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1 ,2017,37(12): 犃犅. 犅. 犗犱狀. 犛狀. : (2017) 犱 : /j.issn "#$%&3 ' 犔犺犛犉 3 犎 ()*,,,, (-45689: ;5 <=>,-4?@AB!/ C,DE <=>,2; F-4;5< =>, "G H I, ) +,:JKL/+,-.MNO, +, 5 PQ (Sorbonne)M-RJS=TU,VWXY Z,[\]^_`ab3 c (flavanone3 hydroxylase,f3h) M,, 1110bp, 369 ; 1438bp, 3 2, J 犔犺犛犉 3 犎 (GenBank J MF614135) 1 Z,` a b 3 c M 犔犺犛犉 3 犎 M : ( 犜狌狆犳狀 ) J RT PCR Z, 犔犺犛犉 3 犎 - -, - V, - 犔犺犛犉 3 犎 ; M- (S2 S6 ); 犔犺犛犉 3 犎, 2hM 犔犺犛犉 3 犎, ;, 犔犺犛犉 3 犎 M!/, 犔犺犛犉 3 犎 M -./:+, PQ ;`ab3 c ;]^; 01 :Q785;Q786 :A 犆狀狀犵狀犱犈狓狆狀犳犔犺犛犉 3 犎犌狀狀犔狌犿 ZHANG Xing,YANGJie,PENG Mengdi,JIA Guixia,HE Hengbin (BeijingKeyLaboratoryofFlowerGermplasmInnovationandMolecularBreeding,NationalFlowerEngineeringandTechnologi calresearchcenter,beijinglaboratoryofurbanandruralecologicalenvironment,forestandflowerbreedinglaboratoryof MinistryofEducation,ColegeofLandscapeArchitecture,BejingForestryUniversity,Beijing100083,China) 犃犫 :Thebudsoforientalhybridlily Sorbonne wereusedtounderstandtheregulatorymechanisms offlowercoloration.basedonprevioustranscriptomedatabase,wesuccessfulyclonedthecodingsequence andgenomesequenceofflavanone3 hydroxylase(f3h).thecdnasequencehadtheencodingregionof1 110bp,andispredictedtoencodeaproteinwith369aminoacids;theDNAful lengthof1438bpcon tainedthreeexonsandtwointrons,andisnamed 犔犺犛犉 3 犎.Bioinformaticsanalysisresultsrevealedthat 犉 3 犎 washighlyconservativeinevolutionandthereisahighsimilaritybetweentheproteinsencodedby 犔犺犛犉 3 犎 and 犉 3 犎 of 犜狌狆犳狀.Analysisbysemi quantitativereversetranscription PCR (RT PCR)revealedthat 犔犺犛犉 3 犎 geneshowedthestrongestexpressionintepals,stigmaandstyle,lower expressioninfilament,ovary,immature stem,stem rootandupper leaf,thelowestexpressioninanther andlower leafof Sorbonne. 犔犺犛犉 3 犎 expressedinalmosteverystageexcepts2ands6.inaddition, darktreatmentcanreducetheexpressionof 犔犺犛犉 3 犎,anditshowedalowestexpressionaftertwohour darktreatment,andafterthat,theexpressionstartedtogoup.withtheincreasingofiluminationtime, : ; : : ( );!"#$%&' (YX )!: (1992-),,, ()*+,-.!/ E mail:zxyybh@163.com 01 :, 23, ()*-456'789:;5 E mail:hengbinhe_1220@bjfu.edu.cn

2 theexpressionlevelof 犔犺犛犉 3 犎 begantoincreaseslightly,buttherewasnosignificantdiferencebe tweenthelighttimegroups. 犓狔狑犱 :Orientalhybridlily Sorbonne ;flavanone3 hydroxylasegenes;clone;expression +,+, +,( 犔狌犿 spp.),! / [1] -. +,!/M (,![ " #$ % &,O -.![M' "# % [2 3] NO+,-.M' M (!/, )*+, 7 -+,-M![.' ( [4 5] ` a b 3 c (flavanone3 hydroxylase, F3H) J-+,,[M ( /0, 1 - [6],23 45.M678,, 9: [7] ; [8] [9 10]! / (3 ` a b C3 M c,, [ < = >,(dihydrok aemp ferol,dhk), < = >,, [`b? X-.,- -+,M (X@6! /A -+, [BC-D Z<E.M 犉 3 犎,N -+,M -. [10] F - 9 G( 犌狀狀犳 ), 犉 3 犎 MHI J - ; M K Y [11 12] L M 9 G : F - 9GM N, M, 犉 3 犎 - ;MO [13] F - 9 G M J -, mrna [12,14] +, 犉 3 犎 MHI!/!/ +, 5 PQ J!/TU,L /`ab3 c M, P ; - M QR, M QR,J &+,-.M STNO UVP,J+,M-.?@; 5 UWCMM '7 1 TU X ~2017 Y +, ; 5 M +, PQ 5JS= T, Z V P([1,A), 9 (S1~S9,[1,B)M-, P 9 HYM - T \3 ],^_ `a b, c -80 +,;5, 10cm -R M+,, c?? \ J: J23,I 50%( O ),, Q RJ 8h +16h M 72h T, J 0hTU, Z h( 0h), h M 10cm -RM- H/ M T\ 3 ], ^ _ ` a, b 犇犖犃 9 犚犖犃 :; 犇犖犃 # DNA 6V9 DNA S M X, M DNA c -20 b RNA EASYspinPlus RNA ` S M X ThermoNanoDrop2000 犗犇 260( A. PQ M- P:1.- ;2.- ;3.- ;4. ; 5.- ;6. ;B. PQ -R ;M9 S1~S9, S1.2cm;S2.3cm;S3.4cm;S4.5cm;S5.6.5cm; S6.7cm;S7.8.5cm;S8.10cm;S9.11cm; [1 S=TU A.Flowertissueof Sorbonne :1.Tepal;2.Anther;3.Filament; 4.Stigma;5.Style;6.Ovary;B.Ninestagesinthedevelopment ofbudsin Sorbonne,indicatedasS1-S9:S1.2cm;S2.3cm; S3.4cm;S4.5cm;S5.6.5cm;S6.7cm;S7.8.5cm; S8.10cm;S9.11cm;Thesameasbelow Fig.1 Experimentmaterials

3 12Y, :+,`ab3-c 犔犺犛犉 3 犎 M]^: 2327 M ) 犗犇 280( 6M )M, V W 犗犇 260/ 犗犇 280 DNA RNA M 6 ( DNA: 犗犇 260/ 犗犇 ; RNA:1.7 < 犗犇 260/ 犗犇 280<2.0) 1% DNA RNA M% RNA -80 b RNA _McDNA -20 b $%&3 ' < 8 犘犆犚 = > - D RNA $ McDNA J, M VWX Y Z $ M ' ` a b 3 c M, ( 7,\ F1 R1( 1) J50μL, 10 PCRbufer5μL,dNTPS5μL,MgSO 43μL,F1 R1 O 1 μl,cdna 2 μl,kod Plus Neo1 μl, ddh 2O32μL PCR J:94 5 min;98 10s,55 30s, min, (40 ; 68 6min;10 b 1%, Blunt( ), DH5α (6V), ^.??@A B # ( DNAMAN Z,$ +, DNA J, ( PCR, M J F1 R1, M J F2 R2( 1) DNAMAN Z,$, J 犔犺犛犉 3 犎, GenBank( gov/websub/?tool=genbank) ( 1.2.3?@ABC D ClustalOmega(ht tp:// M, M JGI (ht tps://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html) %[ M,Blast M 1, Photoshop O [ DNAMAN 犔犺犛犉 3 犎 2 M NCBIBlast@ M (, _ 5M `ab3 c, : 犔犺犛犉 3 犎 M ( NCBIM W (conserveddomaindatabase,cdd) Mega F G 犚犜 犘犆犚 D cdna J, M F3 R3, ( RT PCR J TIP41, J F4 R4( J20μL,2 Taq Mix10 μl,f3 R3O0.4μL,cDNA0.8μL,ddH 2O8.4 μl J:95 5min;95 30s,53 30 s,72 30s,35 ;72 6 min;4 b PCR 0 1% 2 Z: 2.1 $%&3 ' HI JF cdna DNA J, PCR, $ M ([ 2,A B), $ J1110 bpm 1438bpM,: Y )1 Table1 Primersusedinthisstudy Primername F1 R1 F2 R2 F3 R3 F4 R4 Primersequence(5 3 ) ATGGCTCCTGTTGCGACTACCTTC CTAAGCAAGTATTTGATCGAGTTT ATGGCTCCTGTTGCGACTACCTTCCT CCTGGTGGTCGGCGTTCTTGAATCTC TGGATTACCGTCAAGCCGATT CTTCCGTGTTAGCCAACTTCTT CGAAGCCAGAAACGGAGAAGAAT GGGTAGGGTGGATTGGGAAGA A. ;B. ;1~2.PCR 0; M1.DL5000;M2.DL2000. [2 ]^M PCR 0 A.Amplificationresultsofcodingsequenceclone; B.Amplificationresultsofgenomicsequenceclone; 1~2.PCRproducts;M1.DL5000;M2.DL2000 Fig.2 ThePCRproductofcodingsequencecloneand genomicsequenceclone

4 Z J 犔犺犛犉 3 犎,GenBank J MF , K 犔犺 犛犉 3 犎 M J369bp 429bp 312bp,2 J229bp 99bp G, ([3) 5%[ M, JGI M Blast? 1! M " 1547~2269bp /, " 765~1107bp /, " 1146~1638bp / [ ([ 3), # $ ( 犃狀狀犿狌 ), % #$ 犉 3 犎 M2 :& 2 M #$M J768bp, ' ( 犞狏狀犳 ) ( 犌狔狆狌犿犿狀犱 ) (( 犘狌狀狌狆 )M J765bp 1107bp 1068bp, _ M " ) *,, M J 601 bp, + M J 86bp 犔犺犛犉 3 犎 2 1,:! 5M 犉 3 犎 ) _ M, `ab3 c M 2.2 犔犺犛犉 3 犎 K L D DNAMAN, 369, J53.29kD Z([4), 5M F3H M,-, `ab3 c M NCBIM CDD W 犔犺犛犉 3 犎 M, Z, M :./ 2 b0 (2 oxoglutar ate,2 ODD),M1, (2OG Fe(Ⅱ)oxygenasesuperfamilydo main), F3H M [10]. /, HXDX 55 H (HTDPGTITLLL QDQVGGLQATKDGGNTWITVKPIEGAFVVN LGDHGHFLSNGRFKNADH),2 b0, RXS(RLS) 2, 犔犺犛犉 3 犎 3,- M3 Pro 206 Pro 209 Pro 223, 1 M 4 ( [15] 1, 犔犺犛犉 3 犎 : +, M,56 M7 ( 犆狏犿狀 ),8 9 M :( 犘犺狀狓犱狔犳 ) ; ' ; : ( 犘犿狀 ) ' ( ( 犃狀 犱犺狀狀 ) M ; ' ; : < = ( 犛狕犵狀 ) >?-( 犆狌狌犿犿犳 ) 5@( 犃狀犺狌狌犿狀犱狀狌犿 ) ; ' A([5) 2.3 犔犺犛犉 3 犎 MNO8 )* 犔犺犛犉 3 犎 PQ - P V M : 犔犺犛犉 3 犎 - -, - V, - ([6)! Z B, 犔犺犛犉 3 犎, P M 2.4 犔犺犛犉 3 犎 M NO 0)* PQ -+,,[M' 犔犺犛犉 3 犎 PQ 9 - ; M Q R : 犔犺 犛犉 3 犎 S1 ;S2 ;S3 S4 HC,D S1 ;S4~S6, 犔犺犛犉 3 犎 M )E, S6 H ; S7~S9HYC ] ([7) 2.5 犔犺犛犉 3 犎 MNORSTUV )* 犔犺犛犉 3 犎 M,, 犔犺犛犉 3 犎 M F [3 犉 3 犎 M Fig.3 Exon intronstructureof 犉 3 犎 genesindiferentplants

5 12 : ; \ CD 3, 犔犺犛 犉3犎 w XÌÍ 2329 qfì ÃÚw, ^_ FÌ µ1)w, ^_ AcF3H rs AY221246 CcF3H tusa[ JN944581 CaF3H bce GU140081 VvF3H 9: 002275527 3 PpF3H?@HM543570 PcF3H!r] KC460396 RoF3H àvw[ 554630 GrF3H ;<À=> 012636094 CaF3H x( KY348830 SrF3H `al KC412257 AcF3H ^_@ 542819 CmF3H U[L KY427811 LcF3H.'ST KC131463 NF3H òy JQ388493 EgF3H zv 010936235 2 PdF3H ìx 008778969 LhSo rf3h CDMF614135 TfF3H À-Á KC261504 PaF3H \] U23066 AcF3H 56 LOC10972743PF3H { FP093204 AaF3H Sd AY232493 1 4 CD LhSo rf3h X 7#$ F3H, Øø Ths amam noa c ds s nc o l o r Thd f f r n am noa c ds s nwh 狌犿 狆 AY221246 CcF3H 犆犿 犺犽 狀犵 JN944581 CaF3H 犆狌 狌犿 犿 犳 AcF3H 犃 GU140081 VvF3H 犞 狏 狀 犳 002275527 3 PpF3H 犘狌狀狌 狆 HM543570 PcF3H 犘狔狌 KC460396 RoF3H 犚狌犫狌 犱狀 554630 GrF3H 犌 狔狆 狌犿 犿狀犱 012636094 犿犿狌狀 CaF3H 犆犿狆 犺 狌犿 狀 KY348830 SrF3H 犛 狕 犵 狀 KC412257 AcF3H 犃 狀 犱 犺 狀狀 542819 CmF3H 犆 狏 犿 狀 KY427811 LcF3H 犔狔 犺 狀狀 KC131463 NF3H 犖 狌 狕 JQ388493 EgF3H 犈 犵狌 狀 狀 010936235 2 PdF3H 犘犺 狀 狓犱 犳 008778969 狔 LhSo rf3h 犔 狌犿 犛 犫 狀狀 MF614135 TfF3H 犜狌 狆犳 狀 KC261504 PaF3H 犘 犿 狀 U23066 AcF3H 犃狀狀 犿 狌 LOC10972743PF3H 犘犺狔 犺狔犱狌 FP093204 AaF3H 犃狀 犺狌 狌犿狀犱狀狌犿 AY232493 1 F 4 Al o f ham noa c ds so flhso rf3handf3hf r omo h rp l an s g gnmn qunc

6 [ O 1 [5 LhSorF3H : %`ab3 c M Thenumbersatthenodeofthefigureiscredibility. Fig.5 PhylogenetictreeoftheaminoacidsequencesofLhSorF3HcodingproteinandF3Hfromotherplants ([8)! Z 犔犺犛犉 3 犎 ) 3 -+, - PQ.M ( [6 犔犺犛犉 3 犎 PM Fig.6 Expressionanalysisof 犔犺犛犉 3 犎 in diferenttissues [7 犔犺犛犉 3 犎 - ; M Fig.7 Expressionanalysisof 犔犺犛犉 3 犎 in diferentflowerdevelopmentstages [8 犔犺犛犉 3 犎 M Fig.8 Expressionanalysisof 犔犺犛犉 3 犎 respondtolight, 2h H,, N, 犔犺犛犉 3 犎 M 6 [16] 犉 3 犎 -+,,[RS ' M` ab3 c, `ab6[j-+,,[ T MX@, 2N 犉 3 犎 M, -. [17 18] 犉 3 犎, [ 6 7 8, M ',678, 5 (M-.,,U J F3H MV 2W, MX.-+, -+, Y,5N [19] A C5 犉 3 犎 (K / ] ^, Z S=[\]^K+, PQ M F3H, J 犔犺犛犉 3 犎,D (K ST,J +, N F3H M1 `bm [ K (M \ ` a b 3 c M DC ][^M \2, :2 b0. /,M1 [20], ( : _M,[ `a & 1 1, 犔犺犛犉 3 犎 M : % J,: b G,@ _ M! N! /

7 12Y, :+,`ab3-c 犔犺犛犉 3 犎 M]^: 2331 PCR Z, 犔犺犛犉 3 犎 - -, %, 2:O P `b? - M ' [21], - - C 犔犺犛犉 3 犎 M _ M - ; M (, 犉 3 犎 JO +, -. M - +, -! M (, PQ-.M![cQ.' (M, 0,[NO! / J+,-.M![ M!/ \ WX : [1] WANG Y,VAN KRONENBURG B,.Regenerationand agrobacterium mediatedtransformation of multiplelilycultivars [J]. 犘狀犆, 犜狌狀犱犗犵狀犆狌狌,2012,111: [2],, ],.+, b, [ M ] ^ : [J].,2011,31(3): ANLQ,YANG K,ZHANG K,.Cloningandanalysis ofchalconesynthasegeneoflily[j]. 犃犅狀犅 犗犱狀犛狀,2011,31(3): [3],,,.+, b, [ ] ^ LM -. [J].,2012,32(8): CHENJ,ANLQ,WANGT,.Cloningofchalconesyn thasegenein 犔狌犿 andexpressionanalysisofflowercolour changesintransgenic 犜犫 [J]. 犃犅狀犅 犗 犱狀犛狀,2012,32(8): [4], 9, c,. +, b 犔犺 犆犎犐 M]^ [J]. "G,2015,43(9):6 18. DOU XY,LANGLX,BAOF,.Cloningandexpression analysisofchalconeisomerasegene 犔犺犆犎犐 inorientalhybrid lily( 犔狌犿 spp.)[j]. 犑狌狀犳犖犺犉狔犝狀狏 狔,2015,43(9):6 18. [5],,,. 犆犎 1 1 [J]. "G,2012,35(4): FANG WP,ZHANGY,RUANGX,.Analysisofgenomic structureandintronsof 犆犎 1genefromteaplant[J]. 犑狌狀犳犖狀犼狀犵犃犵狌狌犝狀狏狔,2012,35(4): [6] FORKMANN G,HELLER W,GRISEBACH H.Anthocya ninbiosynthesisinflowersofmathiolaincanaflavanone3 and flavonoid3 hydroxylases[j]. 犣犺犳犳狌犖狌犳犺狌狀犵犆,1980,35(9): [7],B,,.9 : 犉 3 犎 M cdna ] ^ [J].H,2008,35(11): ZHANG XJ,XU H C,YOU X R,.Cloningandse quenceanalysisof 犉 3 犎 genecdnafrom 犔狀犵狀犿犫狔 [J]. 犃犎狌狌犛狀,2008,35(11): [8],`,,.; ` a b 3 c 犉 3 犎 M]^ [J].,2010,30(3): ZHANG H L,HUANG Y C,YANG CX,.Molecular cloning and sequences analysis of flavanone 3 hydroxylase genefrom 犉犵狆狔狌犿狌犿 [J]. 犃犅狀犅 犗犱狀犛狀,2010,30(3): [9],B,,. `ab3 c ( 犉 3 犎 )M ]^ \2 [J]. " AB,2014,22(3): HU XJ,XU YJ,GAOLP,.Cloningandfunctionala nalysisofflavanone 3 hydroxylasegene ( 犉 3 犎 )intea ( 犆 犿狀狀 )[J]. 犑狌狀犳犃犵狌狌犅犺狀犵狔, 2014,22(3): [10],` A,,.= 3 犉 3 犎 M [J]. :,2016,35(5): FANJ,HUANG M Y,WU M M,.Comparisonofmo lecularcharacteristics,phylogenyandstructureofthree 犆 犿犉 3 犎 genes[j]. 犌狀犿狀犱犃狆狆犱犅犵狔,2016, 35(5): [11] NAKATSUKA T,NISHIHARA M,MISHIBA K,. Temporalexpressionofflavonoidbiosynthesis relatedgenes regulatesflowerpigmentationingentianplants[j]. 犘狀犛 狀,2005,168(5): [12] NAKATSUKA T,NISHIHARA M,.Twodiferenttrans posableelementsinsertedinflavonoid3,5 hydroxylasegene contributetopinkflowercolorationin 犌狀狀犫 [J]. 犕 狌犌狀狀犱犌狀犿,2006,275(3): [13] NODA N,KANNO Y,KATO N,.Regulationofgene expressioninvolvedinflavonolandanthocyaninbiosynthesis duringpetaldevelopmentinlisianthus ( 犈狌犿犵狀犱犳 狌犿 )[J]. 犘犺狔犵犘狀狌犿,2004,122(3): [14] NAKATSUKAT,SATOK,TAKAHASHIH,.Cloning andcharacterization ofthe UDP glucose:anthocyanin 5 O glucosyltransferase gene from blue flowered gentian [J]. 犑狌狀犳犈狓狆犿狀犅狀狔,2008,59(6): [15] SHUO X,TIAN N,LONG J H.Molecularcloningand characterizationofaflavanone3 hydroxylasegenefrom 犃 犿狀狀狌 l[j]. 犘狀犘犺狔犵狔狀犱犅犺犿狔,2016, 105: [16] FREYRER,UZDEVENESC,GU L,.Geneticsandan thocyaninanalysisofflowercolorin 犕狓狀狆狌狀 [J]. 犑狌狀犳犺犃犿狀犛狔犳犎狌狌犛狀, 2015,140(1): [17] TSUDAS,FUKUIY,NAKAMURA N,.Flowercolor modificationof 犘狌狀犺狔犫犱 commercialvarietiesbymet abolicengineering[j]. 犘狀犅犺狀犵狔,2004,21(5): [18] TANJ,TUL,DENGF,.Ageneticandmetabolicanaly sisrevealedthatcotonfiberceldevelopmentwasretardedby flavonoidnaringenin[j]. 犘狀犘犺狔,2013,162(1): [19] MELDGAARD M.Expressionofchalconesynthase,dihydrofla vonolreductase,andflavanone 3 hydroxylaseinmutantsofbarley deficientinanthocyaninandproanthocyanidinbiosynthesis[j]. 犜犺狀犱犃狆狆犱犌狀,1992,83(6 7): [20].-+,,[RS M - -.M [D]. : "G,2010. [21] JIANG XL,LIU YJ,LIW W,.Tissue specific,develop ment dependentphenoliccompoundsaccumulationprofileand geneexpressionpaterninteaplant( 犆犿狀狀 )[J]. 犘犗狀,2013,8(4):e (:)

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