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- 利 汗
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1 TUNEL FITC Apoptosis Detection Kit TUNEL FITC A111 Vazyme Biotech Co., Ltd Web: Tel: Sales: Support: Service: SYSTEMS 企业已通过 ISO 9001:2015 国际质量管理体系认证 Vazyme biotech co., ltd. 使用说明书 Version 7.2
2 目 录 Contents 01/产品概述 细胞凋亡时 细胞内特异性核酸内切酶活化 染色质DNA在核小体间被特异性切割 DNA降解 成180~200 bp或其它整数倍片段 DNA分子断裂产生的3 -羟基(3 -OH)末端可以在末端脱氧核糖核 苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase TdT)的作用下结合荧光素-12-脱氧三磷酸尿苷 (FITC-12-dUTP) FITC-12-dUTP标记的DNA可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量分析 从而反映细胞凋亡水平 本试剂盒对标记反应进行了优化 采用最佳比例的荧光素标记和未标记的dNTP进行3 -OH末端的 核苷酸掺入 使得同一个断裂的DNA片段末端可以形成更长的 标记尾巴 该 标记尾巴 减少了相 邻掺入dNTP上标记基团的空间位阻 增加了每个断裂片段末端的荧光基团数目 降低了荧光基 团相邻后可能造成的聚集和淬灭 从而提高检测灵敏度 减少非特异性反应 02/产品组分 组 分 A (20 rxn) A (50 rxn) A (100 rxn) 1.25 ml ml ml 100 μl 250 μl μl 20 μl 50 μl 2 50 μl Proteinase K (2 mg/ml) 40 μl 100 μl μl FITC-12-dUTP Labeling Mix DNase I (2 U/μl) 10 DNase I Buffer 13 μl μl 260 μl 500 μl 03/保存条件 01/产品概述 /产品组分 /保存条件 /自备材料 /实验流程概要 /组织切片/贴壁细胞使用方案 /样本预处理 /阳性处理 /标记及检测 /悬浮细胞使用方案 保存 FITC-12-dUTP Labeling Mix -20 避光保存 04/自备材料 试剂 4%多聚甲醛 DAPI/PI Triton X-100 PBS 无水乙醇 其他材料 细胞爬片/载玻片 湿盒 08/常见问题及解决方案 /附录 / 02
3 05/实验流程概要 06/组织切片/贴壁细胞使用方案 请在实验前仔细阅读此操作说明 本使用方案适用于石蜡包埋组织切片 冰冻组织切片 贴 石蜡切片 冰冻切片 贴壁细胞 壁细胞凋亡检测 各样本请严格按照其操作流程进行 如需进行悬浮细胞检测 请参照07/ 悬浮细胞 悬浮细胞使用方案 脱蜡和水化 固定 细胞涂片/爬片 细胞涂片/爬片 06-1/样本预处理 样本预处理 固定 通透(蛋白酶K) 石蜡包埋组织切片 1.室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片2次 每次5 min 以彻底脱掉石蜡 二甲苯为有毒易挥发物质 请在通风橱中进行 2.室温下用无水乙醇浸泡润洗切片2次 每次5 min 通透(Triton X-100/蛋白酶K) 3.室温下用梯度乙醇 (90% 80% 70%)各浸泡润洗1次 每次3 min 4.用1 PBS浸泡润洗切片 并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围多余的液体 洗涤样本 2-3次 可用石蜡笔或疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓 便于下游通透性处理和平衡标记操作 在实验过程中 切勿让样品干燥 处理好的样本放在湿盒中保持湿润 1 PBS 5.按1:100的比例 将2 mg/ml的proteinase K溶液用1 PBS稀释 使其终浓度为20 µg/ml 每个样本上滴加100 µl稀释好的proteinase K溶液 使溶液覆盖全部样本区域 室温孵育 平衡 (室温 min) 1 Equilibration Buffer 100 μl Proteinase K通透时间过长会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载玻片上脱落的风险 过短则可能造成 通透处理不充分 影响标记效率 为得到最好的结果 可能需要优化Proteinase K的孵育时间 6.用1 PBS溶液浸泡润洗样本2~3次 每次3~5 min 轻轻去掉多余液体 并用滤纸小心吸干 ddh2o 标记 (37 60 min) 20 min 34 μl FITC-12-dUTP Labeling Mix 1 μl 载玻片上样本周围的液体 处理好的样本放在湿盒中保持湿润 冰冻组织切片 1.将冰冻切片置于片架上 室温晾干20 min 2.将载玻片浸没在4%多聚甲醛溶液 (溶于1 PBS)中 室温固定30 min 终止/洗涤 3.轻轻去掉多余液体 并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体 1 PBS 4.将载玻片浸没在1 PBS溶液中清洗两次 每次5 min 5.轻轻去掉多余液体 并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体 染色 (室温复染5 min) 可用石蜡笔或疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓 便于下游通透性处理和平衡标记操作 在实验过程中 切勿让样品干燥 处理好的样本放在湿盒中保持湿润 PI/DAPI 选做 洗涤样本 2-3次 6.按1:100的比例 将2 mg/ml的proteinase K溶液用1 PBS稀释 使其终浓度为20 µg/ml 每个样本上滴加100 µl稀释好的proteinase K溶液 使溶液覆盖全部样本区域 室温孵育 10 min 1 PBS Proteinase K通透时间过长会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载玻片上脱落的风险 过短则可能造 成通透处理不充分 影响标记效率 为得到最好的结果 可能需要优化Proteinase K的孵育时间 7.用1 PBS溶液润洗样本2~3次 每次3~5 min 轻轻去掉多余液体 并用滤纸小心吸干载玻 片上样本周围的液体 处理好的样本放在湿盒中保持湿润 分析样品 图一 实验流程概要 03/ 04
4 细胞样品 06-3/标记及检测 细胞爬片的准备 1.按1:5的比例用ddH2O将稀释成1 Equilibration Buffer 在Lab-Tek载玻片小室或TC处理的细胞爬片上培养贴壁细胞 在凋亡诱导处理之后 用PBS 2.滴加100 µl 1 Equilibration Buffer使其全部覆盖待检样本区域 室温平衡10~30 min 漂洗载玻片2次 进入后续实验 3.平衡期间在避光条件下按照下表配制标记液 细胞涂片的准备 以2 106 cells/ml的浓度将细胞重悬于1 PBS 吸取50~100 µl细胞悬液滴于多聚赖氨酸 包被的载玻片上 用一片干净的载玻片轻柔地涂开细胞悬液 进入后续实验 1.将爬片/涂片浸入装有4%多聚甲醛(新鲜配制于1 PBS)的染色缸中 在4 放置25 min 进行细 胞固定 2.将爬片/涂片浸没在1 PBS溶液中清洗两次 每次室温放置5 min 3.轻轻去掉多余液体 并用滤纸小心吸干爬片/涂片上样本周围的液体 可用石蜡笔或疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓 便于下游通透性处理和平衡标记操作 在实验过程中 切勿让样品干燥 处理好的样本放在湿盒中保持湿润 4.按1:100的比例 将2 mg/ml的proteinase K溶液用1 PBS稀释 使其终浓度为20 µg/ml 在每个样本上滴加100 µl稀释好的proteinase K溶液 使溶液覆盖全部样本区域 室温孵育 5 min 也可浸于用1 PBS配置的浓度为0.2% Triton X-100溶液中 室温孵育5 min进行通 阴性对照 阳性对照/样品 ddh2o 3 34 μl FITC-12-dUTP Labeling Mix 0 μl 1 μl 组分 对于面积小于5 cm2的反应 所需体积是50 μl 用50 μl乘以实验和阳性对照反应的数目来确定所需tdt 孵育缓冲液的总体积 对于表面积更大的样本 可成比例地增加试剂体积 4.平衡结束后 用吸水纸吸掉1 Equilibration Buffer 然后在面积为5 cm2的样本上滴加50 μl TdT孵育缓冲液 不要让样本干掉 使用吸水纸时 吸水纸不要接触细胞或者组织 载玻片/爬片需要避光处理 5.将封口膜剪成与组织或爬片同等大小 轻盖在样本上以保证试剂均匀分布 在湿盒的底部 透处理 放上用水浸湿的纸巾 将载玻片置于湿盒内 37 孵育60 min 细胞爬片/涂片在处理时较易脱片 建议使用0.2~0.5%的Triton X-100溶液进行通透 以避免通透引 起的脱片 Proteinase K通透时间过长会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载玻片上脱落的风险 过短则可能 造成通透处理不充分 影响标记效率 为得到最好的结果 可能需要优化Proteinase K孵育的时间 可折起封口膜的边缘以便于移除和操作 湿盒用锡箔纸包裹避光 5.用1 PBS溶液润洗样本2~3次 轻轻去掉多余液体 并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围 的液体 处理好的样本放在湿盒中保持湿润 6.轻轻去掉多余液体 用新鲜的1 PBS溶液清洗2次 每次室温孵育5 min 为了降低背景 样本在用1 PBS清洗后 可再用含0.1% Triton X-100和5 mg/ml BSA的PBS洗3次 每次5 min 这样可将游离的未反应标记物清除干净 7.用滤纸轻轻擦掉样本周围及背面的1 PBS溶液 8.用1 PBS新鲜配制的浓度为1 μg/ml的pi溶液或者用1 PBS新鲜配制的浓度为2 μg/ml的 DAPI溶液在黑暗中对样本进行复染 染色时室温放置5 min 9.洗涤样本 将载玻片浸入1 PBS溶液中清洗3次 每次室温放置5 min 06-2/阳性处理(仅阳性对照进行此步骤 其他样品直接进行06-3/标记及检测) 样本通透处理之后 可通过DNase I处理样本用来准备阳性对照 DNase I处理固定的细胞会引起染色体DNA的断裂 产生许多可标记的DNA 3 末端 以下操作流程 通常会引起被处理的大多数细胞显现绿色荧光 1.按1:10的比例用ddH2O将10 DNase I Buffer稀释成1 DNase I Buffer备用 10.轻轻吸掉多余液体 并向样本区域加100 μl用 1 PBS配制的20%甘油保持样本湿润 11.立即在荧光显微镜下分析样本 用标准的荧光过滤装置在520±20 nm的荧光下观察绿色荧 光 在>620 nm下观察pi的红色荧光 或在460 nm观察dapi的蓝色荧光 如有必要 可以将样本进行封片处理后 4 避光过夜保存 PI/DAPI能将凋亡和未凋亡的细胞都染成红 色/蓝色 只在凋亡的细胞核中才有FITC-12-dUTP掺入而产生的绿色荧光 每个样本需要准备200 µl 1 DNase I Buffer 2.滴加100 µl 1 DNase I Buffer到已通透的样本上 室温平衡5 min 3.用1 DNase I Buffer 以1:100稀释DNase I (2 U/μl) 使其为终浓度20 U/ml的工作液 4.轻轻吸掉多余液体 加入100 μl浓度为20 U/ml DNase I工作液 室温孵育10 min 5.轻轻吸掉多余液体 并将载玻片/爬片在装有1 PBS的染色缸中彻底浸泡润洗2~3次 阳性对照载玻片必须使用单独的染色缸 阳性对照载玻片/爬片上残余的DNase I可能会在实验组中 造成假阳性的错误信号 05/ 06
5 08/常见问题及解决方案 07/悬浮细胞使用方案 1.将3~5 10 个细胞用1 PBS洗2次 每次4 300 g离心5 min 然后用0.5 ml 1 PBS 6 重悬 2.加入5 ml 配制于1 PBS浓度为1%的多聚甲醛溶液 4 孵育20 min进行细胞固定 g离心5 min 弃上清 用5 ml 1 PBS重悬细胞 高背景 (如未凋亡细胞的强绿色荧光背景) 非特异性掺入FITC-12-dUTP 处理方法 在操作过程中保持细胞湿润 标记反应完成 载玻片在用PBS洗一遍之后 可 再用含0.1% Triton X-100和5 mg/ml BSA的PBS洗3次 每次5 min 4.重复离心并用0.5 ml 1 PBS重悬细胞 5.加入5 ml配制于1 PBS浓度为0.2% Triton X-100溶液 室温条件下通透5 min 或者 加入5 ml冰上预冷的70%乙醇 在-20 孵育4 h 细胞能在70%乙醇中-20 的条件下保存一周 通透后的细胞折光率会下降 细胞浑浊不易观察 操作过程中应小心操作 避免细胞丢失 阳性细胞数量少 通透不充分 可通过调整蛋白酶K或Triton X-100的浓度和孵育时间优化通透步骤 g离心5 min 弃上清 用5 ml 1 PBS重悬细胞 重复离心并用1 ml 1 PBS重悬 组织切片从载玻片上脱落 细胞 组织切片粘附之前的包被不充分 在展片之前 用3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl 7.转移2 10 个细胞至新的1.5 ml离心管 g离心5 min 弃上清 并用1 Equilibration Buffer (用ddH2O按1:5的比例稀释 triethoxysilane TESPA Sigma Cat.# A3648)包被显微镜载玻片比多聚赖氨酸 (poly-l-lysine) )重悬细胞 室温孵育5 min 9.在平衡细胞期间 配制标记液 冰上融解FITC-12-dUTP标记混合物 并且依照下表配 效果更好 制标记液 显微镜或流式细胞仪分析只剩下很少的细胞 对于2 106个细胞的一个标准反应 所需体积是50 μl 用50 μl乘上反应数目来确定所需tdt孵育缓冲 液的总体积 阴性对照 阳性对照/样品 ddh2o 3 34 μl 组分 FITC-12-dUTP Labeling Mix 0 μl 1 μl g离心5 min 弃上清并用50 μl TdT孵育缓冲液重悬细胞 37 避光孵育 60 min 每隔15 min轻弹管壁或用微量移液器轻轻重悬细胞 11.加入1 ml 20 mm EDTA终止反应 用移液器轻柔混匀 在操作过程中丢失大量细胞 ①可以提高起始的细胞量 ②在制备细胞悬液时 离心过程中用含1% BSA的PBS洗细胞 标记率低 如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低(因为在固定时染色质未能与蛋白质交联 而在 操作中丢失) 应用溶于1 PBS中的4%多聚甲醛固定或福尔马林或戊二醛固定 过度的固定 导致与蛋白过度交联也会导致标记效率低 可以适当缩短固定时间 或用溶于1 PBS的2%多聚 甲醛固定 g离心5 min 弃上清 用1 ml配制于1 PBS中的0.1%Triton X-100重悬细胞 其中含5 mg/ml BSA 重复一次 共洗两次 g离心5 min 弃上清 用0.5 ml配制于1 PBS中的5 μg/ml PI溶液重悬细胞 14.在黑暗中室温孵育细胞30 min 15.用流式细胞仪分析细胞 或用标准的荧光过滤装置在520±20 nm的荧光下观察fitc的绿色 荧光 在>620 nm的的荧光下观察pi的红色荧光 PI将凋亡和未凋亡的细胞都染成红色 只有凋亡的细胞核中有FITC-12-dUTP掺入才会产生绿色荧光 07/ 08
6 09/附录 多聚赖氨酸包被的载玻片准备 吸取50~100 μl 0.01%(W/V)多聚赖氨酸水溶液(1:10用ddH2O稀释)滴至预清洗过的玻璃 表面 在将要用于固定细胞的区域将多聚赖氨酸溶液涂散为薄层 待载玻片晾干之后迅 速用去离子水漂洗 然后让包被后的载玻片在空气中静置30~60 min 直至晾干 包埋后 的载玻片能在室温储存3个月 缓冲液及溶液组分 1 PBS(pH 7.4) 137 mm NaCl 2.68 mm KCl 1.47 mm KH2PO4 8.1 mm Na2HPO4 PI 溶液(1 mg/ml) 称取10 mg PI溶于10 ml PBS中 0~4 避光储存 使用时适量稀释 DAPI 溶液(1 mg/ml) 称取10 mg DAPI溶于10 ml PBS中 0~4 避光储存 使用时适量稀释 DNA酶 I(DNase I)缓冲液 40 mm Tris-HCl (ph 7.9) 10 mm NaCl 6 mm MgCl2 10 mm CaCl2 4%多聚甲醛溶液 在通风橱中称取4 g多聚甲醛 加1 PBS至100 ml 装于密闭容器中在65 水浴加热溶解 2 h 4 储存溶液 在4 至少可稳定储存两周 10% Triton X-100溶液 在烧杯中混合85 ml ddh2o和10 ml Triton X-100溶液 磁力搅拌混匀 用水定容至 100 ml 09/ 10
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