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1 微生物学通报 Microbiology China Nov. 20, 2015, 42(11): by Institute of Microbiology, CAS DOI: /j.microbiol.china 主编点评文章温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成 L- 丙氨酸 * 周丽邓璨崔文璟刘中美周哲敏 ( 江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡 ) 摘要 : 目的 L- 丙氨酸的存在导致 Escherichia coli 的生长速率显著降低, 最终会降低发酵过程中 L- 丙氨酸的体积合成速率用温度调节基因开关 (λp R -p L ) 高效动态调控重组 E. coli 菌株菌体生长与 L- 丙氨酸合成过程, 使两者相协调方法以野生型 E. coli B0016 为出发菌株, 敲除乙酸甲酸乙醇琥珀酸乳酸代谢产物合成途径以及丙氨酸消旋酶编码基因 (acka-pta pflb adhe frda ldha dadx), 获得菌株 B B 将嗜热脂肪地芽孢杆菌 (Geobacillus stearothermophilus) 来源的 L- 丙氨酸脱氢酶基因 (alad) 克隆于 p L 启动子下游, 并在 B B 菌株中表达, 获得菌株 B B/pPL-alaD, 进行摇瓶和发酵罐发酵考察菌体生长和 L- 丙氨酸发酵性能结果竞争代谢途径的敲除显著降低了副产物合成量, 仅形成极少量的乙酸琥珀酸和乙醇 28 C 下菌株 B B/pPL-alaD 几乎不合成 L- 丙氨酸, 可保证菌体快速生长 ; 而在 42 C 下可高效合成 L- 丙氨酸经发酵罐发酵, 可合成 67.2 g/l L- 丙氨酸, 体积生产强度达到 2.06 g/(l h) 结论通过发酵培养温度的简单切换, 分阶段实现了细胞的快速增量和 L- 丙氨酸的高强度合成关键词 :L- 丙氨酸, 基因开关, 大肠杆菌, 发酵, 代谢工程 L-alanine production in recombinant Escherichia coli with thermo-regulated genetic switch ZHOU Li DENG Can CUI Wen-Jing LIU Zhong-Mei ZHOU Zhe-Min * (The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu , China) Abstract: [Objective] Specific growth rate of Escherichia coli could be significantly decreased by L-alanine, which would result in reduction in L-alanine volumetric productivity. Therefore, the λp R -p L promoter was used as a thermo-controllable genetic switch to coordinate the processes of cell growth and L-alanine production in E. coli. [Methods] Synthetic routes for acetate, formate, ethanol, succinate and lactate as well as for L-alanine recemization were inactivated by deleting the corresponding genes (acka-pta, pflb, adhe, frda, ldha, dadx) in the wild-type E. coli B0016 to generate B B. Subsequently, alanine dehydrogenase derived from Geobacillus stearothermophilus was cloned 基金项目 : 国家自然科学基金项目 (No ); 江苏省自然科学基金项目 (No. BK ); 中央高校基本科研业务费专项资金项目 (No. JUSRP1004) * 通讯作者 :Tel: ; :zhmzhou@jiangnan.edu.cn 收稿日期 : ; 接受日期 : ; 优先数字出版日期 (

2 周丽等 : 温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成 L- 丙氨酸 2273 downstream of the p L promoter and expressed in B B to produce B B/pPL-alaD. Shake-flask and bioreactor experiments were conducted to investigate the properties of cell growth and L-alanine fermentation. [Results] Deletions of the competing pathways significantly decreased by-products accumulation with formation of low levels of acetate, succinate and ethanol. Strain B B/pPL-alaD hardly produced L-alanine during cell growth phase at 28 C, which facilitated high growth rate. Meanwhile, efficient L-alanine production was obtained when cultured at 42 C under oxygen-limited conditions. In bioreactor experiment, strain B B/pPL-alaD produced 67.2 g/l L-alanine, with a productivity of 2.06 g/(l h). [Conclusion] Efficient cell growth and L-alanine production were realized simply by switching the cultivation temperature. Keywords: L-alanine, Genetic switch, Escherichia coli, Fermentation, Metabolic engineering 微生物作为细胞工厂, 已被应用于许多同源及异源代谢产物的生产, 包括发酵型产物 ( 氨基酸有机酸有机醇 ) 以及众多次级代谢产物的生产 [1-4] 然而, 其中多数代谢产物的过量合成会对细胞造成伤害, 抑制细胞的生长或者使代谢流失衡 [5-6] 例如, 提高培养基中 L- 丙氨酸的浓度会显著抑制菌株的生长因此, 希望在细胞生长至较高浓度后再可控地起始目的代谢产物的合成将发酵过程分成独立的细胞生长阶段和产物合成阶段, 提高了发酵液中生物量, 从而获得了较高的体积生产强度 [7] 然而, 这种调控过程并不严密, 在菌体生长阶段仍可积累一定浓度的目的代谢产物, 与菌体生长竞争底物, 使得合成菌体的能力降低 [6-7] 因此, 需要通过基因工程手段对代谢流进行精确控制 λ 噬菌体启动子 [8] p L 和 p R 能够通过改变培养温度快速有效地开启或关闭重组蛋白的表达, 且调控严密, 基本无本底表达 [8-9] [10], 显示了其作为代谢调控基因开关的潜在应用价值在前期研究中, 用 p L 和 p R 启动子成功地对 D- 乳酸发酵过程进行了开关控制, 而该方法在其他代谢产物合成中的应用至今未见报道 L- 丙氨酸是最小的手性分子之一, 被用于医药和兽药行业, 与其他 L- 型氨基酸共同用作手术前和手术后的营养剂 [11] 由于 L- 丙氨酸具有甜味, 也被用于食品添加剂 [12] 目前 L- 丙氨酸是利用固定化 L- 天冬氨酸 -β- 脱羧酶或者德阿昆哈假单胞菌 (Pseudomonas dacunhae) 的细胞菌悬液, 以 L- 天冬氨酸为底物脱羧生产的 [13] 然而, 该生产过程成本高, 其底物 L- 天冬氨酸是由富马酸经天冬氨酸酶催化合成的, 而富马酸是经石油炼制生产的随着石油资源的日渐短缺, 以石油基原料为前体进行 L- [13] 丙氨酸合成已不再符合市场发展趋势利用可再生资源通过微生物发酵合成 L- 丙氨酸受到了人们的关注 [11,14] 近年来, 利用基因工程手段, 将外源丙氨酸脱氢酶基因引入 E. coli 菌株, 在 E. coli 中实现了 L- 丙氨酸的合成, 进一步通过代谢工程策略改造竞争代谢途径, 显著提高了 L- 丙氨酸发酵合成水平和光学纯度 [12,15-16] 然而, 未见精细调节 L- 丙氨酸发酵过程的报道本文以野生型 E. coli CICIM B0016 为出发菌株, 敲除副产物乙酸甲酸乙醇琥珀酸乳酸合成途径编码基因 acka-pta pflb adhe frda ldha, 并敲除丙氨酸消旋酶编码基因 dadx; 进一步将来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌 (Geobacillus stearothermophilus) 的 L- 丙氨酸脱氢酶编码基因 alad 克隆在 p L 和 p R 启动子下游, 在上述重组菌中表达, 构建出可通过温度开关控制 L- 丙氨酸合成的新型 E. coli 重组菌株最后考察温度开关对该重组菌株 L- 丙氨酸发酵过程的控制效果 1 材料与方法 1.1 菌株质粒和引物菌株 Geobacillus stearothermophilus B0031 和 Escherichia coli CICIM B0016 由江南大学工业微生物资源和信息中心筛选和保藏 ( 质粒 pkd46 ( 温度

3 2274 微生物学通报 Microbiol. China 2015, Vol.42, No.11 敏感型, 含有阿拉伯糖启动子调控的 gam bet 和 exo 基因,Amp r ) pkd13 ( 含有 FRT-Kan-FRT 突变盒,Kan r ) pcp20 ( 温度敏感型, 含有 FLP 重组酶, Amp r ), 购于耶鲁大学基因保藏中心 ppl451 质粒由本中心保藏所用菌株和质粒见表 1, 引物序列见表 2 ExTaq DNA 聚合酶 Prime Star DNA 聚合酶各种限制性内切酶和 T4 DNA 聚合酶, 宝生物工程 ( 大连 ) 公司 ; 质粒提取纯化和胶回收试剂盒, 北京博大泰克生物基因技术有限责任公司 1.2 培养基 LB 培养基 (g/l): 胰蛋白胨 10, 酵母粉 5, NaCl 10 M9-1 液体培养基 (g/l):na 2 HPO 4 12H 2 O 15.1, KH 2 PO 4 3.0,NH 4 Cl 1.0,NaCl 0.5,(NH 4 ) 2 SO , 补加 0.1% ( 体积比 ) 1 mol/l MgSO 4 和 0.1% ( 体积比 ) 的微量元素母液微量元素成分为 (g/l): FeCl 3 6H 2 O 2.4,CoCl 2 6H 2 O 0.3,CuCl 2 2H 2 O 0.15, ZnCl 2 0.3, Na 2 MO 4 2H 2 O 0.3, H 3 BO , MnCl 2 4H 2 O 菌株 Strains 菌株质粒 Strains and plasmids 表 1 本研究中所使用的菌株和质粒 Table 1 Strains and plasmids used in this study 相应特征 Relevant characteristics 来源 Sources Geobacillus stearothermophilus B0031 Wild type CICIM-CU a Escherichia coli strains B0016 Wild type CICIM-CU a B B0016,Δack-pta 本研究构建 B B0016,Δack-pta ΔpflB 本研究构建 B B0016,Δack-pta ΔpflB ΔadhE 本研究构建 B B0016,Δack-pta ΔpflB ΔadhE ΔfrdA 本研究构建 B B0016,Δack-pta ΔpflB ΔadhE ΔfrdA ΔldhA 本研究构建 B B B0016,Δack-pta ΔpflB ΔadhE ΔfrdA ΔldhA ΔdadX 本研究构建 B B/pPL-alaD B B with ppl-alad plasmid 本研究构建质粒 Plasmids pkd46 Amp r,γ β exo (red recombinase),temperature-conditional replicon CGSC b ;[17] pkd13 Amp r,kan r,frt-kan-frt cassette CGSC b ;[17] pcp20 Amp r,flp,temperature-conditional replicon CGSC b ;[17] ppl451 Amp r,λci ts 857,p R p L promoter CICIM-CU a ;[8] ppl-alad Amp r,alad 本研究构建注 : a : 江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心 ; b : 耶鲁大学基因保藏中心. Note: a : The Culture and Information Center of Industrial Microorganisms of China Universities, Jiangnan University; b : Genetic Stock Center, Yale University.

4 周丽等 : 温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成 L- 丙氨酸 2275 表 2 本研究中所使用的引物 Table 2 Primers used in this study 引物 Primers AckA-pKD13F Pta-pKD13R YackAF PflB-pKD13F PflB-pKD13R YpflBF YpflBR AdhE-pKD13F AdhE-pKD13R YadhER FrdA-pKD13F FrdA-pKD13R YfrdAF YfrdAR LdhA-pKD13F LdhA-pKD13R YldhAR DadX-pKD13F DadX-pKD13R YdadXF YdadXR 序列 Sequence (5 3 ) TGGCTCCCTGACGTTTTTTTAGCCACGTATCAATTATAGGTACTTCCATG gtgtaggctggagctgcttc GCAGCGCAAAGCTGCGGATGATGACGAGATTACTGCTGCTGTGCAGACTG CAGGTATCCTTTAGCAGCCTGAAGG TTTTACTGTACGATTTCAGTCAAATCTAATTACATAGATTGAGTGAAGGT gtgtaggctggagctgcttc a CGAAGTACGCAGTAAATAAAAAATCCACTTAAGAAGGTAGGTGTTACATG GAGTGAATGCGACCAATAACTGACATT CATACTGGGTCATTTACCTGCGTG CCGTTTATGTTGCCAGACAGCGCTACTGATTAAGCGGATTTTTTCGCTTT gtgtaggctggagctgcttc CGAGCAGATGATTTACTAAAAAAGTTTAACATTATCAGGAGAGCATTATG ATCACAGTGAGTGTGAGCGCG GCACCACCTCAATTTTCAGGTTTTTCATCTCAGCCATTCGCCTTCTCCTT gtgtaggctggagctgcttc ACCCTGAAGTACGTGGCTGTGGGATAAAAACAATCTGGAGGAATGTCGTG TAAGGCACTTCATAGAATGCGCTATGC ATCATCTTCAGTGATAATTTAGCCCTCTTG CTCCCCTGGAATGCAGGGGAGCGGCAAGATTAAACCAGTTCGTTCGGGCA gtgtaggctggagctgcttc TATTTTTAGTAGCTTAAATGTGATTCAACATCACTGGAGAAAGTCTTATG AGCATGGGTAGTTAATATCCTGATTTAGCG CATCACGTCCGGGCCATTTACATGGCGCACACAGCTAAGGAAACGAGATG gtgtaggctggagctgcttc ACGTTGCCTCCGATCCGGCTTACAACAAGTTACACCGTCACAACCGGGAC GTTTTAATACCGAGCTGTTGCAACCG ACATTAACAACTACAGTTGCTGACCAGCC 酶切位点 Restriction sites AlaDF-BamH I TTTGGATCCTAAGGAGGTTAACTATGAAGATCGGCATTCCAAAAGAAATC BamH I AlaDR-EcoR I TTTGAATTCGGATCTTCCAGAGATTGAAGGAGTTGATC EcoR I

5 2276 微生物学通报 Microbiol. China 2015, Vol.42, No 基因敲除方法 [17] 用 Datsenko 等报道的基因敲除方法依次敲除 B0016 菌株染色体上的 acka-pta pflb adhe frda ldha 和 dadx 基因其具体过程为 : 以 pkd13 质粒为模板, 分别用引物对 AckA-pKD13F/ Pta-pKD13R PflB-pKD13F/PflB-pKD13R AdhE-pKD13F/AdhE-pKD13R FrdA-pKD13F/ FrdA-pKD13R LdhA-pKD13F/LdhA-pKD13R 和 DadX-pKD13F/DadX-pKD13R 进行 PCR 扩增, 获得两端各具有 50 bp 同源臂序列中部为 FRT-Kan-FRT 的突变盒片段借助质粒 pkd46 上的 Red 重组系统将突变盒整合于待突变菌株的染色体上, 并用相应的验证引物对 (YackAF/ Pta-pKD13R, YpflBF/YpflBR, AdhE-pKD13F/ YadhER,YfrdAF/YfrdAR,LdhA-pKD13F/YldhAR, YdadXF/YdadXR) 进行菌落 PCR 验证, 最后用 pcp20 质粒去除重组菌中的卡那抗性基因, 并进一步用相应验证引物进行验证 1.4 发酵方法摇瓶发酵方法 : 将保藏于 80 C 甘油保藏管的菌株划线于 LB 平板上培养 24 h, 将单菌落接种于 50 ml LB 液体培养基中,28 C 200 r/min 培养 10 h r/min 离心 5 min, 收集菌体, 用 M9-1 培养基重悬, 以 0.02 g/l ( 菌体干重 / 培养基体积 ) 的接种量接种于 50 ml 含有 5 g/l 葡萄糖的 M9-1 液体培养基中 (250 ml 三角瓶中 ), 进行好氧 - 限氧两阶段发酵培养好氧菌体生长阶段以 28 C 200 r/min 培养至细胞干重 (DCW) 达到 1.37 g/l, 限氧发酵阶段添加 1.5 ml 500 g/l 葡萄糖和 2 g CaCO 3, 于 28 C 或 42 C 静置培养, 直至发酵液中葡萄糖被耗尽, 或两阶段共经 54 h 结束发酵每组进行 3 个平行实验上述培养过程中都添加终浓度为 100 μg/ml 氨苄青霉素发酵罐发酵方法 : 种子液培养方法 : 菌体在 LB 平板及 LB 液体培养基中的培养方法同摇瓶发酵培养方法 r/min 离心 5 min, 收集 LB 液体培养基中获得的菌体, 并以 0.1 g/l ( 菌体干重 / 培养基体积 ) 的接种量接种于 150 ml 含有 5 g/l 葡萄糖 100 μg/ml 氨苄青霉素的 M9-1 液体培养基中 (500 ml 三角瓶中 ),33 C 200 r/min 摇床培养 9 h 发酵罐接种方式 : 将种子液以 g/l ( 菌体干重 / 培养基体积 ) 的接种量接种于含有 M9-1 培养基 ( 不添加氨苄青霉素 ) 的 5 L 发酵罐 (Winpact FS-02,Major Science,Saratoga,CA,USA), 接种后发酵液初始体积为 3 L, 葡萄糖初始浓度为 30 g/l 好氧阶段培养方法 : 好氧菌体生长阶段, 初始空气通量为 3 L/min, 搅拌桨转速为 200 r/min, 此时的溶解氧浓度设定为 100%, 菌体生长过程中调节空气通量直至 7 L/min, 同时将搅拌转速与 DO 值关联来控制溶解氧浓度始终大于 30%; 使用 NH 4 OH 和 10% ( 体积比 ) H 2 SO 4 维持 ph 7.0; 发酵温度控制在 33 C 当菌体浓度达到 OD 600 为 20 时, 将发酵罐温度设定为 42 C 继续好氧培养 45 min, 再进入限氧发酵产酸阶段限氧阶段培养方法 : 第二阶段, 空气通量调为 0, 搅拌桨转速控制为 100 r/min, 添加 NH 4 OH 来维持 ph 为 7.0, 发酵温度为 42 C, 并补加两次浓度为 600 g/l 的葡萄糖, 每次补加 200 ml, 以维持发酵过程中发酵液残糖浓度高于 10 g/l, 当所有补加的葡萄糖消耗尽后即结束发酵发酵罐发酵进行两次平行实验 1.5 分析方法菌体量测定方法 : 菌体密度采用浊度法间接测量, 通过 OD 600 来表示, 并通过下列公式换算为菌体干重菌体干重 (DCW) 和 OD 600 的关系 : 1 OD 600 =0.38 g/l DCW 葡萄糖测定方法 : 葡萄糖用 SBA-40E 葡萄糖生物传感仪 ( 山东省科学院生物研究所 ) 进行分析进行高压液相分析的发酵液样品预处理方法 : 有机酸测定样品预处理方法 : 发酵过程中如果添加了 CaCO 3, 发酵液样品用 5% ( 体积比 ) 浓硫酸酸化, 释放由 CaCO 3 中和的酸类代谢产物, 离心去

周丽等 : 温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成 L- 丙氨酸 2277 除 CaSO 4 沉淀后经 0.45 μm 微孔滤膜过滤后进行高压液相检测氨基酸测定样品预处理方法 : 用 NH 4 OH 调节样品 ph 至 8.0, 适当稀释后再用苯基异硫酸酯 (PITC) 进行衍生衍生步骤为 :500 μl 样品中加入 250 μl 0.

5), 流速为 1 ml/min, 柱温为室温 1.5.5 氨基酸测定方法 : 色谱柱为 AccQ Tag 3.9 mm 150 mm (Waters) 流动相 A 液为 80% ( 体积比 ) 乙腈水溶液,B 液为 97:3 ( 体积比 ) 的 0.

6 周丽等 : 温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成 L- 丙氨酸 2277 除 CaSO 4 沉淀后经 0.45 μm 微孔滤膜过滤后进行高压液相检测氨基酸测定样品预处理方法 : 用 NH 4 OH 调节样品 ph 至 8.0, 适当稀释后再用苯基异硫酸酯 (PITC) 进行衍生衍生步骤为 :500 μl 样品中加入 250 μl 0.1 mol/l PITC 乙腈溶液和 250 μl 1 mol/l 三乙胺乙腈溶液, 充分混匀, 避光室温放置 1 h, 加入 500 μl 正己烷溶液, 涡旋振荡器振荡 1 min, 静置 60 min, 吸取下层溶液, 用 0.45 μm 有机滤膜过滤后进行高压液相检测 [18] 有机酸测定方法 : 有机酸含量用高压液相色谱进行分析, 检测器为 UV (210 nm) 检测器, 色谱柱为 Prevail Organic Acid 5u (Grace Davison Discovery Sciences), 流动相为 25 mmol/l KH 2 PO 4 (ph 2.5), 流速为 1 ml/min, 柱温为室温氨基酸测定方法 : 色谱柱为 AccQ Tag 3.9 mm 150 mm (Waters) 流动相 A 液为 80% ( 体积比 ) 乙腈水溶液,B 液为 97:3 ( 体积比 ) 的 0.1 mol/l 乙酸钠 - 乙腈溶液采用梯度洗脱 :0 20 min,b 液由 95% 下降到 80%;20 30 min,b 液由 80% 上升到 95%;30 40 min,b 液梯度不变检测波长为 254 nm, 柱温为室温乙醇测定方法 : 乙醇含量用 SBA-40E 葡萄糖生物传感仪 ( 山东省科学院生物研究所 ) 进行分析数据分析方法 : 2 ln( X ) X1 平均比生长速率 (μ)= ; t2-t1 P P 转化率 = % ; G2 G1 P2 P1 体积生产强度 = V ( t2 t1) 其中 :X (g/l) 为菌体浓度,t (h) 为时间,P (g) 为产物量,G (g) 为葡萄糖量,V (L) 为发酵结束时发酵液体积 2 结果与分析 2.1 E. coli B B 重组菌株的构建 [17] 用 Datsenko 等报道的基因敲除方法, 在菌株 E. coli B0016 中依次叠加敲除 acka-pta pflb adhe frda ldha 和 dadx 基因, 依次获得了 B B B B B 和 B B 菌株 ( 表 1) 用验证引物对上述突变进行验证, 结果如图 1 所示, 均获得了大小 kb 左右的条带, 表明上述基因已成功删除 2.2 alad 基因的克隆及 E. coli B B/ ppl-alad 重组菌株的构建根据 GenBank EF 报道的 alad 基因序列设计引物 AlaDF-BamH I 和 AlaDR-EcoR I, 并以 G. stearothermophilus B0031 菌株染色体为模板, 进行 PCR 扩增, 获得了 alad 基因及其部分下游基因序列, 其大小约为 1.2 kb 经 DNA 测序并用 BLAST 软件进行 DNA 序列比对, 表明 G. stearothermophilus B0031 来源的 alad 其结构基因部分 (1 119 bp) 与已报道的同菌种来源的 alad 基因图 1 E. coli B B 突变基因的 PCR 鉴定电泳图谱 Figure 1 PCR identification of gene mutations in E. coli B B 注 :M:DL10000 marker;1: 用 YackAF 和 Pta-pKD13R 引物 PCR;2: 用 YpflBF 和 YpflBR 引物 PCR;3: 用 AdhE-pKD13F 和 YadhER 引物 PCR;4: 用 YfrdAF 和 YfrdAR 引物 PCR;5: 用 LdhA-pKD13F 和 YldhAR 引物 PCR;6: 用 YdadXF 和 YdadXR 引物 PCR. Note: M: DL10000 marker; 1: PCR with YackAF and Pta-pKD13R primers; 2: PCR with YpflBF and YpflBR primers; 3: PCR with AdhE-pKD13F and YadhER primers; 4: PCR with YfrdAF and YfrdAR primers; 5: PCR with LdhA-pKD13F and YldhAR primers; 6: PCR with YdadXF and YdadXR primers.

7 2278 微生物学通报 Microbiol. China 2015, Vol.42, No.11 图 2 ppl-alad 质粒物理图谱 (A) 及酶切验证图谱 (B) Figure 2 Map of recombinant vector ppl-alad (A) and restriction pattern of ppl-alad (B) 注 :1:BamH I 和 EcoR I 双酶切重组质粒 ppl-alad;m:dl marker. Note: 1: ppl-alad/bamh I, EcoR I; M: DL marker. (GenBank 登录号 :M ) [19] 最高相似性达到 98%, 有 24 个碱基位点不同用 BLAST 软件进行氨基酸序列比对, 表明与同菌种来源的丙氨酸脱氢酶 (NCBI 登录号 :WP_ ) 最高相似性为 99%, 其中本文获得的 ALD 的 224 位为苏氨酸, 而文献报道的该位点多为异亮氨酸将克隆到的 alad 基因片段用 BamH I 和 EcoR I 进行双酶切, 克隆于 ppl451 质粒载体的相同酶切位点, 获得重组质粒 ppl-alad, 其物理图谱如图 2A 所示重组质粒 ppl-alad 用 BamH I 和 EcoR I 进行双酶切, 电泳获得了 4.2 kb 和 1.2 kb 两条带 ( 图 2B), 表明质粒构建正确将 ppl-alad 质粒转化菌株 B B, 获得 B B/pPL-alaD 重组菌株, 进一步进行发酵实验检测其 L- 丙氨酸合成性能 2.3 L- 丙氨酸浓度对菌体生长的影响菌株 B B 不具有发酵型丙氨酸脱氢酶 (ALD), 发酵液中不积累 L- 丙氨酸, 因此以该菌株为研究对象, 在其培养基中分别添加终浓度为 g/l 的 L- 丙氨酸, 考察 L- 丙氨酸对菌体生长的影响结果如表 3 所示, 添加终浓度为 1 g/l 的 L- 丙氨酸使得菌体比生长速率显著降低, 随着 L- 丙氨酸添加浓度的增加, 菌体生长速率大幅度降低, 表明 L- 丙氨酸对菌体生长存在抑制作用因此,L- 丙氨酸发酵生产过程中, 在菌体生长阶段应限制 L- 丙氨酸的合成量, 以减少其对菌体生长的抑制作用 ; 而当菌体浓度达到一定值时, 再高水平表达 L- 丙氨酸脱氢酶, 可促进 L- 丙氨酸的快速合成 2.4 B B/pPL-alaD 菌株丙氨酸发酵特征野生型菌株 B0016 重组菌株 B B/ ppl-alad 及对照菌株 B B 进行摇瓶发酵培表 3 不同 L- 丙氨酸添加浓度下 B B 菌株的比生长速率 Table 3 Specific growth rate of B B under different concentrations of L-alanine L- 丙氨酸添加量比生长速率 L-alanine addition (g/l) Specific growth rate μ (h 1 ) ± ± ± ± ±0.00

8 周丽等 : 温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成 L- 丙氨酸 2279 养, 测定发酵液中 L- 丙氨酸和有机酸合成量, 结果如表 4 所示野生菌株 B0016 在 M9-1 培养基中进行好氧 - 限氧两阶段发酵培养, 主要代谢产物为乳酸乙酸琥珀酸甲酸和乙醇, 其合成量与野生型菌株 B0013 相仿 [7],L- 丙氨酸含量极低 ( 小于 0.05 g/l) 将竞争代谢途径删除后, 重组菌株 B B 中上述副产物的合成量都大幅度降低, 而由于丙酮酸的分解代谢途径被阻断, 丙酮酸积累量增加, 同时还原型辅酶利用途径的删除也导致糖酵解途径产生的 NADH 不能被氧化再生, 使得限氧阶段糖消耗速率降低菌株 B B/pPL-alaD 在 28 C 下进行两阶段培养, 几乎不能诱导 p R -p L 启动子起始表达, 发酵过程中仅检测出少量的 L- 丙氨酸 (0.26 g/l) 而在 42 C 下进行限氧发酵, 菌株 B B/ ppl-alad 利用葡萄糖合成 11 g/l L- 丙氨酸, 其得率达到 70.3 g 丙氨酸 /100 g 葡萄糖, 生产强度达到 0.2 g/(l h) 上述结果表明通过控制温度调节 p R -p L 启动子的活性, 在 28 C 下可有效关闭 L- 丙氨酸的合成, 避免 L- 丙氨酸的积累对菌体生长产生抑制作用 ; 而在 42 C 下可高效开启 L- 丙氨酸的合成, 实现了重组大肠杆菌 L- 丙氨酸合成的开关控制前期研究中, 用 p L 启动子成功调控了 D- 乳酸发酵过程, 并优化了开关控制的培养条件 (33 C 生长菌体,42 C 诱导及限氧发酵 ) 本文利用该最佳培养条件, 在 5 L 发酵罐中, 考察菌株 B B/ ppl-alad 进行 L- 丙氨酸的发酵效果发酵过程中 L- 丙氨酸和菌体浓度如图 3 所示在菌体生长阶段控制较低温度, 使得 L- 丙氨酸的合成量可控制在极低的水平, 保证了菌体快速生长经 42 C 诱导, L- 丙氨酸开始快速合成, 并且在限氧条件下糖酵解途径可与 L- 丙氨酸合成途径耦合, 实现还原力的循环, 促进了 L- 丙氨酸的快速合成最终发酵液中, L- 丙氨酸产量达 67.2 g/l, 体积生产强度达到 2.06 g/(l h) 限氧发酵阶段 L- 丙氨酸转化率可达 87.2 g/100 g 葡萄糖, 整个发酵阶段 L- 丙氨酸转化率也可达到 67.1 g/100 g 葡萄糖发酵液中主要副产物是乙酸 (5.8 g/l), 其他副产物含量都低于 0.2 g/l 3 结论野生型 E. coli B0016 菌株经好氧 - 限氧两阶段发酵, 产生大量的乳酸乙酸甲酸乙醇琥珀酸等代谢产物 ( 表 4) 将这些代谢产物合成途径编码表 4 L- 丙氨酸发酵性能的比较 Table 4 Comparison of alanine fermentation 丙氨酸转化率菌株 Strain 生产强度 Productivity (g/l h) d Alanine 限氧阶段转化率 Oxygen-limited yield (g/100 g glucose) e 丙氨酸 Alanine Yield for indicated agent (g/100 g glucose) f 乳酸乙酸琥珀酸 Lactate Acetate Succinate 甲酸 Formate 丙酮酸 Pyruvate 乙醇 Ethanol B0016 a 0.00± ± ± ± ± ± ± ± ±0.9 B B a,b 0.00± ± ± ± ± ± ± ± ±0.0 B B/pPL-alaD b,c 0.00± ± ± ± ± ± ± ± ±0.0 B B/pPL-alaD a 0.20± ± ± ± ± ± ± ± ±0.0 注 : a : 菌体生长阶段在 28 C 进行, 限氧发酵阶段在 42 C 进行 ; b : 底物葡萄糖未消耗完 ; c : 整个发酵过程在 28 C 进行 ; d : 限氧阶段的平均生产强度 ; e : 限氧阶段的平均转化率 ; f : 整个发酵阶段的平均转化率. Note: a : Cells were cultured in shake flasks at 28 C during growth phase and at 42 C during oxygen-limited phase; b : Incomplete utilization of glucose substrate; c : Cells were cultured in shake flasks at 28 C during the entire fermentation process; d : Average productivity during the oxygen-limited phase; e : Average alanine yield during the oxygen-limited phase; f : Average yield during the overall fermentation phase.

9 2280 微生物学通报 Microbiol. China 2015, Vol.42, No.11 基因敲除获得菌株 B B, 显著降低了这些产物的积累量 ( 表 4), 其残余量与前期研究结果相仿 [7] 此外,DadX 是 E. coli 中主要的丙氨酸消旋酶 [20], 将该基因敲除, 减少 L- 丙氨酸向 D- 丙氨酸的转化, 可获得高光学纯度的 L- 丙氨酸 [16] Zhang [16] 等通过敲除 mgsa 基因提高菌体生长速率并去除了残余的乳酸副产物可能是由于出发菌株之间的差异, 使得本文在没有敲除 mgsa 基因的情况下, 仍可达到较高的菌体生长速率 ( 图 3), 且发酵液中乳酸副产物含量极低 [16] Zhang 等将来源于 Geobacillus stearothermophilus 的 alad 基因整合于重组 E. coli SZ194 染色体上, 经驯化后, 最终菌株 XZ132 (pflb frd adhe acka mgsa dadx ldha::alad) 经 48 h 可利用无机盐培养基以及 120 g/l 葡萄糖合成 mmol/l 图 3 菌株 B B/pPL-alaD 丙氨酸发酵过程 Figure 3 Representative experiment of alanine fermentation by E. coli B B/pPL-alaD 注 : : 丙氨酸 ; : 细胞干重 (DCW); : 乙酸 ; : 丙酮酸 ; : 乳酸 ; : 琥珀酸 ; : 甲酸 ; : 乙醇. 虚线箭头表示培养温度由 33 C 转为 42 C. 虚线表示发酵由好氧培养阶段转为限氧培养阶段. 箭头表示向发酵罐中添加 120 g (A) 和 120 g (B) 葡萄糖. Note: : Alanine; : Dry cell mass (DCW); : Acetate; : Pyruvate; : Lactate; : Succinate; : Formate; : Ethanol. The dotted arrow shows the time when the culture was shifted from 33 C to 42 C. The dotted line indicates the time when the culture was shifted from the aerobic cultivation to the oxygen-limited production phase. Additions of glucose of 120 g (A) and 120 g (B) were made to the bioreactor as indicated by arrows. 丙氨酸, 丙氨酸转化率达到 95 g/100 g 葡萄糖, L- 丙氨酸光学纯度达到 99.5%, 是目前利用重组 E. coli 菌株进行 L- 丙氨酸合成的最高产量基于上述成功例子, 且考虑到来源于嗜热菌 G. stearothermophilus 的 ALD 具有较好的热稳定性 [16], 所构建的重组菌株在较高温度培养时对该酶活性影响会较小, 本文克隆了该来源的 ALD 在重组 E. coli 中进行 L- 丙氨酸合成所获得的 alad 基 [16] 因与 Zhang 等报道的 (GenBank 登录号 : EF ) 相比, 有 39 个位点碱基不同, 存在 8 个位点氨基酸序列的差异, 这可能使两个酶的催化性能有所差别, 导致两个发酵过程也产生差别然而, 发酵实验表明该 ALD 酶同样可进行 L- 丙氨酸的高效合成 [16] Zhang 等用乳酸脱氢酶基因 (ldha) 的启动子控制 ALD 的表达, 该启动子受生长调节, 可在厌氧条件下高效表达然而, 前期乳酸发酵过程研究中, 发现 P ldha 启动子对于基因表达的调控并不严格例如, 乳酸发酵重组菌株 B (acka pta pps pflb dld poxb adhe frda) 好氧阶段仍可合成 7 g/l 乳酸, 与菌体生长竞争丙酮酸, 抑制了菌体的生长 [7] 因此, 用 P ldha 启动子调控丙氨酸发酵过程, 同样可能导致菌体生长阶段丙氨酸积累而抑制菌体生长 Lee 及 Smith 等在 E. coli 菌株中用 trc 启动子调控 alad 基因 ( 来源于 Bacillus sphaericus) 的表达 [12,15], 但需添加 IPTG 进行诱导, 其价格昂贵, 不适于工业应用本文选用 p L -p R 启动子对 ALD 的表达进行开关调控, 相对于基因工程中一些常用的启动子, 该启动子为严谨型启动子, 在低温下无本底表达, 且仅通过调节温度就可以实现有效调控, 不需要添加一些昂贵的化合物进行诱导 ; 另外, 由于 ppl451 质粒在无抗生素选择压力时仍可较稳定存在 [18], 故在发酵罐发酵试验时未加抗生素, 更符合实际生产过程, 具有更好的应用前景通过控制温度, 可在菌体生长阶段严格关闭菌株 B B/pPL-alaD L- 丙氨酸的合成水平, 避免产物对菌体生长的抑制和竞争作用同时, 在产物

10 周丽等 : 温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成 L- 丙氨酸 2281 合成阶段可开启 L- 丙氨酸的快速合成重组菌株 B B/pPL-alaD 经发酵罐发酵, 可产生 67.2 g/l L- 丙氨酸, 其体积生产强度达到 2.06 g/(l h), 显示出较好的生产潜力进一步对该菌株的开关控制发酵条件进行优化, 提高其 L- 丙氨酸生产性能, 以及将 p L -alad 基因整合于染色体上进行稳定表达的研究结果将在后续文章中报道参考文献 [1] Kern A, Tilley E, Hunter IS, et al. Engineering primary metabolic pathways of industrial micro-organisms[j]. Journal of Biotechnology, 2007, 129(1): 6-29 [2] Krärner R. Genetic and physiological approaches for the production of amino acids[j]. Journal of Biotechnology, 1996, 45(1): 1-21 [3] Mijts BN, Schmidt-Dannert C. Engineering of secondary metabolite pathways[j]. Current Opinion in Biotechnology, 2003, 14(6): [4] Jones BB, Chan H, Rothstein S, et al. RNA polymerase binding sites in λplac5 DNA[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of Sciences of the United States of America, 1977, 74(11): [5] Bunch PK, Mat-Jan F, Lee N, et al. The ldha gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli[j]. Microbiology, 1997, 143(1): [6] Zhou L, Niu DD, Tian KM, et al. Genetically switched D-lactate production in Escherichia coli[j]. Metabolic Engineering, 2012, 14(5): [7] Zhou L, Zuo ZR, Chen XZ, et al. Evaluation of genetic manipulation strategies on D-lactate production by Escherichia coli[j]. Current Microbiology, 2011, 62(3): [8] Love CA, Lilley PE, Dixon NE. Stable high-copy-number bacteriophage[lambda] promoter vectors for overproduction of proteins in Escherichia coli[j]. Gene, 1996, 176(1/2): [9] Elvin CM, Thompson PR, Argall ME, et al. Modified bacteriophage lambda promoter vectors for overproduction of proteins in Escherichia coli[j]. Gene, 1990, 87(1): [10] Ptashne M. A Genetic Switch: Phage λ and Higher Organisms[M]. Cambridge: Cell Press, 1992: 11 [11] Hols P, Kleerebezem M, Schanck AN, et al. Conversion of actococcus lactis from homolactic to homoalanine fermentation through metabolic engineering[j]. Nature Biotechnology, 1999, 17(6): [12] Lee M, Smith G, Eiteman M, et al. Aerobic production of alanine by Escherichia coli acef ldha mutants expressing the Bacillus sphaericus alad gene[j]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2004, 65(1): [13] Shibatani T, Kakimoto T, Chibata I. Stimulation of L-asparate beta-decarboxylase formation by L-glutamate in Pseudomonas dacunhae and improved production of L-alanine[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1979, 38(3): [14] Uhlenbusch I, Sahm H, Sprenger GA. Expression of an L-alanine dehydrogenase gene in Zymomonas mobilis and excretion of L-alanine[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1991, 57(5): [15] Smith GM, Lee SA, Reilly KC, et al. Fed-batch two-phase production of alanine by a metabolically engineered Escherichia coli[j]. Biotechnology Letters, 2006, 28(20): [16] Zhang XL, Jantama K, Moore JC, et al. Production of L-alanine by metabolically engineered Escherichia coli[j]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 77(2): [17] Datsenko KA, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products[j]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000, 97(12): [18] Yang Y, Qin Q, Guo WZ. Separation and quantitative analysis of amino acids derivatized with phenyl isothiocyanate by high performance liquid chromatography (HPLC)[J]. Chinese Journal of Chromatography, 1994, 12(4): (in Chinese) 杨扬, 秦强, 郭伟忠. 苯基异硫氰酸酯衍生氨基酸的高效液相色谱分析 [J]. 色谱, 1994, 12(4): [19] Kuroda S, Tanizawa K, Tanaka H, et al. Alanine dehydrogenases from two Bacillus species with distinct thermostabilities: molecular cloning, DNA and protein sequence determination, and structural comparison with other NAD(P) + -dependent dehydrogenases[j]. Biochemistry, 1990, 29(4): [20] Wild J, Hennig J, Lobocka M, et al. Identification of the dadx gene coding for the predominant isozyme of alanine racemase in Escherichia coli K12[J]. Molecular and General Genetics, 1985, 198(2):

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材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌