BeyoECL,Western荧光检测试剂

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1 碧云天网站 微信公众号 碧云天生物技术 /Beyotime Biotechnology 订货热线 : 或 订货 技术咨询 网址 : BeyoClick EdU-488 细胞增殖检测试剂盒 C0071S BeyoClick EdU-488 细胞增殖检测试剂盒 次 C0071L BeyoClick EdU-488 细胞增殖检测试剂盒 次 产品简介 : BeyoClick EdU-488 细胞增殖检测试剂盒 (BeyoClick EdU Cell Proliferation Kit with Alexa Fluor 488), 是一种基于 DNA 合成过程中胸腺嘧啶脱氧核苷 (thymidine) 类似物 EdU(5-ethynyl-2 -deoxyuridine) 的掺入, 并通过随后的点击反应 (Click reaction) 使 EdU 被 Alexa Fluor 488 所标记, 从而实现简单 快速 高灵敏地检测细胞增殖的试剂盒 本试剂盒可以检测到细胞或组织样品中单个的增殖细胞, 同时也可以对细胞或组织样品总体的细胞增殖情况进行定量检测 本试剂盒可以检测培养的细胞或组织样品, 也可以检测组织切片 经本试剂盒处理后, 增殖的细胞在荧光显微镜下呈现非常明亮的绿色荧光, 可以用于荧光显微镜 激光共聚焦显微镜 流式细胞仪或荧光酶标仪检测, 也可以用于高内涵筛选 (High-Content Screening, HCS) 流式细胞仪或荧光酶标仪检测仅适用于细胞样品, 不适用于组织切片 细胞增殖能力的检测是评估细胞活性 基因毒性和抗肿瘤药物效果等的基本方法 公认的最精确的检测细胞增殖的方法是直接检测细胞中 DNA 的合成 最初广泛使用的通过检测 DNA 合成来检测细胞增殖的方法是放射性标记核苷掺入法, 如氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷 ([ 3 H]thymidine) 掺入法 但该方法由于有放射性污染并且很难实现单细胞检测而受到很大的限制, 随后逐渐被基于抗体检测的 BrdU(bromo-deoxyuridine) 法所替代 BrdU 法步骤繁多, 且需要使用 BrdU 抗体, 影响因素较多, 稳定性比较差 并且由于 BrdU 法需要使用抗体, 有时会和其它目的蛋白基于抗体的检测相互产生干扰 EdU 法基于 EdU 掺入和后续的点击反应, 无需使用抗体 操作便捷 检测灵敏度高, 是一种在 BrdU 法基础上升级换代的新方法, 将会逐步取代 BrdU 法 MTT 法 (C0009) WST-1 法 (C0035 C0036) CCK-8 法 (C0037 C0038 C0039 C0040 C0041 C0042 C0043 C0046) 和 CellTiter-Lumi 化学发光法 (C0065 C0068) 都是基于细胞活性的细胞增殖检测方法, 能检测到细胞的总体增殖效果, 但无法检测到单个的增殖细胞 这几种方法尽管都不是检测 DNA 合成的, 但被广泛用于替代 [ 3 H]thymidine 掺入法 CFDA SE 法 (C0051 C1031) 基于细胞荧光示踪的原理能检测到单个的增殖细胞, 但由于每增殖一次荧光减弱一半, 在荧光显微镜下较难区分荧光减弱一半的细胞, 检测灵敏度不是很高, 通常仅适用于流式细胞仪检测 在进行科学研究时, 上述这些基于细胞活性或 CFDA SE 的方法可以作为 EdU 法的补充性检测方法 EdU(5-ethynyl-2 -deoxyuridine), 中文名为 5- 乙炔基 -2 - 脱氧尿苷, 是一种新型胸苷 ( 胸腺嘧啶脱氧核苷,thymidine) 类似物, EdU 可以在 DNA 合成过程中替代胸苷掺入到新合成的 DNA 中 另一方面,EdU 上的乙炔基能与荧光标记的小分子叠氮化物探针 ( 如 Azide Alexa Fluor 488 Azide Alexa Fluor 555 Azide Alexa Fluor 594 Azide Alexa Fluor 647 等 ) 通过一价铜离子的催化发生共价反应, 形成稳定的三唑环, 该反应非常迅速, 被称作点击反应 (Click reaction), 其反应原理参见图 1 通过点击反应, 新合成的 DNA 会被相应的荧光探针所标记, 从而可以使用适当的荧光检测设备检测到增殖的细胞 图 1. BeyoClick EdU 检测法中的点击反应 (Click reaction) 原理图 荧光探针等标记的叠氮化物 (Labeled Azide) 与掺入到细胞 DNA 中的 EdU, 在铜离子的催化发生共价反应, 形成稳定的三唑环, 最终使细胞 DNA 标记上荧光探针或其它探针 本试剂盒反应简单 检测灵敏度高 本试剂盒基于简单高效的点击反应, 无需 DNA 变性, 只需少量的小分子叠氮化物探针即可非常有效地标记出掺入的 EdU, 并且可以检测到单个细胞的增殖情况 本试剂盒使用便捷 兼容性好 本试剂盒只需常用的多聚甲醛固定和 Triton X-100 穿透, 就可以使叠氮化物探针有效进入细胞并发生点击反应, 不会影响细胞形态, 不会影响基于抗体的免疫荧光和免疫组化检测, 也不会影响 DNA 的荧光染色 ( 如 PI 染色检测细胞周期 DAPI 或 Hoechst 染料检测细胞核 ) 而 BrdU 法为了使大分子的 BrdU 抗体进入细胞并与 DNA 上的 BrdU 结

2 合, 需要对双链 DNA 进行变性处理 ( 如酸变性 热变性或者 DNase 消化等 ), 这种变性可能会影响细胞形态, 影响后续的免疫荧光和免疫组化检测 DNA 的荧光染色等 BrdU 法和 BeyoClick EdU 法检测原理的比较参见图 2 图 2. BrdU 法和 BeyoClick EdU 法检测原理的比较 A. BrdU 法需使用大分子的 BrdU 抗体, 由于空间位阻, 双链 DNA 须变性后才能使 BrdU 抗体与 BrdU 结合 B. EdU 法使用小分子标记的叠氮化物 (Azide), 无需 DNA 变性, 操作更便捷, 兼容性好, 检测结果更加稳定可靠 本试剂盒检测快速, 定性定量检测都非常便捷 相对于至少需要 4 小时的 BrdU 法, 本试剂盒采用的 BeyoClick EdU 法检测新合成的 DNA 只需 小时, 时间上大大缩短 本试剂盒同时提供了染色细胞核的 Hoechst 33342, 以方便染色观察所有的细胞核 可以使用荧光显微镜或流失细胞仪等进行定性和定量检测 HeLa 细胞用本试剂盒和荧光显微镜检测细胞增殖的效果参见图 3;Jurkat 细胞用本试剂盒和流式细胞仪检测细胞增殖的效果参见图 4 图 3. HeLa 细胞用本试剂盒检测细胞增殖的效果图 无 EdU 组观察不到绿色荧光 ( 最左侧一列 );EdU (10μM) 孵育 2 小时组有明亮的绿色荧光 ( 中间一列 ); 而用 10mM 的 DNA 合成抑制剂羟基脲 (Hydroxyurea) 提前预处理 0.5 小时后, 绿色荧光显著减弱, 说明 DNA 合成抑制后,EdU 的掺入被显著抑制 ( 最右侧一列 ) 2 / 5 C0071 BeyoClick EdU-488 细胞增殖检测试剂盒 / 碧云天 /Beyotime

3 图 4. Jurkat 细胞用本试剂盒标记后用流式细胞仪检测细胞增殖的效果图 Jurkat 细胞只用 EdU 标记 ( 左图 ), 或在标记的同时用 10mM 的 DNA 合成抑制剂羟基脲 (Hydroxyurea) 处理 ( 右图 ),2 小时后用本试剂盒进行点击反应, 然后用流式细胞仪进行检测 从图中可以看出, 仅 EdU 标记的细胞有较高比例的绿色荧光 (488 fluorescence) 阳性细胞, 呈现绿色荧光阴性 ( 弱染色 ) 和阳性 ( 强染色 ) 的两个峰 ( 左图 ), 分别对应于未增殖细胞和增殖细胞 经过羟基脲处理的细胞, 绿色荧光阳性的细胞几乎完全消失 ( 右图 ), 仅剩下一个绿色荧光阴性的峰 ( 右图 ) 该检测结果说明 DNA 合成被抑制后,EdU 的掺入也被抑制 实测数据可能会因细胞类型 细胞增殖情况 检测仪器等的不同而存在差异, 图中数据仅供参考 碧云天各种细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒的比较和选择, 请参考 本试剂盒小包装 C0071S 如果用于培养的细胞 (6 孔板 ) 的检测, 可以检测 50 个样品, 每个样品的反应体系为 500μl 的 Click 反应液 ; 如果用于 96 孔板检测, 可以检测 500 个样品, 每个样品的检测体系为 50μl 的 Click 反应液 ; 如果用于 12 孔 24 孔 48 孔或 384 孔板样品的检测, 分别可以检测 和 1250 个样品, 每个样品推荐的 Click 反应液用量为 200μl 100μl 70μl 和 20μl 小包装如果用于流式细胞仪检测, 可以检测 50 个样品, 每个细胞样品的细胞数量宜为 万, 每个样品的反应体系为 500μl 的 Click 反应液 小包装如果用于冰冻或石蜡切片的检测, 可以检测 个样品, 每个样品的反应体系为 μl 的 Click 反应液 大包装 C0071L 可检测样品的数量为小包装 C0071S 的 4 倍 包装清单 : C0071S-1 EdU (10mM) 200μl C0071S-2 Azide μl C0071S-3 Click Reaction Buffer 30ml C0071S-4 CuSO 4 1.1ml C0071S-5 Click Additive 2 管 C0071S-6 Hoechst (1000X) 50μl 说明书 1 份 C0071L-1 EdU (10mM) 800μl C0071L-2 Azide μl C0071L-3 Click Reaction Buffer 120ml C0071L-4 CuSO 4 4.4ml C0071L-5 Click Additive 1 瓶 C0071L-6 Hoechst (1000X) 200μl 说明书 1 份 保存条件 : -20ºC 保存, 一年有效 Azide 488 和 Hoechst 须避光保存 注意事项 : Click Additive 配制成溶液后请注意适当分装 如果溶解后有白色物质析出, 请上下颠倒多次, 待全部溶解后使用 如果该溶液颜色变成棕色, 说明该组分的有效成分已失效, 请弃用 如果需要使用羟基脲 (Hydroxyurea) 作为对照, 可以从碧云天订购 (S1961 Hydroxyurea) 如果用于动物实验需要更多 EdU, 也可以从碧云天订购 (ST067 EdU) 本产品仅限于专业人员的科学研究用, 不得用于临床诊断或治疗, 不得用于食品或药品, 不得存放于普通住宅内 为了您的安全和健康, 请穿实验服并戴一次性手套操作 使用说明 : 1. 需要用户自己准备的耗材和试剂 a. 碧云天的 PBS C0221A, 或 PBS (ph ) b. 固定液 ( 碧云天的免疫染色固定液 P0098, 或 4% 的多聚甲醛 P0099) c. 洗涤液 ( 免疫染色封闭液 P0102,QuickBlock 免疫染色封闭液 P0260, 或含 3% BSA 的 PBS) d. 通透液 ( 碧云天的免疫染色强力通透液 P0097, 免疫染色洗涤液 P0106, 或含 0.3% Triton X-100 的 PBS) e. 去离子水或超纯水 f. 根据实验要求 :18 18mm 盖玻片,6 孔板或其它多孔板, 或流式细胞分析仪用管子 ( 如 12 75mm) 2. 检测体系的准备 a. 如下以 6 孔板或常规切片检测体系为例, 如果使用 12 孔板 96 孔板或 384 孔板等孔板, 检测体系可以相应按比例缩小 b. 如果检测的是悬浮细胞, 请按常规的悬浮细胞的操作方式进行 例如和贴壁细胞相比, 相关步骤需要增加离心步骤等 3. 培养细胞的 EdU 标记及固定 洗涤和通透 碧云天 /Beyotime / C0071 BeyoClick EdU-488 细胞增殖检测试剂盒 3 / 5

4 a. 在 6 孔板中 ( 如有必要可以加入盖玻片 ) 培养适当数量的细胞 细胞培养过夜并且恢复到正常状态后, 进行所需的药物处理或者其它刺激处理等 b. 配制 2X 的 EdU 工作液 : 由于 EdU 工作液是与培养液等体积加入到孔板中, 所以需要配制成 2X 的工作液 推荐的 EdU 终浓度为 10μM (1X), 用细胞培养液 1:500 稀释 EdU (10mM) 即可得到 2X 的 EdU 工作液 (20μM) 注意 : 对于 A549 HeLa 和 NIH/3T3 等贴壁细胞, 推荐 EdU 的使用终浓度为 10μM 但细胞类型 培养液种类 细胞密度 细胞增殖速度等多方面的因素会影响 EdU 掺入到细胞中的量, 因此初次使用时建议对 EdU 的使用浓度进行一定的摸索 如果之前使用过 BrdU 进行实验, 则可以参考 BrdU 的终浓度作为 EdU 的终浓度 c. 将 37ºC 预热的 2X 的 EdU 工作液 (20μM), 等体积加入 6 孔板中, 使 6 孔板中的 EdU 终浓度变为 1X 例如设计终浓度为 10μM, 原先 6 孔板中的培养基为 1ml, 则将 1ml 2X 的 EdU 工作液 (20μM) 加入到孔板中 如果培养基体积过大, 可以先吸除适量的培养液, 再加入等体积的 2X 的 EdU 工作液 ; 或者可以减少工作液的体积并增加 EdU 的浓度, 使最终培养液中的 EdU 浓度为 10μM, 例如 2ml 培养液中加入 220 微升 0.1mM EdU 更换所有的培养液可能会对细胞的增殖有影响, 因此不建议替换所有的培养液 d. 继续孵育细胞 2 小时 该孵育时间的长短取决于细胞生长速率, 通常宜继续孵育细胞周期 10% 左右的时间 对于常见的哺乳动物细胞如 HeLa 3T3 HEK293 等, 细胞周期大约在 小时, 孵育时间宜在 2 小时左右 人胚胎细胞的细胞周期约 30 分钟, 推荐的孵育时间为 5 分钟 ; 酵母细胞的细胞周期约 3 小时, 推荐的孵育时间为 20 分钟, 增殖的神经细胞其细胞周期约 5 天, 推荐的孵育时间为 1 天 孵育时间小于 45 分钟时, 建议提高 EdU 的浓度 ; 孵育时间大于 20 小时时, 建议适当降低 EdU 的浓度 e. EdU 标记细胞完成后, 去除培养液, 并加入 1ml 固定液 ( 可以使用碧云天的免疫染色固定液 P0098, 或 4% 的多聚甲醛 P0099), 室温固定 15 分钟 f. 去除固定液, 每孔用 1ml 洗涤液洗涤细胞 3 次, 每次 3-5 分钟 g. 去除洗涤液, 每孔用 1ml 通透液 ( 可以使用碧云天的免疫染色强力通透液 P0097, 免疫染色洗涤液 P0106, 或含 0.3% Triton X-100 的 PBS), 室温孵育 分钟 h. 去除通透液, 每孔用 1ml 洗涤液洗涤细胞 1-2 次, 每次 3-5 分钟 i. 转步骤 5 4. 动物体内 EdU 的标记及切片样品的处理 EdU 可以通过注射或进食等适当方式进行动物的体内标记 如下以小鼠为例, 其它动物体内 EdU 的标记请参考相关文献 a. 对于小鼠, 可以按照 mg/kg 的用量, 把 EdU 用 PBS 配制成一定浓度, 腹腔注射 特定组织或器官局部注射或者加入饮用水中 具体用量跟所用动物的种类 体重和使用方式有关, 可以参考相关文献, 因此初次使用时建议对 EdU 的使用浓度进行一定的摸索, 或者直接使用 50mg/kg 的浓度进行测试 如果之前使用过 BrdU 进行实验, 则可以参考 BrdU 的终浓度作为 EdU 的终浓度 EdU 可以单独购买碧云天的 ST067 b. 4 小时后或根据特定实验确定的适当时间后, 快速处死小鼠, 取出所需的组织, 按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片 EdU 标记的时间也可以参考相关文献自行调整 c. 对于冰冻切片 : (a) 加入适量固定液 ( 可以使用碧云天的免疫染色固定液 P0098, 或 4% 的多聚甲醛 P0099), 室温固定 15 分钟 (b) 去除固定液, 用适量洗涤液洗涤 3 次, 每次 3-5 分钟 (c) 去除洗涤液, 用适量通透液 ( 可以使用碧云天的免疫染色强力通透液 P0097, 免疫染色洗涤液 P0106, 或含 0.3% Triton X-100 的 PBS), 室温孵育 分钟 (d) 去除通透液, 用适量洗涤液洗涤 1-2 次, 每次 3-5 分钟 (e) 抗原修复 ( 选做 ): 如果同时需要进行目的蛋白的免疫荧光染色, 并有必要进行抗原修复, 可以使用适当的抗原修复液, 例如 P0090 冰冻切片快速抗原修复液 (5X), 或者自行配制的适当的抗原修复液进行抗原修复处理 (f) 转步骤 5 d. 对于石蜡切片 : (a) 脱蜡 : 二甲苯中脱蜡 5-10 分钟 换用新鲜的二甲苯, 再脱蜡 5-10 分钟 无水乙醇 5 分钟, 换新的无水乙醇 3 分钟 95% 乙醇 3 分钟 85% 乙醇 3 分钟 75% 乙醇 3 分钟 50% 乙醇 3 分钟 PBS 5 分钟 (b) 抗原修复 ( 选做 ): 如果同时需要进行目的蛋白的免疫组化染色, 可以使用适当的抗原修复液, 例如 P0081 柠檬酸钠抗原修复液 (50X) P0083 改进型柠檬酸钠抗原修复液 (50X) P0085 EDTA 抗原修复液 (50X) P0086 柠檬酸钠 -EDTA 抗原修复液 (40X) P0088 通用型强力抗原修复液 (10X) P0092 漂片抗原修复液 (10X), 或者自行配制适当的抗原修复液进行抗原修复处理 特别注意 : 如果使用蛋白酶 K 或胰酶进行抗原修复, 必须反复洗涤干净, 否则残留的酶会严重干扰后续标记反应 (c) 转步骤 5 5. EdU 检测注意 : 本步骤六孔板中每孔的反应体系为 500µl 的反应混合物 对于 和 384 孔板, 每孔的反应的体系分别为 200μl 100μl 70μl 50μl 和 20μl 的反应混合物 对于较小的孔, 单位培养面积的液体用量已经适当增加, 以有效避免液体蒸发可能带来的负面影响 对于切片, 可以根据切片大小, 每个切片使用 μl 的反应混合物 如下以六孔板中的细胞样品为例说明具体的操作方法, 对于其它孔板或切片, 仅每步溶液的用量按比例调整即可, 其余方法相同 a. 配制 Click Additive Solution: 对于 C0071S, 用 1.3ml 去离子水溶解一管 Click Additive, 混匀至全部溶解, 即为 Click Additive Solution; 对于 C0071L, 加入 10.4ml 去离子水溶解试剂盒中提供的一瓶 Click Additive, 混匀至全部溶解, 即为 4 / 5 C0071 BeyoClick EdU-488 细胞增殖检测试剂盒 / 碧云天 /Beyotime

5 Click Additive Solution 配制后可以适当分装, 并 -20ºC 保存 b. 参考下表配制 Click 反应液 注意 : 请严格按照下表中组分顺序和体积配制 Click 反应液, 否则点击反应可能无法有效进行 ; 同时,Click 反应液须在配制后 15 分钟内使用 6 孔板样品数组分 Click Reaction Buffer 430μl 860μl 1.72ml 2.15ml 4.3ml 10.75ml 21.5ml CuSO 4 20μl 40μl 80μl 100μl 200μl 500μl 1ml Azide 488 1μl 2μl 4μl 5μl 10μl 25μl 50μl Click Additive Solution 50μl 100μl 200μl 250μl 500μl 1.25ml 2.5ml 总体积 500μl 1ml 2ml 2.5ml 5ml 12.5ml 25ml c. 去除上一步骤中的洗涤液 d. 每孔加入 0.5ml Click 反应液, 轻轻摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖样品 e. 室温避光孵育 30 分钟 f. 吸除 Click 反应液, 用洗涤液洗涤 3 次, 每次 3-5 分钟 g. 如果需要对细胞核进行染色, 可以参照步骤 6 进行 如无其它的特殊需要, 即可在荧光显微镜下观察, 或者使用流式细胞仪 多功能酶标仪进行荧光检测, 或者用高内涵筛选仪器 ( 一般高内涵筛选需要使用染料对细胞核进行染色 ) 进行检测 Azide 488 的最大激发波长是 495nm, 最大发射波长是 519nm 6. 细胞核染色为了检测细胞增殖的比例, 可以考虑使用 Hoechst 进行细胞核染色 一般高内涵筛选仪器也需要对细胞核进行染色 a. 1X Hoechst 溶液的配制 : 按 1:1000 比例用 PBS 稀释 Hoechst (1000X) b. 接上述步骤 5g., 吸除洗涤液后, 每孔加 1X Hoechst 溶液 1ml, 室温避光孵育 10 分钟 c. 吸除 1X Hoechst 溶液 d. 用洗涤液洗涤 3 次, 每次 3-5 分钟 e. 随后即可进行荧光检测 Hoechst 为蓝色荧光, 最大激发波长为 346nm, 最大发射波长为 460nm 相关产品 : 产品编号 产品名称 包装 C0071S BeyoClick EdU-488 细胞增殖检测试剂盒 次 C0071L BeyoClick EdU-488 细胞增殖检测试剂盒 次 C0075S BeyoClick EdU-555 细胞增殖检测试剂盒 次 C0075L BeyoClick EdU-555 细胞增殖检测试剂盒 次 C0078S BeyoClick EdU-594 细胞增殖检测试剂盒 次 C0078L BeyoClick EdU-594 细胞增殖检测试剂盒 次 C0081S BeyoClick EdU-647 细胞增殖检测试剂盒 次 C0081L BeyoClick EdU-647 细胞增殖检测试剂盒 次 C0085S BeyoClick EdU 细胞增殖检测试剂盒 (DAB 法 ) 次 C0085L BeyoClick EdU 细胞增殖检测试剂盒 (DAB 法 ) 次 C0088S BeyoClick EdU 细胞增殖检测试剂盒 (TMB 法 ) 500 次 C0088L BeyoClick EdU 细胞增殖检测试剂盒 (TMB 法 ) 2000 次 S mM Hydroxyurea (DNA Synthesis 抑制剂 ) 10mM 1ml S mg Hydroxyurea (DNA Synthesis 抑制剂 ) 200mg S1961-1g Hydroxyurea (DNA Synthesis 抑制剂 ) 1g S1961-5g Hydroxyurea (DNA Synthesis 抑制剂 ) 5g ST067-50mg EdU 50mg ST mg EdU 250mg ST067-1g EdU 1g Version 碧云天 /Beyotime / C0071 BeyoClick EdU-488 细胞增殖检测试剂盒 5 / 5

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