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1 結核菌藥物感受性試驗 長庚紀念醫院醫檢部 郭安靜 1

2 大綱 結核菌藥物感受性原理 結核菌藥物感受性操作流程 結核菌藥物感受性品管作業 結核菌藥物感受性試驗判讀 重要事項提醒 2

3 結核菌藥物感受性原理 3

4 建議使用時機 第一套分離的 MTBC 治療失敗或是治療三個月未陰轉 臨床治療没有反應, 醫師要求作藥敏試驗 MDR-TB 指對 isoniazid, rifampicin 呈抗藥 XDR-TB 指 MDR-TB 再加上一種 fluoroqguinolone 及一種第二線針劑 ( 如 capreomycin, kanamycin, amikacin) 呈抗藥性 4

5 M. tuberculosis complex 瓊脂平板法 Agar proportion method CLSI-M24 A2 o Middlebrook 7H10 medium o Middlebrook 7H11 medium 5

6 臨界濃度 Critical concentration 可以抑制 95% 特定菌種野生株生長的濃度 The lowest concentrations of drugs that inhibit 95% of wild strains of M. tuberculosis that have never been exposed to the drugs. CLSI M24-A2 6

7 Resistance of agar proportion method Growth of greater than 1% of an inoculum of bacterial cells in the presence of a critical concentration of antituberculous drug. 大於 1% 的細菌出現在抗結核桿菌群的藥物臨界濃度下 當用來測試的臨床分離菌株暴露在藥物臨界濃度下, 菌株生長超過 1%, 則該藥物即不適合繼續當做抗結核治療藥物 CLSI M24-A2 傳染病標準檢驗方法手冊 7

8 適用濃度 Not recommended CLSI M24-A2 8

9 瓊脂平板法 Agar proportion method 直接法 Direct testing 經過消化去汙處理且抹片鏡檢陽性檢體 間接法 Indirect testing 從固態培養基純化之 MTBC 菌株 9

10 藥物感受性試驗快速方法 美國 FDA 核准液態培養系統 o BACTEC TM 460 o BACTEC TM MGIT TM 960 o VersaTREK 結果與瓊脂平板法結果呈現相關 若有抗藥結果可以先發初報, 但需使用瓊脂平板法再行確認 液態培養系統結果有疑義或有其他新的藥物需要測試時, 都需使用瓊脂平板法 CLSI M24-A2 10

11 結核菌藥物感受性操作流程 11

12 四分格培養基 不含藥培養基 (control) 0.2 μg/ml Isoniazid (INH) 2.0 μg/ml Streptomycin (SM) 10.0 μg/ml Streptomycin (SM) 1.0 μg/ml Isoniazid (INH) 1.0 μg/ml Rifampin (RMP) 5.0 μg/ml Ethambutol (EMB) 10.0 μg/ml Ethambutol (EMB) 12

13 接種菌液製備 固態培養基 1. 刮取 新鮮 菌落 足量新鮮 pure 菌落 ( 不要超過 4-5 週 ) 盡可能挑取大範圍菌落 不要刮到培養基 盡可能使用初次培養基, 使用液態次培養菌液可能因慢速生長菌落不足導致 false-susceptible 2. 加入 試管 16*125 mm 無菌試管 3~5 ml 無菌水或生理食鹽水或 PBS 6~10 顆玻璃或塑膠珠 ( 直徑 3 mm) 濃度大於 McFarland No. 1 整個操作過程須避免噴濺及飛沫產生 操作時, 物品擺設及動線設計勿使手越過無菌區, 例如已開蓋朝上的檢體及蓋子 13

14 接種菌液製備 固態培養基 3. 混合 菌液 使用接種環將菌落沿管壁乳化 (emulsify) 確認上蓋鎖緊 使用振盪器以足夠速度 漩渦式離心混合 1-2 分鐘 震盪時保持液面不超過試管 2/3 高度 避免菌液翻騰以減少氣膠生成 4. 靜置沉降 5. 調整濃度 靜置 30 分鐘或以上, 讓大菌落沉降, 避免開蓋時氣膠溢散 試管拿起時宜輕緩, 勿使已沉澱的大顆粒漂浮在要吸取的菌液中 取上清液至另一無菌管 以加入無菌水方式調整濃度至 0.5~1 McFarland 14

15 接種與培養 1. 系列 稀釋 2. 接種 無菌水或生理食鹽水或 PBS 以調整好濃度的菌液進行系列稀釋成 10-2 與 10-4 沿管壁混合均勻, 須更換 drop 連續稀釋時稀釋倍數須精確及須確實混合均勻 操作過程須避免噴濺及飛沫產生 dropper 丟入有裝消毒劑的桶子內, 注意丟棄動線沒有因 dropper 內的殘留液體, 產生噴濺至操作台上的檢體及培養基的疑慮 以無菌微量吸管吸取 0.1 ml10-2 稀釋液 (10 6 CFU/mL) 至含藥與不含藥培養基 ; 或以無菌吸管於各培養基不同處接種 3 滴 ( 可輕微搖晃, 使菌液均勻散開 ) 以相同方式將 10-4 稀釋液 (10 4 CFU/mL) 接種到另一套含藥與不含藥培養基 Modified indirect susceptibility method: 10-2 稀釋液接種到含藥與不含要培養基,10-4 稀釋液只接種到不含藥培養基 15

16 接種與培養 3. 密封 培養基需正面向上擺放至水份已經被培養基吸收 將培養基放入二氧化碳可以進入的 PE 塑膠袋封口 4. 培養 將培養基正面向下放入培養箱培養 36 +/ % CO 2 培養基須避免暴露於陽光下以防止甲醛氣體生成 5. 觀察 為了避免視覺干擾, 可以將放置培養基的塑膠袋從培養箱取出, 正放方式在室溫下放置數小時或 overnight 利用解剖顯微鏡每週觀察 16

17 結核菌藥物感受性品管作業 17

18 Pan-susceptible 菌株 品管菌株種類 o M. tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) o M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177) 抗藥菌株 o 可考慮選擇單抗低濃度 INH 菌株 (ATCC BAA-812) o 安全考量下, 不建議使用具二種藥物之抗藥性菌株 若無法取得標準菌株, 可從能力試驗菌株或臨床經過確認的菌株挑選 18

19 執行頻率 品管菌株使用 o 新批號培養基 ( 培養基或藥物 ) o 若病人檢體每週操作,M. tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) 至少需每週執行一次 o 抗藥菌株執行頻率可以減少 避免繼代培養以減少突變機會 o 菌株以多管小量分裝於 -60 以下且不會自動除霜冰箱 (-20 可保存期限短 ) 19

20 結核菌藥物感受性試驗判讀 20

21 生長情形 >500 colonies (confluent growth) 生長融合 colonies (almost confluent growth) 幾乎融合 生長情形記錄 記錄方式 colonies 2+( 建議實際計數菌落數 ) colonies 1+( 建議實際計數菌落數 ) <50 colonies 計算菌落

22 判讀時間 每週觀察, 若有汙染可提早處理 觀察時間以三週為限 如果不含藥培養基已有 50 個菌落, 可於三週內發出抗藥報告 ; 敏感結果則需觀察滿三週確認後才可發出 21 天菌株生長不佳, 不建議再放至 28 天觀察 22

23 品管菌株 判讀條件 o 通常 10-2 不含藥培養基需有 個菌落生長,10-4 不含藥培養基需有 個菌落生長 臨床菌株 o 不含藥培養基至少需有 50 個菌落生長 ( 實際作業建議至少有 100 個菌落生長 ) o 不含藥培養基需有分開可數的菌落 Clinical Microbiology Procedure Handbook,

24 判讀方法 以計算百分比決定抗藥與否 10-2 /10-4 X 10-2 含藥 /10-4 control*100 24

25 判讀方法 以不含藥培養基生長數達 100 個菌落以上且可數之稀釋濃度比較為原則 如果同稀釋倍數無法計數時, 可計算不同濃度的菌落數後乘以稀釋倍數進行比較 需要重新操作 o 不含藥培養基菌落數生長不足 o 當 10-2 與 10-4 菌落數不成比例而影響結果判讀時 o 當計算之抗藥菌落數比率在 1% 附近易有疑義時 o 含藥培養基比不含藥培養基生長量少, 但不含藥培養基生長融合無法計算菌落數時 25

26 結果判讀 -- 範例一 以不含藥培養基生長數達 50 個菌落以上且可數之稀釋濃度比較為原則 26

27 結果判讀 -- 範例二 如果同稀釋倍數無法計數時, 可計算不同濃度的菌落數後乘以稀釋倍數進行比較 27

28 結果判讀 -- 範例三 如果同稀釋倍數無法計數時, 可計算不同濃度的菌落數後乘以稀釋倍數進行比較 28

29 重要事項提醒 29

30 MTBC 菌落型態認知 單一型態確認 o 建議使用解剖顯微鏡 菌落型態確認 o 結果無法判讀時, 不可由含藥的培養皿直接調菌再作藥敏 30

31 振盪器振盪時間不足 操作細節 o 振盪器振盪須配合使用計時器 濁度調整不正確 ( 過度接種 ) o 調濁度時, 使用濁度計輔助 連續稀釋時稀釋倍數不精確及未確實混合均勻 o 稀釋倍數須正確及確實的連續稀釋 o 使用塑膠滴管置換儘可能大量的混合均勻, 同時要避免氣泡及飛沫 噴濺的產生 31

32 接種時超過 3 滴 o 接種量須確實 o 等量接種 未確實計算菌落數目 操作細節 o 確實計算菌落數目, 由 10 2 及 10 4 的結果正確綜判藥敏結果 生安問題 : 操作過程噴濺及飛沫產生 o 加強優良微生物技術 o 加強生安訓練及落實操作過程防止噴濺及飛沫產生 32

33 敬請指教!! 33

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