Microsoft Word - a D.doc

Size: px

Start display at page:

Download "Microsoft Word - a D.doc"

坊习满
5 years ago
Views:

1 2008 年第 66 卷化学学报 Vol. 66, 2008 第 22 期, 2563~2568 ACTA CHIMICA SINICA No. 22, 2563~2568 研究简报乙酰化蛋白的质谱鉴定研究 a,b 祝叶萍樊惠芝 *,a a,b 沈诚频 b 姚鋆 b 周新文杨芃原 *,a,b ( a 复旦大学化学系上海 ) ( b 复旦大学生物医学研究院上海 ) 摘要报道了两种生物质谱技术 ESI-MS 和 MALDI-MS 在鉴定乙酰化修饰蛋白 BSA-ac 中的应用研究结果. 乙酰化修饰蛋白通过特征碎裂峰 m/z 或 MS/MS 质谱图中相差一个赖氨酸的相邻 b 或 y 离子之间 170 Da 分子量的差异确证赖氨酸乙酰化修饰, 并且后者提供具体修饰位点信息. 研究提示 ESI-MS 和 MALDI-MS 两种质谱技术均可用于鉴定实际复杂样品中的乙酰化蛋白, 且在乙酰化蛋白的鉴定中各有其优点. 关键词乙酰化蛋白 ; 翻译后修饰 ; 质谱 ; 鉴定 Identification of Acetylated Proteins by Mass Spectrometry ZHU, Ye-Ping a,b FAN, Hui-Zhi*,a SHEN, Cheng-Pin a,b YAO, Jun b ZHOU, Xin-Wen b YANG, Peng-Yuan*,a,b ( a Department of Chemistry, Fudan University, Shanghai ) ( b Institute of Biomedical Sciences, Fudan University, Shanghai ) Abstract Identification of acetylated proteins was performed via identifying BSA-ac by two kinds of mass spectrometers including ESI-MS and MALDI-MS. The lysine-acetylated proteins can be confirmed from the observation of a specific ion at m/z or a mass difference of 170 Da between the adjacent b-ions or y-ions. The LTQ-Orbitrap hybrid spectrometer (ESI-MS) comprising an LC pre-concentration system and an ESI ionization source could acquire much more information than the others. However, the ion at m/z could not be detected with a linear ion trap analyzer, which was well observed through a 4700 Proteomic analyzer (MALDI-TOF-TOF). This diagnostic ion can also reduce the false positive rate. It has been demonstrated that ESI and MALDI MS are complementary to each other in analyzing acetylated proteins. Accordingly, it can be concluded from the fact that different results would be obtained with different mass spectrometers, and matched protocols should be used for the identification of the acetylated proteins. Keywords acetylated protein; post-translational modification; mass spectrometry; identification 蛋白质在氨基酸链上共价结合各种非肽的基团, 形成翻译后修饰. 生物体通过蛋白质的翻译后修饰和蛋白质的构象变化实现生命活动机制的调节. 乙酰化是一种可逆且高度调控的蛋白质翻译后修饰, 主要发生于蛋白质赖氨酸残基的 ε-nh 2 位, 它调控细胞凋亡亚细胞的定位 DNA 和蛋白质相互作用 DNA 复制和修复 DNA 转录的活性及蛋白质的稳定性等蛋白质相关过程 [1~5]. 赖氨酸的乙酰化修饰和调控其发生的酶与生命的老化过程及一些重大的疾病 ( 如癌症心血管疾病 ) 存在着密切的联系, 由此蛋白质乙酰化翻译后修饰的鉴定具有重要的生物学意义 [6]. 乙酰化修饰研究领域主要集中于对单个乙酰化蛋 * hzfan@fudan.edu.cn; pyyang@fudan.edu.cn Received May 9, 2008; revised June 5, 2008; accepted July 16, 国家自然科学基金 (Nos , ) 资助项目.

2564 化学学报 Vol. 66, 2008 白的功能研究, 与其相应的传统乙酰化蛋白鉴定的方法有放射性检测和免疫亲和检测 [7], 放射性检测适用于体内标记过或者体外酶催化合成的乙酰化蛋白, 免疫亲和检测则使用乙酰化抗体检测乙酰化蛋白, 但是这些方法都仅能检测到乙酰化蛋白的存在, 不能得到具体的乙酰化修饰位点信息.

2 2564 化学学报 Vol. 66, 2008 白的功能研究, 与其相应的传统乙酰化蛋白鉴定的方法有放射性检测和免疫亲和检测 [7], 放射性检测适用于体内标记过或者体外酶催化合成的乙酰化蛋白, 免疫亲和检测则使用乙酰化抗体检测乙酰化蛋白, 但是这些方法都仅能检测到乙酰化蛋白的存在, 不能得到具体的乙酰化修饰位点信息. 随着蛋白质组学技术的发展, 近几年来规模化的乙酰化蛋白鉴定研究越来越受到重视, Iwabata 等采用二维电泳 (2DE) 与免疫印迹结合的方法对 [8] 鼠脑骨骼肌的赖氨酸乙酰化进行分析, 发现不同器官 [6] 的赖氨酸乙酰化的蛋白质类型有很大差别. Kim 等以人子宫颈癌传代细胞和鼠肝线粒体为样本, 应用 LC-ESI-MS 鉴定到 195 个乙酰化蛋白和 388 个乙酰化位点, 这是首次赖氨酸乙酰化修饰的大规模鉴定. 然而目前从方法学角度系统地对乙酰化蛋白鉴定的研究并不多见. HPLC-ESI-MS 和 2DE-MALDI-MS 是蛋白质鉴定研究中的两条经典路线, 互为补充, 各有其优缺点, 广泛应用于各种翻译后修饰鉴定研究中 [9~12], 不仅能鉴定后修饰蛋白, 而且能得到具体的修饰位点信息, 已成功应用于磷酸化和糖基化修饰的鉴定 [13,14]. 本文结合这两条路线的特性, 采用化学方法合成了一个乙酰化修饰牛血清白蛋白 (BSA-ac), 并采用两种不同的生物质谱技术 ESI-MS 和 MALDI-MS 分别对其进行鉴定. 结果表明, ESI-MS(LTQ-Orbitrap) 和 MALDI-MS(4700 Proteomic analyzer) 两种质谱技术鉴定乙酰化蛋白及其修饰位点信息上各有优点. 本文同时也为乙酰化蛋白的鉴定研究提供了方法学参考. 1 实验部分 1.1 试剂与仪器牛血清白蛋白 (Bovogen); 乙酰化多克隆抗体 (US- Biological); 兔二抗 (Kangchen); PVDF 膜 (Millipore); 乙酸酐和吡啶均为分析纯. SDS-PAGE 电泳仪 (Bio-Rad); 半干转膜仪 (Bio- Rad); Image-master 扫描仪 ; AKTA 快速蛋白纯化仪 (GE Health); 化学发光影像分析仪 (LAS-3000, Fuji Film, Japan); ESI-MS(LTQ-Orbitrap 质谱仪, Thermo Fisher Scientific); MALDI-MS(4700 Proteomic analyzer 质谱仪, ABI). 1.2 实验过程标准乙酰化蛋白 BSA-ac 的制备为了进行乙酰化蛋白的分析鉴定, 制备了标准乙酰化蛋白 BSA-ac. 制备步骤如下 : 取 20 mg 牛血清白蛋白 (BSA), 溶于 5 ml 0.1 mol/l 的碳酸氢铵溶液中. 依次加入 50 µl 乙酸酐和 200 µl 吡啶, 混合均匀, 在 30 烘箱反应 24 h. 反应产物用 AKTA 快速蛋白纯化仪除盐纯化, 得到乙酰化 BSA(BSA-ac) 的 50 mmol/l Tris 溶液, 产物置于 80 冰箱保存, 用于鉴定实验乙酰化蛋白 BSA-ac 表征 SDS-PAGE: 分别将 BSA 和 BSA-ac 样品与 2X SDS- PAGE 上样液按体积比 1 1 混合, 在 95 水浴中加热 5 min, 冷却至室温后, 混旋离心, 以待上样. 用 7 cm SDS-PAGE 胶分离, 选择质量分数为 12% 的分离胶和 5% 的浓缩胶, 样品各上两个泳道, 每个泳道上样量为 4 µg, 浓缩胶和分离胶操作电流分别为 10 和 20 ma, 凝胶通过考马斯亮蓝染色后用 Imager-master 扫描仪扫描保存 ( 图 1). 图 1 一维 SDS-PAGE 凝胶电泳分离 BSA 和 BSA-ac Figure 1 Comparative analysis of BSA and BSA-ac with SDS-PAGE separation Western-blotting 免疫印记 : BSA 和 BSA-ac 用 7 cm 的 SDS-PAGE 胶分离, 样品处理和 SDS-PAGE 凝胶电泳程序设置同上, BSA 上样两个泳道, 上样量都为 4 µg, BSA-ac 上样四个泳道, 上样量分别为 4, 2, 1, 0.5 µg. SDS-PAGE 分离后, 胶用 Bio-Rad 半干转膜仪转膜, 选用 0.45 µm PVDF(MILLIPORE) 膜, 恒电压操作, 10 V 转 40 min, 转膜结束后, 膜用 5% 脱脂奶粉封闭. 一抗使用商品化的乙酰化多抗 (anti-acetyllysine antibody, US- Biological), 二抗为标记 HRP 兔抗 (KANGCHEN), 稀释比例都为最后膜在 ECL-Plus(AMASHAM) 发光液中孵育 5 min, 化学发光影像分析仪 (Fuji Film, LAS-3000) 显影得到发光图 ( 图 2) BSA-ac 质谱鉴定本实验中 MALDI-MS 方法采用 4700 proteomic analyzer 质谱议, ESI-MS 方法采用 LTQ-Orbitrap 质谱仪进行乙酰化蛋白鉴定 proteomic analyzer 和 LTQ-Orbitrap 是两种典型的生物质谱仪, 相应的质量分析器分别为 TOF-TOF 和 Orbitrap, 具有高通量高分辨率和高质量精度的优点, 适合生物大分子的鉴定研究.

No. 22 祝叶萍等 : 乙酰化蛋白的质谱鉴定研究 2565 图 2 免疫印迹验证 BSA 和 BSA-ac Figure 2 Western-blotting analysis of BSA and BSA-ac 方法一 : 4700 proteomic analyzer(maldi-ms) 鉴定 BSA-ac. 用 0.

3 No. 22 祝叶萍等 : 乙酰化蛋白的质谱鉴定研究 2565 图 2 免疫印迹验证 BSA 和 BSA-ac Figure 2 Western-blotting analysis of BSA and BSA-ac 方法一 : 4700 proteomic analyzer(maldi-ms) 鉴定 BSA-ac. 用 0.8 µl CHCA (α- 氰基 -4- 羟基肉桂酸 ) 基质 (4 mg/ml CHCA, 0.2 mg/ml 柠檬酸铵, 质量分数为 0.1% 的 TFA 和 50% 的 ACN) 溶解 BSA-ac 胰蛋白酶酶解后肽段, 点样于靶板上, 质谱测定肽质量指纹谱 (Peptide Mass Fingerprinting, PMF). 然后将实测谱图与 BSA 的 PMF 谱图对比, 将质量增加 42 Da( 乙酰化修饰后质量增加值 ) 的肽段用 MS/MS 串级质谱分析, 验证肽段是否发生乙酰化. 方法二 : LTQ-Orbitrap(ESI-MS) 鉴定 BSA-ac. 将 BSA-ac 胰蛋白酶酶解肽段用 50 µl 5% ACN-0.1% 甲酸溶解, 送入 LC 分析并进行 MS/MS 验证. 由 Mascot 软件分析上述两种质谱鉴定结果. 2 结果与讨论 2.1 合成产物 BSA-ac 的表征由图 1 中可见, BSA 的条带位置略低于标准分子量 marker 中分子量为 72 kda 的条带, 与标准蛋白 BSA 的分子量为 69 kda 吻合. 而进行了乙酰化修饰的 BSA-ac 条带出现在分子量大于标准 BSA 的位置. 说明 BSA 已充分反应生成了 BSA-ac. 用乙酰化抗体对 BSA 和 BSA-ac 进行 Westernblotting 免疫印记验证的结果见图 2. 图中只有 BSA-ac 显现阳性反应, 且发光强度随 BSA-ac 的量而变化. BSA 和标准分子量 marker 都不参与免疫反应, 不发光. SDS-PAGE 和 Western-blotting 两种方法验证合成产物为乙酰化 BSA, 为后续的质谱鉴定提供了可靠的原始依据. 2.2 BSA-ac 的质谱鉴定质谱鉴定赖氨酸乙酰化修饰有两个依据. 其一, 一个乙酰化肽段经过 MS/MS 串级质谱分析后产生一个 m/z 的特征碎裂峰, 这是赖氨酸上乙酰化修饰鉴定的诊断离子 [15]. 每一个肽段中的每一个氨基酸都会有其相对应的亚氨离子 (H 2 N+=CHR), 在质谱中这个离子的存在可以鉴定这个氨基酸的存在, 被乙酰化的赖氨酸的亚氨离子为 m/z 143.1, 这一离子丢失一个 NH 3 后即为 m/z 研究表明, m/z 检测灵敏度是 m/z 的 9 倍之高, 可作为确证赖氨酸乙酰化修饰的依据 [15]. 分子式如下 : + CH=CHCH 2 CH 2 CH 2 NHCOCH 3. 其二, 蛋白质乙酰化修饰肽段在其一级质谱图中表现为质量数 42 Da 的增加 [11], 且在相应的 MS/MS 图中, 相差一个赖氨酸的相邻 b 或 y 离子间存在 170 Da( 赖氨酸乙酰化修饰后赖氨酸分子量 ) 的质量差异. 以乙酰化肽段 m/z 1043 为例说明乙酰化修饰质谱鉴定过程 ( 图 3 和 4). 图 3a 和 3b 分别为 4700 Proteomic analyzer 质谱仪检测得到的 BSA 和 BSA-ac 的 PMF 图. 将谱图分析比对后发现, 在 BSA-ac 的 PMF 图中 m/z 1043 离子相对于 BSA 的 PMF 谱图中的 m/z 1001 离子, 质量数增加了 42 Da( 乙酰化修饰后质量增加值, CH 3 CO-H=43-1= 42) [11]. 对 m/z 1043 离子进一步作 MS/MS 串级质谱分析, 见图 3c. 在图上可以看到相差一个赖氨酸的相邻 b 离子或 y 离子之间有 170 Da 的分子量差值. 同时还可看到 m/z 的峰, 这是赖氨酸乙酰化肽段在 MS/MS 分析时产生的特征碎裂峰, 是赖氨酸乙酰化修饰的诊断离子. 综合以上判据, 鉴定 m/z 1043 为乙酰化修饰基团, 且修饰发生在赖氨酸. 将 LTQ-Orbitrap 质谱仪对 BSA-ac 一级质谱分析得到的双电荷母离子 m/z 522.3( 对应于 MALDI-MS 鉴定得到的单电荷离子 m/z ) 进行 MS/MS 串级质谱分析, 见图 4a 和 4b. 在串级谱图 4b 中可以看到相差一个赖氨酸的相邻 b 离子或 y 离子之间分子量相差 170 Da, 以此鉴定该离子为乙酰化修饰肽段, 且乙酰化修饰发生在赖氨酸上. 两种质谱方法鉴定得到 MS/MS 串级质谱数据后, 采用同一种搜库软件 Mascot 对其进行检索 : LTQ-Orbitrap 质谱仪对 BSA-ac 的鉴定分析, Mascot 软件对数据库检索参数设定如下 : 检索数据库为 IPI(Bovine) 库, 漏切位点数为 2 个, 可变修饰为赖氨酸乙酰化修饰, 一级质谱质量容差为 10 ppm, 串级质谱质量容差 1 Da, 离子得分 >27; 4700 Proteomics analyzer 质谱仪对 BSA-ac 的鉴定分析, Mascot 软件对数据库检索参数设定如下 : 检索数据库为 IPI(Bovine) 库, 漏切位点数为 2 个, 可变修饰为赖氨酸乙酰化修饰, 一级质谱质量容差为 100 ppm, 串级质量容差 0.6 Da, 离子得分 >33. 肽段 m/z , m/z , m/z 经过 4700 Proteomics analyzer 串级质谱鉴定后, 离子得分相对较低, 研究依据串级质谱图中 m/z 特征离子确证赖氨酸乙酰化修饰. 两种方法均鉴定样品为 BSA-ac, 并能给出相应的修饰位点.

4 2566 化学学报 Vol. 66, 2008 图 Proteomic Analyzer 质谱仪鉴定 BSA 和 BSA-ac 得到的一级和二级质谱图 Figure 3 Mass spectra taken from 4700 Proteomic analyzer (a) PMF mass spectrum of BSA; (b) PMF mass spectrum of BSA-ac; (c) MS/MS spectrum of m/z ESI-MS 和 MALDI-MS 鉴定乙酰化蛋白修饰位点的结果表 1 质谱鉴定结果显示, LTQ-Orbitrap 质谱仪鉴定得到了 10 个乙酰化肽段及其相应的位点信息. LTQ- Orbitrap 质谱仪中与 MS 相连的 LC 可以起到一个预分离和富集的作用, 减少了离子之间鉴定的干扰性, 且高质量精度的分析器 Orbitrap, 有利于母离子的筛选, 所以 LTQ-Orbitrap 质谱仪可以检测到较多的肽段并进行 MS/MS 鉴定. 其次 ESI-MS 和 MALDI-MS 对离子的检测灵敏度不一样, ESI 源和 MALDI 源对某些离子存在偏好性也可能是本文中 LTQ-Orbitrap 鉴定到较多离子的一个原因 Proteomic analyzer 质谱仪的 TOF-TOF 质量分析器可以检测到赖氨酸乙酰化诊断离子 m/z 126.1, 但是对于以离子阱为质量分析器的质谱仪 (LTQ-Orbitrap) 而言, 低分子量离子检测缺失的特性使得这一特征诊断离

5 No. 22 祝叶萍等 : 乙酰化蛋白的质谱鉴定研究 2567 图 4 LTQ-Orbitrap 鉴定 BSA-ac 得到的一级和串级质谱图 Figure 4 Mass spectra taken from LTQ-Orbitrap (a) MS spectrum of m/z (z=2); (b) MS/MS of precursor ion m/z (z=2) Table 1 表 1 两种质谱鉴定 BSA-ac 鉴定结果 Identification results of BSA-ac by two MS protocols a Acetylated peptide Acetylated peptide Detected or Not Diagnostic ion (m/z 126.1) Detected or Not MH+ Sequence LTQ-Orbitrap 4700 Proteomic Analyzer LTQ-Orbitrap 4700 Proteomic Analyzer R.SLGK*VGTR.C R.EK*VLTSSAR.Q R.ALK*AWSVAR.L R.CASIQK*FGER.A R.FK*DLGEEHFK.G K.FWGK*YLYEIAR.R K.K*FWGK*YLYEIAR.R R.K*VPQVSTPTLVEVSR.S R.LSQK*FPK*AEFVEVTK.L K.NYQEAK*DAFLGSFLYEYSR.R + a +: detected, : not detected, *: acetylated sites.

6 2568 化学学报 Vol. 66, 2008 表 2 两种质谱鉴定 BSA-ac 鉴定结果 Table 2 Identification results of BSA-ac by two MS protocols LTQ-Orbitrap Ion score 4700 Proteomics analyzer Ion score 子不能被检测到, 这是 4700 Proteomic analyzer 质谱仪在鉴定乙酰化蛋白中的一个独特优点. 对于不同的分离方法 ( 如 HPLC 或 2DE), 蛋白的大规模鉴定往往需要采用不用的质谱技术 ( 如 ESI-MS 和 MALDI-MS). HPLC-ESI-MS 和 2DE-MALDI-MS 是蛋白质鉴定研究中的两条经典路线, 互为补充, 各有其优缺点. 对于实际复杂样品的乙酰化蛋白鉴定研究, 可以根据分离方法使用 ESI-MS 或 MALDI-MS 任意一种技术, 也可以相互结合, 互相补充得到最优的结果. 3 结论本文用两种不同生物质谱方法鉴定乙酰化蛋白或肽时, 通过 m/z 特征碎裂峰或 MS/MS 质谱图中相邻 b 或 y 离子之间 170 Da 的分子量差异确证蛋白质发生赖氨酸乙酰化修饰, 且后者可指明乙酰化修饰发生的位点信息. 带有 ESI 离子源的 LTQ-Orbitrap 质谱仪鉴定乙酰化修饰蛋白或肽可获得较多的修饰信息, 但带有离子阱的质量分析器低分子量离子检测缺失使得 LTQ-Orbitrap 不能检出特征诊断离子 m/z 采用 MALDI 离子源的飞行时间质谱仪 4700 Proteomic analyzer 可检出这一特征离子, 得到补充的修饰信息. 鉴于不同质谱方法获得不同的乙酰化修饰信息, 提示可以采用 2DE-MALDI-MS 或者 LC-ESI-MS 任一技术进行乙酰化蛋白鉴定研究, 也可以相互结合得到最优数据, 为后续的乙酰化蛋白功能研究提供可靠依据. References 1 Iyer, N. G.; Chin, S. F.; Ozdag, H. Proc. Natl. Acad. Sci. 2004, 101, Aggarwal, B. D.; Calvi, B. R. Nature 2004, 430, Gu, W.; Roeder, R. G. Cell 1997, 90, Bernardi, R.; Scaglioni, P. P.; Bergmann, S. Nat. Cell Biol. 2004, 6, Abraham, J.; Kelly, J.; Thibault, P. Mol. Biol. 2000, 295, Kim, S. C.; Sprung, R.; Chen, Y. Mol. Cell 2006, 23, Dormeyer, W.; Ott, M.; Schnölzer, M. Mol. Cell. Proteomics 2005, 4, Iwabata, H.; Yoshida, M.; Komatsu, Y. Proteomics 2005, 5, Wilkins, M. R.; Gasteiger, E.; Gooley, A. A. J. Mol. Biol. 1999, 289, Mann, M.; Jensen, O. N. Nat. Biotechnol. 2003, 21, Martin, R. L.; Morten, B. T.; Tine, E. T. BioTechniques 2006, 40, Guo, Y.-L.; Liu, H.-Q.; Yu, C.-T. Analysis and Testing Technology and Instruments 2001, 7, 129 (in Chinese). ( 郭寅龙, 刘晗青, 余翀天, 分析测试技术与仪器, 2001, 7, 129.) 13 Qian, X.-H.; He, F.-C. Proteomics: Theory & Method, Science Press, Beijing, 2003, Chapter Xia, Q.-C.; Zeng, R. Protein Chemistry & Proteome, Science Press, Beijing, 2004, Chapter Kim, J. Y.; Kim, K. W.; Kwon, H. J. Anal. Chem. 2002, 74, (A DING, W. F.; DONG, H. Z.)

《中国科学》A、E、G与F小开本版式设计

《中国科学》A、E、G与F小开本版式设计 222 E 2006, 36(2): 222~234 * 1** 1,2 1,2 1,2 1,2 3 3 1 1 1,2 (1., 100080; 2., 100039; 3., 200031),. ;,,.. 20 90 (human genome project, HGP), ; HGP 2003, 21. (proteomics) ; (computational proteomics),,,