第 25 卷第 4 期 2013 年 4 月生命科学 Chinese Bulletin of Life Sciences Vol. 25, No. 4 Apr., 2013 文章编号 : (2013) 麻痹性贝类毒素的生物合成研究进展姚戈, 曹瑛 *, 范崇旭

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浩邰
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1 第 25 卷第 4 期 2013 年 4 月 Chinese Bulletin of Life Sciences Vol. 25, No. 4 Apr., 2013 文章编号 : (2013) 麻痹性贝类毒素的生物合成研究进展姚戈, 曹瑛 *, 范崇旭, 应天翼, 陈冀胜 ( 北京药物化学研究所, 北京 ) 摘要 : 麻痹性贝类毒素 (paralytic shellfish toxins, PSTs) 产自多种淡水蓝细菌及海洋甲藻, 常见于爆发的水华及贝类中, 其神经毒性对人畜具有很高的危险性,PSTs 中毒事件在全球范围内时有发生基因组学技术的发展使毒素生物合成基因簇及相关基因得以发现并初步验证综合已报道的 5 种蓝细菌基因簇及相关合成基因生物信息学分析结果, 综述了 PSTs 的生物合成过程及推导的功能酶类, 并对各种环境调控因素影响毒素合成的机理进行了总结关键词 : 麻痹性贝类毒素 ; 基因簇 ; 生物合成中图分类号 :Q948.8; X145 文献标志码 :A Advances in the research of biosynthesis of paralytic shellfish toxins YAO Ge, CAO Ying*, FAN Chong-Xu, YING Tian-Yi, CHEN Ji-Sheng (Beijing Institute of Pharmaceutical Chemistry, Beijing , China) Abstract: Paralytic shellfish toxins (PSTs) occur naturally in harmful algae blooms composed of marine dinoflagellates, as well as in freshwater cyanobacterial blooms, which are considered as a serious neurotoxicological health risk that may affect humans and animals. Many cases of paralytic shellfish poisoning have occurred globally every year. Recently, the candidate PSTs biosynthesis gene clusters were described and the genes involved were identified. In this paper, reviews of the putative functional enzymes implicated in proposed PSTs biosynthetic pathway are made based on the annotation and bioinformatics characterization of the biosynthetic gene clusters in five cyanobacterial species reported before, and the environmental factors that regulate the production of PSTs are summarized. Key words: paralytic shellfish toxins; gene cluster; biosynthesis 近二十年来, 基因组学和蛋白质组学相关技术不断进步, 关于自然界次级代谢产物的生物合成研究得以快速发展, 其研究对象涵盖脂肪酸聚酮多肽或氨基酸类衍生物萜类生物碱糖或糖苷衍生物等多种结构类型麻痹性贝类毒素 (paralytic shellfish toxins, PSTs) 是一类天然产生的具神经毒性的生物碱, 目前已知多个属的淡水蓝细菌 (Cylindrospermopsis Aphanizomenon Anabaena Planktothrix Raphidiopsis, Lyngbya) 以及海洋赤潮甲藻 (Alexandrium Gymnodinium Pyrodinium) 都能合成这类次级代谢产物 [1-3] PSTs 在水华或赤潮中滋生蓄积, 会引起鱼类家畜死亡, 并可经食物链不断富集, 在某些食用贝类及鱼类体内达到危险的高水平 PSTs 每年会造成近起中毒事件 [4], 我国近海也曾发生过多起中毒事件 [5-7] 对此类毒素生物合成机制的研究有助于监测与防治毒素引起的危害, 故越来越受到相关学者的重视随着蓝细菌基因组学的发展, 特别是产毒菌株 PSTs 生物合成基因簇的发现与验证, 为研究 PSTs 生物合成过程提供了新的依据本文综合已报道的多种蓝细菌基因簇及相关合成基因生物信息学分析结果, 对 PSTs 生物合成过程及推导的功能酶类进收稿日期 : ; 修回日期 : * 通信作者 : cao_ying2002@hotmail.com; Tel:

2 428 第 25 卷行了综述 1 PSTs 化学结构 PSTs 是一类具有高毒性的神经毒素, 自从第一种 PSTs 石房蛤毒素 (saxitoxin,stx) 在 1957 年被发现以来 [8], 目前已报道该类同系物达 57 种 [2] PSTs 是一类四氢嘌呤化合物, 其结构上的 4 个位点 (R1~R4) 可以发生乙酰化羟基化磺酰化氨甲酰化等多种取代反应 ( 图 1) 根据取代基的不同,PSTs 可分成以下几类 : 氨甲酰基类磺酰氨甲酰基类脱氨甲酰基类脱氧脱氨甲酰基类羟基苯甲酸类磺酰基苯甲酸类, 以及 Lyngbya wollei 毒素 ( 乙酰基类毒素 ) [2] 取代基的差异导致毒性水平呈现多样化 [3] 通常认为,PSTs 结构中带有正电荷的胍基基团可以与电压门控 Na + 通道的羧基基团相互作用, 从而阻断 Na + 通道, 导致动作电位无法形成, 引起神经中毒迄今为止尚没有针对 PSTs 中毒的解毒药图 1 麻痹性贝类毒素化学结构 2 PSTs 生物合成的遗传基础研究 PSTs 在自然界中产生机制的研究尚处于起步阶段 1993 年,Shimizu [9] 利用放射性同位素标记前体物质培养产毒甲藻试验, 提出了精氨酸乙酸盐与甲硫氨酸作为 PSTs 合成前体的推测, 首次提出了 STX 生物合成路线 2008 年,Kellmann 等利用简并引物通过 PCR 在蓝细菌 Cylindrospermopsis raciborskii T3 中鉴定得到了 O- 氨甲酰转移酶基因 sxti, 并最终发现了用于 STX 生物合成的 sxt 基因簇, 开启了由功能酶系催化的 PSTs 生物合成途径研究之门 2.1 PSTs 生物合成路线的阐明 Kellmann 等 [10] [10] 在报道中提出,C. raciborskii T3 的 sxt 基因簇全长大约 35 kb, 编码 31 个开放阅读框 (ORFs) 通过序列比对分析, 归属了 26 个蛋白, 这些蛋白具有 30 种催化功能, 并利用液相色谱 - 串联质谱方法 (LC-MS-MS) 鉴定了 STX 生物合成过程的部分中间产物由此进一步修正了 Shimizu 提出的 STX 生物合成路线 ( 图 2), 这是目前最为广泛认可的 STX 合成路线在该合成路线中,STX 的生物合成起始于 SxtA 参与的精氨酸与乙酰基的克莱森缩合反应, 其反应如下 : 首先产生中间产物 A ; 然后在脒基转移酶 SxtG 作用下, 将另一分子精氨酸的脒基转移到 A 上, 得到 B ;B 在胞嘧啶核苷脱氨酶 SxtB 作用下, 形成第一个含有杂环的化合物 C ; 在 SxtD ( 甾醇脱饱和酶类 ) 作用下,C 末端的 2 个碳原子间形成双键, 然后在 SxtS( 酮戊二酸依赖的双加氧酶 ) 催化下双键环氧化 ; 该环氧基团在 SxtS 作用下可开环形成醛基, 在多种酶参与下, 经过系列反应, 完成 STX 基本骨架的构建由于在 LC-MS-MS 分析中检测到了中间产物 E, 因此 Kellmann 等 [10] 认为侧链形成的醛基有可能在乙醛还原酶 SxtU 作用下被还原为羟基, 然后经 O- 氨甲酰转移酶 SxtI 催化, 形成氨基甲酸酯衍生物 C12 位的两个羟基则有可能是通过末端加氧酶 SxtT 和 SxtH 催化形成, 最终得到目标产物 STX 2.2 PSTs 基因簇中功能酶系的对比分析除了上述的 C. raciborskii T3, 其他 3 株念珠藻科产毒种 (Aphanizomenon sp. NH-5 Anabaena circinalis AWQC131C 和 Raphidiopsis brookii D9) 及 1 株颤藻科产毒种 L. wollei 的 sxt 基因簇也相继被报道 [11-13] ( 图 3) 已报道的 5 种产毒株的基因簇含有一组功能基因 ( 表 1), 被认为负责 PSTs 的生物合成, 但不同物种中的这组基因在长度和组成上均存在差异与 C. raciborskii T3 相比,R. brookii D9 的 sxt 基因簇仅长 25.7 kb, 编码 25 个 ORFs, 而其

3 第 4 期姚戈, 等 : 麻痹性贝类毒素的生物合成研究进展 429 中 19 个 ORFs 与 C. raciborskii T3 序列 100% 相同, 但其不含有 sxtx sxtn sxtw 和 sxtv 这 4 个基因 A. circinalis AWQC131C 的 sxt 基因簇全长 30.9 kb, 编码 28 个 ORFs, 含有 3 段转座酶序列, 仅含 sxtv 的球型标记 :sxt 基因编码的催化酶或结构框 ;SAM: S- 腺苷甲硫氨酸 ;SAH: S- 腺苷 - 高半胱氨酸 [10] 图 2 修正的 STX 生物合成路线及推定的 sxt 基因功能 [10,13] 表 1 sxt 基因簇中各基因推测的功能基因酶家族推测的功能基因酶家族推测的功能 sxta 甲基转移酶甲基化 sxto 腺苷酰硫酸激酶 PAPS 合成 N- 乙酰基转移酶酰基移至载体 sxtp RTX 毒素结合 PSTs 酰基载体蛋白酰基载体 sxtq 未知未知 II 型氨基转移酶克莱森缩合 sxtr 酰基转移酶未知 sxtb 胞嘧啶核苷脱氨酶环化 sxts 植烷酰辅酶 A 双加氧酶成环反应 sxtc 未知调控 sxtt 苯丙酸双加氧酶 C-12 位双羟基化 sxtd 甾醇脱饱和酶类脱饱和作用 sxtu 乙醛还原酶 C-1 位还原 sxte 未知未知 sxtv 琥珀酸脱氢酶双加氧酶还原酶 sxtf MATE 转运 PSTs sxtw 铁氧化还原蛋白电子载体 sxtg 脒基转移酶脒基转移 sxtx 头孢菌素羟化酶 N-1 位羟基化 sxth 苯丙酸双加氧酶 C-12 位双羟基化 sxty PhoU 信号转导 sxti 氨甲酰转移酶氨甲酰化 sxtz 组氨酸激酶信号转导 sxtj 未知调控 ompr OmpR 信号转导 sxtk 未知调控 sxtsul 磺基转移酶磺基转移 sxtl GDSL 脂肪酶去氨甲酰化 sxtdiox 苯丙酸双加氧酶 C-12 位单羟基化 sxtm MATE 转运 PSTs sxtact 酰基转移酶 C-13 位乙酰化 sxtn 磺基转移酶磺基转移

4 430 第 25 卷 A: Lyngbya wollei; B: Cylindrospermopsis raciborskii T3; C: Anabaena circinalis AWQC131C; D: Aphanizomenon sp. NH-5; E: Raphidiopsis brookii D9 [10-13] 图 3 五种蓝细菌的 sxt 基因簇的结构组成断裂片段, 亦不含有 sxtx 和 sxtw Aph. sp. NH-5 的 sxt 基因簇全长 29 kb, 编码 24 个 ORFs, 其中 sxtv 基因中含有终止密码子, 且不含有 sxto 基因 L. wollei 的 sxt 基因簇全长 35.6 kb, 编码 26 个 ORFs, 含有 2 段 sxtn 重复序列与 3 段 sxtm 重复序列最显著的差别是此基因簇中 sxti 基因被截断, 并插入了其他四个基因簇皆未发现的 sxtact 基因总体而言, 亲缘关系相近的物种其 sxt 基因簇的基因组成和排列也相近, 序列相似度也更高例如,C. raciborskii T3 与 R. brookii D9 基因簇组成最相似,Aph. sp. NH-5 与 A. circinalis AWQC131C 的基因簇序列也最相近, 而 L. wollei 基因簇序列与上述

5 第 4 期姚戈, 等 : 麻痹性贝类毒素的生物合成研究进展 431 四种差异最大, 这与它们在系统发育进化中的关系是一致的 [14] 通过对产毒种 sxt 基因簇中保守的 sxti 基因进行系统进化分析, 显示此基因极可能起源于一种古代的 α- 变形杆菌, 在进化过程中经水平基因转移逐渐分散到多个不同进化分支的物种中 [15] 通过分析不同菌株产生的 STX 类似物种类, 可以推定各基因簇中编码的修饰酶功能例如, STX 的 N1 位点羟基化后生成 neostx, 在 C. raciborskii T3 Aph. sp. NH-5 与 L. wollei 中可检出 neostx, 而在 A. circinalis AWQC131C 与 R. brookii D9 中未检出 neostx [16-20] 对上述 5 个 sxt 基因簇的序列分析显示,3 种产 neostx 的菌株都能够鉴定到 sxtx 基因, 而 A. circinalis AWQC131C 和 R. brookii D9 基因簇中不含有 sxtx 基因所以, 研究者们推定 SxtX 功能可能为催化 N1 位点的羟基化反应同时, 此蛋白结构与头孢菌素羟化酶极其相似 [21], 也进一步证实了其在 STX 羟基化反应中的作用另外, 在 L. wollei 中检出特有的 C13 乙酰化的一类毒素, 但未检出其他 4 个菌株中产生的 C13 氨甲酰基类毒素分析 5 种产毒菌株的 sxt 基因簇显示, 在 L. wollei 产毒株中, 仅含有断裂的 sxti 基因片段, 与其他四种菌株相比, 此基因缺失了 C 端包含催化位点的大段序列, 但插入了特有的 sxtact 基因,sxtACT 基因与辅酶 A 依赖性酰基转移酶超家族中的 O- 酰基转移酶序列非常相似 [13] 所以, 研究者们推定 SxtACT 的功能可能为催化 STX 上 C13 位点的乙酰化取代反应, 生成特异的乙酰基类毒素蓝细菌中 STX 生物合成还涉及到了在微生物代谢中罕见的酶类, 如 SxtA 在图 2 的合成路线中, SxtA 参与了起始的克莱森缩合反应, 催化底物乙酰基团甲基化并与精氨酸发生缩合反应 SxtA 具有聚酮合成酶系的类似结构, 由 4 个催化结构域 (SxtA 1~4) 组成,SxtA1 是腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶 (MTF) 的同系物 [22] ;SxtA2 为 GCN5 关联的 N- 乙酰基转移酶 (ACTF), 催化乙酰 -CoA 的乙酰基转移到其他原子上 [23] ;SxtA3 与酰基载体蛋白 (ACP) 结构类似 [24] ;SxtA4 是 II 型氨基转移酶的同系物, 与 8- 氨基 -7- 氧合壬酸酯合成酶 (AONS) 具有极高的同源性 [25] 2.3 海洋甲藻 PSTs 生物合成相关基因的研究 PSTs 最早从海洋甲藻中发现, 但受限于产毒甲藻的大基因组 (3~245 Gb) 及基因调控的独特性与复杂性 [26-28], 对于其 PSTs 生物合成过程了解较少早期研究者们曾观察到 Alexandrium fundyense 中 PSTs 的产生与细胞周期中的 G 1 期密切相关 [29], 但基于差异显示技术验证的多种 G 1 期正调控的蛋白编码基因中, 并未发现与 PSTs 合成相关的基因 [30] 随后有研究认为 PSTs 生物合成酶系在细胞周期中长期存在, 并受到翻译后调控 [31] 目前已知甲藻中存在蛋白磷酸化级联反应调控的信号通路, 其可能介导生物合成酶系的翻译后调控机制, 从而影响毒素的产生同样, 通过对比同一物种 A. minutum 中产毒株与无毒株, 以及同一产毒株 A. tamarense OF935-AT6 中产毒细胞与无毒细胞之间的基因表达差异, 发现了多组差异表达的基因, 但仍未能证实这些基因与 PSTs 合成有所关联 [32-33] 而在对 Gymnodinium catenatum 产毒株的研究中则发现了两种 3'- 磷酸腺苷 -5'- 磷酸硫酸酯 (PAPS) 依赖性磺基转移酶, 用于催化 PSTs 发生磺酰化反应 [34-35], 这是 PSTs 生物合成与转化进程推测中唯一纯化鉴定到的酶类尽管在甲藻中此类酶的编码基因未获验证, 但在蓝细菌 sxt 基因簇中找到了 sxto 与 sxtn ( 或 sxtsul) 基因, 它们分别编码腺苷酰硫酸激酶与磺基转移酶, 用于催化磺酰类毒素的生成 [10,13] 高通量测序技术的发展为研究甲藻基因信息提供了可能已有研究人员运用鸟枪测序法构建了产毒藻种 A. minutum A. tamarense 与 A. catenella 的基因组 EST 文库, 但未能鉴定到与已知蓝细菌 sxt [32, 基因有明显同源性的基因序列 36-37] 最近,Stuken 等 [38] 构建了 A. fundyense CCMP 1719 与 A. mi nutum CCMP113 的 cdna 文库, 经 Roche 454 测序获得了 > 的转录本序列, 通过生物信息学方法在转录组中成功鉴定得到了包括 sxta 在内的多种 STX 生物合成基因, 从分子水平证实了甲藻中 STX 生物合成途径的存在 3 影响 PSTs 生物合成的环境调控因素研究各种环境因素如何调控产毒种合成 PSTs 的总量和种类, 以及水华中产毒种爆发性繁殖与环境变化之间的相互关系, 有助于揭示有毒水华的形成机理, 减少水华带来的危害多组研究者试图在基因水平阐明环境因素对 PSTs 合成的调控作用, 但总体而言, 受限于基因信息的不足, 以及后续转录分析和蛋白质组代谢组学数据的空白, 尚未能对调控机理进行较深入的研究 3.1 温度光照对毒素生物合成的影响温度对蓝细菌产毒的影响因种而异有研究观察到相较于最优生长温度 25,C. raciborskii C10

6 432 第 25 卷在 19 时合成毒素量有所增加, 特别是细胞外 STX 与 GTX2/3 浓度分别增长 1.6 与 5 倍, 同时低温会导致 STX 转化为 GTX2/3 [39] ; 但 Aph. sp. LMECYA 31 在较高温度下 (28 ) 的 STX 合成水平高于 22 [40] 光强的改变也会影响毒素合成在 100 μem -2 s -1 下,C. raciborskii T3 的毒素合成量达到最高值, 同时毒素合成水平呈昼夜节律变化 ( 光 / 暗为 12:12), 在黑暗条件时有所下降 [41] 3.2 营养成分对毒素生物合成的影响大量营养元素如氮磷对毒素合成有着重要的意义一般来说, 充足的氮源供应能够促进毒素的合成, 而磷限制条件下毒素产量也有所上升 [42-43] 在 C. raciborskii T3 的 sxt 基因簇中, 已证实存在转录调控基因 sxty sxtz 与 ompr [10] sxty 编码 PhoU 蛋白, 是磷元素吸收的负调控因子 [44] ;sxtz 编码一种组氨酸激酶, 而 OmpR 蛋白参与多种代谢反应, 包括氮元素吸收和渗透平衡 [45-46] 这些转录因子极可能参与了毒素合成转录水平的调控, 以适应氮磷等营养元素的变化 Pomati 等 [47] 报道过产毒蓝细菌多发现于电导率高的水体中, 而细胞外 Na + 浓度的增加会导致毒素在胞内的蓄积这表明 PSTs 不仅能阻断 Na + 通道引起中毒, 而且能调控自身的 Na + /K + 泵以维持细胞稳态 sxt 基因簇分析显示 sxtf 与 sxtm 编码的两种蛋白与 NorM 家族的 MATE (multidrug and toxic compound extrusion) 蛋白序列非常相似在细菌中 MATE 蛋白是 Na + 离子驱动的反向转运体, 用于运载阳离子物质 [48] 而 PSTs 都是阳离子 ( 除了 C 类毒素 ), 因此, SxtF 与 SxtM 可能参与构成了毒素的转运系统铁离子广泛参与藻类代谢活动, 如电子传递及固氮作用, 曾有报道称铁离子是赤潮形成的限制性微量元素 [49] 对培养的 A. tamarense 研究显示, 铁缺乏条件下藻生长受限, 但毒素含量及毒性却分别提高了 2.55 倍与 2.54 倍, 并且毒素比例有显著变化, 其中 GTX1/4 含量提高了 5.6 倍, 而 STX 与 GTX2/3 含量有所降低 3.3 其他因素 [50] 多个研究小组都报道过摄食甲藻的桡脚类浮游动物的存在会诱导甲藻毒素合成增加 [51-52] 天然密度的桡足虫会促使 A. minutum 的毒性水平提高 25 倍这种现象被认为是产毒甲藻自我保护的手段 [52] Yang 等 [53] 应用微阵列技术研究了桡足虫的存在对产毒 A. minutum 基因表达的影响, 发现了两类可能参与毒素合成调控的基因, 但作用机制尚待证实甲藻体内存在多种寄生细菌, 其对宿主的 PSTs 毒素合成亦起着多方面的影响有研究发现寄生细菌对多种甲藻不同生长时期的毒性水平有调控作用 [54-55], 其中促使 A. catenella 的毒性水平提高了 5 倍 ; 还有研究人员从甲藻中分离得到了两类寄生细菌 [56-58], 分别能够合成 PSTs( 或 Na + 通道阻断性毒素 ) 以及转化 PSTs, 但这种共生模式的毒素合成及转化机制尚不明确 4 展望在近十几年中, 尽管水华与赤潮的起因仍有争论, 但爆发事件越来越频繁, 并有在全球多水域蔓延的趋势蓝细菌和甲藻中的 PSTs 合成相关基因已被广泛鉴定,PSTs 合成已被证实是一种持续的可遗传的性状, 这意味着 PSTs 的生物合成有一个超越物种差异的共同机制对于 PSTs 生物合成机制的研究尚处于起步阶段, 对 sxt 基因簇中功能基因的分析多停留在生物信息学层次结合功能基因信息开展产毒种的转录水平及蛋白质组分析, 并进一步对推导的生物合成酶类及调控蛋白进行功能验证, 都是今后值得深入研究的方面对产毒机制的阐明不仅能够为水华赤潮的监测与防治提供新的思路, 而且为探寻此类毒素可能的应用价值提供了契机 [ 参考文献 ] [[[[ Smith FMJ, Wood SA, Ginkel R, et al. First report of saxitoxin production by a species of the freshwater benthic cyanobacterium, Scytonema Agardh. Toxicon, 2011, 57: [[[[ Aráoz R, Molgó J, Tandeau de Marsac N. Neurotoxic cyanobacterial toxins. Toxicon, 2010, 56: [[[[ Llewellyn LE. Saxitoxin, a toxic marine natural product that targets a multitude of receptors. Nat Prod Rep, 2006, 23 (2): [[[[ Hallegraeff GM. Harmful algal blooms: a global overview [M]// Hallegraeff GM, Anderson DM, Cembella AD. Manual on harmful marine microalgae. Intergovernmental Oceanographic Commission manuals and guides. No. 33. Paris: United Nations Educational, Scientific, and Cultural Organization, 1995: 1-22 [5] 林燕棠, 贾小平, 杨美兰, 等. 中国沿岸染毒贝类的麻痹性毒素. 热带海洋, 1999, 18(1): 90-5 [6] 江天久, 尹伊伟, 骆育敏, 等. 大亚湾和大鹏湾麻痹性贝类毒素动态分析. 海洋环境科学, 2000, 19(2): 1-5 [7] 李伟才, 栾刚, 李立, 等. 中国沿海部分海区贝类毒素的调查. 海洋科学, 2000, 24(9): [[[[ Schantz EJ, Mold J, Stanger D, et al. Paralytic shellfish

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材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌

第 25 卷第 4 期 2013 年 4 月 生命科学 Chinese Bulletin of Life Sciences Vol. 25, No. 4 Apr., 2013 文章编号 : (2013) 麻痹性贝类毒素的生物合成研究进展 姚戈, 曹瑛 *, 范崇旭

第 25 卷第 4 期 2013 年 4 月生命科学 Chinese Bulletin of Life Sciences Vol. 25, No. 4 Apr., 2013 文章编号 : (2013) 麻痹性贝类毒素的生物合成研究进展姚戈, 曹瑛 *, 范崇旭