Library Preparation ND

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震华
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1 ND601-01/02 VAHTS TM Nano DNA Library Prep Kit for Illumina Vazyme Biotech Co., Ltd 网站 /Web: 咨询热线 /Tel: 销售 /Sales: 技术支持 /Support: 技术服务 /Service: Vazyme biotech co., ltd. 使用说明书 Version 5.2

2 目录 Catalog 产品概述 VAHTS TM Nano DNA Library Prep Kit for Illumina 是针对 Illumina 高通量测序平台文库构建定向优化而成的试剂盒使用本试剂盒可以将微量片段化 DNA 样品制备成 Illumina 高通量测序平台专用文库和同类产品相比,VAHTS TM Nano DNA Library Prep Kit for Illumina 具有更高的文库转化比例更稳定的文库构建流程以及更低的偏好性试剂盒中提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证, 最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性产品组分组分 ND (24 rxn) ND (96 rxn) End Prep Mix da-tailing Mix Ligation Mix Stop Ligation Mix PCR Primer Mix Amplification Mix2 960 μl 300 μl 60 μl 120 μl 120 μl 600 μl μl μl 240 μl 480 μl 480 μl μl 贮藏条件所有组分于 -20 C 保存, 有效期一年必需材料 100% 乙醇灭菌超纯水低吸附 EP 管 PCR 管磁力架 PCR 仪产品概述产品组分贮藏条件必需材料适用范围建库流程使用方法注意事项质量控制 VAHTS TM DNA Clean Beads (Vazyme #N411) 或其他等效性 DNA 纯化产品 VAHTS TM DNA Adapters for Illumina (Vazyme #N801 或 #N802) 适用范围使用 VAHTS TM Nano DNA Library Prep Kit for Illumina 可以制备以下种类文库 : 文库插入长度 (Insert Size) 350 bp 550 bp 初始 DNA 量 (Input DNA) 100 ng 200 ng 推荐测序模式 (Read Length) bp bp 01/ 02

3 建库流程使用方法起始材料要求 : 纯化过的片段化 DNA 或 PCR 产物, 溶于灭菌蒸馏水中如制备插入长度为 350 bp 的文库, 需要初始 DNA 总量为 100 ng (<60 μl); 如制备插入长度为 550 bp 的文库, 需要初始 DNA 总量为 200 ng (<60 μl) DNA 浓度测定 : 准确的 DNA 浓度测定对实验成功与否至关重要我们推荐您使用 Qubit 或荧光染料 PicoGreen 进行 DNA 浓度测定, 请勿使用以吸光度法为基础的任何测定方法 DNA 纯度要求 : 260 nm 吸光度 /280 nm 吸光度 = 1.8~2.0 步骤一 : 末端修复这一步骤将片段化 DNA 末端补平, 并在 5 端进行磷酸化 1. 将 End Prep Mix 解冻后颠倒混匀, 于灭菌 PCR 管中配制如下反应 : 纯化后的片段化 DNA 或 PCR 产物 End Prep Mix ddh 2 O x μl 40 μl To 100 μl 30 C, 30 min 4. 使用 VAHTS TM DNA Clean Beads (Vazyme #N411) 对反应产物进行纯化和长度分选 : 根据目标插入长度稀释磁珠 : 文库插入长度 VAHTS DNA Clean Beads ddh 2 O 350 bp μl 样品个数 μl 样品个数 550 bp 92 μl 样品个数 92 μl 样品个数使用已片段化 DNA 做为初始模板 : 1. 进行末端修复和 5 磷酸化 ; 2. 修复产物进行 da-tailing; 3. da-tailing 产物末端连接接头 ; 4. 连接产物扩增富集 03/ 04

4 按照下述方案进行双轮磁珠分选 : 1) 将 100 μl 末端修复产物转移至新 EP 管中备用 ; 涡旋震荡混匀 VAHTS DNA Clean Beads 2) 吸取 160 μl 稀释后的磁珠至 100 μl 末端修复产物中, 使用移液器吹打 10 次充分混匀 3) 室温孵育 5 分钟 4) 将 EP 管短暂离心并置于磁力架中静置待溶液澄清 ( 约 5 分钟 ), 转移 250 μl 上清至新 EP 管中 5) 吸取 30 μl 未稀释的 VAHTS DNA Clean Beads 至上清中, 使用移液器吹打 10 次充分混匀 6) 室温孵育 5 分钟 7) 将反应管短暂离心并置于磁力架中静置待溶液澄清 ( 约 5 分钟 ), 移除上清 8) 保持 EP 管处于磁力架中, 加入 200 μl 新鲜配制的 80% 乙醇漂洗磁珠室温孵育 30 秒, 移除上清 9) 重复步骤 8, 总计漂洗两次 10) 保持 EP 管处于磁力架中, 开盖空气干燥磁珠 10 分钟 11) 将 EP 管从磁力架中取出, 加入 20 μl 灭菌超纯水洗脱涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀, 于室温放置 2 分钟将反应管短暂离心并置于磁力架中静置待溶液澄清 ( 约 5 分钟 ), 小心吸取 17.5 μl 上清至新 PCR 管中, 切勿触碰磁珠注意 :1. 转移上清时请勿吸取 VAHTS DNA Clean Beads, 即使微量残留都将影响后续文库构建步骤 2. 末端修复产物也可使用其他等效性产品进行纯化和分选, 如 AMPure XP Beads 步骤二 : 末端 da-tailing 这一步骤将在末端修复产物 3 端进行 da-tailing, 用于后续接头连接 1. 将 da-tailing Mix 解冻后颠倒混匀, 于灭菌 PCR 管中配制如下反应 : 纯化后的末端修复产物 17.5 μl da-tailing Mix 12.5 μl 总计 30.0 μl 37 C, 30 min 70 C, 5 min 4 C, 5 min 4. 立即进行步骤三步骤三 : 接头连接这一步骤将在 da-tailing 产物末端连接接头 1. 将 Stop Ligation Mix 解冻后颠倒混匀, 置于 4 备用于灭菌 PCR 管中配制如下反应 : da-tailing 产物 30.0 μl Ligation Mix 2.5 μl DNA Adapter X* 2.5 μl 总计 35.0 μl *VAHTS TM DNA Adapters set1 for Illumina (Vazyme #N801) 中提供 DNA Adapter 1-12, 共计 12 种 ; VAHTS TM DNA Adapters set2 for Illumina (Vazyme #N802) 中提供 DNA Adapter 13-27, 共计 12 种 30 C, 10 min 4. 向反应管中加入 5 μl Stop Ligation Mix, 使用移液器轻轻吹打充分混匀 5. 使用 VAHTS TM DNA Clean Beads (Vazyme #N411) 对反应产物进行纯化 : 1) 涡旋震荡混匀 VAHTS DNA Clean Beads 2) 吸取 40 μl VAHTS DNA Clean Beads 至 40 μl 接头连接产物中, 使用移液器吹打 10 次充分混匀 3) 室温孵育 5 分钟 4) 将反应管短暂离心并置于磁力架中静置待溶液澄清 ( 约 5 分钟 ), 移除上清 5) 保持 EP 管处于磁力架中, 加入 200 μl 新鲜配制的 80% 乙醇漂洗磁珠室温孵育 30 秒, 移除上清 6) 重复步骤 5, 总计漂洗两次 7) 保持 EP 管处于磁力架中, 开盖空气干燥磁珠 10 分钟 8) 将 EP 管从磁力架中取出, 加入 52.5 μl 灭菌超纯水洗脱涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀, 于室温放置 2 分钟将反应管短暂离心并置于磁力架中静置待溶液澄清 ( 约 5 分钟 ), 小心吸取 50 μl 上清至新 EP 管中 9) 涡旋震荡混匀 VAHTS DNA Clean Beads 10) 吸取 50 μl VAHTS DNA Clean Beads 至步骤 8 产物中, 使用移液器吹打 10 次充分混匀 11) 室温孵育 5 分钟 12) 将反应管短暂离心并置于磁力架中静置待溶液澄清 ( 约 5 分钟 ), 移除上清 13) 保持 EP 管处于磁力架中, 加入 200 μl 新鲜配制的 80% 乙醇漂洗磁珠室温孵育 30 秒, 移除上清 14) 重复步骤 5, 总计漂洗两次 15) 保持 EP 管处于磁力架中, 开盖空气干燥磁珠 10 分钟 16) 将 EP 管从磁力架中取出, 加入 22.5 μl 灭菌超纯水洗脱涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀, 于室温放置 2 分钟将反应管短暂离心并置于磁力架中静置待溶液澄清 ( 约 5 分钟 ), 小心吸取 20 μl 上清至新 PCR 管中, 切勿触碰 VAHTS DNA Clean Beads 注意 :1. 转移上清时请勿吸取 VAHTS DNA Clean Beads, 以免影响后续文库扩增 2. 接头连接产物也可使用其他等效性产品进行纯化, 如 AMPure XP Beads 05/ 06

5 步骤四 : 文库扩增这一步骤将接头连接产物扩增富集 1. 将 PCR Primer Mix Amplification Mix2 解冻后颠倒混匀, 于灭菌 PCR 管中配制如下反应 : 纯化过的接头连接产物 20 μl PCR Primer Mix 5 μl Amplification Mix2 25 μl 总计 50 μl 95 C, 3 min 98 C, 20 sec 8 cycles 60 C, 15 sec 72 C, 30 sec 72 C, 5 min 4. 使用 VAHTS TM DNA Clean Beads (Vazyme #N411) 对反应产物进行纯化 : 1) 涡旋震荡混匀 VAHTS DNA Clean Beads 2) 吸取 50 μl VAHTS DNA Clean Beads 至 50 μl PCR 产物中, 使用移液器吹打 10 次混匀 3) 室温孵育 5 分钟 4) 将反应管短暂离心并置于磁力架中静置待溶液澄清 ( 约 5 分钟 ), 移除上清 5) 保持 EP 管处于磁力架中, 加入 200 μl 新鲜配制的 80% 乙醇漂洗磁珠室温孵育 30 秒, 移除上清 6) 重复步骤 5, 总计漂洗两次 7) 保持 EP 管处于磁力架中, 开盖空气干燥磁珠 10 分钟 8) 将 EP 管从磁力架中取出, 加入 32.5 μl 灭菌超纯水洗脱涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀, 于室温放置 2 分钟将反应管短暂离心并置于磁力架中静置待溶液澄清 ( 约 5 分钟 ), 小心吸取 30 μl 上清至新 EP 管中,-20 C 保存步骤五 : 文库质量控制文库浓度测定 : 为了得到均匀的长簇效果和高质量的测序数据, 必须对构建好的文库进行准确的浓度测定我们推荐您使用荧光染料 (Qubit 或荧光染料 PicoGreen ) 或 qpcr 进行文库浓度测定文库分布检测 : 使用 Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer 进行文库分布检测如果使用 High Sensitivity DNA chip: 将构建好的文库稀释 100 倍, 取 1 μl 进行检测如果使用 DNA 1000 chip: 将构建好的文库直接取 1 μl 进行检测 A B 使用 VAHTS TM Nano DNA Library Prep Kit for Illumina 制备的插入长度 350 bp 文库 (A, 文库总长度约 470 bp) 和 550 bp 文库 (B, 文库总长度约 670 bp) 进行 2100 Bioanalyzer 检测, 使用芯片为 DNA 1000 chip 注意 :1. 转移上清时请勿吸取 VAHTS DNA Clean Beads, 以免影响后续文库检测和测序 2. PCR 产物也可使用其他等效性产品进行纯化, 如 AMPure XP Beads 07/ 08

6 注意事项文库制备试剂分装冻存 : 为了避免反复冻融或长期使用后活性下降, 我们推荐您在首次使用后将剩余试剂进行小份分装冻存磁珠操作注意事项 : 应将磁珠孵育至室温后再使用每次吸取磁珠前都应将其充分混匀 DNA 样品加入磁珠后应将其充分混匀所有磁珠操作都应于室温进行移取上清操作应在磁珠被彻底吸附后小心进行, 切勿吸取到磁珠 80% 乙醇应现用现配, 用完丢弃 80% 乙醇漂洗磁珠后应尽量吸干磁珠在洗脱之前应充分干燥, 避免乙醇残留影响后续实验避免样品交叉污染 : 吸取不同样品时更换枪头使用带滤芯的枪头防止 PCR 产物污染 : PCR 产物因操作不当极容易产生污染, 进而导致实验结果不准确可信度不高等问题因此, 我们推荐您将 PCR 反应体系配制区和 PCR 产物纯化区进行强制性的物理隔离使用专用的移液器等设备并定时对各实验区域进行清洁 ( 使用 0.5% 次氯酸钠或 10% 漂白剂进行擦拭清理 ) 以保证实验结果的可信度质量控制 End Prep Mix SDS-PAGE 纯度 : 所有酶组分纯度 >95% 核酸内切酶残留 :100 μl 反应体系中加入 40 μl 本品和 1 μg φx174 RF I DNA,37 C 下孵育 4 小时经琼脂糖凝胶电泳检测,RF II 转化比率 <10% 磷酸酶活性检测 : 在磷酸酶活性检测缓冲液中加入 40 μl 本品和 2.5 mm 对硝基苯磷酸,37 C 下孵育 4 小时经光谱测定法检测,405 nm 处无对硝基苯阴离子特征吸收峰功能性活性检测 : 在末端修复反应体系中加入 500 ng 含 5 和 3 突出末端的片段化 DNA,30 C 下反应 30 分钟经毛细管电泳检测, 末端修复并磷酸化的 DNA 比率 >95% da-tailing Mix SDS-PAGE 纯度 : 所有酶组分纯度 >95% 核酸内切酶残留 :30 μl 反应体系中加入 12.5 μl 本品和 1 μg φx174 RF I DNA,37 C 下孵育 4 小时经琼脂糖凝胶电泳检测,RF II 转化比率 <10% 磷酸酶活性检测 : 在磷酸酶活性检测缓冲液中加入 12.5 μl 本酶和 2.5 mm 对硝基苯磷酸,37 C 下孵育 4 小时经光谱测定法检测,405 nm 处无对硝基苯阴离子特征吸收峰功能性活性检测 : 在加尾反应体系中加入 500 ng 平末端片段化 DNA,37 C 下反应 30 分钟经接头连接检测, 末端加 da 尾的 DNA 比率 >80% Ligation Mix SDS-PAGE 纯度 : 所有酶组分纯度 >95% 16 小时孵育检测 :50 μl 反应体系中包含 10 μl 本品和 1 μg HindIII-λDNA,37 C 下孵育 16 小时经琼脂糖凝胶电泳检测, 条带无降解 ;50 μl 反应体系中包含 10 μl 本品和 1 μg T3 DNA,37 C 下孵育 16 小时经琼脂糖凝胶电泳检测, 条带无降解核酸内切酶残留 :50 μl 反应体系中加入 10 μl 本品和 1 μg φx174 RF I DNA,37 C 下孵育 4 小时经琼脂糖凝胶电泳检测,RF II 转化比率 <10% RNase 活性残留 :50 μl 反应体系中加入 10 μl 本品和 40 ng FAM-RNA,37 C 下孵育 16 小时经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测, 条带无降解连接效率检测 :35 μl 连接反应体系中加入 2.5 μl 本品双端包含 da 突出的 300 bp DNA 片段 1.5 pmol 和 30 bp 末端包含 dt 突出的双链接头 DNA 片段 15 pmol,30 C 下反应 10 分钟经琼脂糖凝胶电泳检测, 双端连接接头 DNA 的比率 >90% Stop Ligation Mix 16 小时孵育检测 :35 μl 反应体系中包含 5 μl 本品和 1 μg HindIII-λDNA,37 C 下孵育 16 小时经琼脂糖凝胶电泳检测, 条带无降解 ;35 μl 反应体系中包含 5 μl 本品和 1 μg T3 DNA,37 C 下孵育 16 小时经琼脂糖凝胶电泳检测, 条带无降解核酸内切酶残留 :35 μl 反应体系中加入 5 μl 本品和 1 μg φx174 RF I DNA,37 C 下孵育 4 小时经琼脂糖凝胶电泳检测,RF II 转化比率 <10% PCR Primer Mix 16 小时孵育检测 :50 μl 反应体系中包含 5 μl 本品和 1 μg HindIII-λDNA,37 C 下孵育 16 小时经琼脂糖凝胶电泳检测, 条带无降解 ;50 μl 反应体系中包含 5 μl 本品和 1 μg T3 DNA,37 C 下孵育 16 小时经琼脂糖凝胶电泳检测, 条带无降解核酸内切酶残留 :50 μl 反应体系中加入 5 μl 本品和 1 μg φx174 RF I DNA,37 C 下孵育 4 小时经琼脂糖凝胶电泳检测,RF II 转化比率 <10% 引物完整度检测 : 经变性 PAGE 电泳检测, 条带单一引物浓度检测 : 测定 A260 mm 吸光值, 测定值与计算值差异 <10% Amplification Mix2 SDS-PAGE 纯度 : 所有酶组分纯度 >95% 核酸内切酶残留 :50 μl 反应体系中加入 25 μl 本品和 1 μg φx174 RF I DNA,37 C 下孵育 4 小时经琼脂糖凝胶电泳检测,RF II 转化比率 <10% 扩增性能检测 :50 μl 反应体系中加入 25 μl 本品,10 ng 人基因组 DNA 以及 0.5 μm 扩增引物扩增 1 kb 片段 30 个循环后经琼脂糖凝胶电泳检测, 有特异性 1 kb 扩增产物可见 09/ 10

ND 张婷

ND 张婷 Library Preparation VAHTS TM Turbo DNA Library Prep Kit for Illumina Vazyme Biotech Co., Ltd 网站 /Web: 咨询热线 /Tel: 400-600-9335 销售 /Sales: sales@vazyme.com 技术支持 /Support: support@vazyme.com 技术服务 /Service: