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1 Chinese Journal of Cell Biology 2018, 40(12): DOI: /cjcb 人源跨膜蛋白 43(TMEM43) 的检测细胞内定位及体外真核表达 1, 张海霞李倩王丹赵克学韩玉梅王兴陇梁浩勤邓盈盈 3 1 1,2 佟春微李向茸马忠仁冯若飞 1,2* ( 1 西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室, 兰州 ; 2 甘肃省动物细胞工程技术研究中心, 兰州 ; 3 西北民族大学生命科学与工程学院, 兰州 ; 4 兰州民海生物工程有限公司, 兰州 ) 摘要为探究人源跨膜蛋白 43(TMEM43) 基因含量定位分布及体外真核表达情况, 利用 RT-PCR 及 Western blot 方法分别检测内源 MRC-5 和 HEK293 细胞内 TMEM43 基因及其蛋白表达情况, 采用间接免疫荧光实验进一步分析其在 MRC-5 细胞内的分布 ; 构建重组表达载体 pcdna3.1- EGFP-TMEM43, 转染至 HEK293 细胞内检测外源 TMEM43 在 HEK293 细胞内的基因和蛋白表达情况结果显示, 基因水平 TMEM43 在 MRC-5 细胞内的表达明显高于 HEK293 细胞, 蛋白水平仅能检测到 MRC-5 细胞内 TMEM43 的表达重组表达质粒 pcdna3.1-egfp-tmem43 转染 HEK293 细胞后, 基因水平 TMEM43 表达显著升高, Western blot 可检测到转染后细胞内 TMEM43 蛋白成功表达结果表明, 不同细胞表达 TMEM43 含量存在差异, 肺来源细胞内 TMEM43 的表达明显高于肾来源的细胞 ; 构建的重组载体 pcdna3.1-egfp-tmem43 可成功转染 HEK293 细胞并表达该研究为 TMEM43 结构及功能与疾病相关机理的进一步探究提供了实验依据关键词跨膜蛋白 43; 真核表达载体 ; 间接免疫荧光实验 Detection, Intracellular Localization and Eukaryotic Expression In Vitro of TMEM43 Gene of Human Zhang Haixia 1,2, Li Qian 3, Wang Dan 4, Zhao Kexue 3, Han Yumei 3, Wang Xinglong 3, Liang Haoqin 3, Deng Yingying 3, Tong Chunwei 3, Li Xiangrong 1, Ma Zhongren 1,2, Feng Ruofei 1,2 * ( 1 Key Bio-Engineering and Technology Laboratory of the Northwest Minzu University, Lanzhou , China; 2 Gansu Engineering Research Center for Animal Cell, Lanzhou , China; 3 Life Science and Engineering College of Northwest Minzu University, Lanzhou , China; 4 Lanzhou Minhai Bioengineering Co. Ltd, Lanzhou , China) Abstract The purpose of this research was to study the content, location, distribution, and expression of human transmembrane protein 43 (TMEM43) gene. TMEM43 gene and protein expression in MRC-5 and HEK293 cells were analyzed by RT-PCR and Western blot, respectively. TMEM43 protein distribution in MRC-5 cells was examined through indirect immunofluorescence assay (IFA). Then construction and transfection of pcdna3.1-egfp-tmem43 into HEK293 cells were performed in order to detect the expression of TMEM43 gene and protein. The results showed that gene expression of TMEM43 in MRC-5 cells was significantly higher than in HEK293 cells with protein expres- 收稿日期 : 接受日期 : 国家自然科学基金 ( 批准号 : ) 国家民委中青年英才计划[ 批准号 : (2018)98] 和教育部长江学者和创新团队发展计划 ( 批准号 : IRT17R88) 资助的课题 * 通讯作者 Tel: , fengruofei@xbmu.edu.cn Received: June 21, 2018 Accepted: October 26, 2018 This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No ), Young Talent of SEAC [Grant No.(2018)98] and Changjiang Scholars and Innovative Research Team in University (Grant No.IRT17R88) *Corresponding author. Tel: , fengruofei@xbmu.edu.cn 网络出版时间 : :32:38 URL:

2 张海霞等 : 人源跨膜蛋白 43(TMEM43) 的检测细胞内定位及体外真核表达 2003 sion only occurring in MRC-5 cells. After transfecting recombinant pcdna3.1-egfp-tmem43 into HEK293 cells, gene expression of TMEM43 was significantly increased along with successful protein expression. TMEM43 content of the lung cells (MRC-5) were significantly higher than the kidney cells (HEK293); the recombinant vector pcdna3.1- EGFP-TMEM43 was successfully transfected into HEK293 cells and expression. This study provided experimental evidence for the further research into the structure, function, and related mechanisms of TMEM43. Keywords transmembrane protein 43 (TMEM43); eukaryotic expression vector; indirect immunofluorescence assay (IFA) 跨膜蛋白 43(transmembrane protein 43, TMEM43), [1] 又称 luma, 在人体中主要由 TMEM43 基因编码该蛋白通过在内核膜上形成蛋白复合体来维持核包膜结构该蛋白在组织中的定位分布尚不清晰 [2] Franke 等证实, TMEM43 存在于心肌闰盘而不是在 [3] 核膜上 Christensen 等则研究发现, TMEM43 主要定 [4] 位于组织的肌纤维膜何仗群等通过生物信息学预测发现, TMEM43 蛋白质有 98% 类似于鼠蛋白, 且存在 [5] 于多种真核和原核生物中 Merner 等从患者或携带者的白细胞及心脏组织中提取全长 TMEM43 cdna, 该研究表明, TMEM43 在血液和心脏组织中均存在致心律失常性右室心肌病, 又称致心律失常性右室发育不良 (arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy, ARVD/C) 和埃德型肌营养不良症 (Emery-Dreifuss muscular dystrophy, EDMD), 与 TMEM43 [6-10] 的突变相关, 研究表明, TMEM43 的基因突变导致了全外显性的 ARVC TMEM43 基因上游具有 PPARγ 反应元件, 这也可能就是导致 ARVC 患者出现 [4] 纤维脂肪性心肌的原因目前, 对于该基因的认识十分有限, 蛋白功能上有待进一步的研究 ; 临床上对于 ARVC 的诊断和治疗亦十分困难基于此, 本研究根据人源 TMEM43 基因序列, 以 MRC-5 和 HEK293 细胞为材料, 分析不同组织人源细胞中 TMEM43 基因及蛋白表达情况构建真核表达载体 pcdna3.1- EGFP-TMEM43, 利用脂质体法将该重组质粒转染至真核 HEK293 细胞中, 利用 RT-PCR 技术检测目的基因转录情况 ; Western blot 检测目的蛋白表达情况该研究旨在分析 TMEM43 基因表达情况, 为探究其生物学功能奠定实验基础, 也为临床诊断 ARVC 提供一定的理论依据 1 材料与方法 1.1 细胞人胚肺成纤维细胞 (MRC-5) 人胚肾细胞 (HEK293) 由甘肃省动物细胞工程技术研究中心提供 1.2 主要试剂和仪器胎牛血清购自兰州民海生物工程有限公司 ; 质粒小提试剂盒培养细胞 / 细菌总 RNA 提取试剂盒高纯质粒小提试剂盒 TIANScript M-MLV Ta q DNA 聚合酶均购自北京天根生化科技有限公司 ; pmd18-t Nhe I EcoR V 限制性内切酶 T4 DNA 连接酶均购自大连宝生物工程有限公司 ; SYBR Select Master Mix 试剂盒购自美国 ABI 公司 ; Lipofectamine TM 2000 Reagent 购自 Invitrogen 公司 ; TCL 显色试剂盒购自 PerkinElmer 公司 ; 兔抗 TMEM43 抗体鼠抗 β-actin 抗体购自 Abcam 公司 ; 山羊抗兔 IgG-HRP 山羊抗鼠 IgG-HRP 山羊抗兔 IgG-Alexa Fluor 594 购自 Jackson 公司 ; DAPI 染色液购自碧云天生物技术研究所 ; Easy Pure Quick Gel Extraction Kit 购自北京全式金生物技术有限公司 ; 感受态细胞 BL21 表达载体 pcdna3.1-egfp 均由西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室提供 ; PCR 仪为德国 Biometra 公司产品 ; 实时荧光定量 PCR 仪为美国 ABI 公司产品 ; 紫外分光光度计为德国 Eppendorf 公司产品 ; 凝胶成像系统为美国 GE 公司产品 ; 激光共聚焦显微镜为日本尼康公司产品 1.3 引物设计与合成根据 GenBank 公布的人源 TMEM43 基因序列 ( 登录号 ): NM_ ), 利用 Primer Premier 5 软件设计 1 对表达引物 (TMEM43-bdF/R), 在上游引物和下游引物中分别加入 Nhe I 和 EcoR V 酶切位点 ( 下划线 ), 并在上游引物中引入 Kozak 序列 ( 粗体 ); 同时, 另设计 1 对 qpcr 检测引物 (TMEM43-qF/R) 引物均由生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司合成 ( 表 1) 1.4 TMEM43 基因水平表达的检测 RT-PCR 方法检测目的基因转录分别收取个不同代次的 MRC-5 和 HEK293 细胞进行

3 2004 研究论文总 RNA 提取反转录获得的 cdna 用于 PCR 扩增 TMEM43 基因, 反应体系为 : DEPC H 2 O 18.5 μl 上下游引物 (TMEM43-bdF/R) 各 0.5 μl(ol) 10 PCR buffer 2.5 μl dntps(10 mmol) 0.5 μl Taq DNA 聚合酶 0.5 μl cdna 2 μl 总体系 25 μl, 反应条件如下 : 94 C 预变性 5 min; 94 C 变性 50 s, 60 C 退火 50 s, 72 C 延伸 90 s, 共 35 个循环 ; 72 C 延伸 10 min 反应结束后, 用 10 g/l 的琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物, 每代次细胞重复检测 3 次, 不同代次分别进行检测 SYBR Green I 实时荧光定量 PCR 方法检测目的基因采用 SYBR Green I 实时荧光定量 PCR 方法对中所得 RT 产物进行检测反应体系如下 : SYBR Select Master Mix(2 ) 12.5 μl, DEPC H 2 O 9.7 μl, 上下游引物 TMEM43-qF/R(10 pmol/μl) 各 0.4 μl, RT 产物 2.0 μl 反应条件如下 : 95 C 30 s; 95 C 5 s, 61.5 C 35 s, 共 40 个循环 ; 95 C 15 s; 65 C 至 95 C, 每 0.5 C/s, 10 s/cycle 为间隔绘制熔解曲线, 根据实验结果计算 MRC-5 细胞及 HEK293 细胞中 TMEM43 基因的含量表 1 引物序列 Table 1 Primer sequence 引物名称 Primer name 引物序列 Sequence of primer 大小 (bp) Size (bp) TMEM43-qF 5 -ATG TTC ATG GGC CTC AAC CTT A-3 88 TMEM43-qR 5 -GGC CAA TGT TGA CCA GGT CTC-3 TMEM43-bdF 5 -CTA GCT AGC CAC CAT GGC MGC GAA YTA TTC CAG TAC TMEM43-bdR 1.5 TMEM43 蛋白水平表达的检测 5 -CGG ATA TCC TCC ARC TTT TTG GYT GGC A-3 分别收取个不同培养代次 MRC-5 和 HEK293 细胞, RIPA 裂解, 产物经 SDS-PAGE 电泳, 条带在 60 V 低温条件下转印至 PVDF 膜用 50 g/l 脱脂奶粉封闭, 封闭时温度为 37 C, 水平 80 r/min 震荡 1 h 加入稀释的兔抗 TMEM43 抗体, 37 C 摇床孵育 2 h, PBST 洗 5 次, 5 min/ 次 ; 再加入 HRP 标记的山羊抗兔二抗, 37 C 摇床孵育 1 h, PBST 洗 5 次, ECL 显色并观察结果, 每代次细胞重复检测 3 次, 不同代次分别进行检测 1.6 TMEM43 蛋白在 MRC-5 细胞中的定位取 MRC-5 细胞铺至 6 孔板, 待细胞密度至 70% 以上时, 弃去原培养基 ; PBS 洗 3 次, 每次 5 min; 加入 80 g/l 预冷丙酮 (1 ml/ 孔 ), 固定 15 min; 弃去, 晾干, 加入 0.1 ml/l Triton X-100 对细胞透化处理 15 min; PBS 洗 3 次, 每次 5 min, 用 50 g/l 牛血清白蛋白于 37 C 封闭 90 min; 加入稀释的兔抗 TMEM43 抗体, 37 C 孵育 1 h; PBS 洗 5 次, 每次 5 min; 再加入稀释的山羊抗兔 IgG-Alexa Fluor 594, 37 C 避光孵育 1 h; 避光条件下 PBS 洗 5 次, 每次 5 min; DAPI 染色液复染核 10~15 min; 蒸馏水洗 10 min; 加入抗荧光猝灭封片液封片 ; 于激光共聚焦显微镜下观察并拍照 1.7 表达载体 pcdna3.1-egfp-tmem43 的构建及鉴定 TMEM43 基因的扩增提取 MRC-5 细胞总 RNA; 利用所述 RT-PCR 扩增 TMEM43 目的基因反应结束, 用 10 g/l 的琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物克隆载体 pmd18-t-tmem43 的构建及鉴定回收 PCR 样品, 将产物与克隆载体 pmd18-t 于 16 C 连接并转化至大肠杆菌 BL21 感受态细胞, 在含 Amp+ 抗性 LB 平板上培养 12~16 h, 随机选取较大圆润而单一的克隆增菌培养, 培养物提取质粒 DNA 并 PCR 验证, 阳性菌液送至生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司进行测序, 阳性质粒命名为 pmd18t-tmem 表达载体 pcdna3.1-egfp-tmem43 的构建 Nhe I+EcoR V 分别双酶切 pmd18t-tmem43 和 pcdna3.1- EGFP 载体, 回收各酶切产物, T4 酶重组连接, 参照所述进行转化及培养, 培养物提取质粒 DNA 并进行双酶切验证, 阳性菌液送至生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司进行测序, 该重组质粒命名为 pcdna3.1-egfp-tmem 脂质体介导重组质粒 pcdna3.1-egfp- TMEM43 的转染在 6 孔板上培养 HEK293 细胞, 待细胞生长至 80%~85% 后, 用 Opti-MEM 清洗细胞, 并分别稀释重组质粒 pcdna3.1-egfp-tmem43 及空载质粒 pcdna3.1-egfp, 按比例与脂质体 Lipofectamine TM 2000 Reagent 混合, 逐滴加入上述 HEK293 细胞中, 等

张海霞等 : 人源跨膜蛋白 43(TMEM43) 的检测细胞内定位及体外真核表达 2005 量 Opti-MEM 作空白对照, 在 37 C 5% CO 2 条件下孵育 6 h, 弃去转染液, 各加入 4 ml DMEM( 含 50 ml/l FBS) 培养液培养 ; 并分别于转染 24 h 48 h 72 h 及 96

9.1 中所得 RT 产物进行检测根据实验结果计算转染前后 HEK293 细胞 TMEM43 含量 1.10 TMEM43 蛋白在 HEK293 细胞中的表达及 Western blot 检测分别收集等量转染 pcdna3.1-egfp-tmem43 组 pcdna3.1-egfp 组及空白组细胞, 参照 1.

M MRC-5 HEK293 1 200 bp 基因, 每个细胞样品重复 3 次, 分别进行检测, RT-PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测, 目的基因条带位于约 1 200 bp 处, 符合预期 ( 图 1A) 根据电泳条带发现, TMEM43 基因在 MRC-5 细胞中含量明显高于 HEK293 细胞 ; 同期进行的 qpcr 检测结果与 RT-PCR 检测结果相符 ( 图 1B),

4 张海霞等 : 人源跨膜蛋白 43(TMEM43) 的检测细胞内定位及体外真核表达 2005 量 Opti-MEM 作空白对照, 在 37 C 5% CO 2 条件下孵育 6 h, 弃去转染液, 各加入 4 ml DMEM( 含 50 ml/l FBS) 培养液培养 ; 并分别于转染 24 h 48 h 72 h 及 96 h 观察拍照 1.9 目的基因转录表达 RT-PCR 方法检测目的基因转录分别收取转染 48 h 后细胞, 各组收取量一致, 经总 RNA 提取, 同所述 RT-PCR 扩增 TMEM43 基因, 10 g/l 琼脂糖凝胶电泳检测 TMEM43 基因的转录情况 SYBR Green I 实时荧光定量 PCR 方法检测目的基因采用中所述 SYBR Green I 实时荧光定量 PCR 方法对中所得 RT 产物进行检测根据实验结果计算转染前后 HEK293 细胞 TMEM43 含量 1.10 TMEM43 蛋白在 HEK293 细胞中的表达及 Western blot 检测分别收集等量转染 pcdna3.1-egfp-tmem43 组 pcdna3.1-egfp 组及空白组细胞, 参照 1.5 所述方法进行 Western blot 分析, ECL 显色并观察结果 2 结果 2.1 TMEM43 基因水平的检测结果对选取的 MRC-5 和 HEK293 细胞分别扩增 TMEM43 M: DNA 分子质量标准 (A) bp bp M: 1 Kb plus DNA ladder marker. M MRC-5 HEK bp 基因, 每个细胞样品重复 3 次, 分别进行检测, RT-PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测, 目的基因条带位于约 bp 处, 符合预期 ( 图 1A) 根据电泳条带发现, TMEM43 基因在 MRC-5 细胞中含量明显高于 HEK293 细胞 ; 同期进行的 qpcr 检测结果与 RT-PCR 检测结果相符 ( 图 1B), TMEM43 基因在 MRC-5 细胞内高表达, 不同代次细胞检测结果均一致该结果与 TMEM43 存在于多种组织内相符 [5], 但不同组织内含量也有所不同, 本次检测结果显示, 肺组织内含量明显高于肾组织 2.2 TMEM43 蛋白水平的检测结果选取不同代次 MRC-5 和 HEK293 细胞, 每组细胞 3 个平行, 分别处理, 产物经 SDS-PAGE 后, Western blot 中表达产物与 TMEM43 抗体反应, 重复该实验 3 次结果显示, MRC-5 细胞在 48 kda 左右出现明显阳性条带, 片段大小符合预期, 而 HEK293 细胞则无条带出现, 该结果与上述基因检测结果相符合, 说明在基因水平 MRC-5 细胞内 TMEM43 含量明显高于 HEK293 细胞, 故 MRC-5 细胞内蛋白水平可明显检测到目的条带, 但是 TMEM43 基因由于在 HEK293 细胞内低表达, 故蛋白水平未检出 ( 图 2) 2.3 TMEM43 蛋白在 MRC-5 细胞中的定位间接免疫荧光实验检测结果见图 3 显微镜下 (B) Relative TMEM43 expression 图 1 TMEM43 基因在不同细胞中 RT-PCR(A) 及 qpcr(b) 检测结果 TMEM43 50 MRC-5 HEK293 Fig.1 The amplification of TMEM43 in different cells by RT-PCR (A) and qpcr (B) MRC-5 HEK293 β-actin 图 2 Western blot 分析 TMEM43 蛋白在不同细胞中的表达情况 Fig.2 Western blot analysis of expressed TMEM43 protein in different cell

5 重组质粒 pcdna3.1-egfp-tmem43 的酶切和测序鉴定重组质粒 pcdna3.1-egfp-tmem43 经 Nhe I+EcoR V 酶切, 结果显示, 可观察到明显的目的条带及载体带, 与预期相符 ( 图 4); Blast 比对测序序列, 显示插入片段的序列与 NM_024334.2 基因序列一致, 表明 pcdna3.

5 2006 研究论文观察发现, MRC-5 细胞质及膜均观察到明显的红色荧光, 而细胞核未观察到 2.4 TMEM43 目的基因的扩增取 MRC-5 细胞抽提总 RNA, 利用 RT-PCR 方法扩增 TMEM43 基因, 在 10 g/l 琼脂糖凝胶中进行电泳, 由图中可以看出, 目的基因条带位于约 bp 处, 符合预期 ( 图 4) 克隆质粒 pmd18t-tmem43 测序结果显示, 插入片段序列与 GenBank 中原序列 NM_ 的基因序列无差异 2.5 重组质粒 pcdna3.1-egfp-tmem43 的酶切和测序鉴定重组质粒 pcdna3.1-egfp-tmem43 经 Nhe I+EcoR V 酶切, 结果显示, 可观察到明显的目的条带及载体带, 与预期相符 ( 图 4); Blast 比对测序序列, 显示插入片段的序列与 NM_ 基因序列一致, 表明 pcdna3.1-egfp-tmem43 构建成功 Alexa Fluor 594 DAPI Merge 2.6 转染后不同时间绿色荧光蛋白的表达在倒置荧光显微镜下观察荧光生成情况, pcdna3.1-egfp-tmem43 组及 pcdna3.1-egfp 组转染后第 24 h 48 h 72 h 和 96 h 的 HEK293 细胞均能观察到特异性绿色荧光表达, 转染后 pcdna3.1- EGFP-TMEM43 组随着时间的延长荧光信号逐渐增强, 后逐渐趋于稳定, 观察发现, 48 h 荧光信号最强 ( 图 5) 另外, 根据荧光信号结果观察发现, 阳性对照 pcdna3.1-egfp 组荧光信号均匀分布于整个细胞, 而实验组 pcdna3.1-egfp-tmem43 细胞荧光信号则呈现点状分布, 24 h 时可看出荧光信号多分布于细胞核及膜上, 而随着时间的延长, 融合蛋白荧光信号部分猝灭, 至 96 h 时已完全呈现星点状此外, 该实验中发现, 阳性对照组荧光均匀分布于整个细胞, 该结果与大部分真核表达结果一致, 但实验组荧光图 3 TMEM43 蛋白在 MRC-5 细胞中的定位 Fig.3 Location of TMEM43 in MRC-5 cells bp bp bp M: DNA 分子质量标准 ; 1: Nhe I+EcoR V 双酶切质粒 pcdna3.1-egfp- TMEM43 产物 ; 2: TMEM43 的 PCR 产物 ; 3: 阴性对照 M: 1Kb plus DNA ladder marker; 1: Nhe I+EcoR V digestion product of recombinant plasmid pcdna3.1-egfp-tmem43; 2: PCR product of TMEM43; 3: negative control. M bp 图 4 TMEM43 基因的扩增及重组质粒的酶切鉴定 Fig.4 The amplification of TMEM43 and digestion of recombinant plasmid 则呈现点状分布, 该结果不同于一般真核表达结果, 这可能与 TMEM43 基因的分布相关, 该基因并非均匀分布于整个细胞, 由此导致出现点状分布的情况 2.7 外源基因对 HEK293 细胞生长的影响普通光学显微镜下观察, 转染后第 24 h 48 h 72 h 及 96 h, pcdna3.1-egfp-tmem43 组 pcdna3.1- EGFP 组及空白对照组细胞均生长良好, 无明显差异 ( 图 6) 2.8 TMEM43 基因在 HEK293 细胞中的转录表达取转染 pcdna3.1-egfp-tmem43 组 pcdna3.1 -EGFP 组及空白对照组细胞分别进行细胞总 RNA 提取, RT-PCR 检测结果显示, 转染 pcdna3.1-egfp- TMEM43 组目的基因转录表达明显强于其他两组

1-egfp; F: mock. 图5 绿色荧光蛋白的表达 Fig.5 Expression of green ﬂuorescence protein 胞细 Mock 48 h 生 24 h 72 h 96 h 国 pcdna3.1-egfp 中 pcdna3.1-egfp-tmem43 图6 重组质粒pcDNA3.1-EGFP-TMEM43转染对HEK293细胞的影响 Fig.

6 2007 张海霞等: 人源跨膜蛋白43(TMEM43)的检测细胞内定位及体外真核表达 B C E F 学学 D 报 A 物 A~D: 分别为重组质粒pcDNA3.1-EGFP-TMEM43转染后第24 h 48 h 72 h和96 h HEK293细胞荧光观察结果; E: 转染pcDNA3.1-EGFP组; F: 空白对照 A-D: the 24 h, 48 h, 72 h and 96 h fluorescence of HEK293 cells after transfected with recombinant plasmid pcdna3.1-egfp-tmem43, respectively; E: transfected with plasmid pcdna3.1-egfp; F: mock. 图5 绿色荧光蛋白的表达 Fig.5 Expression of green ﬂuorescence protein 胞细 Mock 48 h 生 24 h 72 h 96 h 国 pcdna3.1-egfp 中 pcdna3.1-egfp-tmem43 图6 重组质粒pcDNA3.1-EGFP-TMEM43转染对HEK293细胞的影响 Fig.6 Inﬂuence of recombinant plasmid pcdna3.1-egfp-tmem43 transfection on HEK293 cells (图7A); qpcr检测结果显示, 转染pcDNA3.1-EGFPTMEM43组细胞内TMEM43含量亦明显高于其他两组(图7B), 说明TMEM43基因在HEK293细胞中成功转录表达 2.9 TMEM43蛋白在HEK293细胞中的表达取转染pcDNA3.1-EGFP-TMEM43组 pcdna3.1egfp组及空白对照组细胞分别处理后经sds-page 电泳, Western blot过程中表达产物与tmem43抗体反

TMEM43 基因的错义突变可导致 ARVD5 的临床表现为外显性状, 由此确定 TMEM43 基因为 ARVD5 的致病基因但是, 目前对于 TMEM43 的结构及功能知之甚少, 使得对该基因的进一步研究受到限制 (A) M 1 2 3 1 500 bp 1 000 bp 1 200 bp M: DNA 分子质量标准 ; 1: 转染重组质粒 pcdna3.

7 2008 研究论文应, 结果显示, pcdna3.1-egfp-tmem43 组在 78 kda 左右出现目的条带 (TMEM43 大小约 48 kda, EGFP 大小约 30 kda), 片段大小符合预期, 而转染 pcdna3.1-egfp 组及空白组细胞无条带, 说明 TMEM43 蛋白在 HEK293 细胞中成功表达 ( 图 8) 3 讨论针对 TMEM43 的研究, 目前涉及较多的是其与致心律失常性右室心肌病 (ARVD) 相关的研究, 由于 ARVD 临床诊断较为困难 [5,11], 故研究学者对此病进行了较为详细的研究其中, Merner 等 [5] 和 Siragam 等 [12] 发现, TMEM43 基因的错义突变可导致 ARVD5 的临床表现为外显性状, 由此确定 TMEM43 基因为 ARVD5 的致病基因但是, 目前对于 TMEM43 的结构及功能知之甚少, 使得对该基因的进一步研究受到限制 (A) M bp bp bp M: DNA 分子质量标准 ; 1: 转染重组质粒 pcdna3.1-egfp-tmem43 组 ; 2: 转染空载 pcdna3.1-egfp 组 ; 3: 空白对照组 M: 100 bp DNA ladder marker; 1: HEK293 cells transfected with pcdna3.1-egfp-tmem43; 2: HEK293 cells transfected with pcdna3.1-egfp; 3: mock. 图 7 RT-PCR(A) 及 qpcr(b) 检测 TMEM43 基因在 HEK293 细胞中的转录结果 Fig.7 Transcription of TMEM43 gene in HEK293 cells by RT-PCR (A) and qpcr (B) TMEM43 β-actin pcdna3.1-egfp-tmem43 pcdna3.1-egfp Mock 常用的真核表达载体为 pcdna3.1, 但是该载体 (B) Relative TMEM43 expression (FC) : 转染重组质粒 pcdna3.1-egfp-tmem43 组 ; 2: 转染空载 pcdna3.1-egfp 组 ; 3: 空白对照组 1: HEK293 cells transfected with pcdna3.1-egfp-tmem43; 2: HEK293 cells transfected with pcdna3.1-egfp; 3: mock. 图 8 Western blot 检测 TMEM43 蛋白在 HEK293 细胞中的表达 Fig.8 Detected the expression of TMEM43 protein in HEK293 cell by Western blot 转染进细胞后肉眼观察细胞无明显差异, 不能直观地判断转染是否成功, 只能通过后续实验验证本实验室改造的 pcdna3.1 载体携带有绿色荧光蛋白 EGFP, 转染后可通过绿色荧光的生成情况直观地判断转染效果, 有效地提高了实验效率, 通过后续实验验证证明与肉眼观察的结果基本一致本研究选用不同来源的人源细胞进行研究, 对细胞内 TMEM43 基因及蛋白水平进行检测 RT-PCR 检测结果显示, TMEM43 基因在肺组织内 (MRC-5) 表达量高于肾组织 (HEK293); 蛋白水平在肾组织内未检出, 也验证了基因水平肾组织内基因表达量较低, 因此, 蛋白表达丰度较低, Western blot 检测不到基于此, 本研究从 MRC-5 细胞内扩增 TMEM43 基因, 克隆至真核表达载体 pcdna3.1-egfp, 成功构建了重组真核表达载体 pcdna3.1-egfp-tmem43 将此重组载体转染至 HEK293 细胞中进行表达, 结果表明, 转染后基因水平表达量明显提高, 蛋白水平亦可

8 张海霞等 : 人源跨膜蛋白 43(TMEM43) 的检测细胞内定位及体外真核表达 2009 检出 TMEM43 的表达研究还发现, 转染后细胞荧光信号呈现点状分布, 而非整个细胞均匀分布这也从侧面印证了 TMEM43 基因并非均匀分布于整个细胞, 而是不同部位含量不同, 因此荧光信号呈现与其他真核表达不同的结果对于该发现可进行进一步深入研究, TMEM43 在细胞质及膜上每个点含量是否亦不相同? 该种分布方式对于基因的影响及与病毒相互作用是否相关? 总之, 本研究对 TMEM43 的分布进行了初步探索, 为进一步研究其结构和功能奠定了实验基础, 为病毒与基因之间相互关系的研究提供了一定的实验依据参考文献 (References) 1 Wiemann S, Weil B, Wellenreuther R, Gassenhuber J, Glassl S, Ansorge W, et al. Toward a catalog of human genes and proteins: sequencing and analysis of 500 novel complete protein coding human cdnas. Genome Res 2001; 11(3): Franke WW, Dörflinger Y, Kuhn C, Zimbelmann R, Winter- Simanowski S, Frey N, et al. Protein LUMA is a cytoplasmic plaque constituent of various epithelial adherens junctions and composite junctions of myocardial intercalated disks: a unifying finding for cell biology and cardiology. Cell Tissue Res 2014; 357(1): Christensen AH, Andersen CB, Tybjaerg-Hansen A, Haunso S, Svendsen JH. Mutation analysis and evaluation of the cardiac localization of TMEM43 in arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy. Clin Genet 2011; 80(3): 何仗群. TMEM43 基因定点突变克隆构建及其功能初步分析 ( 硕士论文 ). 南华大学 (He Zhangqun. Site-directed mutagenesis of TMEM43 gene and function analysis. University of South China), Merner ND, Hodgkinson KA, Haywood AF, Connors S, French VM, Drenckhahn JD, et al. Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy type 5 is a fully penetrant, lethal arrhythmic disorder caused by a missense mutation in the TMEM43 gene. Am J Hum Genet 2008; 82(4): Hodgkinson KA, Howes AJ, Boland P, Shen XS, Stuckless S, Young TL, et al. Long-term clinical outcome of arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy in individuals with a p.s358l mutation in TMEM43 following implantable cardioverter defibrillator therapy. Circ Arrhythm Electrophysiol 2016; 9(3): e Milting H, Klauke B, Christensen AH, Müsebeck J, Walhorn V, Grannemann S, et al. The TMEM43 Newfoundland mutation p.s358l causing ARVC-5 was imported from Europe and increases the stiffness of the cell nucleus. Eur Heart J 2015; 36(14): Haywood AF, Merner ND, Hodgkinson KA, Houston J, Syrris P, Booth V, et al. Recurrent missense mutations in TMEM43 (ARVD5) due to founder effects cause arrhythmogenic cardiomyopathies in the UK and Canada. Eur Heart J 2013; 34(13): Baskin B, Skinner JR, Sanatani S, Terespolsky D, Krahn AD, Ray PN, et al. TMEM43, mutations associated with arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy in non-newfoundland populations. Hum Genet 2013; 132(11): Jiang C, Zhu Y, Zhou Z, Gumin J, Bengtsson L, Wu W, et al. TMEM43/LUMA is a key signaling component mediating EGFRinduced NF-kappa B activation and tumor progression. Oncogene 2016; 36(20): Te Rijdt WP, Jongbloed JD, de Boer RA, Thiene G, Basso C, van den Berg MP, et al. Clinical utility gene card for: arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy (ARVC). Eur J Hum Genet 2014; 22(2): doi: / ejhg Siragam V, Cui XZ, Masse S, Ackerley C, Aafaqi S, Strandberg L, et al. TMEM43 mutation p.s358l alters intercalated disc protein expression and reduces conduction velocity in arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy. PLoS One 2014; 9(10): e

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽

中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2018, 40(12): DOI: /cjcb 人源跨膜蛋白 43(TMEM43) 的检测 细胞内定位及体外真核表达 1,

中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2018, 40(12): DOI: /cjcb 人源跨膜蛋白 43(TMEM43) 的检测细胞内定位及体外真核表达 1,