188 上海理工大学学报 2013 年第 35 卷血小板输注在临床治疗上有重要应用, 然而, 现有的血小板保存方法都存在很大的局限性, 冷冻干燥将为血小板的长期保存提供一种较为

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1 上海理工大学学报第 35 卷第 2 期犑. 犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犛犺犪狀犵犺犪犻犳狅狉犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾犵狔犞狅犾.35 犖狅文章编号 : (2013) 搁板温度对人血小板冻干保存的影响王波 1, 周正 2, 徐梦洁 2, 许先国 3, 张绍志 2, 陈光明 2 (1. 解放军第 117 医院危重病医学科, 杭州 ;2. 浙江大学能源工程学系, 杭州 ; 3. 浙江省血液中心输血研究所, 杭州 ) 摘要 : 一次干燥温度位的高低直接影响一次干燥所需时间. 实验研究了干燥箱搁板温度对血小板冷冻干燥保存的影响, 检测了冻干血小板复水后的数值恢复率细胞形态和结构血小板凋亡和活化等指标, 与新鲜组进行了对照分析. 结果显示 : 当搁板温度为 -30 时, 血小板冻干复水后的数值恢复率为 (89.0±3.2)%; 血小板平均体积 ( 犕犘犞 ) 和分布宽度 ( 犘犇犠 ) 值分别为 (12.4±1.5) 犳犔和 (18.3±1.5)%, 在可以接受的范围之内 ; 未凋亡率为 (87.5±2.6)%, 非活化率为 (80.4±2.6)%. 关键词 : 血小板 ; 冷冻干燥保存 ; 一次干燥 ; 搁板温度 ; 恢复率中图分类号 : 犚文献标志码 : 犃犈犳犳犲犮狋狊狅犳犛犺犲犾犳犜犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狅狀狋犺犲犔狔狅狆犺犻犾犻狕犪狋犻狅狀狅犳犎狌犿犪狀犘犾犪狋犲犾犲狋狊犠犃犖犌犅狅 1, 犣犎犗犝犣犺犲狀 2 犵, 犡犝犕犲狀犵犼犻犲 2, 犡犝犡犻犪狀犵狌狅 3, 犣犎犃犖犌犛犺犪狅狕犺犻 2 2, 犆犎犈犖犌狌犪狀犵犿犻狀犵 (1. 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犐犆犝, 狋犺犲 117 狋犺犎狅狊狆犻狋犪犾狅犳犘犔犃, 犎犪狀犵狕犺狅狌 , 犆犺犻狀犪 ; 2. 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犈狀犲狉犵狔犈狀犵犻狀犲犲狉犻狀犵, 犣犺犲犼犻犪狀犵犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犎犪狀犵狕犺狅狌 , 犆犺犻狀犪 ; 3. 犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犜狉犪狀狊犳狌狊犻狅狀犕犲犱犻犮犻狀犲, 犅犾狅狅犱犆犲狀狋犲狉狅犳犣犺犲犼犻犪狀犵犘狉狅狏犻狀犮犲, 犎犪狀犵狕犺狅狌 , 犆犺犻狀犪 ) 犃犫狊狋狉犪犮狋 : 犜犺犲狋犻犿犲犱狌狉犪狋犻狅狀狀犲犱犲犱犳狅狉狆狉犻犿犪狉狔犱狉狔犻狀犵犻狊犱犻狉犲犮狋犾狔狉犲犾犪狋犲犱狑犻狋犺狋犺犲狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲犾犲狏犲犾狌狊犲犱狌狉犻狀犵狋犺犲狆狉犻犿犪狉狔犱狉狔犻狀犵狆狉狅犮犲狊. 犜犺犲犳犲犮狋狊狅犳狊犺犲犾犳狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狅犳狋犺犲犱狉狔犻狀犵犮犪犫犻狀犲狋狅狀狋犺犲犾狔狅狆犺犻犾狕犪狋犻狅狀狅犳犺狌犿犪狀狆犾犪狋犲犾狋狊狑犲狉犲犲狓狆犲狉犻犿犲狀狋犪犾狔狊狋狌犱犻犲犱. 犜犺犲犮犲犾狉犲犮狅狏犲狉狔狉犪狋犲犪犳狋犲狉狉犲犺狔犱狉犪狋犻狅狀, 狋犺犲犿狅狉狆犺狅犾犵犻犮犪犾犪狀犱狊狋狉狌犮狋狌狉犪犾犮犺犪狀犵犲狊, 狋犺犲狀狅狀犪狆狅狆狋狅狊犻狉犪狋犲犪狀犱狋犺犲狀狅狀犪犮狋犻狏犪狋犻狅狀狉犪狋犲狑犲狉犲犱犲狋犲犮狋犲犱犪狀犱犮狅犿狆犪狉犲犱狑犻狋犺狋犺狅狊犲狅犳狉犲狊犺狊犲狋. 犜犺犲狉犲狊狌犾狋狊狊犺狅狑狋犺犪狋狑犺犲狀狋犺犲狊犺犲犾犳狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲犻狊犲狋犪狋 -30, 狋犺犲犮犲犾狉犲犮狅狏犲狉狔狉犪狋犲犪犳狋犲狉犲犺狔犱狉犪狋犻狅狀狉犲犪犮犺犲狊 (89.0±3.2)% 犪狀犱狋犺犲犕犘犞犪狀犱犘犇犠狑犲狉犲 (12.4±1.5) 犳犔犪狀犱 (18.3±1.5)% 狉犲狊狆犲犮狋犻狏犲犾狔, 犫狅狋犺狅犳狑犺犻犮犺犪狉犲狑犻狋犺犻狀犪犮犲狆狋犪犫犾犲狉犪狀犵犲狊. 犜犺犲狀狅狀犪狆狅狆狋狅狊犻狉犪狋犲狅犳狉犲犺狔犱狉犪狋犲犱狆犾犪狋犲犾狋狊犻狊 (87.5±2.6)% 犪狀犱狋犺犲狀狅狀犪犮狋犻狏犪狋犻狅狀狉犪狋犲犻狊 (80.4±2.6)%. 犓犲狔狑狅狉犱狊 : 狆犾犪狋犲犾狋 ; 犳狉犲狕犲犱狉狔犻狀犵狆狉犲狊犲狉狏犪狋犻狅狀 ; 狆狉犻犿犪狉狔犱狉狔犻狀犵 ; 狊犺犲犾犳狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲 ; 狉犲犮狅狏犲狉狔狉犪狋犲收稿日期 : 基金项目 : 中央高校基本科研业务费专项基金资助项目 (2012 犙犎犃 4008) 第一作者 : 王波 (1962-), 男, 主任医师. 研究方向 : 战创伤危重病研究. 犈犿犪犻犾 : 狑犪狀犵犫犿犪犻犾. 犺狕. 狕犼. 犮狀

2 188 上海理工大学学报 2013 年第 35 卷血小板输注在临床治疗上有重要应用, 然而, 现有的血小板保存方法都存在很大的局限性, 冷冻干燥将为血小板的长期保存提供一种较为理想的方法, 相关研究近年来在国内外都得到了重视. 影响冻干血小板复水后恢复率和功能的因素有很多, 如保 [1-3] [4] [5] 护剂种类和浓度冻结速率复水条件等. 冻干过程的其它工艺参数, 如温度压力和干燥持续时间, 可能对血小板冻干的效果也有影响, 但目前研究还很少. 其中, 一次干燥温度是一个十分重要的参数, 该温度过高可能导致物料出现塌陷. 但一次干燥温度也不能过低, 有文献指出, 该温度每降低 1, 升华干燥时间将增加 13% [6]. 干燥时间的延长, 不仅影响生产效率, 而且可能影响冻干效果. 本文作者曾在 -38~ -40 的搁板温度下进行过 1 犿犔血小板悬浮液的冻干, 效果较好, 但由于一次干燥温度位低, 干燥持续时间长达 16~ 18 犺. 如果增加血小板的容量, 或加厚冻干瓶内装液的高度, 持续时间会更长. 为了缩短一次干燥时间, 本文将尝试采用比 -38 高的搁板温度进行血小板的一次干燥, 根据冻干血小板复水后的数值恢复率凋亡及活化情况, 来寻找更加合适的一次干燥参数. 1 材料和方法 1.1 血小板洗涤新鲜浓缩血小板 ( ~ 血小板 / 犿犔 ) 来自健康无偿献血者, 由浙江省血液中心提供. 将富含血小板的血浆离心 15 犿犻狀, 使血小板沉淀并去除上层血浆 ; 而后加适量生理盐水, 将血小板打散使之悬浮 ; 之后再离心 10 犿犻狀, 收集血小板, 重复此操作两次. 1.2 海藻糖载入血小板用含有 50 犿狅犾 / 犔海藻糖的缓冲液 (100 犿狅犾 / 犔犖犪犆犾 10 犿狅犾 / 犔犓犆犾和 10 犿狅犾 / 犔犈犌犜犃 ) 将洗涤后的血小板重悬, 制成浓度约为个 / 犿犔的孵化悬浮液 ; 将上述处理后的血小板孵化悬浮液置于 37 的恒温震荡水浴中孵化, 震荡频率为 40 次 / 犿犻狀, 得到的血小板内海藻糖浓度达到约 13 犿狅犾 / 犔 [7]. 1.3 血小板的冷冻干燥冻干保护液的基准缓冲液 ( 犘犅犛缓冲液 ) 由 9.5 犿犿狅犾 / 犔犎犈犘犈犛犿犿狅犾 / 犔犖犪犆犾 4.8 犿犿狅犾 / 犔犓犆犾及 1 犿犿狅犾 / 犔犕犵犆犾 2 组成. 以上述冻干缓冲液作为基准液, 加入 1% 牛血清白蛋白 ( 犅犛犃, 上海生工 ) 作为塑性剂, 加入 20% 海藻糖 ( 犆 10 犎 22 犗 11 2 犎 2 犗, 北京经科宏达生物技术有限公司 ) 作为细胞外保护剂, 浓度百分比以狑 / 狏 ( 犵 /100 犿犔 ) 表示, 配置成血小板冻干保护液. 将已载入海藻糖的血小板洗涤后重悬于该冻干保护液中, 调整细胞悬浮液浓度为个 / 犿犔左右. 取 1 犿犔血小板冻干悬浮液装入直径为 25 犿的玻璃瓶中, 放入 -60 低温冰箱中进行预冻, 其冷却速率约为 10 / 犿犻狀 [8]. 维持 2 犺之后, 迅速取出冻结的血小板样品, 置于预先冷却至一次干燥温 12 度的狆犾狌狊犉狉犲犣狅狀犲型冻干机 ( 犔犪犫犆狅狀犮狅, 美国 ) 冻干箱内隔板上, 进入预先设定好的程序, 一次干燥时间为 20 犺. 一次干燥结束后以 0.2 / 犿犻狀的加热速率使搁板温度升至二次干燥温度 20, 二次干燥时间为 10 犺. 一次干燥参数见表 1. 表 1 血小板一次干燥温度参数犜犪犫.1 犘狉犻犿犪狉狔犱狉狔犻狀犵狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狊狅犳狆犾犪狋犲犾狋犾狔狅狆犺犻犾狕犪狋犻狅狀组别一次干燥温度冻干血小板复水将犘犅犛缓冲液和蒸馏水以 3:1 比例混合制成血小板冻干复水液, 将 1 犿犔的复水液在室温下直接加入冻干样品瓶中, 轻轻震荡, 样品迅速完全溶解于复水溶液中. 1.5 冻干复水血小板血液学分析用犆犈犔犇犢犖 1700 型血球计数仪 ( 犃犫狅狋, 美国 ) 分别对冻干前的血小板和冻干复水后的血小板计数, 血小板冻干保存的数值恢复率 ( 犚犘 ) 的计算公式为犚犘 = 犖犪 / 犖犫 100% 式中, 犖犪表示冻干复水后的血小板计数 ; 犖犫表示冻干前的血小板计数. 利用血球计数仪测定复水后的血小板平均体积 ( 犕犘犞 ) 以及分布宽度 ( 犘犇犠 ), 得到犘犇犠曲线. 1.6 冻干复水血小板活化的三色流式分析冻干复水血小板凋亡检测本实验以 1 犿犔新鲜富含血小板血浆 ( 犘犚犘 ) 为阴性对照,1 犿犔冻干后的血小板为实验样品, 采用流式细胞仪犉犃犆犛犆犪犾犻犫狌狉 ( 犅犇, 美国 ) 进行检测, 步骤如下 : 犪. 样本制备. 实验组和对照组的血小板悬液样品离心 3 犿犻狀 (1500 转 / 犿犻狀 ), 用 0.5 犿犔结合缓冲

3 第 2 期王波, 等 : 搁板温度对人血小板冻干保存的影响 189 液 ( 犅犻狀犱犻狀犵犅狌犳犲狉 ) 重悬. 犫. 荧光染色. 取 10μ 犔该溶液加入流式专用管 ( 犅犇, 美国 ), 再依次向管中加入 10μ 犔犘犐染色剂和 5μ 犔犃狀狀犲狓犻狀犞犉犐犜犆试剂, 添加试剂后的犅犇管室温避光 15 犿犻狀进行染色. 犮. 避光染色后的犅犇管中加入 500μ 犔生理盐水稀释,1 犺之内上机检测. 犱. 数据结果使用犆犲犾犙狌犲狊狋软件进行分析冻干复水血小板活化检测本实验以 1 犿犔新鲜富含血小板血浆 ( 犘犚犘 ) 为阴性对照,1 犿犔核苷酸 ( 犃犇犘 ) 处理后的活化血小板为阳性对照,1 犿犔冻干后的血小板为实验样品, 采用流式细胞仪进行检测, 步骤如下 : 犪. 样本制备. 实验组和对照组的血小板悬液样品离心 3 犿犻狀 (1500 转 / 犿犻狀 ), 用 0.5 犿犔结合缓冲液 ( 犅犻狀犱犻狀犵犅狌犳犲狉 ) 重悬. 犫. 荧光染色. 取 10μ 犔该溶液加入流式专用管, 再依次向管中加入 7.5μ 犔犆犇 62 狆犘犈和犘犃犆 -1 犉犐犜犆, 添加试剂后的犅犇管室温避光 15 犿犻狀进行染色. 犮. 避光染色后的犅犇管中加入 500μ 犔生理盐水稀释,1 犺之内上机检测. 犱. 数据结果使用犆犲犾犙狌犲狊狋软件进行分析. 1.7 统计分析实验结果以 5 次独立实验的平均值 ± 标准差表示, 组间统计显著性差异犘用异方差假设狋检验进行比较. 2 结果 2.1 一次干燥温度位对血小板数值恢复率的影响将密封保存于室温下的冻干血小板复水,7 种不同温度位下的血小板冻干复水后的数值恢复率分犪, 犫犫, 犮别为 (60.4±8.0)%,(80.8±3.9)%,(84.1± 犮, 犱犪, 犱, 犲 4.4)%,(89.0±3.2)%,(89.5±2.1)%, 犲 (89.6±1.6)%,(89.9±1.4)%, 如图 1 所示.( 注 : 犪 : 犘 =0.000; 犫 : 犘 =0.001; 犮 : 犘 =0.233; 犱 : 犘 = 0.365; 犲 : 犘 =0.572) 结果表明, 冻干复水后的血小板数值恢复率随着温度的降低而增加, 到达 -30 时基本不变, 达到 89% 左右. 随着干燥温度的上升, 冻干复水后血小板恢复率迅速下降, 达到 -20 时下降至 61%. 2.2 一次干燥温度位对血小板形态分布的影响表 2 表示血小板的犕犘犞和犘犇犠值随一次干图 1 冻干复水后血小板的数值恢复率 ( 狀 =5) 犉犻犵.1 犖狌犿犲狉犻犮犪犾狉犲犮狅狏犲狉狔狉犪狋犲狅犳狆犾犪狋犲犾狋狊犪犳狋犲狉犳狉犲狕犲犱狉狔犻狀犵犪狀犱狉犲犺狔犱狉犪狋犻狅狀 ( 狀 =5) 燥温度的变化关系. 表 2 冻干前后血小板的犕犘犞和犘犇犠 ( 狀 =5) 犜犪犫.2 犕犘犞犪狀犱犘犇犠狅犳狆犾犪狋犲犾狋狊犫犲犳狅狉犲犪狀犱犪犳狋犲狉犾狔狅狆犺犻犾狕犪狋犻狅狀 ( 狀 =5) 一次干燥温度 / 冻干前血小板犕犘犞 / 犳犔犘犇犠 /% 冻干后血小板犕犘犞 / 犳犔犘犇犠 /% ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.8 实验结果表明, 不论一次干燥温度的取值为多少, 血小板冻干复水后的犕犘犞和犘犇犠值均较复水前偏大, 一部分实验组的值甚至超过了人体血小板的正常标准参考值, 说明血小板冻干和复水过程对其形态和体积分布影响较大. 2.3 冻干血小板凋亡标志物的表达使用流式细胞仪对 -30 作为一次干燥温度的冻干血小板进行凋亡检测, 检测结果用犆犲犾犙狌犲狊狋软件进行分析, 结果如图 2( 见下页 ) 所示. 首先根据血小板大小和颗粒性在前向角 / 测向角散射光 ( 犉犛犆 / 犛犆 ) 中设门犚 2( 图 2( 犪 ) 中横坐标和纵坐标分别代表前向角与测向角散射光信号强度 ). 由于犆犇 61 能与血小板细胞特异性结合, 对犚 2 区域中的细胞, 在图 2( 犫 ) 中标志犆犇 61 犘犲狉犆犘为阳性的细胞设门犚 1 ( 图 2( 犫 ) 中横坐标表示犘犲狉犆犘荧光信号强度 ), 区分血小板细胞和其它碎片及污染物, 对犚 1 区域中的血小板进行凋亡和活化分析. 犃狀犲狓犻狀犞犉犐犜犆能与细胞膜上凋亡早期的标

4 190 上海理工大学学报 2013 年第 35 卷图 2 流式细胞术 ( 犉犆犕 ) 检测冻干复水后的血小板凋亡率犉犻犵.2 犃狆狅狆狋狅狊犻狊狉犪狋犲狅犳狆犾犪狋犲犾犲狋狊犱犲狋犲犮狋犲犱犫狔犉犆犕志物磷脂酰丝氨酸结合呈阳性, 犘犐染色剂能进入细胞膜被破坏的细胞中, 与染色体结合呈阳性. 根据新鲜血小板将图 2( 犮 ) 分为 4 个象限, 左下象限为非活化的存活血小板, 右下象限为早期凋亡的血小板, 左上和右上象限犘犐染色呈阳性, 表示晚期凋亡或死亡的血小板. 图 2( 犮 ),( 犱 ) 中横坐标与纵坐标分别表示犉犐犜犆与犘犐荧光信号强度. 结果表明, 实验组和对照组的活细胞数均占血小板总数的 85% 以上, 但是冻干复水后血小板的细胞凋亡率显著高于新鲜血小板的自然凋亡率. 详细数据参见表 3. 表 3 犃狀狀犲狓犻狀犞 / 犘犐荧光标记法检测血小板的凋亡 ( 狀 =5) 犜犪犫.3 犃狆狅狆狋狅狊犻狊狉犪狋犲狅犳狉犲犺狔犱狉犪狋犲犱狆犾犪狋犲犾犲狋狊犱犲狋犲犮狋犲犱犫狔犃狀狀犲狓犻狀犞 / 犘犐犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀狋犿犪狉犽犿犲狋犺狅犱 ( 狀 =5) 组别犃狀狀犲狓犻狀犞阴犘犐阴犃狀狀犲狓犻狀犞阳犘犐阴犃狀犲狓犻狀犞阴犃狀犲狓犻狀犞阳犘犐阳犘犐阳 2.4 冻干血小板活化标志物的表达犘犃犆 1 犉犐犜犆和犆犇 62 犘犘犈分别为血小板表面活化早期标志物和活化晚期的标志物. 根据新鲜血小板阴性对照同样将图 3( 犪 ) 分为 4 个象限, 左下象限为非活化血小板, 右下象限为活化早期血小板, 右上象限为活化晚期血小板. 利用流式细胞术 ( 犉犆犕 ) 检测血小板活化标志物犘犃犆 1 和犆犇 62 狆的表达, 图 3 为犆犲犾犙狌犲狊狋分析结果, 图中横坐标和纵坐标分别表示犉犐犜犆和犘犈荧光信号强度. 最终详细数据参见表 4. 表 4 犘犃犆 1/ 犆犇 62 狆荧光标记法检测血小板的活化 ( 狀 =5) 犜犪犫.4 犃犮狋犻狏犪狋犻狅狀狉犪狋犲狅犳狉犲犺狔犱狉犪狋犲犱狆犾犪狋犲犾犲狋狊犱犲狋犲犮狋犲犱犫狔犘犃犆 1/ 犆犇 62 狆犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀狋犿犪狉犽犿犲狋犺狅犱 ( 狀 =5) 组别犘犃犆 1 阴犆犇 62 狆阴犘犃犆 1 阳犆犇 62 狆阴犘犃犆 1 阴犆犇 62 狆阳犘犃犆 1 阳犆犇 62 狆阳新鲜血小板 ( 阴性对照组 ) 94.2± ± ± ±0.1 新鲜血小板 ( 阴性对照组 ) 98.8± ± ± ±0.1 犃犇犘处理后的新鲜血小板 52.2± ± ± ±0.1 ( 阳性对照组 ) -30 冻干复水血小 87.5± ± ± ±0.3 板 ( 实验组 ) -30 冻干复水血小板 ( 实验组 ) 80.4± ± ± ±0.3

5 第 2 期王波, 等 : 搁板温度对人血小板冻干保存的影响 191 图 3 犉犆犕检测冻干复水后的血小板活化率犉犻犵.3 犃犮狋犻狏犪狋犻狅狀狅犳狉犪狋犲狆犾犪狋犲犾犲狋狊犱犲狋犲犮狋犲犱犫狔犉犆犕 3 讨论冷冻干燥法保存血小板可以大大延长血小板的保存期限, 并且具有轻便易带复水后可以直接使用等优点, 近年来成为血小板保存技术研究的热点 [9]. 目前国内关于血小板冷冻干燥保存的研究主要是针对保护剂配方优化而进行的. 周新丽等研究了海藻糖作为细胞内外保护剂的冻干配方问题 [7]. 曹伟等研究 [10] 了乙醛前处理和海藻糖载入血小板的问题, 刘景汉等研究了海藻糖加载技术和测定方法 [8]. 优化冻干参数方面的研究目前仍很少, 虽然已有学者对冷冻速率退火等预冻过程中的操作参数进行了一定的研究, 但是对于干燥过程的参数几乎无涉及, 尤其是一次干燥温度的选取. 在食品药品和微生物冷冻干燥领域, 有学者认为物料的温度在整个冻干过程必须始终低于其部分玻璃化转变温度犜犵 [11-12], 也就是说一次干燥的温度必须低于犜犵. 另有学者认为, 结晶型系统的一次干燥温度要低于物料的共晶温度犜犲, 无定形系统的一次干燥温度要低于物料的犜犵 [13-16]. 对于无定形系统, 犜犪狀犵等还提供了另外一种观点, 他们根据一种蛋白质的冻干试验结果, 指出一次干燥温度高于犜犵也是可行的 [17]. 血小板冻干样品的临界温度与许多因素相关, 包括预冻的进程保护剂种类和浓度等. 因此, 可以通过实验的方法选择合适的一次干燥温度, 一方面提高血小板冻干复水后的恢复率和功能, 另一方面加快干燥过程的进程. 由上述实验结果可以看出, 经过预冻的血小板保存液在 -30 左右的数值恢复率达到较满意的水平 (>85%), 即使温度下降到 -40, 恢复率提高的也并不多, 但是相应的水蒸气升华驱动力却从 [13] 12.9 犘犪提高到了 38.0 犘犪, 大大加快了干燥进程. 虽然冻干血小板保存液的玻璃化转变温度为 -34.3, 但是经过冻结形成的血小板并不是完全的无定形系统, 干燥过程中的临界温度也不再是其相应的玻璃化转变温度了. 实验结果表明, 略微提高干燥温度, 并不会对样品的存活率产生很大的影响. 但是, 当温度上升到 -25 甚至 -20 时, 会对血小板冻干后的存活率产生极大的影响, 存活率明显下降, 这说明温度高到已使冻结样品产生了融化现象. 对于一次干燥温度为 -30 以下的实验组, 测得的冻干后血小板犕犘犞值都在正常参考范围内. 但是 -30 和 -32 组比较接近正常范围的上限, 血小板的体积在冻干后有明显的变大趋势. 当干燥温度高于 -30 后, 冻干后血小板的犕犘犞值则均偏离了正常范围, 比 12.5 犳犔的上限要大出许多. 针对血小板分布宽度犘犇犠, 只有 -40 实验组的冻干后血小板在正常的 15.5~18.1 犳犔范围内, 但是也比较接近正常范围的上限 18.1 犳犔, 这说明冻干后血小板体积变异较明显, 虽然其数值恢复率达到了 90% 左右, 但是血小板细胞由于冻干而产生了明显的肿胀现象, 血小板的功能可能会出现一定的损失. 经过冻干后的血小板绝大部分集中于犃狀犲狓犻狀犞阴性和犘犐阴性区, 说明绝大多数的细胞仍然为活细胞, 且结果与之前使用血球计数仪得到的结果相差不大 (89.0%). 早期凋亡的细胞约占所有血小板细胞的 7.8%, 说明冻干和复水过程对血小板存在影响, 使得存在于细胞膜磷脂双分子层中的犘犛外翻暴露于细胞膜外层, 细胞进入凋亡早期阶段. 犘犐阳性的血小板细胞占总数的 4.7%, 这说明部分血小板的细胞膜已经破裂, 这些血小板在复水后将完全失去其原有的功能. 但是, 总体而言,-30 作为一次干燥温度, 细胞的凋亡率比较低, 仍在临床检验可接受范围之内.

6 192 上海理工大学学报 2013 年第 35 卷 -30 冻干后的血小板复水后非活化率可以达到 80% 左右, 说明约有 20% 的冻干后血小板失去了活性. 荧光标记的犆犇 62 狆 ( 这里使用犘犈作为荧光素 ) 抗体阳性表达的血小板百分率可反映血小板活化程度 [18]. 有人研究发现, 保存血小板犆犇 62 狆阳性率与血小板体内存活率及存活期呈负相关 [19]. 这表明,-30 作为一次干燥温度保存的血小板虽然数值恢复率较高, 达到了 89%, 但是, 输注后的止血效果和存活时间可能会受到影响. 刘景汉等人认为, 犆犇 62 狆的表达率较高, 血小板在输注入体内后, 不能很好地满足提高外周血血小板数目的临床需求, 但仍然具有较好的聚集活性和促凝血活性, 可以作为临时血小板代替品进行输注 [8]. 他们认为, 加入适量的可逆性血小板功能抑制剂可以有效地抑制血小板的体外活化, 并且抑制作用是可逆的, 保证了在输入体内后具有原有的黏附释放聚集等功能, 并且具有一定的存活时间 [20]. 参考文献 : [1] 曹伟, 王艳, 靳鹏, 等. 冷冻干燥血小板保存技术研究 [ 犑 ]. 中国实验血液学杂志,2005,13(5): [2] 周新丽, 刘宝林, 张绍志, 等. 糖的浓度和种类对人血小板冷冻干燥保存的影响 [ 犑 ]. 上海理工大学学报, 2007,29(6): [3] 犣犺狅狌犡犔, 犣犺狌犎, 犣犺犪狀犵犛犣, 犲狋犪犾. 犉狉犲狕犲犱狉狔犻狀犵狅犳犺狌犿犪狀狆犾犪狋犲犾狋狊 : 犻狀犳犾狌犲狀犮犲狅犳犻狀狋狉犪犮犲犾狌犪狉狋狉犲犺犪犾狅狊犲犪狀犱犲狓狋狉犪犮犲犾狌犪狉狆狉狅狋犲犮狋犪狀狋狊 [ 犑 ]. 犆狉狔狅犔犲狋犲狉狊,2006,27 (1): [4] 周新丽, 祝宏, 张绍志, 等. 冻结速率对血小板冷冻干燥保存的影响 [ 犑 ]. 细胞生物学杂志,2006,28(3): [5] 犉犪狀犑犔, 犡狌犡犌, 犣犺犪狀犵犛犣, 犲狋犪犾. 犈狓狆犲狉犻犿犲狀狋犪犾狊狋狌犱狔狅狀狉犲犺狔犱狉犪狋犻狅狀犮狅狀犱犻狋狅狀狊狅犳狉犲狕犲犱狉犻犲犱狆犾犪狋犲犾狋狊 [ 犑 ]. 犑狅狌狉狀犪犾狅犳犣犺犲犼犻犪狀犵犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔 : 犛犮犻犲狀犮犲犃,2009,10(5): [6] 犘犻犽犪犾犕犑. 犝狊犲狅犳犾犪犫狅狉犪狋狅狉狔犱犪狋犻狀犳狉犲狕犲犱狉狔犻狀犵狆狉狅犮犲狊犱犲狊犻犵狀 : 犺犲犪狋犪狀犱犿犪狊狋狉犪狀狊犳犲狉犮狅犲犳犻犮犲狀狋狊犪狀犱狋犺犲犮狅犿狆狌狋犲狉狊犻犿狌犾犪狋犻狅狀狅犳狉犲狕犲犱狉狔犻狀犵 [ 犑 ]. 犑狅狌狉狀犪犾狅犳犘犪狉犲狀狋犲狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾犵狔,1985,39(3): [7] 周新丽, 张绍志, 陈光明. 人血小板的冷冻干燥保存 : 细胞内外保护剂的作用 [ 犑 ]. 制冷学报,2008,29(2): [8] 周俊, 刘景汉, 欧阳锡林, 等. 血小板胞内海藻糖测定方法的建立和评价 [ 犑 ]. 中国实验血液学杂志,2004,12 (6): [9] 刘景汉, 周俊, 王冬梅, 等. 冷冻干燥保存血小板的实验研究 [ 犑 ]. 中国实验血液学杂志,2007,15(5): [10] 曹伟, 王艳, 靳鹏, 等. 冷冻干燥血小板保存技术研究 [ 犑 ]. 中国实验血液学杂志,2005,13(5): [11] 刘占杰, 华泽钊, 陈建明, 等. 药品冷冻干燥过程中的玻璃化作用 [ 犑 ]. 中国医药工业杂志,2000,31(8): [12] 犎犪狀犮狅犮犽犅犆, 犛犺犪犿犫犾犻犛犔, 犣狅犵狉犪犳犻犌. 犕狅犾犲犮狌犾犪狉犿狅犫犻犾狋狔狅犳犪犿狅狉狆犺狅狌狊狆犺犪狉犿犪犮犲狌狋犻犮犪犾狊狅犾犻犱狊犫犲犾狅狑狋犺犲犻狉犵犾犪狊狋狉犪狀狊犻狋狅狀狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狊 [ 犑 ]. 犘犺犪狉犿犪犮犲狌狋犻犮犪犾犚犲狊犲犪狉犮犺,1995,12(6): [13] 华泽钊. 冷冻干燥新技术 [ 犕 ]. 上海 : 科学出版社,2006. [14] 犘犪狋犲犾犛犕, 犇狅犲狀犜, 犘犻犽犪犾犕犑. 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犲狀犱狆狅犻狀狋狅犳狆狉犻犿犪狉狔犱狉狔犻狀犵犻狀犳狉犲狕犲犱狉狔犻狀犵狆狉狅犮犲狊犮狅狀狋狉狅犾 [ 犑 ]. 犃犘犛犘犺犪狉犿犛犮犻犜犲犮犺,2010,11 (1): [15] 毕殿洲. 药剂学 [ 犕 ]. 北京 : 人民卫生出版社,1999. [16] 李华, 骆艳娥, 刘延琳. 真空冷冻干燥微生物的研究进展 [ 犑 ]. 微生物学通报,2002,29(3): [17] 犜犪狀犵犡犔, 犘犻犽犪犾犕犑. 犇犲狊犻犵狀狅犳狉犲狕犲犱狉狔犻狀犵狆狉狅犮犲狊犲狊犳狅狉狆犺犪狉犿犪犮犲狌狋犻犮犪犾狊 : 狆狉犪犮狋犻犮犪犾犪犱狏犻犮犲 [ 犑 ]. 犘犺犪狉犿犪犮犲狌狋犻犮犪犾犚犲狊犲犪狉犮犺,2004,21(2): [18] 彭黎明, 杨菁. 血小板功能检测及其应用的研究进展 [ 犑 ]. 中国实验诊断学,2001,5(5): [19] 犎狅犾犿犲犛, 犛狑犲狀犲狔犑犇, 犛犪狑狔犲狉犛. 犜犺犲犲狓狆狉犲狊犻狅狀狅犳狆狊犲犾犮狋犻狀犱狌狉犻狀犵犮狅犾犲犮狋犻狅狀, 狆狉狅犮犲狊犻狀犵, 犪狀犱狊狋狅狉犪犵犲狅犳狆犾犪狋犲犾狋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犲狊 : 狉犲犾犪狋犻狅狀狊犺犻狆狋狅犾狅狊狅犳犻狀狏犻狅狏犻犪犫犻犾狋狔 [ 犑 ]. 犜狉犪狀狊犳狌狊犻狅狀,1997,37(1): [20] 王冬梅, 刘景汉, 周俊, 等. 腺苷对血小板体外激活的抑制作用 [ 犑 ]. 中国实验血液学杂志,2005,13(6): ( 编辑 : 丁红艺 )

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