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1 第 22 卷第 6 期生命科学研究灾燥造援 22 晕燥援 6 圆园 18 年 12 月蕴蚤枣藻杂糟蚤藻灶糟藻砸藻泽藻葬则糟澡 Dec. 圆园 18 DOI: /j.cnki 多倍体鲫鲤原始生殖细胞的标记及其迁移研究李华金 1,2, 许文婷 1,2, 肖亚梅 1,2, 彭亮跃 1,2* (1. 省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室, 中国湖南长沙 ; 2. 湖南师范大学生命科学学院, 中国湖南长沙 ) 摘要 : 原始生殖细胞 (primordial germ cells, PGCs) 的起源和迁移已在多种鱼类进行了研究, 但多倍体鲫鲤原始生殖细胞的标记和迁移尚未见报道遥本实验室前期通过远缘杂交方法成功获得了一个倍性明确尧亲缘关系清晰的多倍体杂交鱼研究体系, 该体系由异源四倍体鲫鲤及其二倍体父母本和三倍体杂交后代组成遥本文利用 RNA 定点表达 (localized RNA expression, LRE) 技术, 将来自于斑马鱼的 nanos1-3'-utr 与 GFP 融合后生成的 mrna 注射入多倍体鱼受精卵中, 首次对多倍体鲫鲤原始生殖细胞进行标记, 并观察了其迁移途径遥结果显示, 多倍体鲫鲤 PGCs 能被斑马鱼 GFP-nanos1-3'-UTR 标记, 并且多倍体鲫鲤 PGCs 的迁移与斑马鱼类似遥本实验结果为多倍体鲫鲤原始生殖细胞的产生和迁移的研究提供了一些基础数据遥关键词 : 多倍体鱼 ; 原始生殖细胞 (PGCs); 迁移 ; 标记中图分类号 : Q955 文献标识码 : A 文章编号 : (2018) Visualization and Migration of Primordial Germ Cells in Polyploid Crucian Carp LI Hua-jin 1,2,XU Wen-ting 1,2,XIAO Ya-mei 1,2,PENG Liang-yue 1,2* (1. State Key Laboratory of Developmental Biology of Freshwater Fish, Hunan Normal University, Changsha , Hunan, China; 2. College of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha , Hunan, China) Abstract: The origin and migration of primordial germ cells (PGCs) have been studied in avariety of fish species, but the visualization and migration of PGCs in polyploid fish have not been reported. The unique fish lineages in our laboratory (including allotetraploid carp, red crucian carp and triploid crucian carp), which have clear genetic backgrounds, were used to label PGCs. In this paper, the mrna generated by fu 原 sion of nanos1-3 忆 -UTR and GFP from zebrafish was injected into the fertilized eggs of polyploid fish, and the PGCs of polyploid fish were labeled for the first time to observe their migration route to the genital ridge. The results showed that the zebrafish nanos1-3 忆 -UTR could label the PGCs of polyploid fish and their mi 原 gration was similar to those of zebrafish. These results provide some basic data for the study of the origin and migration of PGCs of polyploid fish. Key words: polyploid fish; primordial germ cells (PGCs); migration; visualization (Life Science Research,2018,22(6):454 耀 460) 原始生殖细胞 (primordial germ cells, PGCs) 是胚胎发育早期与体细胞分离且最早出现的生殖细胞, 随着胚胎的发育最终迁移至生殖嵴在性腺分化过程中, 其发育成卵原细胞或者精原细胞, 最终分化形成成熟的卵子或精子 [1] 目前,PGCs 的形成最少有两种模式 : 先成论和后成论 [2] 先成论收稿日期院 ; 修回日期院基金项目院湖南省教育厅科学研究优秀青年项目 (16B162); 湖南省科技计划重点研发计划资助项目 (2017SK2232); 长沙市科技计划项目 (kq ) 作者简介院李华金 (1994-), 女, 湖南浏阳人, 硕士研究生 ; 李华金和许文婷对本文的贡献相同, 为本文共同第一作者 ; * 通讯作者 : 彭亮跃 (1978-), 男, 湖南平江人, 博士, 讲师, 主要从事鱼类发育生物学研究,Tel: , ply@hunnu.edu.cn

2 第 6 期李华金等 : 多倍体鲫鲤原始生殖细胞的标记及其迁移研究 455 模式是指生殖细胞在胚胎发育的很早时期就能被鉴定出来, 其分化是由定位在生殖质中特异的 [3] 胞质决定子决定的果蝇线虫类无尾两栖动 [4] [5, 6] [7] 物斑马鱼以及文昌鱼 PGCs 的形成都属于这种模式后成论是指在胚胎发育的晚期才能鉴定出生殖细胞, 该观点认为生殖细胞是由体细胞 [8,9] 周围组织诱导分化而来羊膜动物鸡小鼠和 [10, 11] 两栖纲有尾类动物墨西哥蝾螈等 PGCs 的形成均为后成论模式早期对于鱼类 PGCs 的起源, 研究人员的意见各不相同, 但主要观点有两种 : 一种认为起源于中胚层, 另一种认为起源于内胚层直到 1997 [6] 年,Yoon 等从斑马鱼中分离出了 vasa 基因, 鱼类 PGCs 的起源才真正得到了揭示在斑马鱼中, 母源的 vasa 基因转录产物集中在卵裂早期的卵裂沟中, 在 32 细胞期时被分配到 4 个细胞当中, 这 4 个细胞也就是原原始生殖细胞 ; 在囊胚晚期, vasa 阳性的细胞数增加至 12~16 个, 对称分布, 呈 4 簇, 这些细胞将分化成 PGCs [6] 随后, 人们在 [12] [13] [14] 冰鰕虎鱼金鱼和泥鳅中陆续发现了相似的 PGCs 形成模式, 表明先成论很可能是硬骨鱼类 PGCs 形成的一种普遍模式然而青鳉 PGCs 的形成并不属于这种模式虽然人们在青鳉早期卵裂过程中也发现了生殖质颗粒的成分, 但其 vasa RNA 在早期胚胎中的分布与斑马鱼极不相同, 青鳉 vasa RNA 广泛地分布在卵裂期胚胎的许多细 [15] 胞, 直到原肠晚期 vasa 信号才定位于 PGCs 中 [16] 目前研究的鱼类中, 大西洋鳕鱼鲟鱼大西洋鲑大菱鲆鲤鱼金鱼泥鳅与斑马鱼的 PGCs 形成模式相似, 而虹鳟鱼真鲷与青鳉的 PGCs 形成模式相似目前, 已有多种鱼类生殖细胞标记基因被研究人员利用原位杂交或免疫组化的方法成功地鉴 [17] 定出来 Xu 等利用双色荧光原位杂交的方法, 同时用两种生殖细胞特异基因来标记青鳉的 PGCs 但是这种方法标记的 PGCs 不是活体的, 不能进行分离移植等活体操作, 而转基因技术则可以实现 PGCs 的活体示踪, 为鱼类生殖细胞的研 [18] 究提供了极大的便利 Yoshizaki 等利用绿色荧光蛋白 (GFP) 及其衍生物实现了多种细胞的体内活体标记另一种标记活体 PGCs 的技术称为 : RNA 定点表达 (localized RNA expression, LRE) 技术该技术是将 GFP 融合生殖系特异基因 vasa nanos1 等的 3 忆非翻译区 (3 忆 -UTR) 并人工合成 mr- NA, 然后注射到早期受精卵中, 使 GFP 在胚胎的 [19] PGCs 中特异表达相比于转基因技术,LRE 技术更为简便, 而且周期短用途广该技术的发展大大地推进了鱼类生殖细胞生物学及繁育技术的发展此外, 这种方法也可以用来研究不同物种间 3 忆 -UTR 的保守性及组织特异性的调控研究报道, 将来自于斑马鱼的 nanos1-3 忆 -UTR ( 即 nanos3-3 忆 -UTR) 与 GFP 融合生成的 RNA 注射入鳗鲡受精卵中, 可以将鳗鲡 PGCs 标记出来, 而且将标记的鳗鲡 PGCs 移植入斑马鱼胚胎后, 鳗鲡 PGCs 能够 [20] 同斑马鱼 PGCs 一样向生殖嵴的方向迁移本实验室前期以二倍体鲫鱼和鲤鱼为亲本, 通过远缘杂交方法成功获得了异源四倍体鲫鲤 (allotetraploid carp, 4nAT), 并进一步以异源四倍体鲫鲤为父本二倍体鲫鱼为母本, 通过杂交成功研制出三倍体湘云鲫 (triploid crucian carp) 湘云鲫具有不育生长速度快抗病能力和抗逆性强等多种优良性状, 在全国得到大规模推广养殖, 产 [21~23] 生了良好的社会效应和经济效益更为重要的是, 异源四倍体鲫鲤与其二倍体父 / 母本和三倍体杂交后代组成了一个倍性明确亲缘关系清晰的多倍体杂交鱼研究体系, 为开展鱼类发育生物学及基因功能研究探讨自然界鱼类种间杂交起源与进化提供了重要的研究平台本文利用实验室特有的实验鱼品系, 首次对多倍体鱼原始生殖细胞进行标记, 并观察了其迁移途径, 旨在为多倍体鱼原始生殖细胞的产生和迁移的研究提供一些基础数据 1 材料和方法 1.1 实验材料本文取材的二倍体红鲫三倍体湘云鲫及异源四倍体鲫鲤, 均来自湖南师范大学省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室养殖基地实验鱼养殖条件均为池塘养殖投喂人工饲料 1.2 质粒提取本文所用 EGFP-zfnanos1-3 忆 -UTR 质粒由上海海洋大学水产与生命学院李名友研究员惠赠质粒图谱如图 1 所示质粒提取按试剂盒 AXYGEN axyprep plas 原 mid miniprep kit 250-prep (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA) 步骤操作 : 取 3~5 ml 菌液, 室温下 r/min 离心 1min, 吸去上清后加 250 滋 L solution I/RNase A 重悬菌落, 混匀加入 250 滋 L

3 456 生命科学研究圆园 18 年 solution 域, 倒置轻混匀, 孵育 2min 加入 250 滋 L solution 芋, 立即倒置混匀, 直到生成白色絮状沉淀随后, 室温下 r/min 离心 10 min 将上清液小心转入 HiBind miniprep column ( 有套管 ), 室温下 10000r/min 离心 1min 弃废液, 加入 500 滋 L bufferhb, 室温下 10000r/min 离心 1min 弃废液, 空管在室温下 r/min 离心 2min 将柱子转入新 EP 管, 加入 30~50 滋 Lelution buffer 或 3dH 2 O 到膜上, 室温孵育 1~2min 后在室温下 r/min 离心 1min 最后, 将得到的质粒保存在 -20 益备用 1.3 体外转录先将 EGFP-zfnanos1-3 忆 -UTR 质粒酶切进行线性化处理, 然后用 Sp6 启动子体外转录试剂盒 (Thermo Fisher Scientific, USA) 进行体外转录反应体系如下 : 线性化质粒 DNA 1 滋 g, 2 伊 sp6 NTP cap 10 滋 L, enzyme 2 滋 L, RNA-free water 加至 18 滋 L, 10 伊 reaction buffer 2 滋 L 按照以上体系加好样品, 涡旋混匀,37 益水浴反应 4h; 加入 30 滋 LRNAfree DEPC water 混匀, 再加入 30 滋 LLiCl 混匀, -20 益下反应过夜 ; 反应完成后将样品 g 4 益离心 15min, 弃上清液, 加 75% 乙醇洗涤, g 4 益离心 15 min, 弃上清 ; 重复洗涤一次 ( 注 :75% 乙醇需用 RNA-free water 配制 ), 最后将装有沉淀的 EP 管置于超净工作台上, 室温晾 5min; 待乙醇挥发完全, 加入 30 滋 LRNA-free DEPC water 溶解沉淀, 取 1 滋 L 用分光光度计检测浓度, 剩余的置于 -80 益下保存待用 1.4 显微注射首先, 将人工授精得到的受精卵均匀地铺在加入清水的玻璃皿上 ( 密度不宜太大 ) 待胚胎黏附在玻璃皿上, 加入 0.25% 的胰蛋白酶液消化 3min, 而后洗去胰酶, 将胚胎置于含有 Holtfreter 工作液 ( 每升含 3.5 gnacl 0.05 gkcl gnahco 3 ) 的 1.5% 琼脂培养皿中其次, 将要注射的质粒或 mrna 用 DEPC 水稀释到 80 ng/ 滋 L, 置于冰上备用然后, 吸取 10 滋 L 质粒或 mrna 加入显微注射针 (Kwik-Fil TW100-4), 注意不要产生气泡在显微镜下用镊子轻轻将针尖夹断, 使针尖大小适宜最后, 在显微注射仪 (OLYMPUS SZX12) 下将其注入裸卵胚盘内, 整个注射过程在受精卵第一次卵裂开始前完成 1.5 荧光观察将显微注射后的胚胎置于清水中培养 (25 依 1 益 ), 受精后每隔 2h 在荧光显微镜下观察并拍照所用荧光显微镜型号为 MZ16F (Leica Microsystems, Inc., USA) 1.6 杂交鱼的人工繁殖与胚胎培育分别向雌雄亲鱼注射催产素当亲鱼开始追尾产卵后, 分别挤出精子和卵子, 混匀后用羽毛轻铺在盛水的培养皿上, 待受精卵黏附在培养皿上后换曝气水胚胎每天换水, 且需要挑去已死的胚胎 36 h 左右胚胎孵化出苗, 将鱼苗吸出单独饲养,2~3 d 仔鱼卵黄囊消失, 可以游动摄食, 此时可投喂草履虫, 三周龄幼鱼可投喂丰年虫 2 结果 2.1 二倍体红鲫原始生殖细胞的标记和迁移为了研究二倍体红鲫胚胎中 PGCs 迁移的正常途径, 我们将 GFP-zfnanos1-3 忆 -UTR mrna (100 ng/ 滋 L) 注射到 1~2 个细胞阶段的卵中, 实验重 (539) Eag 玉 (483) BsmB 玉 (443) Sty 玉 (422) Stu 玉 (305) Sac 域 (225) BstE 域 (207) Rsr 域 (147) BsiW 玉 (142) Sma 玉 (140) TspM 玉 -Xma 玉 (133) PflF 玉 -Tth111 玉 (85) EcoR 玉 (79) BamH 玉 (28) Hind 芋 SP6 promoter PuroR SexA 玉 * (658) BstAP 玉 (662) Bst 欲 (693) PaeR7 玉 -Psp 欲 -Tli 玉 -Xho 玉 (1 414) BfuA 玉 -BspM 玉 (1 455) BfrB 玉 -Sph 玉 (1 538) Nsi 玉 (1 540) Swa 玉 (1 882) Xba 玉 (2 022) Acc65 玉 (2 031) Kpn 玉 (2 035) Pvu 域 (2 253) BspQ 玉 -Sap 玉 (2 313) Afl 芋 -Pci 玉 (2 429) AlwN 玉 (2 845) Ahd 玉 (3 322) Xmn 玉 (3 921) Psi 玉 (4 336) BsaA 玉 (4 464) NgoM 郁 (4 565) Nae 玉 (4 567) 忆 UTR ori f1 ori EGFP AmpR T3 promoter lac promoter AmpR promoter Nde 玉 (5 319) EGFP-zfnanos1-3 忆 -UTR 5753 bp 图 1 Fig.1 EGFP-zfnanos1-3 忆 -UTR 质粒图谱 The plasmid map of EGFP-zfnanos1-3 忆 -UTR

4 第 6 期李华金等 : 多倍体鲫鲤原始生殖细胞的标记及其迁移研究 457 复 3 次总共有 382 个卵子注射了 mrna, 受精后 24 h 进行检测, 结果显示 :306 个胚胎正常发育, 其中 158 个 (51.6%) 含有显示出强 GFP 表达的细胞 ( 表 1) 图 2 显示, 红鲫胚胎发育到囊胚早期就可以观察到整个动物极细胞都强烈表达绿色荧光 ( 图 2A, F), 但是在动物极和卵裂腔处没有观察到 PGCs 细胞随着胚胎发育, 进入原肠晚期后, 可以观察到胚胎一侧细胞中的 GFP 表达被上调, 而其他体细胞的发育过程中背景 GFP 表达显著降低 ( 图 2B, G) 在体节阶段, 可明显观察到高表达 GFP 的细胞, 这些胚胎中 GFP 阳性细胞的平均数量为 6~8 个, 但我们也观察到存在 9~12 个的情况 ( 图 2N~Q) 几乎所有这些细胞都位于从头部到卵黄塞附近的背轴的侧面, 有时在头部躯干或腹部区域也可观察到少量 PGCs ( 图 2C, H, K) 在心跳期间,PGCs 继续迁移, 定位在躯干侧面的相似区域周围, 在此期间, 一些 PGCs 聚集成簇 ( 图 2D, I, L) 之后, 这些细胞继续向生殖嵴迁移在出膜期,PGCs 定位于新形成的消化道的腹侧 ( 图 2E, J, M) 2.2 三倍体湘云鲫原始生殖细胞的标记和迁移为了研究三倍体湘云鲫胚胎中 PGCs 迁移的正常途径, 我们将 GFP-zfnanos1-3 忆 -UTR mrna (100 ng/ 滋 L) 注射到 1~2 个细胞阶段的卵中, 实验重复两次总共有 192 个卵子注射了 mrna, 受精后 24 h 进行检测, 结果显示 :147 个胚胎正常发育, 其中 67 个 (45.6%) 含有显示出强 GFP 表达的细胞 ( 表 1) 与二倍体红鲫胚胎 PGCs 细胞类似, 图 2 二倍体红鲫原始生殖细胞的标记和迁移 A: 囊胚期 ;B: 原肠期 ;C: 体节期 ;D: 心跳期 ;E: 出膜期 ;F-J: 分别对应 A~E 的荧光图 ;K~M: 分别对应 H~J 中白框的放大图 ;N: 体节期 ;O: 图 N 中白框放大图 ;P: 体节期 ;Q: 图 P 中白框放大图遥 Fig.2 Localization and migration of PGCs in embryos of red crucian carp during embryonic development A: Blastula stage; B: Gastrul stage; C: Somite stage; D: Heartbeat stage; E: High-pec stage; F~J: Fluorescent views of A~E, re 鄄 spectively; K~M: Higher magnification of the areas indicated by the boxes in H~J, respectively; N: Somite stage; O: Higher magnification of the area indicated by the box in N; P: Somite stage; Q: Higher magnification of the area indicated by the box in P. 表 1 显微注射 GFP-zfnanos1-3 忆 -UTR mrna 24 h 后原始生殖细胞被标记上绿色荧光的胚胎数 Table 1 Number of embryos with GFP-labeled PGCs at 24 hours post fertilization after GFP-zfnanos1-3 忆 -UTR mrna injection Fish Diploid crucian carp Triploid crucian carp Tetraploid crucian carp Experiment No Total 1 2 Total 1 2 Total Embryo number (injection/control) 168/ /248 89/ / /276 56/ / /234 76/ /442 Normal number of embryos after injection (percentage) 132 (78.6%) 102 (81.6%) 72 (80.9%) 306 (80.1%) 102 (75%) 45 (80.4%) 147 (76.6%) 104 (66.7%) 46 (60.5%) 150 (64.7%) Normal number of embryos of control (percentage) 338 (96.6%) 223 (89.9%) 154 (87.5%) 715 (92.4%) 256 (92.8%) 121 (90.3%) 377 (92%) 180 (76.9%) 175 (84.1%) 355 (80.3%) Positive EGFP (percentage) 72 (54.5%) 49 (48%) 37 (51.4%) 158 (51.6%) 47 (46.1%) 20 (44.4%) 67 (45.6%) 46 (44.2%) 20 (43.5%) 66 (44%)

458 生命科学研究圆园 18 年我们在囊胚早期就可以观察到整个动物极细胞都强烈表达绿色荧光 ( 图 3A, F), 然后 GFP 表达强度会偏向一侧 ( 图 3B, G) 随着胚胎发育, 三倍体湘云鲫胚胎中 PGCs 细胞的迁移也与二倍体红鲫中的迁移情况类似在体节阶段, 可明显观察到高表达 GFP 的细胞, 这些胚胎中 GFP 阳性细胞的平均数量为 6~8 个, 但我们观察到 GFP

3 四倍体鲫鲤原始生殖细胞的标记和迁移为了研究四倍体鲫鲤胚胎中 PGCs 迁移的正常途径, 我们将 GFP-zfnanos1-3 忆 -UTR mrna (100 ng/ 滋 L) 注射到 1~2 个细胞阶段的卵中, 实验重复两次总共有 232 个卵子注射了 mrna, 受精后 24 h 进行检测, 结果显示 :150 个胚胎正常发育, 其中 66 个 (44%) 含有显示出强 GFP

5 458 生命科学研究圆园 18 年我们在囊胚早期就可以观察到整个动物极细胞都强烈表达绿色荧光 ( 图 3A, F), 然后 GFP 表达强度会偏向一侧 ( 图 3B, G) 随着胚胎发育, 三倍体湘云鲫胚胎中 PGCs 细胞的迁移也与二倍体红鲫中的迁移情况类似在体节阶段, 可明显观察到高表达 GFP 的细胞, 这些胚胎中 GFP 阳性细胞的平均数量为 6~8 个, 但我们观察到 GFP 阳性细胞仅位于体内的一侧, 表明这些胚胎中 mrna 的分布不均匀 ( 图 3H, K) 在心跳期间,PGCs 继续迁移, 在此期间, 一些 PGCs 也会聚集成簇 ( 图 3I, L) 之后, 这些细胞继续向生殖嵴迁移在出膜期,PGCs 定位于新形成的消化道的腹侧 ( 图 3E, J, M) 2.3 四倍体鲫鲤原始生殖细胞的标记和迁移为了研究四倍体鲫鲤胚胎中 PGCs 迁移的正常途径, 我们将 GFP-zfnanos1-3 忆 -UTR mrna (100 ng/ 滋 L) 注射到 1~2 个细胞阶段的卵中, 实验重复两次总共有 232 个卵子注射了 mrna, 受精后 24 h 进行检测, 结果显示 :150 个胚胎正常发育, 其中 66 个 (44%) 含有显示出强 GFP 表达的细胞 ( 表 1) 同样与二倍体红鲫胚胎 PGCs 细胞类似, 我们在囊胚早期就可以观察到整个动物极细胞都强烈表达绿色荧光 ( 图 4A, F), 然后 GFP 表达强度也会偏向一侧 ( 图 4B, G) 随着胚胎发育, 四倍体鲫鲤胚胎中 PGCs 细胞的迁移也与二倍体红鲫中的迁移情况类似在体节阶段, 可明显观察到高表达 GFP 的细胞, 这些胚胎中 GFP 阳性细胞的平均数量为 6~8 个 ( 图 4H, K) 在心跳期间, PGCs 继续迁移, 在此期间, 一些 PGCs 也会聚集成簇, 但是与二倍体红鲫胚胎相比, 可明显观察到 PGCs 细胞数量较少 ( 图 4I, L) 之后, 这些细胞继续向生殖嵴迁移在出膜期,PGCs 定位于新形成的消化道的腹侧 ( 图 4E, J, M) 图 3 三倍体湘云鲫原始生殖细胞的标记和迁移 A: 囊胚期 ;B: 原肠期 ;C: 体节期 ;D: 心跳期 ;E: 出膜期 ;F~J: 分别对应 A~E 的荧光图 ;K~M: 分别对应 H~J 中白框的放大图遥 Fig.3 Localization and migration of PGCs in embryos of triploid crucian carp during embryonic development A: Blastula stage; B: Gastrul stage; C: Somite stage; D: Heartbeat stage; E: High-pec stage; F~J: Fluorescent views of A~E, re 鄄 spectively; K~M: Higher magnification of the areas indicated by the boxes in H~J, respectively. 图 4 异源四倍体鲫鲤原始生殖细胞的标记和迁移 A: 囊胚期 ;B: 原肠期 ;C: 体节期 ;D: 心跳期 ;E: 出膜期 ;F~J: 分别对应 A~E 的荧光图 ;K~M: 分别对应 H~J 中白框的放大图遥 Fig.4 Localization and migration of PGCs in embryos of allotetraploid carp hybrids during embryonic development A: Blastula stage; B: Gastrul stage; C: Somite stage; D: Heartbeat stage; E: High-pec stage; F~J: Fluorescent views of A~E, re 鄄 spectively; K~M: Higher magnification of the areas indicated by the boxes in H~J, respectively.

6 第 6 期李华金等 : 多倍体鲫鲤原始生殖细胞的标记及其迁移研究讨论鱼类配子的发生是从原原始生殖细胞 (ppgcs) 开始的, 进而分化形成原始生殖细胞 (PGCs), 随后 PGCs 迁移穿过各种胚胎组织到达正在形成中的原始生殖腺, 继续发育形成生殖干细胞 ( 卵原细胞或精原细胞 ) 本文利用 RNA 定点表达技术, 建立了多倍体鲫鲤 PGCs 快速标记方法, 通过在受精卵胚胎发育早期显微注射斑马鱼 GFP-nanos1-3 忆 - UTR mrna, 实现了多倍体鲫鲤 PGCs 的活体标记和追踪原始生殖细胞具有明显的组织学特征, 与体细胞相比一般个体较大, 细胞核大而圆, 细胞质 [24, 25] 较少, 同时细胞质内还含有生殖质颗粒在胚胎发育早期, 生殖质被不对称分配到一些细胞中, 这些细胞最终会发育形成原始生殖细胞生殖质颗粒成分的聚合需要肌动蛋白和微管蛋白网络来 [26] 共同完成在硬骨鱼中, 人们可以通过原位杂交或免疫组化的方法检测到 PGCs, 但这些方法观察的对象是固定后的死材料 RNA 定点表达技术的应用, 使研究者能在活体中观察 PGCs 的动态情况目前, 已有多个报道通过注射斑马鱼 GFPnanos1-3 忆 -UTR 成功标记了胚胎中的 PGCs, 说明 [16,20,27~29] 这种机制在硬骨鱼类中可能是高度保守的本文结果显示, 与其他鱼类相比, 多倍体鱼中 PGCs 的标记效率相对较低, 其中四倍体鲫鲤的荧光标记胚胎比例为 44%, 三倍体湘云鲫的荧光标记胚胎比例为 45.6% 此外, 我们观察到大量只标记到一侧 PGCs 的现象 ( 图 3H, 图 4H), 这种现象在青鳉中也有发现, 推测可能是因为显微注射时胚胎发育已经到了二细胞时期, 但是具体的原因还需更进一步的研究 PGCs 形成于生殖嵴外, 需要经过一系列的迁移才能到达生殖嵴目前, 科研人员通过 vasa 基因原位杂交揭示了数种鱼 PGCs 的迁移模式, 其中最为典型的是模式生物斑马鱼和青鳉斑马鱼胚胎最初的 4 个 PGCs 会依次经过 6 个步骤的 [30] 迁移, 最终到达性腺组织青鳉 PGCs 的迁移主 [31] 要有 3 个阶段不同鱼类 PGCs 迁移的途径和机 [20] 制具有保守性但也有一些不同之处, 主要集中有以下区别 : 体节形成前 PGCs 的位置 ; 体节形成早期 PGCs 的位置 ; 体节形成中期 PGCs 迁移的方向 ;PGCs 最终在胚体上的位置与斑马鱼相比, 裸身鰕虎鱼的 PGCs 也会增殖分化为 8 个细胞, 但在随后的迁移过程中并不形成 PGCs 簇, 而是在体节发生早期分散排列在胚体两侧, 到体节晚 [32] 期时,PGCs 渐渐聚合到体轴下部大菱鲆 PGCs 的迁移模式与斑马鱼相似,50% 外包期,PGCs 分布在胚环中, 到体节时期分两列排在躯干下方, [33] 最终在生殖嵴部位聚集成两簇在原肠时期, 池沼公鱼的 PGCs 随着体细胞迁移至胚体的两侧, 随着细胞分裂,PGCs 分布到了背部肠系膜处, 并 [34] 且通过背部肠系膜细胞在性腺区域聚集本文实验结果显示, 多倍体鱼 PGCs 的起源和迁移与斑马鱼类似囊胚早期就可以观察到整个动物极细胞都强烈表达绿色荧光, 可是在胚环中没有观察到明显的 PGCs 在体节期可明显观察到高表达 GFP 的细胞, 这些胚胎中 GFP 阳性细胞的平均数量为 6~8 个在随后的迁移中, 一些 PGCs 会聚集成簇之后, 这些细胞继续向生殖嵴迁移, 在出膜期,PGCs 定位于新形成的消化道的腹侧本文实验结果表明, 与二倍体红鲫相比, 三倍体湘云鲫和四倍体鲫鲤的 PGCs 细胞数量明显偏少我们在生产实际中观察到, 四倍体鲫鲤的繁殖能力比二倍体红鲫的繁殖能力有所下降, 而三倍体湘云鲫是不育的, 这是否与其原始生殖细胞的数量或迁移出现异常相关? 多倍体鲫鲤育性与 PGCs 的相关性是一个值得研究的方向参考文献 (References): [1] Okutsu T, YanoA, Nagasawa K, et al. Manipulation of fish germ cell: visualization, cryopreservation and transplantation[j]. Journal of Reproduction &Development, 2006, 52(6): [2] Saffman EE, Lasko P. Germline development in vertebrates and invertebrates[j]. Cellular &Molecular Life Sciences, 1999, 55(8-9): [3] Santos AC, Lehmann R. Germ cell specification and migration in Drosophila and beyond[j]. Current Biology, 2004, 14(14): [4] Ikenishi K. Germ plasm in Caenorhabditis elegans, Drosophila and Xenopus[J]. Development, Growth anddifference, 1998, 40 (1): [5] Olsen LC, Aasland R, Fjose A. Avasa-like gene in zebrafish identifies putative primordial germ cells[j]. Mechanisms of De 原 velopment, 1997, 66(1-2): [6] Yoon C, Kawakami K, Hopkins N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryosandisexpressedintheprimordialgermcells[j].development, 1997, 124(16): [7] Wu HR, Chen YT, Su YH, et al. Asymmetric localization of germlinemarkers Vasa and Nanos duringearly development in the amphioxus Branchiostoma floridae [J]. Developmental Biol 原 ogy, 2011, 353(1):

7 460 生命科学研究圆园 18 年 [8] Stebler J, Spieler D, Slanchev K, et al. Primordial germ cell migration in the chick and mouse embryo: the role of the chemokinesdf-1/cxcl12[j].developmentalbiology,2004,272 (2): [9] Saga Y. Mouse germ cell development during embryogenesis[j]. Current Opinion in Genetics &Development, 2008, 18(4): [10] Johnson AD, Bachvarova RF, Drum M, et al. Expression of axolotl DAZL RNA, amarker of germ plasm: widespread ma 原 ternal RNA and onset of expression in germ cells approaching the gonad[j]. Developmental Biology, 2001, 234(2): [11] Johnson AD, Drum M, Bachvarova RF, et al. Evolution of predetermined germ cells in vertebrate embryos: implications for macroevolution[j]. Evolution &Devlopment, 2003, 5(4): [12] Saito T, Otani S, Nagai T, et al. Germ cell lineage from asin 原 gle blastomere at 8-cell stage in shiro-uo (ice goby)[j]. Zoologi 原 cal Science, 2002, 19(9): [13] Otani S, Maegawa S, Inoue K, et al. The germ cell lineage i 原 dentified by vas-mrna during the embryogenesis in goldfish[j]. Zoological Science, 2002, 19(5): [14] Fujimoto T, Kataoka T, Sakao S, et al. Developmental stages and germ cell lineage of the loach (Misgurnus anguillicaudatus)[j]. Zoological Science, 2006, 23(11): [15] ShinomiyaA, Tanaka M, KobayashiT, et al. The vasa-like gene, olvas, identifies the migration path of primordial germ cells during embryonic body formation stage in the medaka, O 原 ryzias latipes[j]. Development Growth &Differentiation, 2000, 42(4): [16] Saito T, P 觢 eni姚糟 ka M, Goto R, et al. The origin and migration of primordial germ cells in sturgeons[j]. PLoS One, 2014, 9(2): e [17] Xu H, Li Z, Li M, et al. Boule is present in fish and bisexually expressed in adult and embryonic germ cells of medaka[j]. PLoS One, 2009, 4(6): e6097. [18] Yoshizaki G, Takeuchi Y, Sakatani S, et al. Germ cell-specific expression of green fluorescent protein in transgenic rainbow trout under control of the rainbow trout vasa-like gene promot 原 er[j]. International Journal of Developmental Biology, 2000, 44 (3): [19] Knaut H, Steinbeisser H, Schwarz H, et al. An evolutionary conserved region in the vasa 3 忆 UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish[j]. Current Biology, 2002, 12(6): [20] Saito T, Goto-Kazeto R, Kawakami Y, et al. The mechanism forprimordialgerm-cellmigrationisconservedbetweenjapanese eel and zebrafish[j]. PLoS One, 2011, 6(9): e [21] 刘筠, 刘少军, 孙远东, 等. 多倍体鲫鲤 [J]. 中国农业科技导报 (Liu Yun, Liu Shao-jun, Sun Yuan-dong, et al. Ployploid hy 原 brids of crucian carp 伊 common carp[j]. Review of China Agri 原 cultural Science and Technology), 2003, 5(6): 3-6. [22] 刘少军, 胡芳, 周工建, 等. 三倍体湘云鲫繁殖季节的性腺结构观察 [J]. 水生生物学报 (Liu Shao-jun, Hu Fang, Zhou Gongjian, et al. Gonadal structure of triploid crucian carp produced bycrossing allotetraploid hybridsof Carassiumauratus red var. ( 意 ) 伊 Cyprinus carpio ( )with Japanese crucian carp (Caras 原 sius auratus Cavieri T. et S)[J]. Acta Hydrobiologica Sinica), 2000, 24(4): [23] 陈松, 王静, 刘少军, 等. 改良三倍体鲫鱼的生物学特性研究 [J]. 中国科学 C 辑 : 生命科学 (Chen Song, Wang Jing, Liu Shao-jun, et al. Study on biological characteristics of improved triploid crucian carp[j]. Science in China Series C: Life Sciences), 2009, 39(5): [24] Braat AK, Zandbergen T, Van De Water S, et al. Characteri 原 zation of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distributionof vasa RNA[J].Developmental Dynamics,1999, 216 (2): [25] Yamaha E, Goto-Kazeto R, Saito T, et al. Primordial germ cell in teleost fish with special references to its specification and migration[j]. Journal of Applied Ichthyology, 2010, 26(5): [26] Eno C, Pelegri F. Modulation of F-actin dynamics by maternal Mid1ip1L controls germ plasm aggregation and furrow recruitment in the zebrafish embryo[j]. Development, 2018, 145(10): dev [27] Li M, Tan X, Sui Y, et al. Conserved elements in the nanos3 3 忆 UTR of olive flounder are responsible for the selective re 原 tention of RNA in germ cells[j]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry &Molecular Biology, 2016, 198: [28] Saito T, Fujimoto T, Maegawa S, et al. Visualization of primor 原 dial germ cells in vivo using GFP-nos1 3 忆 UTR mrna[j]. InternationalJournalofDevelopmentalBiology,2006,50(8): [29] Saito T, Goto-Kazeto R, Fujimoto T, et al. Inter-species trans 原 plantation and migration of primordial germ cells in cyprinid fish[j]. International Journal of Developmental Biology, 2010, 54 (10): [30] Weidinger G, Wolke U, K 觟 prunner M, et al. Identification of tissues and patterning events required for distinct steps in early migration of zebrafish primordial germ cells[j]. Develop 原 ment, 1999, 126(23): [31] Kurokawa H, Aoki Y, Nakamura S, et al. Time-lapse analysis reveals different modes of primordial germ cell migration in the medaka Oryzias latipes[j]. Development Growth &Differen 原 tiation, 2006, 48(3): [32] Saito T, Otani S, Fujimoto T, et al. The germ line lineage in ukigori, Gymnogobius species (Teleostei: Gobiidae) during em 原 bryonic development[j]. The International Journal of Develop 原 mental Biology, 2004, 48(10): [33] Lin F, Xu S, Ma D, et al. Germ line specific expression of avasa homologue gene in turbot (Scophthalmus maximus): evidence for vasa localization at cleavage furrows in euteleostei[j]. Molecu 原 lar Reproduction &Development, 2012, 79(11): [34] Takahashi E, Shimizu Y, Urushibata H, et al. Migration be 原 havior of PGCs and asymmetrical gonad formation in pond smelt Hypomesus nipponensis[j]. International Journal of De 原 velopmental Biology, 2017, 61(6-7):

人工催产干法授精孵化胚胎发育观察

人工催产干法授精孵化胚胎发育观察金万昆俞丽杨建新张慈军高永平赵宜双王春英人工催产干法授精孵化胚胎发育观察胚盘隆起细胞期细胞期细胞期细胞期细胞期多细胞期囊胚早期囊胚中期囊胚晚期原肠早期原肠中期原肠晚期神经胚期胚孔封闭期眼泡出现期尾芽期晶体出现期肌肉效应期心脏搏动期孵出期日龄仔鱼日龄仔鱼日龄仔鱼日龄仔鱼感谢中国水产科学院黑龙江水产研究所沈俊宝研究员的悉心指导