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1 A comprehensive investigation to data dependent acquisition workflow for deep coverage of proteome CNCP2018 联合数据分析报告 刘超 pfind 团队 2018 年 8 月 22 日

2 CNCP2018 联合数据分析 相同的 HeLa 细胞样品 全国共 13 家单位 17 个实验室参与 设计原则 : 1 简单 2 通用 反馈优化建议 生物质谱实验室 pfind 团队 采集 2 小时质谱数据 2

3 研究目的 1 探索是否可以对色谱 - 质谱平台进行参数优化实践 ; 2 评估各个色谱 - 质谱平台的发展水平 ; 3 倡议大家关注色谱 - 质谱数据采集基础技术, 共同提升对复杂生物样品的覆盖度 ; 3

4 一 实验设计 二 结果分析 提纲 三总结展望

5 蛋白质组学领域研究不同层次 不同类型的科学问题 分析标准品分析复杂样品发现疾病标志物 5

6 格斗有各种形式 各个门派 拳击散打自由搏击 6

7 格斗有各种形式 各个门派 拳击散打自由格斗 用拳击打对手是基本技术 7

8 简单 通用的实验方案 复杂生物样品的深度解析 1 统一的 HeLa 样品 2 采集 120 分钟高精度二级谱图 3 pfind+pquant 进行数据分析 8

9 分析内容 生物质谱实验是一个黑盒, 只能对比鉴定结果? Liquid Chromatography Mass Spectrometry DDA: Data Dependent Acquisition Sample amount LC peak capacity LC gradient MS resolution MS ion injection time MS dynamic exclusion MS top-n # Peptides identified # Proteins identified 9

10 分析内容 打开黑盒, 分析 DDA 内部的工作机制, 衡量每个参数对鉴定结果的影响 Liquid Chromatography Mass Spectrometry DDA: Data Dependent Acquisition Sample amount LC peak capacity LC gradient MS resolution MS ion injection time MS dynamic exclusion MS top-n # Peptides identified # Proteins identified 10

11 分析过程 2018 年上半年 1 月, 形成初步方案 5 月, 发布第一轮分析报告 6 月, 公开正式发布通知 1 预实验 2 正式实验 3 月, 落实生物样品 4 月底, 确认实验室方案 7 月, 分析全部数据, 反馈结果 3 公布结果 4 月初, 联络实验室, 进行预实验预分析 4 月, 向各实验室反馈分析结果 8 月, 汇总结果, 准备报告 11

12 CNCP2018 联合数据分析 相同的 HeLa 细胞样品 全国共 13 家单位 17 个实验室参与 序号 仪器 实验室数目 1 QEHF-X 2 2 Lumos 4 3 QE-HF 4 4 Fusion 1 5 QE plus 1 6 Elite 2 7 QE 2 8 Velos 1 反馈优化建议 生物质谱实验室 pfind 团队 采集 2 小时质谱数据 12

13 一 实验设计 二 结果分析 提纲 三总结展望

14 QEHFX1 QEHFX2 Lumos1 Lumos2 Lumos3 Lumos4 QEHF1 QEHF2 QEHF3 QEHF4 Fusion1 QE plus1 QE1 QE2 Elite1 Elite2 Velos1 鉴定蛋白质数目 结果分析 pfind3 鉴定结果, 肽段 蛋白质层次 FDR 小于等于 1% 横向 : 各平台对比分析 质谱仪性能在发展, 有何新挑战? 纵向 : 同一平台优化色谱质谱参数 是否可以优化? 怎么优化? 编号原则 : 仪器类型 + 提交顺序 14

15 近10年质谱仪相关技术发展迅速 2018, QEHFX 2017, Lumos 2016, Fusion 2014, QEHF 2012, Elite 2011, QE 2009, Velos 15

16 QEHFX1 QEHFX2 Lumos1 Lumos2 Lumos3 Lumos4 QEHF1 QEHF2 QEHF3 QEHF4 Fusion1 QE plus1 QE1 QE2 Elite1 Elite2 Velos1 QEHFX1 QEHFX2 Lumos1 Lumos2 Lumos3 Lumos4 QEHF1 QEHF2 QEHF3 QEHF4 Fusion1 QE plus1 QE1 QE2 Elite1 Elite2 Velos1 鉴定蛋白质数目 采集二级谱图数目 质谱仪采集速度影响采集二级谱图数目 横向 : 各平台对比分析 ; 主要差异 : 采集速度差异大 ; 巧妇难为无米之炊

17 质谱仪采集速度影响采集二级谱图数目 Velos: ~3 Hz QEHFX: ~40Hz 上图一个点对应一个 cycle, 横坐标是该 cycle 所占采集时间, 纵坐标是该 cycle 采集的二级谱图数目 ; 17

18 质谱仪采集速度影响采集二级谱图数目 DDA cycle 累计采集二级谱图 每个 cycle 采集的二级谱图 二级谱图数目 时间适中 时间适中 时间短 时间长 18

19 分析内容 横向比较 质谱采集速度差异大 色谱效果差异如何? 19

20 色谱峰容量 (Peak Capacity) 差异大 pquant 为每条肽段重构色谱曲线 Full Width 所有肽段的色谱 Full Width 直方图 肽段持续洗脱时间长拖尾现象明显 肽段持续洗脱时间短拖尾现象不明显 Shishkova, E.; Hebert, A. S.; Coon, J. J., Now, More Than Ever, Proteomics Needs Better Chromatography. Cell Syst 2016, 3, (4),

21 QEHFX1 QEHFX2 Lumos1 Lumos2 Lumos3 Lumos4 QEHF1 QEHF2 QEHF3 QEHF4 Fusion1 QE plus1 QE1 QE2 Elite1 Elite2 Velos1 QEHFX1 QEHFX2 Lumos1 Lumos2 Lumos3 Lumos4 QEHF1 QEHF2 QEHF3 QEHF4 Fusion1 QE plus1 QE1 QE2 Elite1 Elite2 Velos1 鉴定蛋白质数目 色谱峰容量 色谱峰容量 (Peak Capacity) 差异大 质谱仪性能好色谱性能好 ; 好的色谱可以提升鉴定结果数目 ; Shishkova, E.; Hebert, A. S.; Coon, J. J., Now, More Than Ever, Proteomics Needs Better Chromatography. Cell Syst 2016, 3, (4),

22 色谱峰容量与鉴定结果 Coon: 提升色谱峰容量, 可以显著提升鉴定肽段数目 ; Shishkova, E.; Hebert, A. S.; Coon, J. J., Now, More Than Ever, Proteomics Needs Better Chromatography. Cell Syst 2016, 3, (4),

23 Coon 实验室的数据 ( Now, More Than Ever, Proteomics Needs Better Chromatography ) 90min., 30cm, 1.7um 3Nov2015_ES_3p5um_20cm_IT_rapid 2015/11/4 12:40:15 RT: NL: 2.73E10 TIC MS 3Nov2015_ ES_3p5um _20cm_IT_r apid 中值 0.17 中值 3.1 Pc= Time (min) 90min., 20cm, 3.5um 3Nov2015_ES_3p5um_20cm_IT_rapid 2015/11/4 12:40: Relative Abundance RT: NL: 2.73E10 TIC MS 3Nov2015_ ES_3p5um _20cm_IT_r apid 中值 0.35 中值 Time (min) 23

24 小结 我们横向分析了来自 17 个实验室 采集自 8 种质谱仪的数据 近 10 年, 质谱仪的采集速度提升了一个数量级 从小于 4Hz 到大于 40Hz 色谱性能在全流程中的重要性日益凸显 Pc 对鉴定结果数目有显著影响 24

25 QEHFX1 QEHFX2 Lumos1 Lumos2 Lumos3 Lumos4 QEHF1 QEHF2 QEHF3 QEHF4 Fusion1 QE plus1 QE1 QE2 Elite1 Elite2 Velos1 鉴定蛋白质数目 结果分析 pfind3 鉴定结果, 肽段 蛋白质层次 FDR 小于等于 1% 横向 : 各平台对比分析 质谱仪性能在发展, 有何新挑战? 纵向 : 同一平台优化色谱质谱参数 是否可以优化? 怎么优化? 编号原则 : 仪器类型 + 提交顺序 25

26 同一平台优化色谱质谱参数 QEHFX1 QEHFX2 Lumos1 Lumos2 Lumos3 Lumos4 QEHF1 QEHF2 QEHF3 QEHF4 Fusion1 QE plus1 QE1 QE2 Elite1 Elite2 Velos1 采集二级谱图数目 QEHFX1 QEHFX2 Lumos1 Lumos2 Lumos3 Lumos4 QEHF1 QEHF2 QEHF3 QEHF4 Fusion1 QE plus1 QE1 QE2 Elite1 Elite2 Velos1 鉴定肽段序列数目同一质谱仪, 结果差异大

27 以两个 QEHF 数据为例 QEHF1 QEHF2 Items Identification results Acquired Identified # Full MS Scans # MS/MS Scans # MS/MS Scans # Peptides # Sequences # Proteins # Protein Groups < < QEHF2 采集和鉴定的二级谱图多 27

28 以两个 QEHF 数据为例 QEHF2 质谱参数合理每个 cycle 都很饱满 约 20Hz 右图有两个纵坐标, 左坐标 ( 黑线 ) 是累积采集的二级谱图数目, 右坐标 ( 蓝点 ) 是每个 cycle 内的二级谱图数目, 数学上可以理解为右坐标是左坐标的导数 ; 28

29 质谱仪采集速度影响采集二级谱图数目 DDA cycle 累计采集二级谱图 每个 cycle 采集的二级谱图 二级谱图数目 时间适中 时间适中 时间短 时间长 29

30 以两个 QEHF 数据为例 QEHF1 设置 1 拖 20, 但是很多 cycle 采集不到 20 张二级谱图质谱仪 一直 在采集一级谱图 小于 20Hz 30 右图有两个纵坐标, 左坐标 ( 黑线 ) 是累积采集的二级谱图数目, 右坐标 ( 蓝点 ) 是每个 cycle 内的二级谱图数目, 数学上可以理解为右坐标是左坐标的导数 ;

31 以两个 QEHF 数据为例 QEHF1 QEHF2 Items Identification results Acquired Identified # MS/MS Scans # MS/MS Scans # MS/MS Scans # Peptides # Sequences # Proteins # Protein Groups < > > QEHF2 鉴定的二级谱图多 QEHF1 鉴定的肽段和蛋白质多 31

32 提升色谱峰容量可以提升鉴定肽段数目 约 70% 的肽段被一张二级谱图鉴定到 中值 :0.43 几乎没有拖尾 QEHF1 中值 :0.60 有拖尾现象 QEHF2 一条肽段被 3 4 张二级谱图鉴定到 32

33 各参数对鉴定结果的影响 对于同一个色谱质谱平台, 鉴定到肽段数目 N identified_pep 多 N identified_pep = N acquired_ms2 r MS2_pep q Ms2 1 N acquired_ms2, 采集二级谱图数目多 2 r MS2_pep, 谱图利用率高 3 q MS2, 谱图质量好 Liquid Chromatography Mass Spectrometry DDA: Data Dependent Acquisition Sample amount LC peak capacity LC gradient MS resolution MS ion injection time MS dynamic exclusion MS top-n 33

34 各参数设置需要找到平衡点 设置不同的动态排除设置不同的最大离子注入时间 (Max Ion injection Time) MIT=100ms % MIT=45ms % MIT=35ms % 采集二级谱图数目鉴定二级谱图数目鉴定肽段数目 34

35 CNCP2018 联合数据分析 共 17 个实验室提交了数据, 其中 11 个实验室提交了至少 2 组数据 QEHFX 优化前蛋白质鉴定数目 优化后蛋白质提升数目 Items Identification Results # MS/MS Scans # Peptides # Sequences # Protein Groups ID Rate 81.6% 61.2% 优化后 优化前, 该结果不如优化效果良好的 QEHF 35

36 怎么优化? 托尔斯泰 : 找出短板, 逐一优化 幸福的家庭都是相同的, 不幸的家庭各有各的不幸 36

37 小结 我们纵向研究优化色谱 - 质谱平台的参数设置问题 1 围绕下述公式设计合适的参数 N identified_pep = N acquired_ms2 r MS2_pep q Ms2 2 利用 干 实验技术可以对 湿 实验参数设置进行评估 3 设置合理的参数可以更好地发挥色谱- 质谱平台的能力 37

38 一 实验设计 二 结果分析 提纲 三总结展望

39 总结与展望 CNCP2018 联合数据分析 : 设计了一个 简单 通用 的实验方案, 基于 pfind 系列软件, 我们对相关数据进行深入分析, 揭示基础技术状态 ; Liquid Chromatography Mass Spectrometry DDA: Data Dependent Acquisition Sample amount LC peak capacity LC gradient MS resolution MS ion injection time MS dynamic exclusion MS top-n # Peptides identified # Proteins identified 39

40 深入且精细的数据分析是基础 数据定性 定量分析的灵敏度和准确度是关键 ; 二级谱图解析率 100.0% 90.0% 80.0% 70.0% 60.0% 50.0% 40.0% 30.0% 20.0% 10.0% 0.0% 87% 69% 提取肽段一级谱图信号 40

41 色谱技术并不简单 Mouse tissues, QE-HF, 4h gradient _QEp8_KiSh_SA_Cerebellum_P05_Singleshot1.raw Relative Abundance RT: NL: 2.96E10 TIC MS _QE p8_kish_sa_ Cerebellum_P 05_Singleshot Time (min) 270 分钟的梯度 41

42 Mann 数据的肽段洗脱时间直方图 中值 (Pc= (270*60)/6.82= 2375 ) 持续洗脱时间超过 0.5 分钟的肽段并不多 几乎没有拖尾现象 42

43 DDA 的工作过程 DDA 模式下对肽段采集二级谱图一条肽段打一张二级谱图 漏打 ( 二级谱图 ) 错打 重打 混打 43

44 总结与展望 面向基于 DDA 策略的蛋白质深度覆盖, 随着质谱采集速度的提升, 有两个性能指标 ( 参数 ) 变得越来越重要 1 色谱峰容量 ; 快速洗脱 分馏 vs. 不分馏 2 在一级谱图中发现肽段母离子的能力 ; 精准打谱 DDA vs. DIA 44

45 致谢 南方科技大学 田瑞军实验室 45

46 衷心感谢所有参与 CNCP2018 联合数据分析的实验室 我们一起努力, 为中国蛋白质组学事业的发展添砖加瓦! 46

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