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裤胡
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1 1002 中国人兽共患病学报 ChineseJournalofZoonoses 2017,33 (11) DOI: /j.issn 论著猪戊型肝炎病毒 SYBRGreenⅡ 荧光定量 RTGPCR 检测方法的建立与应用李幽幽 1, 龚双燕 1, 李小璟 1, 毛汐语 1, 邓益超 1, 朱玲 1,2, 徐志文 1,2 摘要 : 目的建立一种快速检测猪戊型肝炎病毒 (HEV) 的方法. 方法针对 HEVORF2 基因保守序列设计 1 对引物, 基于 SYBR Green Ⅱ 染料, 建立了检测 HEV 的实时荧光定量 RTGPCR 方法. 结果该方法只能对猪戊型肝炎病毒检测到荧光, 对猪繁殖与呼吸综合征病毒猪瘟病毒猪流行性腹泻病毒猪嵴病毒猪传染性胃肠炎病毒猪轮状病毒均不能检测到荧光信号, 特异性好 ; 检测 HEV 时, 在 ~ 拷贝 / μ L 内具有良好的线性关系, 灵敏度可以达到拷贝 / μ L, 扩增相关系数为 0.996, 扩增产物的熔解温度为 84.0 ±0.1, 该检测方法组内变异系数为 0.83%~0.94%, 组间变异系数为 0.83%~0.94%, 重复性较好. 利用该方法对临床 61 份来自四川各地的猪肠内容物进行检测, 检出 9 份阳性, 且与常规 PCR 检测方法的阳性符合率为 100%. 结论建立的针对 HEV 的荧光定量 RTGPCR 有效可行, 对 HEV 的临床检测和进一步研究奠定了基础. 关键词 : 猪戊型肝炎病毒 ;SYBR GreenⅡ; 荧光定量 RTGPCR 中图分类号 :R373.2 文献标识码 :A 文章编号 : (2017) DevelopmentandapplicationofaSYBR Green ⅡrealGtimeRTGPCR fordetectionofswinehepatitisevirus LIYouGyou 1,GONGShuangGyan 1,LIXiaoGjing 1,MAO XiGyu 1, DENG YiGchao 1,ZHU Ling 1,2,XUZhiGwen 1,2 (1.AnimalMedicalColege,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611134,China; 2.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseand Human HealthofSichuanProvince,Sichuan AgriculturalUniversity,Chengdu611134,China) Abstract:InordertoestablisharealGtimeRTGPCRbasedonSYBR Green Ⅱ fordetectionofhepatitisevirus(hev),a pairofspecialprimerswasdesignedaccordingtotheconservedsequencesoforf2ingenbank.resultshowedthatthestandg ardcurveofestablishedsybr Green ⅡrealGtimeRTGPCRhadawidedynamicrangefrom copies/ μ L withalinearcorrelation(r 2 )of0.996.thesensitivitycouldreach copies/ μ L.ThemeltingcurveanalysisusingSYBR Green Ⅱ dyeshowedonespecificpeakwithameltingtemperature(tm)of84.0 ±0.1.Noamplificationwasdetectedfrom thernasamplesofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,classialswinefevervirus,transmissiblegastroenterig tisvirus,porcinebocavirus,porcineepidemicdearrhoeavirusporcinekobuvirusandporcinerotavirusbythispcr,respectiveg ly.excelentreproducibilitywasobtainedfordetectingconstructedpositiveplasmiddna withintragassayof0.83% -0.94% andintergassayof0.83%-0.94%.furtherdetectionof61specimensshowedthat9ofthem werehevpositive,andthereg sultsofthequantitativertgpcr werethesameasthatoftheconventionalrtgpcr.inconclusion,therealgtimequantitative RTGPCRforHEVisfeasible,therealGtimeRTGPCRestablishedinthisstudywilbeusefulforearlierrapidlaboratorydiagnoG sisandpathogenesisofhev. Keywords:hepatitisEvirus;SYBR Green Ⅱ;realGtime 四川省科技支撑计划 (No.2014NZ0043), 国家十二五科技支撑计 RTGPCR 划 (No.2015BAD12B04G2.3) 联合资助通讯作者 : 朱玲, abtcxzl72@126.com SupportedbytheSichuan ProvinceScienceand Technology 作者单位 :1. 四川农业大学动物医学院, 成都 ; SupportProgram (No.2014NZ0043),andthe NationalSciG 2. 四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室, enceandtechnologysupport"the12thfivegyear"program 成都 (No.2015BAD12B04G2.3)

2 11 期李幽幽等 : 猪戊型肝炎病毒 SYBR GreenⅡ 荧光定量 RTGPCR 检测方法的建立与应用 1003 Correspondingauthor:ZhuLing, abtcxzl72@126.com HEV 属于肝炎病毒科 (HepeviridaeFamily) 肝炎病毒属 (Hepevirus), 是单股正链无囊膜的 RNA 病毒, 呈球形, 直径 32~34nm, 核衣壳呈二十面体立体对称. 基因组长约 7.2kb, 由 3 个开放式阅读框架组成.HEV 分为 4 个主要基因型 [1], HEVG1 主要分布在亚洲和非洲国家 ;HEVG2 见于墨西哥和尼日利亚 ;HEVG3 分布于美国和欧洲国家 [2], 但近年来发现也存在与日本韩国中国大陆和中国台湾 ;HEVG4 主要分布于中国日本和越南. 我国存在的主要是 1 型和 4 型 [3G5]. 该病毒的主要传播途径是粪口传播, 即通过饮用被污染的水和食用被污染的食物而感染 [6G8]. 食用未煮熟的感染 HEV 的动物组织或内脏也可能导致食源性感染 [9G10], 除此之外, 母婴传播 [11G12] 输血 [13G15] 传播也是重要的传播途径. 孕妇感染 HEV 可导致流产或死亡, 病死率高达 20% -30%.HEV 还分布于多种动物中, 并可在人与猪之间相互传播, 是人类健康和养猪业的重要病原 [16G17]. 目前, 国内外对 HEV 的检测方法各异, 例如 ELISA PCR 等常规检测方法, 但是对于 HEV 含量低的样品以及处理过程中易产生抑制物等因素, 均限制了 HEV 的早期临床诊断. 因此, 本研究基于 SYBRGreenⅡ 染料, 建立用于 HEV 检测的荧光定量 RTGPCR 方法, 以期达到灵敏性高可定量操作便利和成本相对较低等特点的检测目的. 1 材料与方法 1.1 病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 猪瘟病毒 (CSFV) 猪流行性腹泻病毒 (PEDV) 猪嵴病毒 (PKoV) 猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV) 猪轮状病毒 (ProVA) 猪戊型肝炎病毒 (HEV) 阳性病料均由四川农业大学动物生物技术中心保存. 1.2 主要试剂 DL2000DNA Marker,SYBR Green PremixE TaqⅡ,2 Taq PLR MasterMix 均购自天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司 ;DNA 凝胶回收试剂盒 pmd19gt 载体质粒抽提试剂盒等均购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司产品. 1.3 引物的设计与合成将 10 株来自不同地区猪戊型肝炎病毒代表株的全基因序列利用软件进行同源性分析, 选出高度保守的核酸区域为 ORF2 基因, 针对保守区设计一对引物分别是 HEVGF:5 G ATTTCGTCGGCTGGAGGTG3, HEVGR : 5 G ACGGGACTCACCAAGATCAATAG3. 预期扩增目的片段大小为 150bp. 引物由生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司合成. 1.4 HEV 重组质粒标准品的制备使用胶回收试剂盒对得到的 PCR 产物进行回收纯化, 将回收产物与 pmd19gtvector(simple) 连接, 将连接产物转化至 DH5α 感受态细胞. 用质粒 DNA 提取试剂盒提取质粒. 将鉴定为阳性的重组质粒送至生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司进行测序. 在 NCBI 上对测序结果进行比对, 分析结果表明该阳性重组质粒与试验预期相符, 可作为 HEV 荧光定量 RTGPCR 的阳性标准品. 将获取的阳性标准品用超微量紫外可见分光光度计测定浓度, 经计算其 DNA 浓度为拷贝 / μ L, 置于 -20 保存. 使用胶回收试剂盒对得到的 PCR 产物进行回收纯化, 将回收产物与 pmd19gtvector(simple) 连接, 将连接产物转化至 DH5α 感受态细胞. 用质粒 DNA 提取试剂盒提取质粒. 将鉴定为阳性的重组质粒送至生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司进行测序. 在 NCBI 上对测序结果进行比对, 分析结果表明该阳性重组质粒与试验预期相符, 可作为 HEV 荧光定量 RTGPCR 的阳性标准品. 将获取的阳性标准品用超微量紫外可见分光光度计测定浓度, 经计算其 DNA 浓度为拷贝 / μ L, 置于 -20 保存. 1.5 标准曲线实验分别使用两步法和三步法对该方法的循环数进行优化. 对退火温度在进行优化. 用双蒸水将阳性标准品进行 10 倍倍比稀释, 取 7 个浓度梯度的阳性标准品作为模板 ( 拷贝 / μ L), 按照优化的反应条件进行扩增, 观察扩增曲线, 标准曲线由荧光定量 PCR 仪自动生成. 1.6 敏感性试验用双蒸水将阳性标准品进行 10 倍倍比稀释, 采用浓度为 ~ 拷贝 / μ L 的阳性标准品作为模板, 分别用建立的荧光定量 RTGPCR 与常规 RTGPCR 对标准品进行检测, 对比两种检测方法的敏感性. 常规 RTGPCR 反应条件为 :95 预变性 5min,94 40s,53 30s, 72 40s,35 个循环 ;72 延伸 5min. 1.7 重复性试验将阳性标准品稀释成 3 个稀释度 ( 拷贝 / μ L), 用所建立的荧光定量 RTGPCR 对样品分别进行 3 次

3 1004 中国人兽共患病学报 2017,33(11) 重复检测, 进行组内重复性试验 ; 对获得的阳性标准品做组间的重复性试验, 在相同反应条件下, 利用该方法每间隔 1 周对其进行 3 次独立的检测, 检验该方法的重复性. 1.8 特异性试验用已建立的荧光定量 RTGPCR 同时对 PRRSV,CSFV,TGEV,PKoV,PEDV ProG VA 和 HEV 进行检测, 验证其特异性. 1.9 荧光定量 RTGPCR 对临床样品的检测将采自四川省成都绵阳眉山遂宁乐山雅安等规模化猪场的 61 份猪粪便用 PBS 稀释至 2g/mL 的浓度, 离心后取上清用 Trizol 法提取样品总 RNA, 按照已优化的体系和条件, 用已建立的荧光定量 RTG PCR 和常规 PCR 对样品进行检测. 2 结果 2.1 优化的检测条件经过对两步法三步法的循环数和退火温度的优化后, 最佳反应体系为 25μL: 图 2 HEV 实时荧光定量 RTGPCR 的溶解曲线 Fig.2 ThemeltingcurveofrealGtimeRTGPCRfordetecG tionofhev ( 图 3); 而荧光定量 RTGPCR 可检测到的最低病毒浓度为拷贝 / μ L, 灵敏度可以达到拷贝 / μ L( 图 4). 结果证明, 荧光定量 RTGPCR 的敏感性比常规 RTGPCR 提高了 100 倍. SYBRPrimixE Taq TM 12.5μL, 上下游引物 (20 μmol/l) 各 1.2μL, 模板 2μL, 水补足至 25μL. 经验证该反应最佳条件为 :95 30s;95 5s,53 30s,72 30s; 进行 39 个循环. 熔解曲线 :95 5s,60 以每秒升高 0.5 的速度, 直至升温到标准曲线分析用建立的荧光定量 RTGPCR 检测各浓度梯度的 HEV 阳性标准品时, 所得到的标准曲线显示, 在 ~ 拷贝 / μ L 之间有良好的线性关系, 标准曲线的斜率是 ,y 轴截距是 , 其相关系数为 0.996, 符合试验预期 ( 图 1). M:DL2000DNA Marker;1G7:Theplasmidconcentrationsare from ~ copies/ μ L,respectively;8:Negative control 图 3 HEV 常规 PCR 的敏感性试验 Fig.3 SensitivitytestofconventionalPCRfordetectionof HEV 图 1 HEV 实时荧光定量 RTGPCR 的标准曲线 Fig.1 ThestandardcurveofrealGtimeRTGPCRfordetecG tionofhev 2.3 熔解曲线分析对熔解曲线进行分析, 结果显示在熔解温度 Tm= 84.0 ±0.1 处呈现特异性峰值, 没有引物二聚体和非特异性产物 ( 图 2). 2.4 敏感性试验对常规 PCR 与已建立的荧光定量 RTGPCR 进行敏感性比较, 结果显示常规 RTG PCR 可检测的最低病毒浓度为拷贝 / μ L 1G7:Theplasmidconcentrationsarefrom ~ copies/ μ L,respectively;8:Negativecontrol 图 4 实时荧光定量 RTGPCR 的敏感性试验 Fig.4 ThesensitivitytestofrealGtimeRTGPCR 2.5 重复性试验用已建立的实时荧光定量 RTG PCR 对 3 个不同稀释浓度的阳性标准品进行重复

4 11 期李幽幽等 : 猪戊型肝炎病毒 SYBR GreenⅡ 荧光定量 RTGPCR 检测方法的建立与应用 1005 性检测, 在相同反应条件下分别进行 3 次试验, 检验该方法的重复性, 并计算变异系数 ( 表 1). 结果显示, 组内变异系数小于 1.0%, 组间变异系数小于 1 0%, 表明所建立的荧光定量 RTGPCR 具有较好的重复性. 表 1 SYBRGreen Ⅱ 荧光定量 RTGPCR 的组内组间重复性试验结果 Tab.1 IntraGasayandInterGasayreproducibilitytestoftheSYBRGreen Ⅱ realgtimepcr 样品浓度 ( 拷贝 / μ L) 组内变异实验组间变异实验 IntraGassayvariability InterGassayvariability Concentrationof n Ct 值平均值变异系数 Ct 值平均值变异系数 standardplasmid(copies/ μ L) AverageofCt CV (%) AverageofCt CV (%) ± ± ± ± ± ± 特异性试验按照已建立的实时荧光定量 RTGPCR 方法对 PRRSV,CSFV,TGEV,PKoV, PEDV ProVA 和 HEV 反转录后所获得的 cdna 进行检测, 结果显示只有 HEV 阳性样本能够扩增出曲线 ( 图 5), 证明所建立的方法具有很强的特异性. 表 2 猪肠内容物样品检测结果 Tab.2 Intestinalcontentssampletestingresults 样品 Sample 61 份猪肠内容物 61samplesofinG testinalcontents 检测方法 Testmethod HEV 阳性样品编号 HEVpositive samplenumber 常规 RTGPCR Conventional RTG 18,19,25,29,33,39 PCR 荧光定量 RTGPCR RealGtimeRTGPCR 9,18,19,25,28,29, 33,39,55 1:AmplificationcurveofHEV 2G7:AmplificationcurveofPRRSV,CSFV,TGEV,PKoV,PEDV andprova 图 5 HEV 实时荧光定量 RTGPCR 的特异性试验 Fig.5 SpecificitytestofrealGtimeRTGPCRfordetection ofhev 2.7 荧光定量 RTGPCR 对临床样品的检测按照已建立的荧光定量 RTGPCR 对临床采集的 61 份疑似 HEV 发病猪的肠内容物进行检测, 同时用常规 RTGPCR 进行检测, 对两种检测方法的结果进行比较. 荧光定量 RTGPCR 检测结果显示,61 份样本中有 9 份为 HEV 阳性 (Ct 值为 11.26G28.82). 常规 RTGPCR 只检测到了 6 份 HEV 阳性样本. 两种检测方法所检出的阳性病料符合率为 100%( 表 2). 3 讨论光定量 PCR 主要有两大类, 分别为探针类和染料类. 荧光定量 PCR 和常规 PCR 比较, 荧光定量 PCR 更为快速, 并有较高的敏感性和特异性, 除此之外, 还能够显著减少试验过程当中的污染. 近年来, 也有多个关于利用探针法检测 HEV 的报 [18G19] 道, 探针法的优点是可以通过探针提高反应收集荧光信号的特异性, 只有与探针相结合的区域发生扩增才能够被接收到荧光信号, 能够提前对反应条件进行优化 ; 缺点是合成探针成本高. 而这种染料法比探针法更经济. 它不仅可以完成溶解曲线, 而且可以分析所有产物的 Tm 值, 缺点是与探针法相比特异性略差, 但本研究中的溶解曲线呈现的是单一特异性峰, 并且在特异性试验中显示只特异性扩增 HEV, 说明本研究中建立的 SYBRGreenⅡ 染料法的特异性很高, 我们选择 SYBR Green Ⅱ 染料法建立针对 HEV 的荧光定量检测方法, 能够满足临床诊断的需求. HEV 是一种人兽共患病病原, 该病的流行主要发生在亚洲, 非洲及墨西哥等发展中国家. 猪感染 HEV 的情况在世界上所有的猪场都普遍存在.

5 1006 中国人兽共患病学报 2017,33(11) 研究表明, 猪是 HEV 的主要贮存宿主, 感染的猪一般有短暂的病毒血症, 持续 1-2 周. 我国猪场中 HEV 的感染情况也很普遍, 有研究者对我国 20 个省直辖市和民族自治区的 120 个规模化猪场的 8626 头保育猪的血清进行检测, 结果发现抗 HEV 抗体阳性率高达 83.4%, 被调查的每个猪场中均出现了 HEV 感染的情况, 说明 HEV 感染在我国猪场 [20] 是极为严重的. 猪自然感染 HEV 一般不出现明显的临床症状, 所以建立一种灵敏度高操作方便并且成本低的检测方法迫在眉睫. 目前, 已建立的检测方法以巢式 RTGPCR 最为常用. 但是, 巢式 RTG PCR 操作步骤繁琐, 导致检测时间增长, 不能及时得出检测结果. 所以, 本研究建立了灵敏度高程序简单并且成本低的 HEV SYBR GreenⅡ 荧光定量 RTGPCR. 近年来, 关于 HEV 荧光定量的方法的应用的研究主要针对浙江, 吉林, 河北和北京等地.2016 年刘敏等人对中国 15 个省市自治区和直辖市的 HEV 分布情况进行调查分析, 但是有些地区的 HEV 分布情况还没有被调查, 其中包括西南地区, [21] 如四川云南贵州西藏和重庆等地. 至今对于四川地区的猪源 HEV 的发病情况还没有相关报道, 本研究中针对 HEV 的 ORF 区域设计引物, 利用建立的荧光定量方法对四川省的 HEV 发病率情况进行初步分析, 为该地区 HEV 的预防工作提供了数据支持. 本试验对采自四川省成都绵阳眉山遂宁乐山雅安地区规模化猪场的 61 份猪肠内容物进行检测, 其中 9 份样品呈阳性, 阳性率为 14 75%; 常规 RTGPCR 检测结果中, 有 6 份呈阳性, 阳性率为 9.8%, 与荧光定量 RTGPCR 检测的阳性结果符合率为 100%, 结果显示本研究中建立的荧光定量 RTGPCR 对样品的检出率高于常规 PCR. 本研究建立了 SYBR GreenⅡ 荧光定量 RTGPCR 对 HEV 的检测方法, 该方法具有灵敏性高特异性强可定量等优点, 为 HEV 的临床诊断起到了很好的指示作用, 为我国相关研究者对 HEV 的进一步研究奠定基础. 参考文献 : [1]SchlauderGG,MushahwarIK.GeneticheterogeneityofhepatiG tisevirus[j].jmedvirol,2001,65(2):282g292. [2]NingH,NiuZ,YuR,etal.Identificationofgenotype3hepatiG tisevirusinfecalsamplesfromapigfarmlocatedinashanghai suburb[j].vetmicrobiol,2007,121(1g2):125g130.doi: /j.vetmic [3]HuangFF,HaqshenasG,GueneteDK,etal.DetectionbyreG versetranscriptiongpcrandgeneticcharacterizationoffieldisog latesofswinehepatitisevirusfrompigsindiferentgeographic regiosoftheunitedstates[j].jclin Microbiol,2002,40(4): 1326G1332.DOI: /JCM G [4]Chen Y,Tian DY,Xia NS.Epidemiologyandgenotypesof HEVin Wuhan[J].ChinJDigDis,2005,6(4):182.DOI: /j.1443G x [5]MitsuiT,TsukamotoY,SuzukiS,etal.SerologicalandmolecG ularstudiesonsubclinicalhepatitisevirusinfectionusingperig odicserumsamplesobtainedfromhealthyindividuals[j].jmed Virol,2005,76(4):526G533.DOI: /jmv [6]MushahwarIK.HepatitisEvirus:molecularvirology,clinical features,diagnosis,transmission,epidemiologyandprevention [J].J Med Virol,2008,80(4):646G658.DOI: /jmv [7]SchlauderGG,DawsonGJ,ErkerJC,etal.Thesequenceand phylogeneticanalysisofanovelhepatitisevirusisolatedfroma patientwithacutehepatitisreportedintheunitedstates[j].j MedVirol,1998,79 (3):447G456.DOI: /0022G1317G 79G3G447 [8]TokitaH,HaradaH,GotandaY,etal.MolecularandserologiG calcharacterizationofsporadicacutehepatitiseinajapanese patientinfectedwithagenotype IhepatitisEvirusin1993[J]. JMedVirol,2003,84(Pt2):421.DOI: /vir G0 [9]MatsudaH,OkadaK,TakahashiK,etal.SeverehepatitisE virusinfectionafteringestionofuncookedliverfromawildboar [J].JInfectDis,2003,188(6):944.DOI: / [10]TamadaY,YanoK,YatsuhashiH,etal.Consumptionofwild boarlinkedtocasesofhepatitise[j].jhepatol,2004,40(5): 869G870.DOI: /j.jhep [11]KhurooMS,KamiliS.Clinicalcourseanddurationofviremia inverticalytransmitedhepatitisevirus (HEV)infectionin babiesborntohevginfectedmothers[j].jviralhepat,2009, 16(7):519.DOI: /j.1365G x [12]KumarA,BeniwalM,KarP,etal.HepatitisEinpregnancy [J].IntlJGynaecolObstetrics,2004,85(3):240.DOI: /j.ijgo [13]MitsuiT,Tsukamoto Y,YamazakiC,etal.Prevalenceof hepatitisevirusinfectionamonghemodialysispatientsinjag pan:evidenceforinfection withagenotype3 HEV byblood transfusion.[j].jmedvirol,2004,74(4):563g572.doi: /jmv [14]BoxalE,HerbornA,KochethuG,etal.TransfusionGtransG mitedhepatitiseina nonhyperendemic country[j].transg fusion Med,2006,16(2):79G83.DOI: /j.1365G x [15]Colson P,CozeC,Galian P,etal.TransfusionGassociated hepatitise,france.[j].emerginfectdis,2007,13(4):648g 649.DOI: /eid ( 下转第 1017 页 )

124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na

124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na 河南农业科学,2013,42(2):123-127 JournalofHenanAgriculturalSciences PCR PRRSV CSFV PCV2,, (, 450011) : 根据 TaqMan 复合荧光探针设计原则, 应用 Primer5.0 和 Oligo6.0 软件设计检测猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 猪瘟病毒 (CSFV) 和猪圆环病毒 2 型 (PCV2) 的特异性引物和探针,