标题

Size: px

Start display at page:

Download "标题"

吊切邬
5 years ago
Views:

1 2014 年 2 月 Vol.32 No.2 February 2014 Chinese Journal of Chromatography 189 ~ 193 技术与应用 DOI: / SP.J 高效液相色谱法检测新西兰 Manuka 蜂蜜中的甲基乙二醛陈磊, 栾军, 费晓庆, 吴斌, 沈崇钰, 张睿 ( 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心, 江苏南京 ) 摘要 : 建立了高效液相色谱法用于检测新西兰 Manuka 蜂蜜中的甲基乙二醛将蜂蜜溶于水后加入邻苯二胺水溶液, 在室温避光条件下衍生化反应 8 h 以上, 产物过 0 22 μm 滤膜后用 HPLC 检测以 Kromasil 反相色谱柱为分析柱 ; 甲醇和 0 1% (v / v) 乙酸水溶液为流动相, 梯度洗脱 ; 检测波长为 318 nm; 外标法定量甲基乙二醛在 1 ~ 50 mg / L 范围内线性良好, 相关系数为 ; 检出限 ( S / N = 3) 为 0 02 mg / L, 定量限 ( S / N = 10) 为 0 06 mg / L; 在 mg / kg 添加水平下的回收率为 98 3% ~ 101 5%, 相对标准偏差 ( n = 5) 小于 5%; 衍生化产物在 24 h 内稳定实验结果表明, 该方法前处理过程简单, 具有良好的灵敏度回收率和重复性, 可用于新西兰 Manuka 蜂蜜的质量控制该方法也适用于中国蜂蜜中甲基乙二醛的检测关键词 : 高效液相色谱 ; 甲基乙二醛 ;Manuka; 蜂蜜中图分类号 :O658 文献标识码 :A 文章编号 : (2014) Determination of methylglyoxal in Manuka honey of New Zealand by high performance liquid chromatography CHEN Lei, LUAN Jun, FEI Xiaoqing, WU Bin, SHEN Chongyu, ZHANG Rui (Animal, Plant and Food Inspection Center, Jiangsu Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanjing , China) Abstract: An HPLC method was developed for the determination of methylglyoxal in Manuka honey of New Zealand. The honey sample was dissolved in water and mixed with o phenylene diamine solution for derivatization. After the reaction for at least 8 h in the dark at room tem perature, the solution was filtered with 0 22 μm membrane and injected into an HPLC system for analysis. The separation was carried out on a Kromasil reversed phase column with gradient elution. The mobile phases were methanol and 0 1% ( v / v) acetic acid aqueous solution. The detection wavelength was 318 nm. The external standard method was used for quantitation. The linear range of methylglyoxal was 1-50 mg / L with a correlation coefficient of The LOD (S / N = 3) and LOQ (S / N = 10) were 0 02 mg / L and 0 06 mg / L, respectively. The recoveries at the spiked levels of 50, 100, 200 mg / kg were 98 3% % and the RSDs ( n = 5) were less than 5%. The derivative of methylglyoxal was stable within 24 h. The results showed that the pretreatment of this method is simple and the sensitivity, the recovery and repeatability are good. This method can be used for the quality control of Manuka honey of New Zealand, and also for the detection of methylglyoxal in Chinese honey. Key words: high performance liquid chromatography (HPLC); methylglyoxal (MGO); Manuka; honey Manuka 蜂蜜是新西兰特有的一种珍贵蜜种, 是蜜蜂采集新西兰特有的一种红茶树 Manuka (Leptospermum scoparium) 的花蜜酿造而成的它区别于其他蜂蜜之处在于 Manuka 蜂蜜有强大而独特的抗菌活性蜂蜜一般都具有抗菌活性, 这是由蜂蜜本身的高渗透性较强的酸度并且一般含有通讯联系人.Tel:(025) ,E mail:coffeecatchen@ 163.com. 基金项目 : 国家质检总局科技计划项目 (2013KJ40); 国家质检总局科技计划项目 (2011IK209). 收稿日期 :

2 190 色谱第 32 卷过氧化物造成的 [1,2] 而 Manuka 蜂蜜的抗菌活性则不依赖于过氧化物, 因此被称为非过氧化抗菌活性 ( non peroxide antibacterial activity, NPA ) [3] 1991 年,Molan 等最早报道了这种抗菌活性的物质基础, 并将其命名为 Manuka 独有因子 ( unique Manuka factor, UMF); 由于并不清楚 UMF 的准确分子结构, 采用微生物学方法对 Manuka 蜂蜜的 NPA 进行了检测通过比较 Manuka 蜂蜜和一系列不同浓度的苯酚溶液对金黄色葡萄球菌的抑制程度, 从而对 Manuka 蜂蜜的 NPA 进行评级, 并标示为 UMF5+ UMF10+ UMF15+ 等等 ( 数字表示苯酚溶液的浓度 ) 目前,UMF 已经被新西兰 UMF 蜂蜜协会 ( Unique Manuka Factor Honey Associa tion, UMFHA) 作为评价 Manuka 蜂蜜的质量指标, 并要求被授权的蜂蜜生产商将其标注在产品包装上 2008 年,Mavric 等发现甲基乙二醛 (methyl glyoxal, MGO) 可能是 Manuka 蜂蜜具有 NPA 的 [5] 主要物质基础同年,Adams 等也报道了相同的结论, 并且发现 Manuka 蜂蜜中 MGO 的含量与 NPA 的相关性高达 0 98 由于采用微生物方法检测 NPA 操作比较繁琐, 结果变异较大, 而且物质基础不明确, 因此部分研究人员呼吁采用 MGO 的含量来代替 UMF 值用于标示 Manuka 蜂蜜的 NPA 但是, 也有部分研究人员认为还没有充分的证据证明 MGO 能完全代表 Manuka 蜂蜜的 NPA, 而且 UMF 更能体现新西兰 Manuka 植物的地域独特性和绿色环保理念因此, 目前市场上销售的 Manu ka 蜂蜜的产品包装上会有 UMF 和 MGO 两种指标来标示 Manuka 蜂蜜的抗菌活性目前国内对 Manuka 蜂蜜的研究较少, 且主要 [1] [2] 集中在其抗菌活性方面朱威等和玄红专等综述了国外对 Manuka 蜂蜜抗菌活性的研究孙艳 [6] 萍等研究了 Manuka UMF25+ UMF10+ 以及其他 7 种蜂蜜对铜绿假单胞菌的体外抗菌活性, 结论为 9 种蜂蜜在体外均可抑制铜绿假单胞菌, 进口蜜更佳对 Manuka 蜂蜜中相关物质的检测方法, 仅见吕辰 [7] 等采用高效液相色谱串联质谱法对多种蜂蜜中的 5 种双稠吡咯啶类生物碱进行了筛查, 结果发现野百合碱克氏千里光宁和倒千里光碱均未检出, 而千里光菲啉和千里光宁在大多数蜂蜜中均能检出 MGO 属于二羰基化合物, 国内报道的检测方法 [8] 集中在大气环境监测领域李阳等建立了一种五氟化苯肼衍生化热解吸 GC / MS 方法对大气中 [9] 23 种羰基化合物进行了测定牟翠翠等和冯艳 [10] 丽等分别报道了 2,4 二硝基苯肼衍生高效液相 [11] 色谱法用于测定大气中二羰基化合物邹婷等采用五氟苄基羟胺衍生与 GC / MS 联用的方法分析了大气中的单羰基化合物和多羰基化合物对于蜂蜜中 MGO 的检测方法, 目前国内尚无相关文献报道对此, 本实验室开发了高效液相色谱法对 Manuka 蜂蜜的 MGO 含量进行检测 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 Agilent 1200 液相色谱仪, 配有自动脱气机二元高压泵自动进样器柱温箱二极管阵列检测器及 ChemStation 数据处理软件 ( 美国 Agilent 公司 ); PURELAB Option Q15 纯水仪 ( 英国 ELGA 公司 ); 电子天平 ( 精确到 g, 德国 Sartorius 公司 ; 精确到 0 01 g, 瑞士 METTLER TOLEDO 公司 ) MGO 对照品 (40% 水溶液 ) 购自美国 Sigma Aldrich 公司 ; 邻苯二胺 ( o phenylenediamine, OPD) 购自阿拉丁化学试剂 ( 上海 ) 有限公司 ; 甲醇 ( 色谱纯, 德国 Merck 公司 ); 水为超纯水 ( 18 2 MΩ cm); 0 22 μm 有机滤膜 ( 德国 Membrana 公司 ) Manuka 蜂蜜样品由新西兰 UMF 蜂蜜协会提供, 中国蜂蜜样品由通标标准技术服务有限公司提供 1.2 标准溶液的配制精密量取 MGO 对照品 100 μl, 用水稀释并定容至 10 ml, 配成 4 g / L 的标准储备液 (4 避光保存 ) 临用前用水将标准储备液逐级稀释为适当浓度的标准工作溶液精密称取邻苯二胺 0 6 g, 用水溶解并定容至 100 ml, 配成 6 g / L 的邻苯二胺水溶液 1.3 样品前处理称取 1 g 蜂蜜溶于 10 ml 水中, 取 1 ml 该蜂蜜水溶液与 1 ml 邻苯二胺水溶液 (6 g / L) 混匀, 在室温避光条件下进行衍生化反应 8 h 以上, 过 0 22 μm 滤膜后进样分析 1.4 液相色谱条件色谱柱 :Kromasil 反相色谱柱 ( 150 mm 4 6 mm, 5 μm); 流动相 :0 1% ( v / v) 乙酸水溶液 ( A) 和甲醇 (B); 检测波长 :318 nm; 流速 :1 0 ml / min; 柱温 :30 ; 进样量 :10 μl; 保留时间 :10 3 min 梯度洗脱程序 :0 ~ 5 min, 30% B; 5 ~ 10 min, 30% B ~ 90% B; 10 ~ 15 min, 90% B; 15 ~ 16 min, 90% B ~

第 2 期陈磊, 等 : 高效液相色谱法检测新西兰 Manuka 蜂蜜中的甲基乙二醛 191 30% B; 16 ~ 20 min, 30% B 2 结果与讨论 2.

均为蜂蜜水溶液与邻苯二胺水溶液在室温避光条件下反应 8 h 以上, 只是蜂蜜样品和邻苯二胺溶液的浓度不同本实验在室温避光反应时间 (8 h 以上 ) 等衍生化条件不变的基础上, 对衍生化试剂的浓度进行了优化图 1 (a) 邻苯二胺 (b)mgo 和 (c)mgo 衍生化产物的化学结构式 Fig.

3 第 2 期陈磊, 等 : 高效液相色谱法检测新西兰 Manuka 蜂蜜中的甲基乙二醛 % B; 16 ~ 20 min, 30% B 2 结果与讨论 2.1 衍生化反应条件的优化 MGO 的紫外吸收弱, 需衍生化反应后再进行检测 MGO 属于 1,2 二羰基化合物,Weigel 等报道 1,2 二羰基化合物能与邻苯二胺反应生成喹噁啉类化合物 ( 见图 1), 在反相色谱柱上有较好的保留, 且紫外吸收强 Mavric 等和 Oelschlaegel 等建立的 MGO 检测方法中的衍生化条件均是在 Weigel 等报道的基础上进行了修改, 均为蜂蜜水溶液与邻苯二胺水溶液在室温避光条件下反应 8 h 以上, 只是蜂蜜样品和邻苯二胺溶液的浓度不同本实验在室温避光反应时间 (8 h 以上 ) 等衍生化条件不变的基础上, 对衍生化试剂的浓度进行了优化图 1 (a) 邻苯二胺 (b)mgo 和 (c)mgo 衍生化产物的化学结构式 Fig. 1 Chemical structures of (a) OPD, (b) MGO and (c) MGO derivative 对色谱柱伤害较大, 本实验对衍生化反应中蜂蜜水溶液的浓度也进行了调整 Mavric 等和 Weigel 等报道的方法中蜂蜜水溶液的浓度分别为 150 和 300 g / L, 本实验中蜂蜜水溶液的浓度为 100 g / L 并且与邻苯二胺溶液等体积混合, 因此用于进样的溶液中只含有 50 g / L 的蜂蜜, 能尽量避免高糖基质对色谱柱的损伤在本实验的方法学验证和实际样品检测完成前后, 色谱柱压力和 MGO 衍生化产物的保留时间均未见明显改变 2.2 检测波长的选择文献报道的 MGO 检测波长为 312 nm [4,12] 或 316 nm 本实验中, 通过光谱扫描发现, 最佳的检测波长为 318 nm 2.3 线性范围检出限和定量限 MGO 标准溶液与邻苯二胺水溶液进行衍生化反应后进行检测, 以衍生化产物的峰面积 Y 对 MGO 的质量浓度 X(mg / L) 进行线性回归, 在 1 ~ 50 mg / L 范围内线性良好, 相关系数为检出限 ( S / N = 3) 为 0 02 mg / L, 定量限 ( S / N = 10) 为 0 06 mg / L HPLC 图谱见图 3, 在 MGO 衍生化产物的保留时间附近并没有干扰峰存在将 100 mg / L 的 MGO 标准溶液分别与 g / L 的邻苯二胺水溶液按体积比 1 1 混合, 进行衍生化反应通过比较 MGO 衍生化产物的峰面积考察衍生化效率, 结果如图 2 所示从图 2 中可以看出, 邻苯二胺水溶液的浓度从 1 g / L 升高到 6 g / L, 衍生化产物的量逐渐上升 ; 从 6 g / L 升高到 10 g / L, 衍生化产物的量开始趋于稳定, 提示反应到达完全因此, 本实验选择 6 g / L 的邻苯二胺水溶液此外, 由于蜂蜜直接稀释后的水溶液含糖量高, 图 2 邻苯二胺浓度对衍生化效率的影响 Fig. 2 Effect of the mass concentration of OPD on the efficiency of derivatization 图 3 试剂空白 ( 水 ) 及 MGO 标准溶液 (1 mg / L) 和 Manuka 蜂蜜样品的衍生产物的 HPLC 图谱 Fig. 3 HPLC chromatograms of reagent blank ( water) and the derivatives of MGO standard solution (1 mg / L) and Manuka honey

4 192 色谱第 32 卷 Mavric 等 Weigel 等和 Oelschlaegel 等报道的 MGO 检出限分别为 mg / kg, 本方法的检出限为 0 02 mg / L, 即 0 4 mg / kg; 差异的原因可能是所使用的蜂蜜水溶液浓度不同 Mavric 等和 Weigel 等报道的检出限较低, 但蜂蜜水溶液浓度较高 (150 和 30 g / L), 高糖分对色谱柱损伤较大 ;Oelschlaegel 等使用的蜂蜜水溶液浓度很低 (15 g / L), 但检出限太高本实验条件中蜂蜜水溶液浓度介于两者之间, 在保证灵敏度的前提下, 能尽量减少高糖基质对色谱柱的损伤而且,Manuka 蜂蜜样品中 MGO 的含量一般较高, 本实验的检出限能够满足实际样品的检测需要 2.4 精密度和回收率在 Manuka 蜂蜜样品中分别添加 mg / kg 的 MGO, 每个添加水平重复 5 次, HPLC 检测后计算精密度和回收率 3 个添加水平下的 RSD 分别为 1 26% 0 89% 和 0 69%, 平均回收率分别为 98 3% 101 5% 和 99 5% ( 见表 1) 结果表明, 蜂蜜中的其他物质对 MGO 衍生化产物的检测准确度并没有影响表 1 Manuka 蜂蜜中 MGO 的精密度和回收率 (n = 5) Table 1 Precision and recovery of MGO spiked in Manuka honey (n = 5) Background / Spiked / Found / Recovery / % RSD / % 衍生化产物的稳定性在 Manuka 蜂蜜样品中分别添加 mg / kg 的 MGO, 每个添加水平重复 3 次, 在衍生化反应结束后 0 h 和 24 h 分别检测, 考察衍生化产物的稳定性结果如图 4 所示, 衍生化产物在室温放置 24 h 后仍稳定, 蜂蜜中的其他物质对 MGO 衍生化产物的稳定性没有影响 2.6 蜂蜜样品的检测利用本方法对 61 个 Manuka 蜂蜜样品中的 MGO 含量进行了检测其中,UMF 标示值为 5+ 的蜂蜜样品共 14 个, MGO 含量为 ( ± 62 1 ) mg / kg; UMF 标示值为 10 + 的蜂蜜样品共 16 个, MGO 含量为 (324 6 ± 90 4) mg / kg; UMF 标示值为 15+ 的蜂蜜样品共 12 个,MGO 含量为 (523 7 ± 59 1) mg / kg; UMF 标示值为 20+ 的蜂蜜样品共 13 个,MGO 含量为 (726 1±76 9) mg / kg; UMF 标示值为 25 + 的蜂蜜样品共 6 个, MGO 含量为 ( ± 75 8) mg / kg 该检测结果与 Adams 图 4 MGO 衍生化产物的稳定性 (n = 3) Fig. 4 Stability of MGO derivative (n = 3) [5] [14] 等和 Stephens 等的报道基本相符此外, 利用本方法对中国不同产地的油菜蜜荆条蜜洋槐蜜椴树蜜葵花蜜枣花蜜荞麦蜜棉花蜜共 16 个样品中的 MGO 含量进行了检测结果 [14] 显示,MGO 含量均 1 mg / kg Stephens 等报道, 新西兰 Kanuka 蜜三叶草蜜 Rewarewa 蜜和甘露蜜中 MGO 的含量均远低于 Manuka 蜜 Arena [15] 等报道, 意大利刺槐蜜栗子蜜柑橘蜜桉树蜜甘露蜜以及多花种混合蜂蜜中 MGO 的含量均 3 mg / kg 以上研究结果均显示,MGO 为 Manuka 蜂蜜中的特有成分本文建立的 MGO 含量检测方法, 可以为我国进口 Manuka 蜂蜜的质量评价提供参考 3 结论建立了高效液相色谱法用于检测新西兰 Manu ka 蜂蜜中的甲基乙二醛该方法前处理简单, 具有良好的灵敏度回收率和重复性, 可用于新西兰进口蜂蜜的质量控制, 也适用于中国蜂蜜中甲基乙二醛的检测参考文献 : [1] Zhu W, Hu F L, Li Y H, et al. Natural Product Research and Development ( 朱威, 胡福良, 李英华, 等. 天然产物研究与开发 ), 2004, 16(4): 372 [2] Xuan H Z, Hu F L. Journal of Bee ( 玄红专, 胡福良. 蜜蜂杂志 ), 2002(9): 23 [3] Allen K L, Molan P C, Reid G M. J Pharm Pharmacol, 1991, 43(12): 817 Mavric E, Wittmann S, Barth G, et al. Mol Nutr Food Res, 2008, 52(4): 483 [5] Adams C J, Boult C H, Deadman B J, et al. Carbohydr Res, 2008, 343(4): 651 [6] Sun Y P, Li P. Occupation and Health ( 孙艳萍, 李萍. 职业与健康 ), 2012, 28(19): 2366 [7] Lü C, Ding T, Ma X, et al. Chinese Journal of Chromatogra phy ( 吕辰, 丁涛, 马昕, 等. 色谱 ), 2013, 31(11): 1046

5 第 2 期陈磊, 等 : 高效液相色谱法检测新西兰 Manuka 蜂蜜中的甲基乙二醛 193 [8] Li Y, Shao M, Lu S H. Environmental Chemistry ( 李阳, 邵敏, 陆思华. 环境化学 ), 2009, 28(5): 630 [9] Mu C C, Feng Y L, Zhai J Q, et al. Chinese Journal of Ana lytical Chemistry ( 牟翠翠, 冯艳丽, 翟金清, 等. 分析化学 ), 2010, 38(11): 1573 [10] Feng Y L, Mu C C, Fu Z R, et al. Chinese Journal of Ana lytical Chemistry ( 冯艳丽, 牟翠翠, 付正茹, 等. 分析化学 ), 2011, 39(11): 1653 [11] Zou T, Feng Y L, Fu Z R, et al. Acta Scientiae Circumstan tiae ( 邹婷, 冯艳丽, 付正茹, 等. 环境科学学报 ), 2012, 32 (11): 2718 Weigel K, Opitz T, Henle T. Eur Food Res Technol, 2004, 218(2): 147 Oelschlaegel S, Gruner M, Wang P N, et al. J Agric Food Chem, 2012, 60(29): 7229 [14] Stephens J M, Schlothauer R C, Morris B D, et al. Food Chem, 2010, 120(1): 78 [15] Arena E, Ballistreri G, Tomaselli F, et al. J Food Sci, 2011, 76(8): C1203

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.