A, 2004, 1059: 191~198 色 谱 技 术 在 阿 莫 西 林 中 有 关 物 质 的 302

308 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 分 析 和 鉴 定 中 的 应 用 雷 勇 胜 1, 金 松 子 1, 姜 喜 成 1, 宋 丽 明 1, 王 琳 2, 蒋 庆 峰 1 (1. 天 津 药 物 研 究 院 分 析 测 试 中 心, 天 津 ;2. 河 南 大 学 药 学 院, 开 封 ) 药 物 中 杂 质 的 分 析 非 常 重 要, 因 其 杂 质 会 影 响 药 物 的 质 量, 有 时 候 甚 至 会 引 起 副 反 应 特 别 是 随 着 色 谱 技 术 的 发 展, 使 药 物 中 杂 质 的 分 析 更 趋 于 完 善 Nageswara Rao 等 [1] 综 述 了 近 年 来 用 HPLC 法 分 析 药 物 中 杂 质 的 研 究 进 展 阿 莫 西 林 (Amoxicillin), 是 一 种 最 常 用 的 青 霉 素 类 广 谱 β- 内 酰 胺 类 抗 生 素, 为 一 种 白 色 粉 末, 半 衰 期 约 为 61.3 分 钟 在 酸 性 条 件 下 稳 定, 胃 肠 道 吸 收 率 达 90% 阿 莫 西 林 杀 菌 作 用 强, 穿 透 细 胞 壁 的 能 力 也 强, 是 目 前 应 用 较 为 广 泛 的 口 服 青 霉 素 之 一, 阿 莫 西 林 为 青 霉 素 类 抗 生 素, 对 肺 炎 链 球 菌 溶 血 性 链 球 菌 等 链 球 菌 属 不 产 青 霉 素 酶 葡 萄 球 菌 粪 肠 球 菌 等 需 氧 革 兰 阳 性 球 菌 大 肠 埃 希 菌 奇 异 变 形 杆 菌 沙 门 菌 属 流 感 嗜 血 杆 菌 淋 病 奈 瑟 菌 等 需 氧 革 兰 阴 性 菌 的 不 产 β 内 酰 胺 酶 菌 株 及 幽 门 螺 杆 菌 具 有 良 好 的 抗 菌 活 性 阿 莫 西 林 通 过 抑 制 细 菌 细 胞 壁 合 成 而 发 挥 杀 菌 作 用, 可 使 细 菌 迅 速 成 为 球 状 体 而 溶 解 破 裂 其 制 剂 有 胶 囊 片 剂 颗 粒 剂 分 散 片 等 阿 莫 西 林 在 高 温 光 照 酸 碱 和 氧 化 条 件 下, 降 解 情 况 如 下 : 在 高 温 条 件 下, 随 着 时 间 增 加, 样 品 外 观 逐 渐 变 为 淡 黄 色, 会 发 生 明 显 的 降 解 : 尤 其 因 结 晶 水 的 失 去, 阿 莫 西 林 分 子 之 间 因 脱 水 而 非 常 容 易 发 生 聚 合 ; 在 光 照 条 件 下, 随 着 时 间 的 增 加, 样 品 外 观 逐 渐 变 为 淡 黄 色, 杂 质 数 量 没 有 明 显 的 增 加 ; 在 酸 性 条 件 下, 随 着 时 间 增 加, 杂 质 数 量 有 明 显 的 增 加, 一 些 杂 质 的 含 量 也 有 明 显 的 变 化, 阿 莫 西 林 的 含 量 从 98.6% 下 降 到 86.0%, 实 验 结 果 表 明, 阿 莫 西 林 在 酸 性 条 件 下 不 稳 定, 会 发 生 明 显 的 降 解 : 主 要 降 解 杂 质 为 (5S,6R) (5R,6R) 构 型 的 青 霉 噻 唑 酸 (Penicilloic acids of amoxicillin) 脱 羧 青 霉 噻 唑 酸 (Penilloic acids of amoxicillin); 在 碱 性 条 件 下, 随 着 时 间 增 加, 杂 质 数 量 有 明 显 的 增 加, 一 些 杂 质 的 含 量 也 有 明 显 的 变 化, 碱 性 条 件 下 也 能 促 进 阿 莫 西 林 的 聚 合 主 要 降 解 产 物 是 :(5S,6R) (5R,6R) 构 型 的 青 霉 噻 唑 酸 (Penicilloic acids of amoxicillin), 阿 莫 西 林 的 聚 合 物 ; 在 氧 化 条 件 下, 也 会 发 生 明 显 的 降 解, 主 要 降 解 杂 质 是 (5R,6R) 构 型 的 青 霉 噻 唑 酸 ( 图 一 为 阿 莫 西 林 中 的 有 关 物 质 的 化 学 结 构 ), 临 床 上 证 实 阿 莫 西 林 的 聚 合 物 会 引 起 过 敏 反 应 朱 康 琳 等 [2] 介 绍 了 阿 莫 西 林 产 品 中 的 聚 合 物 杂 质 : 阿 莫 西 林 的 青 霉 噻 唑 酸 阿 莫 西 林 的 脱 羧 青 霉 噻 唑 酸 等 及 形 成 机 理, 分 析 了 影 响 阿 莫 西 林 聚 合 物 形 成 的 因 素 及 主 要 致 敏 原, 为 阿 莫 西 林 质 量 控 制 提 供 了 依 据 所 以, 用 色 谱 技 术 分 析 和 鉴 定 阿 莫 西 林 中 的 相 关 物 质 是 十 分 必 要 的 下 面 就 简 要 介 绍 一 下 色 谱 技 术 在 这 方 面 的 应 用 1 色 谱 技 术 在 阿 莫 西 林 中 相 关 物 质 的 分 析 和 鉴 定 中 的 应 用 1.1 HPLC 法 李 哲 媛 等 [3] 采 用 Ohpak SB-802.5HQ( 聚 合 基 柱 ) 凝 胶 色 谱 柱, 以 0.1mol/L 磷 酸 盐 缓 冲 液 (ph 7.0) 为 流 动 相, 外 标 法 定 量, 建 立 了 在 该 系 统 下 以 分 子 量 最 大 的 杂 质 作 为 阿 莫 西 林 中 的 信 号 杂 质 进 行 质 量 控 制 ; 李 哲 媛 等 [4] 还 采 用 高 效 液 相 凝 胶 色 谱 系 统 对 21 批 阿 莫 西 林 样 品 中 高 分 子 杂 质 进 行 测 定 ; 晁 阳 等 [5] 也 采 用 凝 胶 色 谱 法 测 定 阿 莫 西 林 中 的 高 分 子 杂 质 ( 阿 莫 西 林 聚 合 物 ), 并 对 国 内 上 市 的 两 个 厂 家 阿 莫 西 林 颗 粒 的 高 分 子 杂 质 进 行 了 测 定, 杂 质 含 量 均 小 作 者 简 介 : 雷 勇 胜 (1982-), 男, 山 西 人, 硕 士, Tel: , xiaolei_0520@126.com 于 0.1% 顾 立 素 等 [6] 采 用 反 相 色 谱 和 Superdex Petide 凝 胶 色 谱 分 别 测 定 阿 莫 西 林 颗 粒 和 原 料 中 的 高 分 子 杂 质, 测 定 的 6 批 阿 莫 西 林 颗 粒 中 均 无 高 聚 物, 均 为 阿 莫 西 林 闭 环 二 聚 体 和 阿 303

309 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 [7] 莫 西 林 噻 唑 酸 罗 兴 洪 等 采 用 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 了 阿 莫 西 林 颗 粒 中 的 高 分 子 杂 质, 色 谱 柱 为 Sephadex G-10 凝 胶 柱 ; 流 动 相 A 为 0.1 mol/l 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 (ph=7.0), 流 动 相 B 为 水 ; [8,9] 流 速 为 0.6~0.9mL/min; 检 测 波 长 为 254 nm 金 少 鸿 等 对 阿 莫 西 林 聚 合 物 进 行 了 分 离, [10] 并 且 用 HPLC 法 测 定 了 样 品 Fong 等 用 HPLC 三 重 梯 度 洗 脱 的 方 法 研 究 了 阿 莫 西 林 胶 囊 中 的 amoxicilin penicilloic acids(pa) p-hydroxyphenyl-glycine(p-hpg) 6-aminopenicillanic [11] acid (6-APA) 及 未 知 结 构 的 杂 质 De Pourcq 等 通 过 HPLC 法 定 量 研 究 阿 莫 西 林 及 其 分 解 产 物, 反 相 的 C8 可 以 分 离 Amoxicillin amoxicilloates amoxicillin oligomers 和 amoxicillin piperazine-2,5-dione 实 验 结 果 表 明, 阿 莫 西 林 的 三 水 合 物 中 的 主 要 杂 质 是 amoxicilloate, 阿 莫 西 林 钠 中 的 主 要 杂 质 是 piperazine-2,5-dione, 二 聚 物 三 聚 物 和 四 聚 物 比 较 少 Perez-Lozano [12] 等 按 照 VICH 兽 药 靶 动 物 安 全 性 研 究 指 导 原 则 用 一 种 新 的 HPLC-RP 的 方 法 研 究 阿 莫 西 林 的 降 解 产 物 及 稳 定 性, 证 明 该 方 法 是 可 靠 快 速 的 质 量 控 制 方 法 对 于 阿 莫 西 林 中 高 分 子 量 杂 质 的 分 析 和 质 量 控 制, 一 般 采 用 RPLC 和 HPLC-MS 的 技 [13] 术, 但 在 没 有 对 照 品 的 情 况 下, 这 些 方 法 使 用 起 来 并 不 方 便 Cai 等 用 凝 胶 过 滤 层 析 色 谱 结 合 反 相 色 谱 分 析 了 阿 莫 西 林 中 高 分 子 量 的 杂 质 实 验 表 明, 相 对 于 反 相 色 谱 法, 凝 胶 过 滤 层 析 色 谱 是 一 种 更 加 简 单 测 定 阿 莫 西 林 中 聚 合 物 的 分 析 方 法, 在 三 种 方 法 中,Superdex peptide 柱 是 一 种 不 错 的 选 择 此 外, 现 在 提 倡 低 碳, 凝 胶 是 不 使 用 任 何 有 机 溶 剂 的, 有 利 于 保 护 环 境 有 关 阿 莫 西 林 分 析 中 常 用 的 HPLC 系 统 见 下 表 1 表 1 阿 莫 西 林 分 析 中 常 用 的 HPLC 系 统 方 法 色 谱 柱 检 测 波 长 (nm) 柱 温 ( ) 流 速 (ml/min) 流 动 相 1 ODS 磷 酸 缓 冲 液 (0.02mol/L,pH 为 5.0)- 甲 醇 =93:7 2 ODS 230 室 温 - 磷 酸 缓 冲 液 (0.1mol/L,pH 为 4.5)- 甲 醇 =95:5 3 C 磷 酸 缓 冲 液 (0.05mol/L,pH 为 5.0)- 甲 醇 =94:6 4 ODS 254 室 温 % 醋 酸 液 - 甲 醇 =80:20 5 * ODS-PLRP-S 230 室 温 1.5 磷 酸 缓 冲 液 (0.05mol/L,pH 为 5.0)- 乙 腈 =96:4 * 注 : 方 法 5 中 的 PLRP-S 为 聚 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 苯 柱 1.2 LC-MS 法 LC-MS 技 术 在 快 速 结 构 鉴 定 方 面 有 广 泛 的 应 用, 该 技 术 将 液 相 色 谱 高 效 的 在 线 分 离 能 力 与 质 谱 高 选 择 性 灵 敏 度 的 检 测 能 力 相 结 合, 可 以 同 时 得 到 化 合 物 的 保 留 时 间 在 线 紫 外 光 谱 分 子 量 及 特 征 结 构 碎 片 等, 该 方 法 高 效 快 速 灵 敏 度 高, 尤 其 适 用 于 含 量 少 不 易 分 离 得 到 或 在 分 离 过 程 中 容 易 丢 失 的 组 分 同 样, 在 阿 莫 西 林 杂 质 的 快 速 鉴 定 中 也 有 很 重 要 的 作 用 Valvo 等 [14] 用 LC UV 与 LC MS 分 析 了 阿 莫 西 林 中 的 杂 质, 通 过 质 谱 能 够 快 速 鉴 定 这 些 杂 质 的 结 构, 表 明 这 是 快 速 鉴 定 杂 质 的 方 法, 因 为 很 难 获 得 阿 莫 西 林 杂 质 的 对 照 品,HPLC 的 方 法 受 到 了 限 制 Valvo 等 [15] 还 用 LC-MS 鉴 定 了 阿 莫 西 林 钠 中 的 一 个 新 的 杂 质, 并 推 测 了 它 的 结 构 形 成 机 理 牛 长 群 等 [16] 用 LC-MS 定 性 分 析 阿 莫 西 林 中 的 相 关 物 质, 通 过 解 析 相 关 物 质 的 质 谱, 确 定 其 结 构, 确 定 了 9 种 阿 莫 西 林 的 相 关 物 质, 并 定 量 分 析 了 实 际 样 品 中 的 相 关 物 质 1.3 其 它 色 谱 法 随 着 色 谱 技 术 的 发 展, 其 它 色 谱 技 术 也 应 用 于 阿 莫 西 林 杂 质 的 分 析, 这 对 HPLC 法 是 一 种 有 益 的 补 充 胶 束 动 电 毛 细 管 色 谱 法 由 将 表 面 活 性 剂 的 胶 束 水 溶 液 作 为 介 质, 用 于 毛 细 管 电 泳, 这 样 的 电 泳 分 离 技 术 称 为 MEKC 或 MECC 由 于 引 入 了 胶 束 相, 它 被 视 为 准 固 定 相 (pseudo stationary phase) 这 种 技 术 以 水 作 为 流 动 相, 分 离 机 制 中 除 电 渗 电 泳 外 还 增 加 了 胶 束 色 谱 分 离 机 制, 它 即 可 以 分 离 阴 阳 离 子, 又 可 以 进 行 中 性 分 子 的 测 定, 并 适 于 生 物 大 分 子 的 分 析, 大 大 拓 宽 了 应 用 范 围, 增 强 了 分 离 能 力, 缩 短 了 分 析 时 间, 提 高 了 重 现 性, 304

310 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 成 为 了 高 效 毛 细 管 电 泳 的 一 种 阳 离 子 表 面 活 性 剂 作 为 缓 冲 液 添 加 剂, 主 要 用 于 无 机 与 有 机 阴 离 子 的 分 离 测 定 非 离 子 表 面 活 性 剂 作 为 准 固 定 相, 可 控 制 电 渗 流, 手 性 表 面 活 性 剂 的 加 入 可 用 于 对 映 异 构 体 的 分 离 Li 等 [17] 用 胶 束 动 电 毛 细 管 色 谱 法 分 析 阿 莫 西 林 的 杂 质, 通 过 对 各 种 影 响 因 素 的 研 究, 如 ph 值 缓 冲 液 浓 度 十 二 烷 基 硫 酸 钠 和 有 机 溶 剂 的 浓 度, 这 种 方 法 可 以 完 全 分 离 阿 莫 西 林 及 其 杂 质 牛 长 群 等 [18] 用 高 效 毛 细 管 电 泳 分 离 阿 莫 西 林 聚 合 物, 并 测 定 了 所 收 集 的 样 品, 试 验 表 明 : 大 部 分 样 品 以 开 环 和 闭 环 的 二 聚 物 为 主, 其 它 聚 合 物 较 少, 本 法 与 HPLC 法 相 比, 特 点 是 : 由 于 半 峰 宽 与 保 留 时 间 无 关, 采 用 相 对 含 量 的 定 量 方 法 测 定 多 个 组 分 的 含 量, 使 结 果 更 加 准 确, 特 别 是 含 量 较 少, 在 HPLC 中 保 留 时 间 较 长 的 组 分, 采 用 HPCE 法 有 利 于 准 确 定 量, 更 能 真 实 反 映 产 品 质 量 Roets 等 [19] 通 过 离 子 交 换 树 脂 Amberlite XAD-2 分 离 阿 莫 西 林 的 聚 合 物, 通 过 氢 谱 和 快 原 子 轰 击 质 谱 确 定 其 聚 合 物, 分 别 是 二 聚 物 三 聚 物 四 聚 物, 此 外, 还 有 piperazinedione H O H O H N H 2 C O O H H 2 N O H H N S C H 3 C H 3 H C O O H L - O * H N N H * H N O * H S C O O H C H 3 C H 3 N N ( 4 - ) O H O H H O H O H H N H 2 H N O N H 2 O O H N H N H H N H * * S C O O H S H C O O H C H 3 C H 3 C O O H C H 3 C H 3 H O H N H 2 O O H N H H N N H S C O O H C H 3 C H 3 H 3 C H 3 C H 3 C H N H O C O O H H O H N H 2 O H N * H H H N * S C O O H C H 3 C H 3 H O O H O 4 - H O H O H H H N O N H O H H N O H N ( n ) * H H N * S O H N H N S H C O O H C H 3 C H 3 C O O H C H 3 C H 3 H O n H O O H N H 2 H N O H H H N N H O H H O ( n ) S O H N * H N O O H N H C H 3 C H 3 * S H H N H H C O O H C H 3 C H 3 S n C O O H C H 3 C H 3 6 -A P A 图 1 阿 莫 西 林 中 的 化 学 结 构 1.4 小 结 近 年 来, 色 谱 技 术 取 得 了 较 大 进 展, 特 别 是 一 些 联 用 技 术 的 发 展 更 是 日 新 月 异, 极 大 地 促 进 了 药 学 的 发 展 随 着 色 谱 技 术 的 发 展, 一 定 会 有 更 丰 富 更 多 样 的 色 谱 手 段 应 用 于 这 305

311 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 方 面, 使 药 品 阿 莫 西 林 的 质 量 研 究 更 加 深 入 参 考 文 献 : [1] Nageswara Rao R, Nagaraju V. [J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2003, 33: [2] 朱 康 玲, 康 月 菊, 尹 翠 英, 焦 瑞 恒. [J]. 石 家 庄 职 业 技 术 学 院 学 报,2006, 18(2): 9-10 [3] 李 哲 媛, 李 玉 凤, 范 兵, 傅 文, 向 金 莲. [J]. 华 西 药 学 杂 志,2005, 20(1): [4] 哲 媛, 李 玉 凤, 范 兵, 向 金 莲. [J]. 中 国 现 代 应 用 药 学,2006, 23(4): [5] 晁 阳, 余 丽 丽, 章 郑 俊. [J]. 医 药 世 界,2006, (11): [6] 顾 立 素, 胡 昌 勤, 周 进 东, 罗 兴 洪, 赵 耀 军. [J]. 药 品 评 价,2005, 2(2): [7] 罗 兴 洪, 周 进 东, 赵 耀 军. [J]. 中 国 药 业,2004, 13(5): [8] 金 少 鸿, 经 洁. [J]. 抗 生 素,1987, 12: [9] 金 少 鸿, 经 洁. [J]. 抗 生 素,1987, 12: [10] Fong Godwin W.K, Martin David T, Johnson Raymond N, Kho Boen T. [J]. Journal of Chromatography A, 1984, 298: [11] De Pourcq P, Hoebus J, Roets E, Hoogmartens J, Vanderhaeghe H. [J]. Journal of Chromatography A, 1985, 321: [12] Pérez-Lozano P, García-Montoya E, Orriols A, Miñarro M, TicóJ.R. [J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2006, 42: [13] Cai Shan-Ying, Hu Chang-Qin, Xu Ming-Zhe. [J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2003, 31: [14] Valvo L, Ciranni E, Alimenti R, Alimonti S, Draisci R, Giannetti L, Lucentini L. [J]. Journal of Chromatography A, 1998, 797: [15] Valvo L, Alimonti S, Alimenti R, De Sena C, Ciranni Signoretti, Draisci R, Giannetti L. [J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 1997, 15: [16] 牛 长 群, 祝 仕 清. [J]. 药 学 学 报,1997, 32(3): [17] Li YM, Van Schepdael A, Zhu Y, Roets E, Hoogmartens J. [J]. Journal of Chromatography A, 1998, 812: [18] 牛 长 群, 祝 仕 清.[J] 药 学 学 报,2001, 36(10): [19] Roets E, De Pourcq P, Toppet S, Hoogmartens J, Vanderhaeghe H, Williams D.H. [J]. Journal of Chromatography A, 1984, 303: Applications of chromatography technologies in analysis and identification to impurities of Amoxicillin LEI Yong-sheng 1, JIN Song-zi 1, JIANG Xi-cheng 1, SONG Li-ming 1, WANG-lin 2, JIANG Qing-feng 1 (1.Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin , China 2. Pharmacy school of Henan Unversity, Kaifeng , China) Abstrct: The applications of chromatography technologies in analysis and identification to impurities of Amoxicillin have been reviewed. Keywords: Amoxicillin; impurities; chromatography; reviews 306

312 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 球 型 高 分 子 共 聚 物 GDX 型 气 相 色 谱 填 料 即 固 定 相 的 结 构 特 征 张 策 ( 天 津 博 瑞 健 合 色 谱 技 术 有 限 公 司, 天 津 ) 使 用 填 充 柱 作 为 气 相 色 谱 分 离 手 段 曾 经 开 创 了 色 谱 分 析 的 先 例 经 历 了 50 余 年 的 技 术 发 展 和 进 步, 目 前 种 类 繁 多 的 气 相 色 谱 填 充 柱 及 内 装 的 色 谱 填 料 即 固 定 相 仍 然 在 色 谱 分 析 领 域 发 挥 着 巨 大 的 作 用 因 其 具 有 操 作 简 便 快 速 针 对 性 强 而 又 经 济 耐 用 等 优 点, 尤 其 适 合 工 矿 企 业 中 气 体 生 产 气 体 监 测 过 程 的 在 线 分 析 和 科 研 教 学 中 非 复 杂 组 份 的 分 离 分 析 色 谱 仪 的 关 键 部 位 是 色 谱 柱, 而 决 定 色 谱 柱 性 能 的 则 是 内 装 的 色 谱 柱 填 料 即 色 谱 固 定 相 气 相 色 谱 固 定 相 在 种 类 结 构 上 的 多 样 性, 包 括 基 质 的 不 同, 极 性 和 所 带 功 能 基 团 的 差 别, 孔 径 比 表 面 积 的 差 异 等, 决 定 了 填 充 柱 色 谱 分 离 范 围 的 广 泛 性, 如 永 久 性 气 体 的 测 定,C1~ C5 脂 肪 烃 及 异 构 体 芳 香 烃 醇 酫 酮 酯 等 有 机 化 合 物 的 分 析, 这 里 暂 不 一 一 列 举 气 相 色 谱 固 定 相 在 我 国 已 有 40 年 的 生 产 历 史, 本 文 作 者 就 几 种 典 型 的 气 相 色 谱 固 定 相 或 称 气 相 色 谱 柱 填 料 的 结 构 特 征 并 结 合 生 产 过 程 中 的 要 素 工 艺 做 下 文 简 单 的 评 述 这 里 首 先 明 确,GDX 型 气 相 色 谱 固 定 相 是 由 二 乙 烯 基 苯 苯 乙 烯 通 过 三 种 聚 合 模 式 而 组 成 的 球 型 高 分 子 共 聚 物, 一 些 文 献 或 信 息 中 提 出 的 聚 二 乙 烯 苯 聚 苯 乙 烯 等 都 是 不 全 面 的 GDX 型 做 为 品 种 最 多 的 有 机 基 质 固 定 相, 可 按 其 极 性 比 表 面 积 的 不 同 而 选 择 使 用, 且 不 需 任 何 前 处 理, 直 接 装 柱, 耐 酸 碱 1 非 极 性 型 的 GDX 固 定 相 这 里 指 的 的 GDX-101 GDX-102 GDX-103 GDX-104 GDX-105 GDX-201 GDX-203 七 个 品 种, 其 共 同 的 特 点 是 具 有 非 极 性 表 面, 按 孔 径 大 小 排 列 为 GDX-203> GDX-103> GDX-102= GDX-201>GDX-101=GDX-104>GDX-105 GDX-203 是 所 有 GDX 品 种 中 孔 径 最 大 的, 比 表 面 达 800m 2 /g, 适 合 高 沸 点 化 合 物 如 高 碳 烷 烃 等 分 析, 虽 然 GDX-104 与 GDX-101 具 有 相 同 的 孔 径 和 比 表 面 积, 但 GDX-104 的 钢 性 要 强 于 GDX- 101, 这 是 由 产 品 的 合 成 工 艺 所 决 定 的 前 面 提 到 的 GDX 型 固 定 相 是 由 三 种 模 式 聚 合 而 成 的 共 聚 物, 在 GDX-104 的 聚 合 体 中, 聚 苯 乙 烯 占 主 要 成 份, 而 GDX-101 则 是 聚 二 乙 烯 苯 所 占 的 比 例 要 多, 这 一 点 在 选 择 使 用 固 定 相 时 可 作 为 参 考 同 样 GDX-102 与 GDX-201 也 类 似 上 述 不 同 的 聚 合 模 式,GDX-201 的 钢 性 要 强 一 些, 国 外 典 型 的 非 极 性 同 类 产 品 为 Porapak Q 2 弱 极 性 的 GDX-301 与 GDX-303 型 气 相 色 谱 填 料 GDX-301 的 合 成 工 艺 中 引 入 的 极 性 基 团 为 -Cl, GDX-303 的 极 性 基 团 为 -COOH, 结 构 上 的 特 点 决 定 了 它 们 都 可 用 于 极 性 化 合 物 的 分 析, 而 GDX-303 孔 径 较 大, 更 适 合 含 硫 化 合 物 的 分 析 一 般 情 况 下, 孔 径 越 大, 固 定 相 小 球 的 骨 架 越 松 驰, 在 装 柱 操 作 中 应 注 意 这 一 特 点 3 含 有 氮 杂 环 的 中 等 极 性 的 GDX-401 GDX-403 型 气 相 色 谱 柱 填 料 ( 下 转 第 309 页 ) 作 者 简 介 : 张 策, 男, 高 级 工 程 师 tjbrjh@163.com 307

313 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 几 类 固 相 萃 取 柱 使 用 的 填 料 产 品 概 述 张 策 ( 天 津 博 瑞 健 合 色 谱 技 术 有 限 公 司, 天 津 ) 作 为 样 品 前 处 理 和 条 件 实 验 等 有 效 的 实 验 器 材, 固 相 萃 取 柱 (SPE 柱 ) 已 被 广 泛 地 使 用 SPE 柱 品 牌 纷 杂, 种 类 繁 多, 规 格 不 一, 尤 其 是 一 些 无 具 体 注 释 或 描 述 不 确 定, 甚 至 不 确 定 标 注 的 牌 号, 给 众 多 使 用 者 带 来 不 便, 甚 至 误 导 规 范 的 文 字 说 明 应 包 括 : 柱 体 的 容 积 和 填 料 的 重 量 如 500mg/6ml, 填 料 的 基 质 以 及 表 面 基 团 的 种 类 如 硅 胶 基 质 键 合 C18 聚 苯 乙 烯 基 球 表 面 磺 酸 基 即 表 面 磺 化 等, 这 样 即 使 是 不 同 的 产 品 牌 号, 也 可 实 现 相 互 替 代 而 方 便 使 用 者 固 相 萃 取 柱 的 柱 体 应 高 纯 光 洁, 在 使 用 有 机 溶 剂 时 无 溶 出, 筛 片 无 杂 质, 筛 孔 孔 径 大 小 合 适, 孔 分 布 均 匀 本 文 重 点 讲 述 的 是 固 相 萃 取 柱 使 用 的 填 料, 通 过 描 述 一 些 填 料 的 基 质 结 构 表 面 特 征, 使 读 者 对 不 同 牌 号 的 SPE 产 品 的 性 质 种 类 有 一 个 初 步 的 了 解 1 硅 胶 基 质 的 SPE 填 料 所 谓 硅 胶 基 质 指 的 是 具 有 一 定 孔 径 和 比 表 面 积 的 硅 胶 颗 粒, 通 过 键 合 或 其 它 化 学 或 物 理 手 段 使 硅 胶 表 面 改 性, 从 而 具 有 某 种 色 谱 性 能 目 前 国 内 外 使 用 最 多 的 用 来 制 造 SPE 填 料 的 硅 胶 有 60 埃 和 100 埃 两 种 孔 径 规 格, 颗 粒 直 径 多 为 40-60μ, 孔 径 为 60 埃 的 硅 球 是 国 外 填 料 使 用 较 多 的 基 质, 来 源 于 大 规 模 的 工 业 生 产 线, 生 产 的 大 量 硅 胶 产 品 可 用 于 日 用 化 妆 品 工 业, 环 境 治 理 和 家 庭 宠 物 饲 养 等 多 方 面, 因 此 货 源 充 足, 但 键 合 改 性 后 被 键 合 在 硅 胶 表 面 的 基 团 数 量 ( 即 键 合 量 ) 相 对 较 低, 会 影 响 填 料 的 使 用 期, 下 面 所 述 的 硅 胶 基 质 SPE 填 料 都 以 100 埃 孔 径 为 例 1.1 -C 18 -C 8 -C 4 -C 6 H 5 等 非 极 性 填 料 它 们 分 别 是 在 硅 胶 表 面 键 合 十 八 烷 基 辛 基 丁 基 苯 基 的 非 极 性 SPE 填 料, 残 余 的 硅 羟 基 可 用 小 分 子 硅 烷 封 尾 处 理, 以 称 做 钝 化, 即 将 硅 胶 表 面 的 极 性 点 降 到 最 低, 也 有 些 此 类 填 料 不 经 封 尾 处 理, 目 的 是 使 填 料 略 带 一 些 极 性, 增 加 其 亲 水 性, 但 使 用 寿 命 会 降 低 上 述 填 料 具 有 工 艺 成 熟, 质 量 稳 定 性 高, 应 用 范 围 广, 经 济 耐 用 等 优 点, 不 足 之 处 是 耐 碱 性 差, 一 般 使 用 PH 为 2~9 如 无 特 殊 说 明,SPE 柱 上 的 标 识 为 -C18 -C8 等, 指 的 都 是 此 类 填 料, 包 括 国 内 品 牌 YWG-C18 YWG-C8 等, 国 外 品 牌 LRP-2 PrepODS 等 在 此 提 示 一 点, ODS 即 十 八 烷 基 三 氯 硅 烷 的 缩 写 字 母, 和 -C18 有 着 相 同 的 含 意 填 料 产 品 的 理 化 参 数 应 包 括 颗 粒 度 ( 粒 径 ) 孔 径 比 表 面 积 和 键 合 量 或 键 合 率, 键 合 量 用 碳 含 量 表 示, 一 般 C%=18~20%, 碳 含 量 过 高, 会 增 加 样 品 在 固 定 相 上 的 保 留 时 间, 过 低 会 影 响 填 料 的 分 离 效 能 或 吸 附 性 能 1.2 -SiO 2 -NH 2 -CN -(OH) 2 等 极 性 填 料 -SiO2 即 为 硅 胶 表 面 只 有 硅 羟 基 的 极 性 填 料 ( 空 白 硅 胶 ), 要 求 表 面 Ca Mg Fe 等 杂 质 尽 可 能 小, 因 为 硅 胶 表 面 的 金 属 杂 质 会 与 某 些 微 量 样 品 产 生 螯 合 作 用 而 形 成 不 可 逆 的 吸 附 -NH2 为 表 面 键 合 氨 丙 基,-CN 为 表 面 键 合 氰 丙 基, 而 -(OH)2 为 二 醇 基, 也 称 为 Diol, 其 作 用 机 理 类 似 于 空 白 硅 胶 填 料, 而 极 性 吸 附 能 力 低 于 硅 胶 填 料 硅 胶 基 质 的 极 性 填 料 中, YWG-NH2 YWG-SiO2 等 均 为 国 产 填 料, 性 能 与 国 外 的 PSA PorasilA 等 相 当 用 它 们 装 填 的 SPE 柱 都 应 标 出 -NH2 -CN 等 极 性 基 团 的 种 类, 同 时 标 明 或 说 明 填 料 为 硅 胶 基 质 2 硅 胶 基 质 的 离 子 型 填 料 作 者 简 介 : 张 策 (1965) 男, 高 级 工 程 师 tjbrjh@163.com 308

314 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 可 分 为 强 阳 离 子 填 料 SCX, 强 阴 离 子 填 料 SAX, 弱 阳 离 子 填 料 -COOH, 弱 阴 离 子 填 料 -NH2 等 由 于 使 用 离 子 型 SPE 柱 多 在 碱 性 条 件 下, 而 硅 胶 的 耐 碱 性 能 较 差, 故 离 子 型 填 料 多 由 有 机 基 质 的 基 球 合 成 而 得 3 有 机 基 质 的 SPE 填 料 这 里 的 有 机 基 质 指 的 是 聚 苯 乙 烯 或 聚 二 乙 烯 苯 等 有 机 聚 合 物 微 球, 耐 酸 碱 是 它 的 特 点, 但 很 难 达 到 硅 胶 那 样 的 高 纯 度, 因 为 有 机 微 球 合 成 中 的 各 种 反 应 副 产 物 及 添 加 剂 的 除 去 是 比 较 困 难 的 工 序, 在 有 机 溶 剂 的 存 在 下, 有 机 微 球 会 有 微 量 的 杂 质 溶 出, 影 响 实 验 的 准 确 度 做 为 SPE 填 料, 按 照 引 入 官 能 团 的 工 艺 大 体 可 分 为 三 种 1 无 需 引 入 官 能 团 而 直 接 使 用 的 有 机 填 料, 如 大 孔 吸 附 树 脂 类, 只 是 微 球 的 孔 和 非 极 性 的 表 面 在 起 作 用, 此 类 填 料 牌 号 繁 多, 使 用 者 易 被 混 淆, 无 论 是 哪 一 国 的 产 品 都 应 标 注 非 极 性 吸 附 树 脂 并 注 明 孔 径 2 有 机 基 球 合 成 中 引 入 官 能 团 的 SPE 填 料, 如 HLB 国 产 的 GDX-403 GDX-502 等, 引 入 基 团 有 氮 杂 球 氰 基 羧 基 等 针 对 一 些 有 复 杂 结 构 的 较 大 分 子 样 品, 此 类 样 品 效 果 独 特 3 在 有 机 基 球 上 键 合 官 能 团 的 SPE 填 料, 如 有 机 基 质 的 强 阳 离 子 和 强 阴 离 子 填 料, 表 面 所 键 合 的 离 子 交 换 基 团 与 前 述 硅 胶 基 质 的 离 子 填 料 相 同, 它 们 除 具 有 离 子 交 换 性 质 外, 耐 酸 碱 能 力 强 牌 号 为 PCX MCX PAX MAX 等 4 无 机 吸 附 剂 型 SPE 填 料 此 类 型 包 括 氧 化 铝 硅 胶 硅 藻 土 硅 镁 吸 附 剂 ( 也 称 弗 罗 里 硅 土 Florisil) 活 性 碳 石 墨 化 碳 等, 填 料 要 求 纯 度 要 高, 无 水 溶 性 或 油 溶 性 杂 质 此 类 SPE 柱 填 料 组 份 简 单, 无 论 是 何 种 牌 号 都 应 简 单 明 确 标 注 结 语 : 固 相 萃 取 柱 的 应 用 基 于 液 相 色 谱 理 论,SPE 填 料 也 是 液 相 色 谱 填 料 的 一 个 使 用 范 畴, 无 论 SPE 柱 的 经 营 者 还 是 使 用 者 都 应 明 确 SPE 柱 属 于 液 相 色 谱 柱 的 一 个 分 支, 所 谓 的 固 相 色 谱 固 相 柱 的 词 语 都 是 极 其 不 专 业 的, 另 外, 为 加 强 自 有 产 品 的 垄 断 性 而 有 意 忽 略 SPE 柱 的 标 识 或 不 明 确 填 料 的 结 构, 这 些 做 法 也 是 不 可 取 的 ( 上 接 第 307 页 ) 合 成 工 艺 在 主 原 料 共 聚 过 程 中, 同 时 引 入 含 有 氮 杂 环 的 有 机 官 能 团,GDX-401 型 官 能 团 含 量 相 对 较 少, 比 表 面 积 280 m 2 /g, 而 GDX-403 型 不 但 极 性 官 能 团 聚 合 量 多, 孔 径 也 相 对 较 大, 比 表 面 积 370 m 2 /g, 这 是 两 者 的 区 别 这 里 想 提 一 点, 在 干 态 状 态 下, 它 们 极 易 产 生 静 电 团 聚 使 装 柱 操 作 不 便, 在 抗 静 电 剂 如 丙 酮 存 在 情 况 下, 可 使 团 聚 的 填 料 分 散 开 来 典 型 的 分 析 实 例 可 进 行 盐 酸 有 机 胺 等 物 质 的 分 离 测 定 国 外 产 品 可 与 此 对 应 的 是 Porapak R Porapak N Chromosorb 102 等 4 较 强 极 性 的 GDX-501 GDX-502 型 气 相 色 谱 固 定 相 在 生 产 合 成 中 GDX-501 GDX-502 都 是 引 入 了 -CN 基 团 的 较 强 极 性 的 色 谱 填 料, 且 在 GDX 系 列 填 料 中 使 用 广 泛, 比 较 而 言, GDX-501 的 极 性 要 强 物 GDX-502, 较 深 的 颜 色 和 较 强 的 静 电 作 用 也 反 映 出 它 的 强 极 性, 而 GDX-501 的 孔 径 要 小 于 GDX-502 应 用 方 面, 如 C4 烯 烃 异 构 体 CO CO2 等 分 析 测 定, 国 外 同 类 型 产 品 包 括 Hayesep C Chromosorb 104 等 气 相 色 谱 固 定 相 除 GDX 系 列 外, 还 包 括 TDX 系 列 即 碳 分 子 筛 多 孔 硅 胶 系 列 活 性 炭 石 墨 化 碳 黑 5A 分 子 筛 13X 分 子 筛 白 色 担 体 红 色 担 体 及 其 硅 烷 化 产 品 等, 另 文 表 述 309

315 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 蜂 胶 活 性 成 分 及 质 量 控 制 的 研 究 张 明 月 ( 天 津 市 疾 病 预 防 控 制 中 心, 天 津 ) 蜂 胶 (propolis) 是 蜜 蜂 从 植 物 芽 孢 或 树 干 破 皮 伤 处 采 集 来 的 树 脂 ( 树 胶 ), 并 混 入 蜜 蜂 上 颚 腺 的 分 泌 物, 和 蜂 蜡 少 量 花 粉 等 加 工 而 成 的 一 种 具 有 芳 香 气 味 和 黏 性 的 胶 状 固 体 物 质 [1] 主 要 活 性 成 分 有 黄 酮 类 化 合 物 ( 槲 皮 素 芦 丁 山 奈 黄 素 白 杨 黄 素 芹 菜 素 高 良 姜 素 松 属 素 等 ) 萜 烯 类 有 机 酸 ( 阿 魏 酸 咖 啡 酸 苯 甲 酸 等 ) 脂 肪 酸 (10- 羟 基 -α- 癸 烯 酸 等 ) 氨 基 酸 胰 蛋 白 酶 等 活 性 酶 类 维 生 蜂 胶 制 品 有 两 类, 一 类 是 以 水 为 载 体 的, 即 所 谓 水 溶 性 蜂 胶 ; 另 一 类 是 以 酒 精 为 载 体 的, 即 所 谓 醇 溶 或 酒 精 溶 的 蜂 胶 原 胶 ( 即 从 蜂 箱 中 直 接 取 出 的 蜂 胶 ) 中 含 有 杂 质 而 且 重 金 属 含 量 较 高, 不 能 直 接 食 用, 必 须 经 过 提 纯 去 杂 去 除 重 金 属 如 铅 等 之 后 才 可 用 于 加 工 生 产 各 种 蜂 胶 制 品 蜂 胶 的 活 性 成 分 因 产 地 气 候 储 存 方 式 提 取 工 艺 的 不 同 而 不 同, 从 而 使 蜂 胶 质 量 和 功 效 存 在 差 异 蜂 胶 的 质 量 控 制 贯 穿 于 收 购 和 加 工 的 全 过 程, 随 着 现 代 各 种 检 测 技 术 不 断 发 展, 特 别 是 近 年 来 色 谱 技 术 的 日 益 发 展 检 测 手 段 和 能 力 的 不 断 增 强 为 蜂 胶 中 有 效 成 分 的 含 量 测 定 的 研 究 提 供 良 好 的 工 作 平 台, 采 用 先 进 的 现 代 分 析 技 术 色 谱 光 谱 电 泳 技 术 以 及 联 用 技 术, 如 气 相 色 谱 质 谱 联 用 高 效 毛 细 管 电 泳 质 谱 联 用 技 术 和 高 效 液 相 色 谱 质 谱 联 用 技 术, 通 过 现 代 仪 器 分 析 方 法, 分 析 蜂 胶 中 的 有 效 成 分 和 特 有 的 芳 香 物 质, 科 学 建 立 起 相 应 的 质 量 技 术 评 价 平 台 和 质 量 标 准 评 价 平 台, 最 终 推 广 行 业 应 用, 从 而 确 保 蜂 胶 质 量 稳 定 可 控, 使 蜂 胶 这 一 宝 贵 的 资 源 能 更 好 造 福 于 人 类 对 蜂 胶 活 性 分 成 及 其 质 量 控 制 的 几 个 问 题 作 以 下 综 述 : 1 蜂 胶 感 官 的 判 别 农 业 部 颁 发 的 标 准 无 公 害 食 品 - 蜂 胶 (NY ) [1] 中 规 定 蜂 胶 为 不 透 明 团 块 或 碎 片, 在 35 以 上 逐 渐 变 软, 有 粘 性 和 可 塑 性, 有 明 显 的 芳 香 味, 颜 色 由 于 树 种 或 生 产 季 节 不 同 呈 褐 色 灰 褐 暗 绿, 灰 黑 色 等, 有 光 泽, 有 明 显 的 辛 辣 感 GB/T 蜂 胶 [7] 除 了 对 蜂 胶 感 官 有 上 述 描 述 外 还 对 蜂 胶 的 乙 醇 提 取 物 的 感 官 进 行 了 规 定 商 业 部 颁 发 的 蜂 胶 蜂 蜡 (SB/T SB/T ) [8] 则 根 据 感 官 性 状 对 蜂 胶 进 行 了 分 级 2 蜂 胶 黄 酮 类 物 质 的 含 量 蜂 胶 产 品 中 的 蜂 胶 含 量 是 有 一 定 比 例 的, 总 黄 酮 含 量 是 一 个 标 志 性 成 分 指 标, 农 业 部 颁 发 的 标 准 无 公 害 食 品 - 蜂 胶 (NY ) 规 定 总 黄 酮 含 量 8%,GB/T 蜂 胶 中 按 照 总 黄 酮 含 量 和 乙 醇 提 取 物 含 量 的 不 同 对 蜂 胶 和 蜂 胶 乙 醇 提 取 物 分 了 二 级 无 公 害 食 品 - 蜂 胶 (NY ) 使 用 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 蜂 胶 中 常 见 的 高 良 姜 素 (galangin) 槲 皮 素 (quercetin) 芦 丁 (rutin) 杨 梅 酮 (myricetin) 莰 菲 醇 (kaempferol) 芹 菜 素 (apigenin) 松 属 素 (pinocembrin) 柯 因 (chrysine) 等 8 种 黄 酮 含 量, 计 算 总 和 为 总 黄 酮 含 量 该 方 法 同 国 家 质 检 总 局 国 家 蜂 产 品 质 量 监 督 检 验 中 心 颁 布 的 GB/T [9] 中 的 液 相 方 法 基 本 一 致,GB/T 同 时 还 制 订 了 该 8 种 黄 酮 的 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 检 测 法 的 测 定 方 法 GB/T 蜂 胶 则 以 芦 丁 为 对 照, 采 用 分 光 光 度 比 色 法 测 定 总 黄 酮 的 含 量,GB/T [10] 亦 是 采 用 分 光 光 度 比 色 法 测 定 蜂 胶 中 总 黄 酮 含 量 [11] 王 小 平 等 用 高 效 液 相 色 谱 法 建 立 蜂 胶 指 纹 图 谱 分 析 方 法, 用 以 鉴 别 蜂 胶 和 树 胶, 采 用 蜂 胶 黄 酮 类 物 质 中 主 要 成 分 芦 丁 槲 皮 素 白 羊 素 高 良 姜 素 作 为 观 察 指 标, 方 法 学 考 察 中 精 密 度 试 验 重 复 性 试 验 稳 定 性 试 验 色 谱 图 的 相 似 度 均 大 于 0.95, 对 蜂 胶 HPLC 色 谱 图 进 行 解 析, 确 定 有 13 个 共 有 峰, 构 筑 了 蜂 胶 药 材 的 HPLC 色 谱 图 的 指 纹 特 征, 可 作 为 蜂 胶 鉴 别 的 310

316 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 依 据 朱 恩 圆 等 [12] 采 用 RP-HPLC 梯 度 洗 脱 的 方 法 对 蜂 胶 总 黄 酮 进 行 研 究, 对 不 同 产 地 的 蜂 胶 指 纹 图 谱 比 较 选 出 10 个 稳 定 的 且 具 有 代 表 的 峰 作 为 共 有 峰, 建 立 了 蜂 胶 的 指 纹 图 谱 沙 娜 等 [13] 应 用 反 相 高 效 液 相 色 谱 法 使 蜂 胶 中 各 成 分 得 到 较 好 的 分 离, 根 据 检 测 结 果 确 定 了 15 个 共 有 指 纹 峰, 并 指 认 了 其 中 的 14 个 成 分, 建 立 蜂 胶 药 材 指 纹 图 谱, 对 蜂 胶 进 行 质 量 控 制 薛 晓 丽 [14] 则 通 过 使 用 高 效 液 相 色 谱 法 和 气 质 联 用 分 析 仪 将 现 代 的 超 临 界 CO2 流 体 提 取 工 艺 与 传 统 的 乙 醇 浸 出 提 取 工 艺 相 比 较, 结 果 表 明 : 两 种 方 法 都 有 利 于 蜂 胶 有 效 化 学 成 分 的 提 取, 乙 醇 浸 出 提 取 工 艺 有 利 于 提 取 蜂 胶 中 黄 酮 类 物 质, 超 临 界 CO2 流 体 提 取 工 艺 有 利 于 蜂 胶 中 化 学 成 分 的 分 析, 应 根 据 提 取 活 性 成 分 的 主 次 及 具 体 情 况 进 行 选 择 单 体 成 分, 进 行 指 纹 图 谱 研 究, 建 立 指 纹 图 谱 库 20 世 纪 80 年 代 初 发 展 的 毛 细 管 电 泳 (capillaryelectrophoresis,ce) 依 据 样 品 中 各 组 分 之 间 的 迁 移 速 度 和 分 配 行 为 上 的 差 异 而 实 现 分 离 的 一 类 液 相 分 离 技 术, 较 HPLC 测 定, 高 效 毛 细 管 电 泳 法 可 以 更 好 分 离 多 种 黄 酮 类 化 合 物, 并 可 以 对 糖 类 有 机 酸 进 行 同 时 测 定 [15], 与 HPLC 互 补 可 以 测 定 蜂 胶 中 的 芳 香 类 化 合 物 如 酯 类 化 合 物 糖 糖 醇 类 化 合 物 氨 基 酸 脂 肪 酸 及 黄 酮 类 的 含 量 3 蜂 胶 中 的 挥 发 性 成 分 的 研 究 蜂 胶 中 香 气 挥 发 性 成 分 有 萜 烯 类 醇 醛 酮 酯 等 类 别, 其 挥 发 性 成 分 是 其 一 个 重 要 的 质 量 指 标, 具 有 指 纹 特 征 传 统 的 挥 发 性 有 机 物 富 集 方 法 为 水 蒸 气 蒸 馏 和 同 时 蒸 馏 萃 取, 不 能 满 足 快 速 分 析 的 要 求 王 小 平 等 [16] 采 用 GC-MS 法 分 别 对 不 同 产 地 蜂 胶 乙 醚 索 氏 提 取 法 所 得 提 取 物 的 化 学 成 分 进 行 分 析 比 较, 发 现 蜂 胶 的 产 地 生 态 环 境 等 条 件 与 蜂 胶 挥 发 油 种 类 及 含 量 密 切 相 关, 可 考 虑 通 过 选 择 蜂 场 附 近 的 生 态 环 境 如 主 要 树 木 种 类 等, 改 善 蜂 胶 产 品 的 质 量 李 雅 萍 等 [17] 利 用 固 相 微 萃 取 (SPME) 对 蜂 胶 挥 发 性 成 分 进 行 提 取, 采 用 气 相 色 谱 - 质 谱 联 用 技 术 对 提 取 物 进 行 定 性 定 量 研 究, 并 与 溶 剂 ( 乙 醇 乙 酸 乙 脂 ) 提 取 法 对 蜂 胶 挥 发 性 成 分 特 别 是 萜 烯 类 物 质 的 提 取 效 果 进 行 了 比 较, 建 立 了 SPME-GC/MS 联 用 技 术 分 析 蜂 胶 中 香 气 挥 发 性 成 分 方 法, 得 到 较 理 想 的 结 果, 利 用 SPME-GC/MS 联 用 技 术 对 不 同 产 地 采 集 期 的 蜂 胶 成 分 进 行 分 析, 提 取 有 用 的 指 纹 信 息, 为 进 一 步 分 析 蜂 胶 某 些 成 分 的 药 用 价 值 及 蜂 胶 的 开 发 利 用 及 指 纹 图 谱 的 建 立 提 供 依 据 赵 强 等 [18] 采 用 超 临 界 CO2 萃 取 和 冷 冻 分 离 得 到 蜂 胶 挥 发 油, 用 化 学 发 光 法 测 定 蜂 胶 挥 发 油 对 羟 自 由 基 和 超 氧 阴 离 子 自 由 基 的 清 除 性 能, 并 用 色 质 联 用 法 分 析 其 化 学 组 成 实 验 结 果 表 明, 蜂 胶 挥 发 油 能 有 效 抑 制 羟 自 由 基 和 超 氧 阴 离 子 自 由 基 诱 导 的 化 学 发 光, 通 过 GC-MS 分 析, 鉴 定 出 51 种 化 合 物 3.1 蜂 胶 中 的 蜂 蜡 蜂 蜡 在 蜂 胶 中 占 有 约 30%-40%, 农 业 部 颁 发 的 标 准 无 公 害 食 品 - 蜂 胶 (NY ) 中 规 定 蜂 蜡 和 75% 乙 醇 不 溶 物 含 量 45% 该 标 准 采 用 重 量 法 测 定 75% 乙 醇 可 溶 物 含 量 后 采 用 减 量 法 测 定 了 蜂 蜡 和 75% 乙 醇 不 溶 物 含 量 骆 尚 骅 [19] 在 蜂 胶 质 量 控 制 的 几 个 指 标 和 检 则 方 法 一 文 中 采 用 索 氏 提 取 - 重 量 法 测 定 了 蜡 类 含 量 3.2 蜂 胶 中 酚 酸 类 化 合 物 的 研 究 有 机 酸 成 分 也 是 蜂 胶 的 活 性 成 分, 其 含 量 的 变 化 也 会 影 响 蜂 胶 质 量, 蜂 胶 中 的 有 机 酸, 如 苯 甲 酸 咖 啡 酸 阿 魏 酸 香 草 酸 肉 桂 酸 绿 原 酸 等, 具 有 强 烈 的 抗 病 原 微 生 物 和 保 护 动 物 肝 脏 的 作 用, 与 蜂 胶 中 黄 酮 类 物 质 起 协 同 作 用 索 志 荣 [20] 采 用 高 效 液 相 色 谱 分 析 方 法 测 定 了 蜂 胶 浸 膏 中 咖 啡 酸 p- 香 豆 酸 反 式 阿 魏 酸 肉 桂 酸 乔 松 素 白 杨 素 和 高 良 姜 素 7 种 多 酚 化 合 物 的, 并 用 该 方 法 测 定 我 国 不 同 省 份 的 9 个 蜂 胶 浸 膏 样 品, 为 评 价 和 控 制 蜂 胶 的 质 量 提 供 科 学 依 据 孟 霞 等 [21] 建 立 了 高 效 液 相 色 谱 同 时 测 定 蜂 胶 中 的 苯 甲 酸 咖 啡 酸 阿 魏 酸 香 草 酸 肉 桂 酸 绿 原 酸 的 方 法, 用 于 实 际 样 品 分 析, 结 果 满 意, 为 测 定 蜂 胶 液 中 有 机 酸 类 物 质 提 供 了 方 法 依 据 国 家 质 检 总 局 颁 布 了 蜂 胶 中 阿 魏 酸 含 量 的 测 定 方 法 液 相 色 谱 - 紫 外 检 测 法 GB/T [22] 周 立 东 等 [23] 则 采 用 采 用 弱 碱 溶 解 蜂 胶 再 酸 化 萃 取 的 方 法 纯 化 样 311

317 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 品, 用 返 滴 法 测 定, 以 水 杨 酸 作 为 对 照 品 检 测 样 品 中 游 离 酸 含 量, 结 果 测 定 了 5 个 不 同 产 地 [24] 的 蜂 胶 样 品 的 游 离 酸 含 量, 方 法 操 作 简 单, 有 助 于 蜂 胶 质 量 的 鉴 别 李 熠 等 采 用 超 高 效 液 相 色 谱 法 同 时 测 定 了 蜂 胶 中 方 法, 能 够 同 时 测 定 蜂 胶 中 的 阿 魏 酸 类 黄 酮 咖 啡 酸 苯 乙 酯 [25] 等 12 种 活 性 成, 为 建 立 蜂 胶 的 指 纹 图 谱 和 评 价 蜂 胶 质 量 提 供 了 一 种 新 的 方 法 贺 峥 嵘 等 则 采 用 紫 外 分 光 光 度 仪, 傅 立 叶 变 换 红 外 光 谱 仪 以 及 核 磁 共 振 谱 仪 等 不 同 分 析 技 术 对 贵 州 蜂 [26] 胶 中 的 有 机 酸 成 分 进 行 了 研 究 HROBONOVA Katarina 等 采 用 在 线 固 相 萃 取 - 液 相 色 谱 法 测 定 了 蜂 胶 中 芥 草 酸 奎 尼 酸 绿 原 酸 迷 迭 香 酸 对 羟 基 苯 甲 酸 等 有 机 酚 酸 类 物 质, 只 有 对 羟 基 苯 甲 酸 没 有 检 出 4 氧 化 时 间 国 内 外 大 量 的 科 学 研 究 证 明, 蜂 胶 对 机 体 的 诸 多 保 健 功 效 与 其 抗 氧 化 活 性 有 着 密 切 的 关 系 因 此, 蜂 胶 的 抗 氧 化 活 性 特 别 受 到 研 究 者 的 关 注 和 重 视 农 业 部 颁 发 的 标 准 无 公 害 食 品 - 蜂 胶 (NY ) 商 业 部 颁 发 的 蜂 胶 蜂 蜡 (SB/T SB/T ) 以 及 国 家 质 检 总 局 颁 布 的 蜂 胶 (GB/T ) 均 对 氧 化 时 间 进 行 了 规 定, 并 提 供 了 相 应 的 检 测 方 法 5 其 他 方 面 有 资 料 表 明 还 可 以 对 蜂 胶 的 灰 分 酶 活 力 维 生 素 微 量 元 素 以 及 矿 物 质 进 行 分 析 测 定 [19,27-30] [31], 对 于 蜂 胶 浸 提 液, 还 应 增 加 乙 醇 含 量 和 比 重, 从 而 对 蜂 胶 质 量 的 控 制 更 加 全 面 在 蜂 胶 质 量 评 定 中, 不 仅 要 对 蜂 胶 的 感 官 性 状 进 行 观 察 对 天 然 活 性 成 分 进 行 分 析 检 测, 还 要 把 有 毒 物 的 残 留 如 铅 砷 汞 镉 等 重 金 属 污 染 和 农 药 残 留 以 及 霉 菌 致 病 菌 等 指 标 也 应 作 为 质 量 控 制 的 重 要 指 标 农 业 部 颁 发 的 标 准 无 公 害 食 品 - 蜂 胶 (NY ) 对 蜂 胶 中 的 微 生 物 指 标 及 检 验 方 法 重 金 属 指 标 及 检 验 方 法 农 药 残 留 指 标 及 检 验 方 法 均 进 行 了 规 范 国 家 质 检 总 局 颁 发 了 GB/T [32], 采 用 微 波 消 解 - 石 墨 炉 原 子 吸 收 分 光 光 度 法 测 定 蜂 [33] 胶 中 的 铅 Fang Chen 等 利 用 固 相 萃 取 法 处 理 样 品, 电 子 捕 获 - 气 相 色 谱 法 测 定 了 蜂 胶 中 17 种 有 机 氯 杀 虫 剂, 定 量 限 在 2.6~38.1 μg/kg 之 间, 平 均 回 收 率 为 62.6~109.6%, RSD% 为 0.8 ~9.4%, 4,4 -DDE 在 很 多 种 峰 胶 中 被 检 出 6 结 论 蜂 胶 作 为 一 种 独 特 而 宝 贵 的 纯 天 然 保 健 食 品 资 源 和 药 源, 成 为 近 年 来 国 内 外 蜂 产 品 研 究 开 发 的 一 个 热 点 综 合 以 上 各 项 研 究 成 果, 利 用 先 进 的 分 析 手 段 对 蜂 胶 质 量 建 立 系 统 全 面 科 学 的 质 量 评 价, 对 规 范 蜂 产 品 市 场 秩 序, 确 保 蜂 胶 质 量 稳 定 可 控, 使 之 更 大 程 度 的 造 福 于 人 类 参 考 文 献 : [1] NY 无 公 害 食 品 - 蜂 胶. 中 华 人 民 共 和 国 农 业 部. [2] 李 彦 杰, 杨 勇, 阚 健 全. 蜂 胶 化 学 成 分 及 其 生 物 活 性. 粮 食 与 油 脂.2003,12: [3] 徐 响, 张 红 城, 董 捷. 蜂 胶 功 效 成 分 研 究 进 展. 食 品 工 业 科 技.2008,9: [4] 何 晓 波, 周 俐 斐, 芦 柏 震. 蜂 胶 的 药 理 活 性. 中 国 药 业.2006,15: [5] 宫 继 荣. 蜂 胶 在 临 床 各 科 的 应 用. 中 外 健 康 文 摘 医 药 学 刊.2008,5:159. [6] 齐 东 梅. 蜂 胶 的 药 理 作 用 和 临 床 应 用. 首 都 医 药.2008,2: [7] GB/T 蜂 胶. 中 华 人 民 共 和 国 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局. [8] SB/T SB/T 蜂 胶 蜂 蜡. 中 华 人 民 共 和 国 国 内 贸 易 部. [9] GB/T 芦 丁 杨 梅 酮 槲 皮 素 莰 菲 醇 芹 菜 素 松 属 素 苛 因 高 良 姜 素 含 量 的 测 定 方 312

318 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 法 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 检 测 法 和 液 相 色 谱 - 紫 外 检 测 法. 中 华 人 民 共 和 国 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局. [10] GB/T 蜂 胶 中 总 黄 酮 含 量 的 测 定 方 法 分 光 光 度 比 色 法. 中 华 人 民 共 和 国 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局. [11] 王 小 平, 林 励, 白 吉 庆. HPLC 指 纹 图 谱 法 鉴 别 蜂 胶 和 树 胶. 山 西 农 业 科 学.2009,3: ,142. [12] 朱 恩 圆, 窦 玉 玲, 魏 东 芝 等. 蜂 胶 HPLC 指 纹 图 谱 及 质 量 控 制. 中 国 中 药 杂 志 : [13] 沙 娜, 黄 慧 莲, 张 金 强 等. 蜂 胶 的 HPLC 指 纹 图 谱 研 究. 中 国 药 科 大 学 学 报.2009,40: [14] 薛 晓 丽. 蜂 胶 中 天 然 有 机 化 合 物 提 取 工 艺 比 较 及 含 量 测 定. 长 春 师 范 学 院 学 报 ( 自 然 科 学 版 ).2007, 26(6): [15] 潘 建 国, 贺 丽 苹, 郑 尧 隆 等. 蜂 胶 有 效 成 分 测 定 及 质 量 控 制 的 现 代 分 析 技 术 应 用. 中 国 蜂 业.2008, 59(3): [16] 王 小 平, 林 励, 潘 建 国 等. 不 同 产 地 蜂 胶 挥 发 油 成 分 的 GC-MS 比 较 分 析. 药 物 分 析 杂 志 (1): [17] 李 雅 萍, 贺 丽 苹, 陈 玉 芬 等. SPME-GC/MS 联 用 技 术 分 析 蜂 胶 中 挥 发 性 成 分 的 研 究. 现 代 食 品 科 技.2007,97: [18] 赵 强, 张 彬, 李 岂 凡 等. 蜂 胶 挥 发 油 抗 氧 化 性 能 及 其 成 分 研 究. 天 然 产 物 研 究 与 开 发. 2008, 20: [19] 骆 尚 骅. 蜂 胶 质 量 控 制 的 几 个 指 标 和 检 测 方 法. 中 国 养 蜂.1999,50: [20] 索 志 荣, 曹 炜, 秦 海 燕 蜂 胶 浸 膏 中 7 种 多 酚 化 合 物 的 高 效 液 相 色 谱 法 分 析. 食 品 科 学.2008, 29: [21] 孟 霞, 彭 敬 东, 刘 绍 璞. 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 蜂 胶 液 中 的 6 种 有 机 酸. 西 南 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 ). 2008,3: [22] GB/T 蜂 胶 中 阿 魏 酸 含 量 的 测 定 方 法 液 相 色 谱 - 紫 外 检 测 法. 中 华 人 民 共 和 国 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局. [23] 周 立 东, 南 垚, 孙 兰 等. 返 滴 定 法 测 定 蜂 胶 中 游 离 酸 含 量. 中 国 养 蜂.2005,56(5): [24] 李 熠, 赵 静, 薛 晓 锋 等. 超 高 效 液 相 色 谱 法 同 时 测 定 蜂 胶 中 的 12 种 活 性 成 分. 色 谱.2007,25(6): [25] 贺 峥 嵘, 潘 卫 东, 卢 玉 振 等. 贵 州 蜂 胶 中 的 有 机 酸 成 分 研 究. 中 草 药.2002,33(5): [26] HROBONOVA Katarina,LEHOTAY Jozef,CIZMARIK Jozef. Determin-ation of Organic Acids in Prop o-lis by HPLC Using Two Column-s with an OnLine SPE System. Journal of liquid chromatograp-h y & r elated technologies.2009,32(14): [27] 章 彬 佳, 胡 福 良, 郑 火 青 等. 蜂 胶 中 酶 活 力 的 测 定. 中 国 蜂 业.2008,59 (6):7-9. [28] 庞 海 岩, 刘 晨, 朱 茜 等. ICP-AES 测 定 蜂 胶 中 12 种 元 素. 广 东 微 量 元 素 科 学.2002,9(4): [29] 张 帆, 贺 学 锋, 汪 学 楷. 蜂 胶 中 微 量 元 素 的 测 定 离 子 色 谱 法. 食 品 工 业 科 技.2000,21(3): [30] Santana E.Q, Almeida A.A,Jabor A.P,et al. Determination of calcium and magnesium in hydroethanolic extracts of propolis by atomic absorption flame spectrophotometry. Journal of Basic and Applied Pharmaceutical Sciences.2008,29(1): [31] 骆 尚 骅. 蜂 胶 质 量 控 制 的 几 个 指 标 和 检 测 方 法 ( 续 ). 中 国 养 蜂.1999,50: [32] GB/T 蜂 胶 中 的 铅 的 测 定 微 波 消 解 - 石 墨 炉 原 子 吸 收 分 光 光 度 法. 中 华 人 民 共 和 国 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局. [33] Fang Chen1, Lanzhen Chen1, Qiang Wang,et al. Determinati-on of organochlorine pesticides in prop olis by gas chromato-graphy-electron capture detection using double column serie-s solid-phase extr action. Analytical and Bioanalytical Chemi-stry.2009,393(3):

319 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 植 物 激 素 茉 莉 酸 的 短 端 进 样 快 速 CE 手 性 分 离 韩 晔 华, 白 玉, 刘 虎 威 ( 北 京 分 子 科 学 国 家 实 验 室, 生 物 有 机 与 分 子 工 程 教 育 部 重 点 实 验 室, 北 京 大 学 化 学 与 分 子 工 程 学 院 分 析 化 学 研 究 所, 北 京 ) 植 物 激 素 是 植 物 体 内 合 成 的 一 系 列 微 量 有 机 化 合 物, 在 极 低 的 浓 度 下 便 可 引 发 生 理 反 应, 从 而 调 控 植 物 从 种 子 休 眠 萌 发 营 养 生 长 和 分 化 到 生 殖 成 熟 和 衰 老 的 整 个 生 命 过 程 茉 莉 酸 (Jasmonic acid, JA ) 及 其 甲 酯 既 是 其 中 重 要 一 类 茉 莉 酸 是 调 节 高 等 植 物 发 育 应 答 外 界 刺 激 ( 尤 其 是 创 伤 ) 调 节 基 因 表 达 的 一 类 内 源 信 号 分 子 茉 莉 酸 有 两 个 手 性 中 心, 故 有 两 对 对 映 异 构 体 这 些 异 构 体 在 植 物 体 内 的 分 布 和 所 起 的 生 理 活 性 各 不 相 同, 对 其 手 性 分 离 是 进 一 步 研 究 的 必 要 前 提 但 目 尚 未 分 离 出 四 个 手 性 异 构 体 因 此 本 研 究 的 目 标 是 建 立 起 简 单 快 速 的 毛 细 管 电 泳 分 析 方 法 以 实 现 茉 莉 酸 四 个 手 性 异 构 体 的 完 全 分 离, 为 进 一 步 揭 示 茉 莉 酸 的 生 理 调 控 作 用 和 茉 莉 酸 属 植 物 间 的 比 较 性 差 异 奠 定 基 础 毛 细 管 电 泳 因 其 高 效 快 速 及 有 多 种 手 性 添 加 剂 可 选 择 而 在 手 性 分 离 领 域 独 具 优 势 我 们 从 最 常 用 的 环 糊 精 入 手, 根 据 空 腔 大 小 的 匹 配 度 和 静 电 相 互 作 用 筛 选 出 对 茉 莉 酸 有 手 性 识 别 的 添 加 剂 此 外, 我 们 对 缓 冲 液 种 类 浓 度 ph 值, 作 为 手 性 选 择 试 剂 的 环 糊 精 的 种 类 浓 度, 电 泳 分 析 电 压 温 度 的 都 做 了 系 统 优 化, 最 终 实 现 了 茉 莉 酸 四 个 异 构 体 的 同 时 基 线 分 离 为 了 进 一 步 发 掘 电 泳 方 法 快 速 高 效 的 优 势, 我 们 在 已 有 基 础 之 上 开 发 了 毛 细 管 短 端 进 样 的 分 析 方 法 即 将 样 品 从 毛 细 管 出 口 端 用 负 压 力 引 入, 然 后 施 加 与 常 规 电 泳 相 反 的 电 势, 使 得 茉 莉 酸 样 品 区 带 由 出 口 端 向 检 测 窗 口 端 迁 移, 这 样, 有 效 分 离 长 度 就 由 常 规 电 泳 的 cm 缩 短 至 8.5 cm, 使 分 析 时 间 大 大 缩 短 经 系 统 优 化, 茉 莉 酸 的 四 个 异 构 体 在 2.8 min 内 实 现 了 基 线 分 离, 充 分 展 现 了 该 方 法 快 速 分 析 的 优 势 此 外, 该 方 法 与 部 分 填 充 技 术 相 似, 都 是 利 用 部 分 长 度 的 分 离 区 带 对 目 标 物 进 行 分 离, 故 为 我 们 下 一 步 利 用 部 分 填 充 技 术 将 毛 细 管 电 泳 与 质 谱 联 用 实 现 高 灵 敏 度 检 测 奠 定 了 基 础 参 考 文 献 ( 略 ) 国 家 自 然 科 学 基 金 (No ,No ) 资 助 项 目 * 通 讯 联 系 人 : hwliu@pku.edu.cn 314

320 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 免 疫 亲 和 色 谱 LC-QTOF MS 联 用 分 离 分 析 植 物 多 肽 系 统 素 的 研 究 * 杜 甫 佑, 白 玉, 刘 虎 威 ( 北 京 分 子 科 学 国 家 实 验 室, 生 物 有 机 与 分 子 工 程 教 育 部 重 点 实 验 室, 北 京 大 学 化 学 与 分 子 工 程 学 院 分 析 化 学 研 究 所, 北 京,100871) 植 物 多 肽 激 素 是 一 类 非 常 重 要 的 植 物 激 素, 它 在 植 物 的 生 长 发 育 环 境 适 应 等 方 面 具 有 重 要 的 作 用, 是 一 类 防 御 信 号 分 子 建 立 准 确 快 速 分 离 分 析 植 物 体 中 痕 量 多 肽 激 素 的 方 法, 是 研 究 植 物 激 素 分 子 作 用 机 理 的 关 键 问 题 之 一 本 文 采 用 免 疫 亲 和 柱 -LC-QTOF MS 联 用 分 离 分 析 植 物 体 中 的 系 统 素 多 肽 激 素 首 先 采 用 免 疫 方 法 获 得 特 异 性 的 系 统 素 多 克 隆 抗 体, 将 该 抗 体 与 CNBr-Sepharose 4B 凝 胶 耦 合, 制 备 凝 胶 免 疫 亲 和 柱 研 究 了 该 免 疫 柱 的 洗 脱 条 件 上 样 条 件 及 柱 容 量 结 果 表 明, 该 免 疫 亲 和 柱 在 优 化 的 条 件 下, 对 番 茄 系 统 素 的 柱 容 量 可 达 1096 ng/ml, 可 富 集 纯 化 番 茄 系 统 素 土 豆 系 统 素 Ⅰ 和 土 豆 系 统 素 Ⅱ, 这 三 种 系 统 素 在 该 免 疫 柱 上 的 回 收 率 分 别 为 92.9% 56.7% 和 34.8% 另 一 方 面, 对 LC-QTOF MS 的 色 谱 和 质 谱 条 件 进 行 了 优 化, 建 立 了 系 统 素 标 准 分 析 方 法, 其 线 性 范 围 为 ng/ml, 检 出 限 低 于 0.4 ng/ml 采 用 所 建 立 的 免 疫 亲 和 柱 -LC-QTOF MS 联 用 对 番 茄 叶 和 土 豆 叶 进 行 了 分 析, 结 果 表 明, 本 研 究 所 采 用 的 番 茄 叶 和 土 豆 叶 样 品 中 的 番 茄 系 统 素 土 豆 系 统 素 Ⅰ 和 土 豆 系 统 素 Ⅱ 的 含 量 分 别 约 为 和 0.44 ng/ml 参 考 文 献 ( 略 ) 国 家 自 然 基 金 (No 和 ) 和 博 士 后 科 学 基 金 (No ) 资 助 项 目 * 通 讯 联 系 人 : hwliu@pku.edu.cn 315

321 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 动 物 信 息 素 的 分 离 检 测 方 法 研 究 进 展 翁 瑞 1, 2 1 2, 张 晓 丽, 刘 虎 威 (1. 山 东 大 学 化 学 与 化 工 学 院, 山 东 济 南 ;2. 北 京 大 学 化 学 与 分 子 工 程 学 院, 北 京 ) 信 息 素 是 由 生 物 的 分 泌 腺 分 泌, 并 排 出 到 外 环 境 中 的 化 学 物 质, 这 些 化 学 物 质 会 对 其 他 生 物 ( 多 为 同 种 生 物 ) 的 行 为 生 理 活 动 等 产 生 一 定 的 影 响 根 据 产 生 影 响 的 不 同, 信 息 素 可 以 分 为 性 信 息 素 聚 集 信 息 素 等 根 据 化 学 结 构 中 官 能 团 的 不 同, 信 息 素 可 以 分 为 羧 酸 醇 酯 醛 酮 胺 杂 环 化 合 物 等 信 息 素 广 泛 存 在 于 动 物 的 汗 液 尿 液 和 唾 液 中, 多 为 易 挥 发 的 有 机 化 合 物 (VOCs) 这 些 易 挥 发 的 有 机 化 合 物 则 构 成 了 动 物 的 气 味 信 息 素 的 分 泌 由 动 物 的 新 陈 代 谢 状 态 调 节, 由 于 每 个 个 体 都 处 于 不 同 的 新 陈 代 谢 状 态, 所 以 每 个 个 体 都 有 其 独 特 的 气 味, 就 像 人 的 指 纹 这 些 指 纹 特 征 反 映 了 生 物 个 体 的 非 常 重 要 的 生 物 信 息, 可 广 泛 应 用 于 害 虫 防 治 和 疾 病 诊 断 等 德 国 小 蠊 作 为 病 原 体 的 带 菌 者, 极 易 引 起 过 敏 性 疾 病 Nojima 将 气 相 色 谱 (GC) 与 触 角 电 位 检 测 (EAD) 联 用, 检 测 其 性 信 息 素, 并 化 学 合 成 了 这 一 化 合 物 从 行 为 测 试 和 现 场 捕 获 实 验 的 结 果 来 看, 此 合 成 的 化 合 物 具 有 非 常 好 的 活 性 这 提 示 我 们 可 以 将 次 人 工 合 成 的 德 国 小 蠊 的 性 信 息 素 应 用 于 此 害 虫 的 监 测 和 控 制, 从 而 提 供 了 一 种 非 常 好 的 防 治 德 国 小 蠊 的 方 法 疾 病 诊 断 方 面,Berkel 等 通 过 对 人 呼 出 气 体 中 的 VOCs 的 分 析, 发 现 吸 烟 者 和 非 吸 烟 者 呼 出 的 气 体 中,2,5- 二 甲 基 己 烷 十 二 烷 2,5- 二 甲 基 呋 喃 和 2- 甲 基 呋 喃 四 种 化 合 物 的 含 量 有 很 大 差 异, 这 可 以 作 为 区 分 吸 烟 者 和 非 吸 烟 者 的 重 要 的 生 物 信 息 Buszewski 等 对 20 名 非 吸 烟 者 4 名 被 动 吸 烟 者 和 14 名 吸 烟 者 呼 出 的 气 体 进 行 气 相 色 谱 - 质 谱 (GC-MS) 分 析, 发 现 吸 烟 者 和 被 动 吸 烟 者 呼 出 的 气 体 中 含 有 较 多 的 乙 腈 呋 喃 3- 甲 基 呋 喃 2,5- 二 甲 基 呋 喃 2- 丁 酮 辛 烷 和 癸 烷 等, 而 非 吸 烟 者 呼 出 的 气 体 中 含 有 更 多 的 饱 和 烃 Belda-Iniestaa 等 和 Song 等 对 肺 癌 患 者 呼 出 气 体 中 的 VOCs 进 行 了 分 析, 据 此 可 对 肺 癌 进 行 初 步 的 预 测 为 了 对 信 息 素 的 各 个 成 分 进 行 鉴 定, 并 进 一 步 挖 掘 其 指 纹 特 征 中 蕴 含 的 生 物 信 息, 开 发 有 效 的 分 离 检 测 方 法 是 非 常 必 要 的 Zhang 综 述 了 信 息 素 的 样 本 预 处 理 方 法 信 息 素 成 分 的 检 测 方 法, 以 及 信 息 素 中 蕴 含 的 生 物 信 息 的 提 炼 方 法, 并 讨 论 了 提 炼 生 物 信 息 的 重 要 性 及 前 景 本 文 综 述 了 动 物 信 息 素 的 样 本 预 处 理 方 法 和 分 离 检 测 方 法 的 研 究 进 展, 并 对 这 一 方 向 未 来 的 发 展 趋 势 进 行 了 展 望 * 通 讯 联 系 人 : hwliu@pku.edu.cn 316

322 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 磁 性 分 离 在 植 物 类 转 基 因 食 品 检 测 中 的 应 用 王 爱 迪, 冉 晓 华, 万 谦 宏, 赵 卫 东, 陈 磊 (1. 天 津 大 学 药 物 科 学 与 技 术 学 院, 天 津 ; 2. 天 津 出 入 境 检 验 检 疫 局 动 植 物 和 食 品 检 测 中 心, 天 津 ) 自 20 世 纪 80 年 代 迅 速 崛 起 的 植 物 基 因 工 程 技 术 为 抗 虫 害, 抗 除 草 剂 等 育 种 技 术 开 辟 了 新 的 途 径, 同 时 转 基 因 作 物 被 大 面 积 种 植, 由 其 加 工 而 成 的 转 基 因 食 品 在 世 界 范 围 内 引 起 了 人 们 的 广 泛 关 注 转 基 因 食 品 对 于 人 体 和 环 境 的 安 全 性 仍 是 公 众 争 议 的 焦 点, 各 国 都 要 求 对 转 基 因 食 品 进 行 定 性 和 定 量 的 检 测 基 于 基 因 组 核 酸 模 板 的 PCR 检 测, 是 目 前 最 常 用 的 转 基 因 食 品 检 测 方 法 传 统 的 核 酸 纯 化 方 法 以 有 机 溶 剂 作 为 蛋 白 变 性 剂, 操 作 繁 琐, 耗 时 耗 力 生 物 磁 分 离 技 术 由 于 具 有 快 速 简 便 绿 色 环 保 对 生 物 样 品 影 响 小 易 于 实 现 自 动 化 等 优 点, [1-3] 在 核 酸 分 离 纯 化 等 生 物 学 领 域 日 益 体 现 出 了 重 要 的 作 用 由 于 食 品 的 成 分 复 杂 而 粘 稠, 从 中 提 取 基 因 组 DNA 所 用 的 磁 性 微 球 需 要 具 有 更 高 的 饱 和 磁 化 强 度, 更 好 的 单 分 散 性 和 更 低 的 剩 磁 本 研 究 报 道 了 利 用 溶 剂 热 法 制 备 单 分 散 性 好, 磁 响 应 性 高 的 磁 性 微 球, 通 过 表 面 修 饰, 获 得 四 氧 化 三 铁 / 二 氧 化 硅 复 合 微 球, 并 将 其 作 为 吸 附 剂, 用 于 食 品 中 基 因 组 DNA 的 提 取 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 与 试 剂 JEOL 透 射 电 子 显 微 镜,TDL-40B 型 低 速 台 式 大 容 量 离 心 机,VS-15 小 型 离 心 机,UV2450 紫 外 分 光 光 度 计,DYCP-31C 水 平 电 泳 槽,BioDoc-IT 凝 胶 成 像 系 统,FeCl 3 6H 2 O( 天 津 市 双 船 化 学 试 剂 厂 ), 乙 二 醇 三 乙 二 醇 醋 酸 钠 ( 天 津 科 威 化 学 试 剂 公 司 ), 十 二 烷 基 硫 酸 钠 聚 乙 二 醇 8000( 北 京 鼎 国 生 物 技 术 有 限 公 司 ) 四 乙 氧 基 硅 烷 (TEOS, 武 大 有 机 硅 新 材 料 有 限 公 司 ), 蛋 白 酶 K( 德 国 merck 公 司 ), 盐 酸 胍 ( 天 津 市 光 复 精 细 化 工 研 究 所 ) 1.2 磁 性 微 球 的 制 备 及 修 饰 [4] 按 照 文 献 的 溶 剂 热 还 原 方 法, 制 备 Fe 3 O 4 磁 性 微 球, 饱 和 磁 化 强 度 (Ms) 达 到 emu/g 按 照 Sol-gel 方 法, 在 磁 珠 表 面 进 行 TEOS 修 饰, 得 到 以 Fe 3 O 4 为 核, 以 SiO 2 为 壳 的 复 合 磁 性 微 球 1.3 DNA 提 取 及 检 测 称 取 大 豆 粉, 豆 奶 粉, 豆 腐, 土 豆, 薯 条 各 0.5g 于 离 心 管 中, 加 入 预 热 的 细 胞 裂 解 液 5 ml (0.01mol/LTris-HCl,0.15mol/LNaCl,0.002mol/L 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠,2% 十 二 烷 基 磺 酸 钠 (SDS),pH 8.0),5 mol/l 的 盐 酸 胍 溶 液 0.5mL,10mg/mL 的 蛋 白 酶 K 溶 液 50μL 55 温 育 30 min, 加 入 10μl3mg/mL 的 RNase, 反 应 5 min, 放 入 4 冰 箱 30 min, 然 后 于 4000 rpm 离 心 10 min, 取 上 清 于 1.5mL 离 心 管 中,12000rpm 离 心 5 min 得 到 样 品 液 取 0.5 ml10mg/ml 的 磁 性 微 球 悬 液 放 于 1.5mL 的 离 心 管 中, 磁 分 离 弃 去 清 液, 加 入 吸 附 液 (PEG %,2 mol/l NaCl)1.0mL, 振 摇 混 匀, 加 入 样 品 液 0.5mL, 室 温 充 分 混 匀 10 min 磁 场 分 离, 弃 去 清 液 再 加 入 吸 附 液 1.0 ml, 同 法 处 理 一 遍 70% 乙 醇 洗 涤 磁 珠 两 遍, 弃 去 洗 涤 液 室 温 下 风 干 加 入 TE (0.01 mol/l EDTA,0.025mol/LTris-HCl, ph 8.0) 缓 冲 液 0.5mL, 轻 轻 颠 倒 10min, 使 磁 珠 充 分 分 散 均 匀 磁 分 离, 清 液 即 为 DNA 提 取 液, 备 用 空 白 组 操 作 时 不 加 样 品 液, 其 余 操 作 均 相 同 以 空 白 组 为 对 照, 用 紫 外 分 光 光 度 计 上 测 定 在 260 nm 和 280 nm 的 吸 收 值 A 260 和 A 280, 以 317

323 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 A 260 /A 280 的 值 鉴 定 DNA 的 纯 度 取 10μLDNA 提 取 液 在 1% 琼 脂 糖 凝 胶 上 电 泳 检 测,TAE 为 缓 冲 溶 液, 溴 化 乙 锭 染 色, 在 凝 胶 成 像 仪 上 观 察 并 拍 照 2 结 果 2.1 磁 性 微 球 的 表 征 用 JEOL 透 射 电 子 显 微 镜 对 磁 性 Fe 3 O 4 颗 粒 的 粒 径 和 形 貌 进 行 分 析, 见 图 1 可 以 看 出 所 制 备 的 磁 性 微 球 单 分 散 性 良 好, 球 形 规 整 图 1 Fe3O4/SiO2 磁 性 微 球 的 透 射 电 镜 照 片 100 nm(a) 和 800 nm(b) 2.2 转 基 因 作 物 及 其 制 品 DNA 提 取 及 其 检 测 由 表 1 所 示, 提 取 的 食 品 DNA 的 A 260 /A 280 均 介 于 之 间, 表 明 其 纯 度 较 高, 其 质 量 满 足 后 续 PCR 的 检 测 要 求 同 时 由 图 2 的 电 泳 检 测 结 果 可 知, 食 品 的 加 工 过 程 对 其 DNA 片 段 的 影 响 较 大, 从 马 铃 薯 鲜 品 以 及 豆 粉 中 可 以 提 取 到 基 因 组 DNA, 其 分 子 量 大 于 10kb, 但 薯 片 以 及 豆 腐 豆 奶 粉 等 食 材 由 于 在 加 工 过 程 中 受 到 ph 温 度 影 响 较 大, 只 能 提 取 到 小 片 段 DNA 图 2 DNA 的 1% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 图 1. 豆 腐 ;2. 豆 奶 粉 ;3. 大 豆 粉 ;4. 薯 条 ;5. 马 铃 薯 -M.1 kb DNA ladder 318

324 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 表 1 DNA 紫 外 检 测 结 果 样 品 豆 腐 豆 奶 粉 大 豆 粉 薯 条 土 豆 A A A260/A 讨 论 综 上 所 述, 热 溶 剂 还 原 法 制 备 得 到 的 磁 性 微 球 具 有 磁 响 应 性 高 和 粒 径 分 布 均 一 的 特 点, 可 以 作 为 DNA 的 固 相 萃 取 剂 以 磁 性 微 球 为 吸 附 剂 的 生 物 磁 分 离 技 术 方 法 简 便, 快 速, 适 用 于 转 基 因 作 物 以 及 深 加 工 食 品 的 核 酸 纯 化 以 及 后 续 生 物 鉴 定, 在 转 基 因 食 品 进 出 口 检 验 和 规 范 食 品 市 场 方 面 具 有 广 阔 的 应 用 前 景 参 考 文 献 : [1] ZC Zhang, C Yuan, QH Wan. [J]. Analytical Chem, 2007, 35:31-36 [2] Saiyed ZM, Ramchand CN, Telang SD. [J]. Phys: Condens Matter, 2008, 20: [3] RB Shi, YC Wang, YL Hu, et al. [J]. J Chromatogr B, 2009, 1216: [4] SH Xuan, YJ Wang, JC Yu, et al. [J]. Chem Mater, 2009, 21: Detection of Genetically Modified Food Based on Magnetic Microspheres WANG Ai-di 1, RAN Xiao-hua 1, WAN Qian-hong 1, ZHAO Wei-dong 2, CHEN Lei 1, (1.College of Pharmaceuticals and Biotechnology, Tianjin University, Tianjin ; 2. Animal & Plant & Foodstuffs Inspection Center of Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Tianjin ) Abstract: The genetically modified food (GMF) captivated widespread attention since 1980s. Since the safety of GMF remains the focus of public controversy, it is necessary to make the qualitative and quantitative detection. The most accepted analytical methods for GMF detection is based on DNA techniques, that is polymerase chain reaction (PCR). In comparison with traditional methods using liquid-liquid extraction, the solid-phase process developed in this work is characterized by simplify, expedite, and amenable to automation. Magnetite microspheres were synthesized using a hydrothermal method and follow up by a sol-gel process. The multiple beads were comprised of a magnetite core and silica shell with the saturation magnetization values up to emu/g. They were used as solid-phase adsorbent for rapid extraction of genomic DNA from plant source food. Keywords: Magnetic Microspheres; Hydrothermal Method; Genetically Modified Food; DNA Extraction 319

325 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 原 子 层 沉 积 法 制 备 键 合 相 硅 胶 肖 得 力, 万 谦 宏, 陈 磊 ( 天 津 大 学 药 物 科 学 与 技 术 学 院, 天 津 ) 硅 胶 基 质 分 离 载 体 具 有 机 械 强 度 好, 孔 结 构 和 表 面 积 易 于 控 制, 化 学 和 热 稳 定, 表 面 具 有 足 够 的 可 反 应 硅 羟 基 等 优 点, 成 为 各 种 分 离 载 体 的 理 想 基 质 材 料 硅 胶 表 面 修 饰 的 方 法 主 要 有 液 相 反 应 法 自 组 装 法 超 临 界 流 体 反 应 法 和 原 子 层 沉 积 法 与 其 他 方 法 相 比, 原 子 层 沉 积 法 避 免 了 价 格 昂 贵 且 污 染 环 境 的 有 机 溶 剂 或 超 临 界 流 体 等 反 应 介 质 的 使 用, 同 时 具 有 反 应 耗 时 短, 易 于 扩 大 生 产 及 有 机 功 能 基 团 键 合 量 高 等 优 势 为 硅 胶 基 质 分 离 载 体 的 生 产 开 辟 [1-5] 了 一 条 节 能 降 耗, 环 境 友 好 的 绿 色 途 径 我 们 利 用 原 子 层 沉 积 法 制 备 了 苯 基 键 合 硅 胶 和 环 氧 丙 基 键 合 硅 胶, 可 以 获 得 比 传 统 液 相 法 更 高 的 键 合 量 在 此 基 础 上 制 备 了 表 面 为 二 醇 基, 孔 内 为 间 氨 基 苯 硼 酸 的 新 型 限 进 介 质 固 相 萃 取 剂, 以 儿 茶 酚 胺 类 药 物 作 为 顺 式 二 羟 基 化 合 物 模 型, 其 在 制 备 的 新 型 限 进 性 固 相 萃 取 剂 上 具 有 较 高 的 回 收 率 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 与 试 剂 GSHA-1 型 高 压 反 应 釜 ( 威 海 鑫 泰 化 工 设 备 厂 ),5μm 球 形 硅 胶 ( 天 津 市 倍 思 乐 色 谱 技 术 开 发 中 心 ), 苯 基 三 甲 氧 基 硅 烷 及 γ- 缩 水 甘 油 醚 氧 基 丙 基 三 甲 氧 硅 烷 ( 武 大 有 机 硅 新 材 料 股 份 有 限 公 司 ),Fe 3 O 4 -SiO 2 复 合 磁 性 微 球 ( 天 津 市 倍 思 乐 色 谱 技 术 开 发 中 心 ), 磺 酸 化 聚 合 物 微 球 (50μm, 天 津 市 倍 思 乐 色 谱 技 术 开 发 中 心 ) 1.2 原 子 层 沉 积 法 制 备 键 合 硅 胶 称 取 5.0 g 经 过 酸 化 干 燥 处 理 过 的 球 形 硅 胶 放 入 坩 埚 中, 将 其 置 于 高 压 釜 内, 加 入 3.0mL γ- 缩 水 甘 油 醚 氧 基 丙 基 三 甲 氧 硅 烷 和 1.0mL 三 乙 胺, 密 封 高 压 釜, 抽 气 至 真 空, 加 热 至 120 反 应 4 h 待 反 应 釜 冷 却 至 室 温, 取 出 反 应 产 物, 依 次 用 甲 苯, 甲 醇, 甲 醇 - 水 (1:1,V/V) 甲 醇 和 丙 酮 洗 涤 60 真 空 干 燥 12 h, 即 得 环 氧 基 键 合 硅 胶 将 硅 烷 试 剂 换 成 苯 基 三 甲 氧 基 硅 烷 即 可 得 到 苯 基 键 合 硅 胶 作 为 对 照, 采 用 传 统 液 相 法 制 备 键 合 相 硅 胶 1.3 限 进 性 硅 胶 材 料 的 制 备 称 取 1.0g 环 氧 丙 基 键 合 硅 胶 和 1.0g 磺 酸 化 聚 合 物 球, 置 于 100mL 离 心 管 中, 加 入 50mL 去 离 子 水,65 摇 床 反 应 48h 反 应 结 束 后, 依 次 用 水 和 甲 醇 洗 涤, 挥 干, 加 入 50mL 氯 仿,3500 rpm 离 心 10min, 倾 去 浮 于 氯 仿 上 层 的 磺 酸 化 聚 合 物 微 球 将 下 层 环 氧 丙 基 键 合 硅 胶 置 于 三 口 瓶 中, 加 入 ph3.0 的 盐 酸 溶 液 50mL,90 反 应 2h 反 应 结 束 后, 依 次 用 水 和 甲 醇 洗 涤 60 真 空 干 燥 12 h 得 到 孔 内 为 环 氧 丙 基, 孔 外 为 二 醇 基 的 键 合 硅 胶 加 入 0.4g 间 氨 基 苯 硼 酸, 加 去 离 子 水 约 50mL, 均 匀 分 散, 用 3MNaOH 溶 液 调 ph 到 8.5, 超 声 溶 解 10min 后, 再 用 3MNaOH 溶 液 调 ph 到 8.5 室 温 下 轻 柔 摇 晃 24h, 反 应 结 束 后 依 次 用 0.5MNaCl 溶 液,0.1M NaHCO 3 溶 液, 0.1 mmhcl 溶 液 及 去 离 子 水 洗 涤 填 料 至 中 性, 抽 滤,60 真 空 干 燥 12h, 得 到 孔 内 为 间 氨 基 苯 硼 酸, 孔 外 为 二 醇 基 的 限 进 性 键 合 硅 胶 作 为 对 照, 制 备 孔 内 外 均 键 合 二 醇 基 的 硅 胶 和 孔 内 外 均 键 合 间 氨 基 苯 硼 酸 的 硅 胶 2 结 果 与 讨 论 2.1 苯 基 键 合 硅 胶 的 性 能 表 征 通 过 扫 描 电 镜 照 片, 考 察 苯 基 键 合 硅 胶 微 球 的 形 貌 和 粒 径 分 布 如 图 1 所 示, 填 料 粒 径 320

326 2010 年 9 月 第 一 届 环 渤 海 色 谱 学 术 交 流 会 ( 第 十 九 届 天 津 市 色 谱 学 术 交 流 会 ) 会 报 在 5μm 左 右, 单 分 散 性 良 好 2.2 苯 基 键 合 硅 胶 填 料 色 谱 性 能 的 比 较 为 了 评 价 两 种 不 同 方 法 制 备 的 苯 基 键 合 硅 胶 填 料 分 离 结 构 相 似 的 芳 香 化 合 物 的 色 谱 性 能, 我 们 选 取 苯 酚 / 对 氯 硝 基 苯 / 萘 作 为 分 子 探 针, 在 甲 醇 - 水 流 动 相 条 件 下, 比 较 三 种 物 质 的 分 离 情 况, 对 氯 硝 基 苯 和 萘 在 液 相 法 制 备 的 苯 基 硅 胶 填 料 上 两 峰 重 叠, 而 在 原 子 层 沉 积 法 制 备 的 硅 胶 填 料 上 分 离 度 达 到 这 是 由 于 原 子 层 沉 积 法 制 备 的 苯 基 键 合 硅 胶 的 键 合 量 更 高, 可 达 到 3.6 mmol/m 2, 对 模 型 化 合 物 的 保 留 能 力 更 强 2.3 儿 茶 酚 胺 类 药 物 回 收 率 的 测 定 图 1 苯 基 键 合 硅 胶 的 扫 描 电 镜 图 图 2 去 甲 肾 上 腺 素 肾 上 腺 素 多 巴 胺 的 回 收 率 选 用 去 甲 肾 上 腺 素 肾 上 腺 素 多 巴 胺 等 三 种 儿 茶 酚 胺 类 药 物 评 价 环 氧 基 键 合 硅 胶 (A), 321