5. 轻轻混匀, 室温 (20 C ~25 C) 避光处放置 15 分钟 6. * 使用 Annexin V-Biotin 试剂进行检测时 : 1 Binding Buffer 缓冲液洗细胞一次, 去上清 1 Binding Buffer 缓冲液 100µl 溶解 SAv-FITC 试剂 0.5µg

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责潘
5 years ago
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1 凋亡检测操作流程一 Annexin V 检测凋亡细胞膜的改变试剂及溶液 : A. 对于单独购买的试剂 : a) 10X Binding Buffer ( 货号 :556454):0.1 M HEPES,pH 7.4;1.4 M NaCl;25 mm CaCl 2 使用前稀释至 1X b) Propidium Iodide(PI, 货号 :556463): 建议与以下试剂同时使用 Annexin V-FITC( 货号 : , ) 或 Annexin V-Biotin ( 货号 : ,556417) c) Via-Probe ( 货号 : ): 核酸染料 7-AAD 建议与以下试剂同时使用 Annexin V-PE( 货号 : ,556421) 或 Annexin V-Biotin( 货号 :556418,556417) d) 1X PBS Buffer ( 货号 : ):8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na 2 HPO 4 7H 2 0, 0.24 g KH 2 PO 4, 加水至 1L 调整 ph 值至 7.2 高压灭菌室温保存 B. 对于凋亡检测试剂盒 ( 货号 :556547) a) FITC Annexin V ( 组分编号 : X): 每个样本 5 μl 用量 b) Propidium Iodide (PI, 组分编号 : E)): 现成的核酸染料每个样本 5 μl 用量 c) 10X Annexin V Binding Buffer( 组分编号 : E): 0.1 M Hepes/NaOH (ph 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mm CaCl2. 使用时用双蒸水配制成 1X 操作步骤 : 1. 取 Falcon 试管, 按标本顺序编好阴性对照管和标本管号 2. 使用冷的 PBS 缓冲液洗细胞两次, 再用 1 Binding Buffer 缓冲液制成细胞 /ml 的悬液 3. Falcon 试管中加入 100 µl 细胞悬液 4. 按以下体积加入 Annexin V 与核酸染料 : 管号名称荧光标记 Annexin V 核酸染料 : 1 阴性对照单阳 1 AV-FITC - 3 单阳 2 - PI 4 样本 AV-FITC PI

2 5. 轻轻混匀, 室温 (20 C ~25 C) 避光处放置 15 分钟 6. * 使用 Annexin V-Biotin 试剂进行检测时 : 1 Binding Buffer 缓冲液洗细胞一次, 去上清 1 Binding Buffer 缓冲液 100µl 溶解 SAv-FITC 试剂 0.5µg, 加入到细胞管中轻轻混匀加入 5µl PI, 室温 (20-25 C) 避光处放置 15 分钟 7. 各试验管中分别加入 1 Binding Buffer 缓冲液 400µl 1 小时内上流式细胞仪测定结果 Annexin V Blocking 待测细胞与未标记的重组 Annexin V 预孵育, 然后进行实验, 是 Annexin V 细胞凋亡检测的质量控制原理是预先阻断 Annexin V-FITC 的结合位点, 这样可以证明 Annexin V-FITC 凋亡分析的特异性 1. 使用冷的 PBS 缓冲液洗细胞两次, 再用 1 Binding Buffer 缓冲液制成细胞 /ml 的悬液 2. 在 5ml 的培养管中加入 100µl 细胞悬液 ( 约个细胞 ) 3. 加入 5-15µg 纯化的重组 Annexin V 注意, 不同的细胞系, 以及凋亡的不同阶段, 其 Annexin V 位点饱和所需要的纯化的重组 Annexin V 含量不同某些情况下, 为达到最好效果, 可以减少细胞数量, 个细胞加 5-15µg 纯化的重组 Annexin V 4. 轻轻混匀, 室温反应 15 分钟 5. 加入 5µl 的 Annexin V-FITC 或 / 和 PI, 轻轻混匀, 室温避光处放置 15 分钟 6. 各试验管中分别加入 1 Binding Buffer 缓冲液 400µl 7. 1 小时内上流式细胞仪测定结果

3 二 BrdU 检测凋亡细胞 DNA 断裂片段相关试剂及组分 : APO-DIRECT 试剂盒 ( 货号 :556381): PartA(4 C 保存 ) PartB(-20 C 保存 ) PI/RNase A Solution FITC-dUTP Reaction Buffer TdT Enzyme Rinsing Buffer Negative Control Cells: 已固定细胞 Wash Buffer Positive Control Cells: 已固定细胞 APO-BRDU 试剂盒 ( 货号 :556405): PartA(4 C 保存 ) PartB(-20 C 保存 ) FITC-Labeled Anti-BrdU mab PI/Rnase staining buffer Br-dUTP Reaction Buffer TdT Enzyme Rinsing Buffer Negative Control Cells: 已固定细胞 Wash Buffer Positive Control Cells: 已固定细胞实验操作 ( 适用于 APO-DIRECT 试剂盒 ): 1. 细胞固定 : 1) 用 PBS 洗细胞后, 将细胞重悬于 1% 多聚甲醛的 PBS 溶液中, 浓度为 /ml, 冰浴分钟 2) 300 g 离心 5 分钟, 弃上清 3) 用 5ml PBS 洗细胞两次, 重悬于 70% 乙醇中, 浓度为 /ml, 冰浴分钟 (70% 乙醇细胞悬液在 -20 C 放置小时后进行细胞凋亡检测, 得到的效果最好细胞可以在 -20 C 保存几个月 ) 2. 配制染色液, 现用现配 DNA 标记液 1 个测试 5 个测试 10 个测试 Reaction Buffer l l l TdT Enzyme 0.75 l 3.75 l 7.50 l

4 FITC-dUTP 8.00 l l l 蒸馏水 l l l 总体积 51 l 255 l l 3. 细胞染色 : 1) 取离心管和 Falcon 试管, 按标本顺序编号 2) 取细胞悬液加入离心管中,300 g 离心 5 分钟, 弃去乙醇, 留下沉积细胞质控细胞 (Negative Control Cells Positive Control Cells): 混匀后取 1ml( 细胞数约 /ml) 加入离心管中,300 g 离心 5 分钟, 弃去乙醇, 留下沉积细胞 3) 每管各加入 1.0ml Wash Buffer, 洗细胞两遍, 弃上清 4) 加入 DNA 标记液 50 l 重悬细胞 5) 37 C 温育 60 分钟 ( 或者室温过夜 ), 每 15 分钟摇匀一次 ( 非质控细胞 37 C 温育时间需根据不同情况有所凋整 ) 6) 每管加入 1.0ml Rinse Buffer,300 g 离心 5 分钟, 弃上清重复两遍, 弃去上清 7) 加入 0.5ml PI/RNase A Solution, 混匀若细胞浓度低, 可将用量调整到 0.3ml 8) 室温避光孵育 30 分钟 9) 3 小时内上流式细胞仪测定结果

5 三 JC-1 检测凋亡细胞线粒体膜电位改变 BD MitoScreen (JC-1) 线粒体膜电位检测试剂盒 (551302): 组分试剂准备 : JC-1( 染料 ) 描述 4 瓶, 每瓶用于 25 个样本冻干粉, 使用前稀释至储存液 ( Stock Solution ), 使用时稀释至工作液 ( Working Solution) 10 Assay Buffer 60ml, 足以用于 100 个样本使用前稀释至 1X A.10 Assay Buffer 的稀释 (Assay Buffer 作为实验的反应液用于清洗细胞 ) a) 使用前将 10 Assay Buffer 置于 37 C 水浴箱中至溶解 b) 用双蒸水 1:10 稀释 10 Assay Buffer, 搅拌 5 分钟 c) 使用前将 1 Assay Buffer 在 37 C 预热 B.JC-1 的配制 JC-1 是以冻干粉形式提供使用前先配置成储存液, 使用时再配置成工作液 JC-1 储存液保存于 - 20 C JC-1 工作液由储存液配置而来, 现用现配, 多余的工作液不能储存后继续使用 JC-1 储存液的配制 ( 一瓶 ): a) 室温下每瓶用 125μl DMSO 稀释 JC-1 冻干粉反复倒置混匀小瓶使 JC-1 充分溶解 b) 储存液应立即稀释为工作液或分装成小份 ( 避光操作 ),-20 C 保存 ( 可长达 6 个月 ) c) 避免反复冻融 JC-1 储存液 JC-1 工作液的配制 : a) 37 C 预热 1 Assay Buffer b) 用 1 Assay Buffer 1:100 稀释 JC-1 储存液至 JC-1 工作液例如将 125μl 的 JC-1 储存液加入 ml 预热的 1 Assay Buffer 中实验操作时, 每个样本 (<10^6 细胞 ) 需要 0.5ml 的 JC-1 工作液 c) 轻柔混匀 JC-1 工作液待用 ( 混匀后可能会出现少许 JC-1 聚集微粒, 但并不影响流式检测也可在室温 13,000g 离心 3 分钟或 1,000g 离心 15 分钟去除 JC-1 团絮 )

6 实验操作 : 1. 制备 /ml 的细胞悬液, 浓度不宜过高, 因为超过该浓度容易造成细胞的凋亡 2. 诱导细胞进行凋亡的处理, 同时保留一份未经诱导的细胞作为对照 3. 凋亡处理结束后, 每个无菌的 15ml 聚苯乙烯离心管中加入 1ml 细胞悬液, 室温下,400 g, 离心 5 分钟, 弃上清 4. 每管加入 0.5 ml 新鲜配制的 JC-1 工作液, 充分混匀后置于 37 C 的 CO 2 培养箱, 孵育分钟 5. 按以下步骤洗涤细胞两次 : 第一次 : 每管加体积为 2 ml 的 1 Assay Buffer, 轻轻悬浮细胞, 振荡或用枪头使细胞分散, 以免细胞聚集成块 400 g, 室温离心 5 分钟, 弃上清第二次 : 每管加体积为 1ml 的 1 Assay Buffer, 轻轻悬浮细胞, 振荡或用枪头使细胞分散, 以免细胞聚集成块 400 g, 室温离心 5 分钟, 弃上清 6. 每管加体积为 0.5 ml 的 1 Assay Buffer, 轻轻悬浮细胞, 上机检测

7 四 Caspase-3 检测细胞凋亡蛋白酶的活化相关试剂盒 : 实验操作 : 产品及组分货号包装 PE Active Caspase-3 Apoptosis Kit 次 PE 标记多克隆大鼠抗活化的 Caspase-3 抗体细胞固定 / 破膜剂 (Cytofix/Cytoperm Solution) 破膜 / 清洗液 (10x)(Perm/Wash Buffer) FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit 次 FITC 标记多克隆大鼠抗活化的 Caspase-3 抗体细胞固定 / 破膜剂 (Cytofix/Cytoperm Solution) 破膜 / 清洗液 (10x)(Perm/Wash Buffer) 1. Camptothecin 诱导细胞凋亡在 DNA 合成中, 需要拓扑异构酶 I Camptothecin 是拓扑异构酶 I 的抑制剂, 它在体外依剂量不同而影响凋亡的发生在此,Camptothecin 做为常规的凋亡诱导方案, 辅助细胞凋亡分析凋亡诱导试验用品 a) 用 DMSO 制备 1.0mM 的 Camptothecin 储备液 b) Jurkat T 细胞 (ATCC TIB-152) 凋亡诱导试验步骤 a) cells/ml 增殖的 Jurkat T 细胞加入 Camptothecin,Camptothecin 终浓度为 4-6 M b) 细胞 37 C 孵育 4 小时 2. Active Caspase-3 染色步骤 1) 计算抗体和 Perm/Wash Buffer 缓冲液用量 : 每个测试样本加入 100 l Perm/Wash Buffer 缓冲液和 20 l 抗体 ( 见下表 ) 测试样本数细胞总数 Perm/Wash Buffer 体积 (ml) 抗体量 ( l) cells cells cells cells

8 2) 根据用量制备 Perm/Wash Buffer(1 ), 将 10 浓度缓冲液使用蒸馏水进行 10 倍稀释, 注意 : 有时 10 浓度的缓冲液内会出现沉淀, 属正常现象, 在稀释成 1 浓度的缓冲液后, 使用 0.45 的滤器过滤即可 3) 使用冷的 PBS 缓冲液洗细胞两次, 再用 Cytofix/Cytoperm Solution 调整细胞浓度为 cells/0.5ml 4) 细胞冰浴 20 分钟 5) 细胞离心, 弃上清室温下, 使用 1 Perm/Wash Buffer 洗细胞两次,Perm/Wash Buffer 缓冲液的用量为 0.5ml Buffer/ cells 6) 按样本数加入 1 Perm/Wash Buffer 和抗体, 混匀, 室温反应 30 分钟 7) 每测试管中, 用 1.0ml 的 1 Perm/Wash Buffer 洗细胞一次, 再用 0.5ml 的 1 Perm/Wash Buffer 制成细胞悬液, 在流式细胞仪上进行样本分析

Microsoft Word - 培训资料.doc

Microsoft Word - 培训资料.doc 流式检测细胞凋亡 Annexin V 检测细胞凋亡...2 实验原理...2 实验用品...2 操作步骤...3 Annexin V Blocking...5 凋亡细胞的 DNA 断裂片段分析...7 实验原理...7 实验用品...8 操作步骤...9 BrdU Flow Kits 检测细胞增殖...12 实验原理...12 BrdU Flow Kits 试剂盒...12 结果分析...17 流式仪器设置指南...18