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1 2017 年 9 月 Vol.35 No.9 September 2017 Chinese Journal of Chromatography 987 ~ 994 研究论文 DOI: / SP.J 高效液相色谱光电二极管阵列高分辨质谱联用鉴定马鞭草提取物中的化学成分孙玉明 1, 王月月 1, 蔡蕊 1, 张华 1 2, 王玉林 (1. 大连理工大学化工学院, 辽宁大连 ; 2. 大连医科大学基础医学院, 辽宁大连 ) 摘要 : 采用高效液相色谱光电二极管阵列高分辨质谱联用 ( HPLC PDA HRMS) 技术对马鞭草中的主要化学成分进行分析和鉴定通过综合分析所检测到化合物的色谱一级和多级全扫描质谱数据, 对马鞭草提取物中的化学成分进行分析鉴定马鞭草提取物中检测到环烯醚萜苷类黄酮类三萜类苯乙醇苷类和二萜酚类化合物等共 21 种化学成分, 其中鼠尾草酸鼠尾草酚迷迭香酚异迷迭香酚迷迭香酸以及金合欢素 7 O 芸香糖苷 6 种化合物并未在其他有关马鞭草提取物鉴定的文献中出现该方法简单快速, 准确度高, 为鉴定中药材真伪和品质提供了可靠的科学依据关键词 : 高效液相色谱 ; 光电二极管阵列检测 ; 高分辨质谱 ; 质谱裂解 ; 结构鉴定 ; 马鞭草 ; 提取物中图分类号 :O658 文献标识码 :A 文章编号 : (2017) Identification of the chemical compositionsof Verbena officinalis L. extract by high performance liquid chromatography photodiode array high resolution mass spectrometry SUN Yuming 1, WANG Yueyue 1, CAI Rui 1, ZHANG Hua 1, WANG Yulin 2 (1. School of Chemical Engineering, Dalian University of Technology, Dalian , China; 2. Basic Medical College, Dalian Medical University, Dalian , China) Abstract: To investigate the main chemical compositions of Verbena officinals L. extract, a qualitative high performance liquid chromatography photodiode array high resolution mass spec trometry ( HPLC PDA HRMS) method was established. The structures of the compounds detec ted were identified by analyzing the chromatographic profiles and the corresponding mass spec tra obtained by full scan and MS n full scan. Twenty one compounds including iridoid glycosides, flavonoids, triterpenoids, phenylpropanoids and phenolic diterpenoids were identified, and six of them were not reported in other literatures about Verbena officinalis L. extract, such as carnosic acid, carnosol, rosmanol, isorosmanol, rosmarinic acid and acacetin 7 O rutinoside. This method is simple, rapid, accurate and sensitive. It provides a reliable scientific basis for the identification of the authenticity and quality control of Chinese medicinal materials. Key words: high performance liquid chromatography ( HPLC); photodiode array detection; high resolution mass spectrometry ( HRMS ); mass fragmentation; structure identification; Verbena officinalis L.; extract 马鞭草 (Verbena officinalis L.) 为马鞭草科植物马鞭草的干燥地上部分, 马鞭草以全草入药, 始载于名医别录, 具有活血化瘀清热解毒截疟利水消肿的作用 [1] [2-4] 研究表明, 马鞭草还具有抗肿瘤抗炎镇痛保护神经抗真菌抗氧化和抗早孕等作用由于马鞭草中的活性成分具有临床治疗意义, 其提取物中的化学成分得到了深入的研究 [1,4-9] 收稿日期 : 通讯联系人.E mail:wangyulin1971@ 126.com.

2 988 色谱第 35 卷 [1,5,6,9] 文献中多采用传统方法将大量药材进行提取分离得到纯品, 再对化合物进行光谱鉴定据报道 [5-10], 马鞭草提取物含有环烯醚萜苷黄酮类苯乙醇苷类三萜类及挥发油类化合物, 其中环烯醚萜苷是马鞭草的特征性成分, 也是有效成分之一近年来,HPLC MS 技术因其高效的分离能力和较强的鉴别能力而被广泛应用于中药化学组分的鉴别中 [11-13] 本文旨在采用高效液相色谱光电二极管阵列高分辨质谱联用 ( HPLC PDA HRMS) 技术对马鞭草中的化学成分进行分离检测, 通过综合分析色谱及一级和多级全扫描质谱数据对各化学成分进行结构验证, 为进一步分离马鞭草中的活性成分提供前期依据, 为中药材鉴定真伪和品质提供可靠的科学依据 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 LTQ Orbitrap XL 配 Thermo Xcalibur 2 1 数据处理系统 Accela 液相色谱系统 ( 包括 Accela 1250 四元梯度泵 Accela AS 自动进样器 Accela PDA 检测器 ) Hypersil Gold C 18 柱 (150 mm 2 1 mm, 5 μm)( 美国赛默飞世尔公司 ); BS124S 万分之一电子天平 ( 德国赛多利斯科学仪器有限公司 ); KQ 200DB 数控超声波清洗器 ( 昆山市超声仪器有限公司 ); Milli Q 超纯水机 ( 美国 Millipore 公司 ); RE 52C 旋转蒸发仪 ( 巩义市英峪予华仪器厂 ); AK 1000A 摇摆式中药粉碎机 ( 温岭市奥力中药机械有限公司 ) 甲醇 ( 色谱纯, 德国 Merck 公司 ); 乙酸 ( 色谱纯, 北京 Dikma 公司 ); 无水乙醇 ( 分析纯, 天津富宇精细化工有限公司 ); 马鞭草 ( 安徽德昌药业饮片有限公司, 由大连医科大学第一附属医院中药剂科李永杰鉴定并确认 ); 木犀草素原料药 ( 纯度 >98%, 西安沃森生物科技有限公司 ); 鼠尾草酸 ( 纯度 >60%, 上海源叶生物科技有限公司 ); 齐墩果酸 ( 纯度 > 95%, 西安小草植物科技有限责任公司 ); 迷迭香酸蒙花苷 ( 纯度均不小于 98%, 上海源叶生物科技有限公司 ) 实验用水为自制超纯水 1.2 样品处理将马鞭草粉碎得粗粉, 取适量马鞭草粗粉和无水乙醇, 以 1 g 马鞭草粗粉中加入 10 ml 无水乙醇的比例混匀, 于 20 超声 (50 Hz) 提取 2 h, 静置过夜真空抽滤后于 55 减压浓缩得到马鞭草提取物浸膏称取适量马鞭草提取物浸膏, 加入无水乙醇超声溶解, 配制成 200 g / L 的溶液, 用甲醇水 ( 1 1, v / v) 溶液将上述溶液稀释至 5 g / L, 经 0 22 μm 的微孔有机滤膜过滤后进样 1.3 色谱和质谱条件色谱条件 : 色谱柱为 Hypersil Gold C 18 柱 ; 柱温为室温 ; 进样量为 5 μl 流动相 A 为甲醇, 流动相 B 为体积分数为 0 3% 的冰醋酸水溶液 ; 流速为 0 2 ml / min 梯度洗脱程序为 :0 ~ 20 min, 20% A ~ 40% A; 20 ~ 30 min, 40% A ~ 100% A; 30 ~ 40 min, 100% A PDA 检测器波长范围 :200 ~ 400 nm 质谱条件 :ESI 源, 分别采用正负两种模式进行检测 ; 源喷射电压在正负模式下分别为 3 5 和 3 0 kv; 鞘气和辅助气均为氮气, 流速分别为 15 和 5 L / min; 加热毛细管温度为 350 ; 扫描方式为一级和多级全扫描 ; 分辨率为 ; 最大允许偏差为 ± 结果与讨论本文采用 HPLC PDA HRMS 技术对马鞭草提取物的化学组分进行了分析和鉴定通过综合分析化合物的色谱 ( 见图 1) 及一级和多级质谱数据, 分别采用 ESI + 和 ESI - 模式对样品进行检测, 共检测到 21 种化合物, 各化合物相关数据见表 1 和图 2 化合物 1 和 2 为环烯醚萜苷类化合物, 分别为戟叶马鞭草苷和马鞭草苷该类化合物在 ESI + 和 ESI - 模式下均有质谱响应, 且在 ESI + 模式下易形成 [M + Na ] + 峰 ( m / z 和 ) 和 [2M+Na] + 峰 ( m / z 和 ), 而在 ESI - 模式下易形成甲酸加合峰 [M-H+CH 3 COOH] - (m / z 和 ) 为进一步确定化合物结构, 在 ESI + 模式下对化合物的准分子离子峰进行二级全扫描质谱分析, 通过综合分析化合物的元素组成和碎片信息, 确证化合物结构如化合物 1 的 [M+H] + 峰 ( m / z 405) 产生的主要碎片离子 [14] m / z 为和 193, 与文献报道一致其中 m / z 243 比 m / z 405 少 162, 推测为糖苷键断裂脱掉 1 分子葡萄糖产生的碎片离子 [M+H-C 6 O 5 ] + ; m / z 225 为 m / z 243 脱掉 1 分子水形成的碎片离子 [M+H-C 6 H 12 O 6 ] + ; m / z 207 为 m / z 225 脱掉 1 分子水形成的碎片离子 [M+H-C 6 H 12 O 6 -H 2 O] +, 说明化合物 1 的苷元部分含有游离的羟基 ;m / z 193 为 m / z 225 脱掉 1 分子甲醇形成的碎片离子 [M+H-C 6 H 12 O 6 -CH 3 OH] +,

3 第 9 期孙玉明, 等 : 高效液相色谱光电二极管阵列高分辨质谱联用鉴定马鞭草提取物中的化学成分 989 图 1 高效液相色谱高分辨质谱联用检测马鞭草提取物的典型色谱图 Fig. 1 Typical chromatograms of Verbena officinalis L. extract detected by HPLC high resolution mass spectrometry ( HRMS) a. detected by photodiode array (PDA) detector; b. detected by MS in ESI + mode; c. detected by MS in ESI - mode. Peak Nos.: 1. hastatoside; 2. verbenalin; 3. quercetin 3 O glucoside; 4. verbascoside; 5. luteolin 7 O glucoside; 6. isoverbascoside; 7. pedalitin 6 O glucoside; 8. rosmarinic acid; 9. apigenin 7 O glucoside; hydroxyl wogonoside; 11. acacetin 7 O rutinoside; 12. luteolin; 13. isorosmanol; 14. rosmanol; hydroxyl wogonin; 16. apigenin; 17. carnosol; 18. barbinervic acid; 19. carnosic acid; 20. ursolic acid; 21. oleanolic acid. Table 1 表 1 HPLC HRMS 检测到的马鞭草提取物中的化学成分 Chemical compositions of Verbena officinalis L. extract detected by HPLC HRMS No. Retention time / min Molecular formula [M+H] + / [M-H] - (m / z) Error / (ppm, 10-6 ) Fragment ions (m / z) C 17 H 24 O / # , 225, 207, C 17 H 24 O / # , 227, C 21 H 20 O / / , 285, C 29 H 36 O / / , 479, 471, C 21 H 20 O / / C 29 H 36 O / / , 479, 471, C 22 H 22 O / / , 302, 274, C 18 H 16 O 8 # / , 197, 179, C 21 H 20 O / / C 22 H 22 O / / C 28 H 32 O / / , 285, 270, C 15 O / / , 241, C 20 H 26 O / / , C 20 H 26 O / / , C 16 H 12 O / / , 258, C 15 O / / , 229, 225, C 20 H 26 O / / C 30 H 48 O / / , 407, 453, 435, C 20 H 28 O 4 # / C 30 H 48 O 3 # / , 407, C 30 H 48 O 3 # / # not detected.

4 990 色谱第 35 卷 Fig. 2 图 2 21 种马鞭草提取物化学成分的结构式 Structural formulas of the 21 chemical compositions of Verbena officinalis L. extract 1-21 are the same as those in Fig. 1. 说明苷元结构中含有甲氧基的结构单元综上, 确定化合物 1 为戟叶马鞭草苷同理确定化合物 2 为马鞭草苷化合物 ~ 均为黄酮类化合物, 其中化合物 ~ 11 均为黄酮苷类化合物, 分别为槲皮素 3 O 葡萄糖苷木犀草素 7 O 葡萄糖苷胡麻黄素 6 O 葡萄糖苷芹菜素 7 O 葡萄糖苷 4 羟基汉黄芩苷和金合欢素 7 O 芸香糖苷 ; 化合物和 16 为黄酮苷元类化合物, 分别为木犀草素 4 羟基汉黄芩素和芹菜素本文所检测到的 9 种黄酮类化合物在 ESI + 和 ESI - 模式下均有质谱响应, 其中化合物 11( 金合欢素 7 O 芸香糖苷也称蒙花苷 ) 在有关马鞭草提取物化学成分鉴定的文献中未见报道, 因此本文将以化合物 11 为例阐述黄酮类化合物的结构推测过程 ESI + 模式下测得化合物 11 的准分子离子峰 [M+H] + 的精确质量数为 , 与离子式 C 28 H 33 O + 14 相对应,m / z 为 [ M+Na] + 为进一步验证其结构, 对 m / z 593 进行二级全扫描质谱分析, 如图 3 所示, 其产生的主要碎片离子为 m / z 447 和 285 m / z 447 比 m / z 593 少 146, 推测为糖苷键断裂脱掉 1 分子鼠李糖产生碎片离子

第 9 期孙玉明, 等 : 高效液相色谱光电二极管阵列高分辨质谱联用鉴定马鞭草提取物中的化学成分 991 [M+H-C 6 O 4 ] +, 说明结构中含有鼠李糖结构单元 m / z 285 比 m / z 447 少 162, 推测为化合物 11 失去 1 分子鼠李糖后又脱去 1 分子葡萄糖形成碎片离子 [M+H-C 6 O 4 -C 6 O 5 ] +, 说明结构中还含

5 第 9 期孙玉明, 等 : 高效液相色谱光电二极管阵列高分辨质谱联用鉴定马鞭草提取物中的化学成分 991 [M+H-C 6 O 4 ] +, 说明结构中含有鼠李糖结构单元 m / z 285 比 m / z 447 少 162, 推测为化合物 11 失去 1 分子鼠李糖后又脱去 1 分子葡萄糖形成碎片离子 [M+H-C 6 O 4 -C 6 O 5 ] +, 说明结构中还含有葡萄糖结构单元 ; 未发现有单独脱去 1 分子葡萄糖形成的碎片离子, 说明该化合物结构中所含有的葡萄糖与鼠李糖互相连接形成双糖结构, 葡萄糖直接与苷元相连, 由此推测该化合物为芸香糖苷 m / z 即为苷元的准分子离子, 对应的离子式为 C 6 O + 5, 对 m / z 285 进行多级全扫描, 产生 [13,15] 的碎片离子的 m / z 为和 153, 与文献报道基本一致其中 m / z 270 比 m / z 285 少 15, 为脱掉甲基自由基形成的碎片离子, 说明结构中含有甲氧基, 由此推测苷元部分可能为金合欢素或汉黄芩素 ;m / z 242 比 m / z 270 少 28, 为脱掉 1 分子 CO 形成的碎片离子 ;m / z 153 为 C 环开环裂解通过 Retro Diels Alder 断裂形成的碎片离子, 说明该结构中的甲氧基位于 B 环 ; 如果苷元部分为汉黄芩素, 则应产生与 4 羟基汉黄芩素相同的碎片离子 m / z 168, 故由此确定苷元部分为金合欢素综上, 化合物 11 可能的裂解途径见图 4 同时通过与蒙花苷对照品对比发现, 化合物 11 与蒙花苷对照品的色谱和质谱行为完全一致, 由此确定化合物 11 为金合欢素 7 O 芸香糖苷, 即蒙花苷化合物 4 和 6 为苯乙醇苷类化合物, 分别为毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷 ESI + 模式测得化合物 4 和 6 准分子离子 [ M + H] + 峰的精确质量数均为 , 与离子式 C 29 H 37 O + 15 相对应, m / z 为 [ M + NH 4 ] + ; 而 m / z 为 [M+Na] + ESI - 模式下测得 m / z 为 [M-H] - 峰, 推测其可能为毛蕊花糖苷或异毛蕊花图 3 化合物 11 的质谱图 Fig. 3 Mass spectra of compound 11 图 4 化合物 11 的质谱裂解途径 Fig. 4 Mass spectral fragmentation pathways of compound 11

6 992 色谱第 35 卷糖苷 [11], 二者的保留时间分别为和 min 在 ESI + 模式下对 m / z 625 进行二级全扫描质谱分析, 产生的主要碎片离子的 m / z 为其中 m / z 607 为 m / z 625 脱掉 1 分子水形成的碎片离子 [ M+H-H 2 O] + ; m / z 479 比 m / z 625 少 146, 推断为 m / z 625 脱掉 1 分子鼠李糖形成的碎片离子 [M+H-C 6 O 4 ] + ; 而 m / z 471 比 m / z 625 少 154, 推断为碳氧键断裂脱掉 1 分子 4 羟乙基邻苯二酚形成的碎片离子 [ M+H-C 8 O 3 ] + ; m / z 325 比 m / z 479 少 154, 推断为 m / z 625 同时脱掉 1 分子鼠李糖和 1 分子 4 羟乙基邻苯二酚形成的碎片离子 [M+H-C 6 O 4 -C 8 O 3 ] + [11] 另据文献报道, 在反相色谱系统中毛蕊花糖苷的保留时间相对较短, 由此确定化合物 4 为毛蕊花糖苷, 化合物 6 为异毛蕊花糖苷化合物和 19 为二萜酚类化合物, 分别为迷迭香酸迷迭香酚异迷迭香酚鼠尾草酚和鼠尾草酸该类化合物由于结构中有酚羟基的结构单元, 故在 ESI - 模式下均有质谱响应, 而化合物和 17 因含有过氧桥的结构单元而在 ESI + 模式下也可以被检测到本文以在 ESI + 和 ESI - 两种模式下均有质谱响应的化合物 13 和 14 为例阐述所检测到二萜酚类化合物的结构推测过程 ESI + 模式下测得化合物 13 和 14 的准分子离子 [M+H] + 峰的精确质量数均为 , 与离子式 C 20 H 27 O + 5 对应, m / z 为 [ M + Na ] + 相峰, m / z 为 [ 2M + Na] + 峰 ;ESI - 模式下测得 m / z 为 [ M - H ] - 峰, m / z 为 [2M-H] - 峰, 初步推断为迷迭香酚或异迷迭香酚为进一步验证其结构, 在 ESI - 模式下对 m / z 345 进行二级全扫描质谱分析, 如图 5 所示, 二者产生的主 [16] 要碎片离子 m / z 均为 301 和 283, 与文献报道一致 m / z 301 比 m / z 345 少 44, 推测为脱掉 1 分子 CO 2 形成的碎片离子 [ M -H -CO 2 ] - ; m / z 283 比 m / z 301 少 18, 推测为又脱掉 1 分子水形成的碎片离子 [M-H-CO 2 -H 2 O] - [17] 根据文献报道, 在反相色谱系统中迷迭香酚的保留时间相对较长, 故确定化合物 13 为异迷迭香酚, 化合物 14 为迷迭香酚化合物和 21 为三萜类化合物, 分别为马尾柴酸熊果酸和齐墩果酸该类化合物由于结构中含有羧基基团而在 ESI - 模式下有质谱响应, 当结构中含有较多的羟基基团增加了获得质子的能力时, 亦可在 ESI + 模式下被检测到, 如化合物 18( 马尾柴酸 ) ESI - 模式下测得化合物 20 和 21 的准分子离子 [ M - H] - 峰的 m / z 为 , 与离子式 C 30 H 47 O - 3 相对应, 初步判断为齐墩果酸或熊果酸 [18,19] 为进一步验证其结构, 对 m / z 455 进行二级全扫描质谱分析, 化合物 20 产生的主要碎片离子 m / z 为和 391, 而化合物 21 的主要碎片离子 m / z 只有 407 m / z 409 比 m / z 455 少 46, 推测为失去 1 分子甲酸形成的碎片离子 [M-H-HCOOH] -, 说明该结构中含有羧基基团 ; m / z 407 比 m / z 455 少 48, 推测为失去 1 分子 CH 4 O 2 形成的碎片离子 [ M -H -CH 4 O 2 ] -, 而 m / z 图 5 化合物 13 和 14 的质谱图 Fig. 5 Mass spectra of compounds 13 and 14

7 第 9 期孙玉明, 等 : 高效液相色谱光电二极管阵列高分辨质谱联用鉴定马鞭草提取物中的化学成分比 m / z 409 少 18, 推测为熊果酸失去 1 分子甲酸后再脱掉 1 分子水形成的碎片离子 [M-H-HCOOH-H 2 O] -, 说明该结构中含有羟基基 [20] 团根据文献报道, 在反相色谱系统中齐墩果酸的保留时间大于熊果酸, 同时通过与齐墩果酸对照品对比发现, 化合物 21 与齐墩果酸对照品的色谱和质谱行为完全一致, 其一级和二级全扫描质谱图见图 6 综上可知, 化合物 20 为熊果酸, 化合物 21 为齐墩果酸图 6 齐墩果酸对照品和化合物 21 的质谱图 Fig. 6 Mass spectra of the oleanolic acid reference substance and compound 21 其余化合物的结构推测过程见补充材料 ( www. chrom China. com/ UserFiles / File/ S1.pdf) 综上, 本研究采用 HPLC HRMS 技术分别在 ESI + 和 ESI - 模式下对马鞭草提取物的化学组分进行了分析和鉴定在 ESI + 模式下检测到 17 种化合物, 在 ESI - 模式下检测到 19 种化合物, 其中 15 种化合物在 ESI + 和 ESI - 两种模式下均有质谱响应综合 ESI + 和 ESI - 两种检测模式下的结果, 在马鞭草提取物中共检测到 21 种化合物 :2 种环烯醚萜苷类分别马鞭草苷和戟叶马鞭草苷 ;9 种黄酮类化合物分别为木犀草素木犀草素 7 O 葡萄糖苷芹菜素芹菜素 7 O 葡萄糖苷 4 羟基汉黄芩素 4 羟基汉黄芩苷槲皮素 3 O 葡萄糖苷胡麻黄素 6 O 葡萄糖苷和金合欢素 7 O 芸香糖苷 ;3 种三萜类化合物分别为熊果酸齐墩果酸和马尾柴酸 ;2 种苯乙醇苷类分别为毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷 ;5 种二萜酚类分别为鼠尾草酚鼠尾草酸迷迭香酚异迷迭香酚和迷迭香酸其中 6 种化合物并未在其他有关马鞭草提取物鉴定的文献中出现, 分别为鼠尾草酚鼠尾草酸迷迭香酚异迷迭香酚迷迭香酸和金合欢素 7 O 芸香糖苷 3 结论采用 HPLC PDA HRMS 技术鉴定马鞭草提取物中的化学成分, 既利用了色谱的分离技术又结合了质谱的高选择性和较强的结构鉴别能力, 具有分离速度快检测效率高准确性好等优点用该方法共检测出马鞭草提取物中的 21 种化合物, 并对每种化合物进行多级全扫描质谱分析, 使所推测化合物的结构得到了进一步的确证该方法操作简便快速高效准确可靠, 可作为马鞭草药材鉴别和质量控制的有效方法致谢感谢大连医科大学第一附属医院中药剂科李永杰对本研究中所使用的中药材马鞭草的鉴定参考文献 : [1] Zhang T, Ruan J L, Lü Z M, et al. China Journal of Chinese Materia Medica, 2000, 25(11): 676 张涛, 阮金兰, 吕子敏. 中国中药杂志, 2000, 25(11): 676 [2] Lai S W, Yu M S, Yuen W H, et al. Neuropharmacol, 2006, 50(6): 641

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