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土妥鱼
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1 Online system: 06, (): 955~96 DOI: 0.969/j.issn 新发 PDCoV 和 TGEV 双重 RT-PCR 检测方法的建立及初步应用刘玲玲, 曹贝贝, 张利卫韩丽韦学雷, 兰培英河南农业大学牧医工程学院 / 河南省动物性食品安全重点实验室, 郑州 0 * 通讯作者,huhui00@6.com,* 胡慧 * 王亚宾摘要猪 Delta 冠状病毒 (Porcine deltacoronavirus, PDCoV) 是一种新发现的冠状病毒, 临床上主要引起感染仔猪出现水样腹泻呕吐和脱水等症状, 和猪传染性胃肠炎病毒 (Porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV) 感染引起的临床症状极为类似, 且临床上 PDCoV 和 TGEV 混合感染时有发生, 单靠临床诊断很难区分两种疾病, 因此建立同时检测且区分 PDCoV 和 TGEV 的检测方法具有重要的临床意义本研究根据 GenBank 中收录的 PDCoV N 基因和 TGEV N 基因序列设计了对引物, 在同一反应体系中同时扩增 PDCoV 的 N 基因片段和 TGEV 的 N 基因片段, 通过对 RT-PCR 反应条件的优化, 建立了同时检测 PDCoV 和 TGEV 的双重 RT-PCR 方法, 并对该方法进行了特异性灵敏性和重复性研究结果显示, 所建立的双重 RT-PCR 对 PDCoV 和 TGEV 的最低检测量分别是. 0 copies/μl 和.68 0 copies/μl, 利用该双重 RT-PCR 方法对猪流行性腹泻病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV) 猪博卡病毒 (Porcine bocavirus, PBoV) 猪繁殖与呼吸综合征病毒 (Porcine respiratory and reproductive syndrome virus, PRRSV) 和猪伪狂犬病毒 (P. pseudorabies virus, PRV) 的扩增结果均为阴性, 显示出较好的特异性为了解所建立的双重 RT-PCR 方法的临床应用效果, 对 5 份临床样品进行了检测结果表明, 双重 RT-PCR 检出 PDCoV 阳性样品份 ( 阳性率为.0%),TGEV 阳性样品份 ( 阳性率为.76%), 同时感染 PDCoV 和 TGEV 的阳性样品份 ( 阳性率为 0.79%), 且检测结果与单一 PDCoV 和 TGEV RT-PCR 相符因此, 本研究所建立的双重 RT-PCR 方法可用于 PDCoV 和 TGEV 的临床检测, 为进一步研究 PDCoV 和 TGEV 的临床鉴别诊断和流行病学调查提供了理论依据和技术支持关键词猪 Delta 冠状病毒 (PDCoV), 猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV), 双重 RT-PCR 中图分类号 S855. 文献标识码 A Establishment and Preliminary Application of Duplex RT- PCR for Detection of Emerging Porcine deltacoronavirus and Porcine transmissible gastroenteritis virus LIU Ling-Ling CAO Bei-Bei, ZHANG Li-Wei, HAN Li WEI Xue-Lei LAN Pei-Ying, HU Hui,* WANG Ya-Bin * Key Laboratory for Animal-derived Food Safety of Henan Province, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 0, China * Corresponding author, huhui00@6.com Abstract Porcine deltacoronavirus (PDCoV) is a newly discovered coronavirus. It mainly infects piglets and causes severe enteritis accompanied by diarrhea and vomiting and other symptoms. The symptoms are symptomatically indistinguishable from those that caused by Porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV). 基金项目 : 国家重点基础研究发展计划 (97) 项目 (No. 06YFD00) 和河南省科技开放合作项目 (No ) 收稿日期 : 接受日期 :

2 956 In clinic the co-infection of PDCoV and TGEV is common, which causes huge economic losses to the swine industry. In order to control and prevent effectively these diseases, development of rapid detection methods of PDCoV and TGEV is the primary task. Thus, according to the analysis of PDCoV and TGEV N gene sequences in GenBank, two pairs of primers targeting the N gene of PDCoV and TGEV were designed respectively. By optimizing the PCR reaction conditions, a duplex RT-PCR detection method was established for the simultaneous detection of PDCoV and TGEV, and the specificity, sensitivity and repeatability of the method were studied. The results showed that the duplex RT-PCR had high sensitivity and specificity with a limited detection of. 0 copies/μl for PDCoV and.68 0 copies/μl for TGEV, respectively, and no specific amplifications from other virus, such as Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), Porcine bocavirus (PBoV), Porcine respiratory and reproductive syndrome virus (PRRSV) or Porcine pseudorabies virus (PRV). 5 clinical samples tested by the duplex RT- PCR showed that the positive rates of PDCoV and TGEV were.0% and.76%, respectively, co-infection rate of PDCoV and TGEV was 0.79%. The date showed that the duplex RT-PCR method established in this study could be used for the clinical detection of PDCoV and TGEV, which provides the theoretical basis information and technical support for further applied to clinical differential diagnosis and epidemiological investigation of TGEV and PDCoV. Keywords Porcine deltacoronavirus (PDCoV), Porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV), Duplex RT-PCR 猪 Delta 冠状病毒 (Porcine deltacoronavirus, PD- CoV) 是一种新发现的猪冠状病毒, 属于冠状病毒科冠状病毒属的 δ 冠状病毒群成员, 为有囊膜的单股正链 RNA 病毒 (Homwong et al., 05) 临床上主要引起感染母猪 (Sus scrofa) 和仔猪出现水样腹泻呕吐和脱水等症状, 发病率和死亡率高达 50% ~%, 生长猪和成年猪感染后死亡率低 (Jung et al., 05), 目前尚无有效的生物制品可对其控制该病毒于 0 年在中国香港首次报到 (Woo et al., 0), 检测的猪粪便样品 PDCoV 阳性率约 0% 美国于 0-0 在腹泻仔猪和母猪的粪便中首次检测到 PDCoV(Wang et al., 0), 此后在美国 0 多个州均检测到 PDCoV (Douglas et al., 0; Li et al., 0), 给美国养猪业造成了严重的经济损失随后, 在加拿大和韩国 (Lee, Lee, 0) 也报道检测到了 PDCoV, 其阳性检出率高达 5% 我国大陆也从腹泻猪的临床样品中检测到 PDCoV, 其阳性率高达 5.76%~58.%( 逢凤娇等, 05; Song et al., 05) 本实验室从 0-0 起, 对来自河南各地市及其周边地市养猪场的仔猪母猪的腹泻病料样品进行 PDCoV 检测, 发现部分猪场也存在 PDCoV 感染猪传染性胃肠炎病毒 (Porcine transmissible gas troenteritis virus, TGEV) 属于冠状病毒科冠状病毒属的 α 冠状病毒群成员, 是猪传染性胃肠炎的病原, 主要引起仔猪腹泻, 临床症状和 PDCoV 非常相似, 也表现为猪呕吐腹泻和脱水等特征, 各年龄段的猪均可发病, 而对周龄内仔猪的危害最大, 死亡率高达 % 虽然 5 周龄以上猪的死亡率很低, 但这些猪通常成为僵猪, 饲料报酬低, 给养殖业带来了巨大的经济损失目前该病尚无有效的治疗药物到目前为止我国大部分省市 ( 自治区 ) 都有该病的发生流行, 给养猪业造成了极大困扰 PDCoV 和 TGEV 均是引起仔猪腹泻的重要病原体, 两者临床症状相似, 发病年龄相似, 并且常常混合感染, 仅根据临床症状较难进行鉴别诊断, 因此, 建立一种同时检测这种病原的诊断方法十分必要本研究通过 DNAstar 软件对 GenBank 中收录的 PDCoV N 基因序列和 TGEV N 基因序列进行序列分析, 获得其保守序列, 并利用 Primer Premier 5.0 软件对该保守序列设计对特异性引物, 在此基础上建立 PDCoV 和 TGEV 的双重 RT-PCR 检测方法, 并对此方法进行特异性敏感性重复性评价分析应用此方法对 5 份河南各地市及其周边地市养猪场送检的临床样品进行检测分析, 进一步在实践中验证该方法的可靠性, 以期为兽医临床诊断和流行病学调查提供理论依据材料与方法. 主要实验材料及临床病料收集猪 Delta 冠状病毒 (Porcine deltacoronavirus, PD-

3 新发 PDCoV 和 TGEV 双重 RT-PCR 检测方法的建立及初步应用 Establishment and Preliminary Application of Duplex RT-PCR for Detection of Emerging PDCoV and TGEV 957 CoV) CH- 0 株猪传染性胃肠炎病毒 (Porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV) HN- 0 株猪流行性腹泻病毒 (Porcine epidemic diarrhea vi rus, PEDV) 猪伪狂犬病毒 (Porcine pseudorabies vi rus, PRV) 猪博卡病毒 (Porcine bocavirus, PBoV) 阳性病料均由河南农业大学河南省动物性食品安全重点实验室保存 ; 猪繁殖与呼吸综合征病毒 (Por cine respiratory and reproductive syndrome virus, PRRSV) 疫苗购自哈尔滨维科生物技术公司 ;pmd- 8T 载体和大肠杆菌 (Escherichia coli)dh5α 购自北京康为世纪生物科技有限公司 ( 北京 );5 份仔猪腹泻病料 ( 肠道内容物或粪便 ) 采自河南各地市及其周边地市养猪场. 主要试剂 Taq PCR Mix 酶 DNA marker DNA 凝胶回收试剂盒质粒抽提纯化试剂盒均购自北京康为世纪生物科技有限公司 ; 琼脂糖购自 Promega 公司 ( 美国 );Tris 平衡酚购自北京索莱宝科技有限公司 ; Protein K 购自宝生物工程有限公司 ( 大连 ); QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取试剂盒和 QIA- GEN 反转录试剂盒购自凯杰企业管理有限公司 ( 上海 ); 其他试剂均为国产分析纯. 引物的设计及合成利用 Primer Premier 5.0 软件, 根据 GenBank 中收录的 PDCoV HKU5-55 毒株 ( 登录号 : JQ0650) N 基因 TGEV H55 毒株 ( 登录号 : GQ7566) 的 N 基因设计对引物, 扩增 PDCoV N 基因部分片段 8,TGEV N 基因部分片段 9, 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 ( 表 ). 病料的处理用 0 mmol/l 的磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered saline, PBS) 将样品稀释 0 倍, 在涡旋仪上震荡混匀后, 于 -70 反复冻融次,, 000 r/min 离心 5 min, 取上清液备用.5 病毒核酸的提取.5. 病毒 RNA 的提取及反转录 RNA 的提取按 QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取试剂盒说明书进行提取, 并按 QIAGEN 反转录试剂盒说明将 RNA 反转录为 cdna,-70 保存备用.5. 病毒 DNA 的提取按常规的蛋白酶 K 法 ( 李小康等, 007) 抽提 PRV PBoV 的 DNA,-70 保存.6 PDCoV 和 TGEV 目的片段的扩增用步骤.5. 得到的 PDCoV 和 TGEV cdna 作为模板, 利用设计的对特异性引物分别进行 PD- CoV 和 TGEV N 基因的单一 RT-PCR 扩增单一 RT- PCR 反应体系如下 : Taq PCR Mix 酶 5 μl, 上下游引物 (5 μmol/l) 各 0.5 μl,cdna 模板 μl, ddh O 补足 5 μl PCR 反应扩增程序为 :95 5 min,95 min,5 0 s,7 0 s,5 个循环, 7 延伸 0 min RT-PCR 产物经.0% 琼脂糖凝胶电泳检测, 用胶回收试剂盒回收目的基因, 将回收的目的基因与 pmd8-t 载体连接, 转化至大肠杆菌 DH5α, 挑取白色菌落 7 0 r/min 过夜培养, 菌液 PCR 鉴定为阳性的菌液, 分别标记为 PMD-8T-PD- CoV-N 和 PMD-8T-TGEV-N, 取 μl 阳性菌液送上海生工生物工程技术服务有限公司测序.7 PDCoV 和 TGEV 双重 RT- PCR 扩增以及反应条件的优化对双重 RT-PCR 反应条件 ( 退火温度, 引物终浓度, Taq PCR Mix 酶浓度和反应总体积 ) 进行优化, 确定最佳反应条件为 : Taq DNA MasterMix 表 RT-PCR 扩增引物信息 Table The information of primer used for RT-PCR amplification 引物 Primer PDCoV NF PDCoV NR TGEV NF TGEV NR 序列 (5'~') Sequence ATGGCTACTGGCTGCGTTAC GCGTTTCCTGGGCTGATT CCCTCCAGCAAGGTTCAA GCAACCCAGACAACTCCA 片段大小 / Fragment size 8 9 登录号 Accession No. JQ0650 GQ7566 参考毒株 Reference strains HKU5-55 H55

4 958.5 μl, 对上下游引物 (5 μmol/l) 各 0.5 μl, 质粒模板各 μl,ddh O 补足 5 μl 反应程序为: 95 5 min,95 min,5 0 s,7 0 s,5 个循环,7 延伸 0 min 取 5 µl RT-PCR 扩增产物于 % 琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定.8 双重 RT-PCR 的特异性实验采用建立的双重 RT-PCR 方法分别对 PDCoV TGEV PEDV PBoV PRV 和 PRRSV 进行检测, 同时设阴性对照, 验证所建立双重 RT-PCR 方法的特异性.9 双重 RT-PCR 的敏感性实验以测序正确的重组质粒作为模板, 用 Nano- Drop C 超微量分光光度计测定浓度后, 根据公式 [(6.0 0 次 copies/mol) ( 浓度 )/(MW g/mol)= copies/ml, 即 (6.0 0 ) (ng/μl 0-9 )/(DNA length 660)=copies/μL)] 计算出每 μl 质粒液体中含有的质粒拷贝数, 将相同浓度的两种质粒混合后进行 0 倍系列稀释, 用优化后的反应条件进行双重 RT-PCR 扩增.0 双重 RT-PCR 的重复性实验利用建立好的 PDCoV 和 TGEV 双重 RT-PCR 检测方法, 以 PDCoV 和 TGEV 的重组质粒为模板, 选择不同时间点 ( 每隔一周 ) 进行重复检测次, 以确定结果的可靠性和重复性. 双重 RT-PCR 方法的初步临床应用对来自河南各地市及其周边地市养猪场的 5 份仔猪病毒性腹泻病料 ( 肠道内容物或粪便 ), 将病料处理后提取 RNA 反转录为 cdna, 用单一 RT-PCR 和已经建立的双重 RT-PCR 方法分别对样品 cdna 进行检测, 通过对单一 RT-PCR 和双重 RT- PCR 检测结果的比较, 来验证建立的双重 RT-PCR 方法的临床应用效果结果与分析. PDCoV 和 TGEV 单一 RT-PCR 扩增产物的鉴定用单一 RT-PCR 方法分别对 PDCoV 和 TGEV 的 N 基因片段进行扩增, 根据所设计的对特异性引物, 分别得到了目的基因片段, 琼脂糖凝胶电泳结果显示,PDCoV 扩增出一条约 8 的目的片段 ( 图 A),TGEV 扩增出一条约 9 的目的片段 ( 图 B), 与预期结果大小一致将目的片段克隆获得的重组质粒 PMD- 8T-PDCoV-N 和 PMD- 8T- TGEV-N 进行测序, 其测序结果分别与对应的 P- DCoV HKU5-55 N 基因核苷酸序列和 TGEV H55 N 基因核苷酸序列完全一致 ( 图, ). 双重 RT-PCR 产物的电泳分析以 PDCoV 和 TGEV 重组质粒为模板分别用单一 RT-PCR 和建立好的双重 RT-PCR 同时进行扩增, 设置阴性对照, 结果见图单一 RT-PCR 分别扩增出 PDCoV 8 和 TGEV 9 特异性条带, 双重 RT-PCR 可同时扩增出两条相应的特异性条带. 双重 PCR 的特异性实验分别以 PDCoV 和 TGEV 的单一及混合质粒为模板,PEDV 和 PRRSV 的 cdna,pbov 和 PRV 的 DNA 为模板用建立的双重 RT-PCR 方法进行扩增, 结果见图 5 结果显示, 只有 PDCoV 和 TGEV 的单一和混合质粒扩增出与相应目的片段大小符合的条带, 而其他病毒均无条带, 说明所建立的双重 RT-PCR 只能检测到 PDCoV 和 TGEV 两种病毒, 不能检测到其他病毒, 特异性好. 双重 RT-PCR 的敏感性实验用 NanoDrop C 超微量分光光度计测定质粒 PMD-8T-PDCoV-N 的浓度为.5 ng/μl, 拷贝图结果 M M 0 Figure PDCoV N 基因 (A) 和 TGEV N 基因 (B) 的 RT-PCR 扩增 TGEV N gene (B) A The result of RT-PCR of PDCoV N gene (A) and M:DL marker;a:pdcov;b:tgev;: 阴性对照 : Negative control 0 B

5 新发 PDCoV 和 TGEV 双重 RT-PCR 检测方法的建立及初步应用 Establishment and Preliminary Application of Duplex RT-PCR for Detection of Emerging PDCoV and TGEV 959 ATGGCTACTGGCTGCGTTACACCAGACAAAAGCCAGGTGGTACTCCGATTCCTCCATCCTATGCCTTTTA ATGGCTACTGGCTGCGTTACACCAGACAAAAGCCAGGTGGTACTCCGATTCCTCCATCCTATGCCTTTTA PMD-8T-PDCoV-N ATGGCTACTGGCTGCGTTACACCAGACAAAAGCCAGGTGGTACTCCGATTCCTCCATCCTATGCCTTTTA HKU5-55 N TTATACTGGCACAGGTCCCAGAGGAAATCTTAAGTATGGTGAACTCCCTCCTAATGATACCCCAGCAACC 7 TTATACTGGCACAGGTCCCAGAGGAAATCTTAAGTATGGTGAACTCCCTCCTAATGATACCCCAGCAACC PMD-8T-PDCoV-N 7 TTATACTGGCACAGGTCCCAGAGGAAATCTTAAGTATGGTGAACTCCCTCCTAATGATACCCCAGCAACC HKU5-55 N ACTCGTGTTACTTGGGTTAAGGGTTCGGGAGCTGACACTTCTATTAAGCCTCATGTTGCCAAACGCAACC ACTCGTGTTACTTGGGTTAAGGGTTCGGGAGCTGACACTTCTATTAAACCTCATGTTGCCAAACGCAACC PMD-8T-PDCoV-N ACTCGTGTTACTTGGGTTAAGGGTTCGGGAGCTGACACTTCTATTAAGCCTCATGTTGCCAAACGCAACC HKU5-55 N CCAACAATCCTAAACATCAGCTGCTACCTCTCCGATTCCCAACCGGAGATGGCCCAGCTCAAGGTTTCAG CCAACAATCCTAAACATCAGCTGCTACCGCTCCGATTCCCAACCGGAGATGGCCCAGCTCAAGGTTTCAG PMD-8T-PDCoV-N CCAACAATCCTAAACATCAGCTGCTACCTCTCCGATTCCCAACCGGAGATGGCCCAGCTCAAGGTTTCAG HKU5-55 N AGTTGACCCCTTCAACGCTAGAGGAAGACCTCAGGAGCGTGGAAGTGGCCCAAGATCTCAATCTGTTAAC 8 AGTTGACCCCTTCAACGCTAGAGGAAGACCTCAGGAGCGTGGAAGTGGCCCAAGATCTCAATCTGTTAAC PMD-8T-PDCoV-N 8 AGTTGACCCCTTCAACGCTAGAGGAAGACCTCAGGAGCGTGGAAGTGGCCCAAGATCTCAATCTGTTAAC HKU5-55 N TCCAGAGGCACAGGCAATCAGCCCAGGAAACGC 5 TCCAGAGGCACAGGCAATCAGCCCAGGAAACGC PMD-8T-PDCoV-N 5 TCCAGAGGCACAGGCAATCAGCCCAGGAAACGC HKU5-55 N 图 Figure PMD-8T-PDCoV-N 与 HKU5-55 N 基因核苷酸序列的比对分析 Comparison of the nucleotide sequences of N genes of PMD-8T-PDCoV-N and HKU5-55 数为. 0 0 ; 质粒 PMD-8T-TGEV-N 的浓度为 8 ng/μl, 拷贝数为以 PDCoV 和 TGEV 的混合质粒 0 倍倍比稀释后, 选取 0 9 ~0 0 copies/μl 质粒作为模板, 用建立好的双重 RT-PCR 方法进行扩增, 结果见图 6 建立的双重 RT-PCR 对 PDCoV 的最低检测量为. 0 copies/μl, TGEV 的最低检测量为.68 0 copies/μl.5 双重 RT-PCR 的重复性实验以等体积混合的 PDCoV 和 TGEV 的重组质粒为模板, 利用建立好的 RT-PCR 方法每隔一周扩增一次, 电泳结果显示次扩增结果一样, 见图 7, 说明本实验建立的双重 RT-PCR 方法具有较高的重复性.6 双重 PCR 方法的初步应用用建立的双重 RT-PCR 和单一 RT-PCR 分别对河南各地市及其周边地市养猪场的 5 份仔猪病毒性腹泻病料进行扩增, 部分检测结果见图 8, 双重 RT-PCR 可以特异的检测出腹泻病料中的 PDCoV 和 TGEV; 总的检测结果见表,5 份临床样品中, 检出 PDCoV 阳性样品份, 阳性率是.0%; TGEV 阳性样品份, 阳性率是.76%;PDCoV 和 TGEV 混合感染阳性样品份, 阳性率是 0.79%; PDCoV 和 TGEV 单一 RT-PCR 和双重 RT-PCR 检测结果一致, 符合率为 % 讨论 PDCoV 和 TGEV 是引起仔猪腹泻性疾病的重要肠道病毒 (Hu et al., 05; Ma et al., 05), 临床上主要引起仔猪腹泻呕吐和脱水等症状, 由这种病毒引起的仔猪腹泻在全世界范围内流行, 且混合感染情况比较普遍, 混合感染对仔猪肠道的损伤比单一感染严重很多 PDCoV 引起仔猪死亡率 (0% ~0%) 低于 TGEV 引起的死亡率 (%), 截止目前尚无有效的药物可对其控制, 并且两者在临床症状流行病学和病理变化上无明显差异, 给养猪业造成了巨大的经济损失因此, 本研究针对临床上

6 960 CCCTCCAGCAAGGTTCAAAATTTTGGAACTTATGTCCGAGAGACTTTGTACCCAAAGGAATAGGTAACAG CCCTCCAGCAAGGTTCAAAATTTTGGAACTTATGTCCGAGAGACTTTGTACCCAAAGGAATAGGTAACAG PMD-8T-TGEV-N CCCTCCAGCAAGGTTCAAAATTTTGGAACTTATGTCCGAGAGACTTTGTACCCAAAGGAATAGGTAACAG H55-N GGATCAGCAGATTGGTTATTGGAATAGACAAACTCGCTATCGCATGGTGAAGGGCCAACGTAAAGAGCTT 7 GGATCAGCAGATTGGTTATTGGAATAGACAAACTCGCTATCGCATGGTGAAGGGCCAACGTAAAGAGCTT PMD-8T-TGEV-N 7 GGATCAGCAGATTGGTTATTGGAATAGACAAACTCGCTATCGCATGGTGAAGGGCCAACGTAAAGAGCTT H55-N CCTGAAAGGTGGTTCTTCTACTACTTAGGTACTGGACCTCATGCAGATGCCAAATTTAAAGATAAATTAG CCTGAAAGGTGGTTCTTCTACTACTTAGGTACTGGACCTCATGCAGATGCCAAATTTAAAGATAAATTAG PMD-8T-TGEV-N CCTGAAAGGTGGTTCTTCTACTACTTAGGTACTGGACCTCATGCAGATGCCAAATTTAAAGATAAATTAG H55-N ATGGAGTTGTCTGGGTTGC ATGGAGTTGTCTGGGTTGC PMD-8T-TGEV-N ATGGAGTTGTCTGGGTTGC 55-N 图 Figure PMD-8T-TGEV-N 与 H55 N 基因核苷酸序列的比对分析 Comparison of the nucleotide sequences of N genes of PMD 8T-TGEV-N and H55 M M 图 Figure and TGEV 常见的仔猪腹泻类冠状病毒病 TGE 和新发的仔猪腹泻病 PDCoV, 建立了双重 RT-PCR 方法, 可以在一个反应体系中同时检测这两种病原, 为临床上对这两种疾病的诊断流行病学调查等研究提供了技术支持 PDCoV TGEV 单一和双重 RT-PCR 电泳 Single and duplex RT-PCR products of PDCoV M:DL DNA marker;:pdcov 和 PEDV;:PDCoV;: PEDV;: 阴性对照 : PDCoV and PEDV; : Negative control 传统的诊断 PDCoV 和 TGE 的方法有临床观察显微病变观察病毒分离荧光抗体检测免疫组织化学法等每种诊断方法都有其缺陷性 : 临床观察及显微病变无法区分是 PDCoV 感染还是 TGEV 感染 ; 病毒分离更加困难, 因为这种病毒只能适应某些特定细胞, 并且不易分离成功 ; 荧光抗体检测免疫组织化学法的最大缺陷是非特异性强 ( 陈芳等, 005), 而且需要特异性抗体 PCR 技术 0 图 5 Figure 5 and TGEV 双重 RT-PCR 的特异性实验 Specificity test of duplex RT- PCR of PDCoV M:DL DNA marker;:pdcov 和 TGEV 双重 PCR;~7 分别是 PDCoV TGEV PEDV PBoV PRV 和 PRRSV;8: 阴性对照 : Duplex RT- PCR of PDCoV and TGEV; ~7: PDCoV, TGEV, PEDV, PBoV, PRV and PRRSV, respectively; 8: Negative control 因具有快速特异敏感和易于操作等特点, 在畜禽传染病的检测鉴别诊断方面已得到了广泛应用多重 PCR 技术是在单一 PCR 基础上发展起来的一种检测技术, 能同时检测鉴别多种病原, 具有简便以及快速检测的优点 ( 李小康等, 007) 目前, 国内利用分子生物学技术鉴定 PDCoV 和 TGEV 仅是单一 RT-PCR 法, 对疑似病例需采用个单一 PCR 体系分别鉴定, 不仅操作繁琐, 而且耗费大时间长, 这对临床上区分这种病毒感染实用价值不大本实验根据 PDCoV 和 TGEV 基因组特点, 针

7 新发 PDCoV 和 TGEV 双重 RT-PCR 检测方法的建立及初步应用 96 Establishment and Preliminary Application of Duplex RT-PCR for Detection of Emerging PDCoV and TGEV 对其保守基因设计引物成功建立可以同时检测于临床上这种病的鉴别诊断和混合感染检测具 PDCoV 和 TGEV 的双重 RT-PCR 诊断方法一次有极其重要的应用价值 RT-PCR 反应就能快速鉴定区分样品中的 PDCoV 通过敏感性和特异性等实验对所建立的双重和 TGEV 达到对这两种疾病的同步诊断比单项 RT-PCR 方法进行了评价敏感性实验结果显示 PCR 节省试剂和时间减少了 PCR 仪使用次数对该方法对 PDCoV 和 TGEV 的最低检测浓度分别为 M 和.68 0 copies/μl 逢凤娇(05)在国 9 0 内首次建立了 PDCoV 的 RT-PCR 检测方法对 PD- CoV 最低检测浓度为.05 0 copies/μl 表明本研 0 究建立的多重 RT-PCR 反应具有较高的敏感性影物间的配对和竞争性扩增对扩增效果影响很大反响多重 PCR 扩增效果的因素很多引物的设计引应体系(PCR 缓冲液成分, dntp 浓度, 镁离子浓度图6 和酶浓度)和反应程序(退火温度, 退火及延伸时间双重 RT-PCR 的敏感性实验 Figure 6 和循环次数)的调整和优化也有利于提高 PCR 的 Sensitivity test of duplex RT- PCR of PDCoV 扩增效果此外在对抽提的 RNA 进行反转录时 and TGEV 所使用的引物对扩增效果也有较大影响特异性 M DL DNA marker ~0 分别为 09~ copies/μl 阴性对照实验结果表明双重 RT-PCR 方法对 PDCoV 检测为 ~0: 0 ~0 copies/μl, respectively; : Negative control 阳性对猪常见的一些病毒如 PEDV PBoV PRV 9 0 M 0 A M 0 图7 M 0 B 双重 RT-PCR 的重复性实验 Figure 7 Repeatability test of duplex RT-PCR of PDCoV and TGEV M DL DNA marker PDCoV和TGEV PDCoV TGEV 阴性对照 A B和C分别代表第一二和三周的RT-PCR A, B and C on behalf of the first, second, and third week of RT-PCR, respectively; : PDCoV and TGEV; : Negative control M 图8 部分临床样品的双重 RT-PCR 检测 Figure 8 The detection of clinical some samples by duplex RT-PCR M DL DNA marker ~9 临床样品 0 阳性对照阴性对照 ~9: Clinical samples; 0: Positive control; : Negative control C

8 96 表 Table 临床样品检测结果 PDCoV and TGEV detection result of clinical samples 检测病料 Samples PDCoV TGEV PDCoV+TGEV ) 样品数 / 份 Sample 单一 RT-PCR Single plex RT-PCR 阳性数 / 份阳性率 /% Positive samples Positive rate 双重 RT-PCR Duplex RT-PCR 阳性数 / 份阳性率 /% Positive Positive rate 符合率 /% Coincidence rate ):PDCoV 和 TGEV 共感染 ): PDCoV and TGEV co-infection 和 PRRSV 均未检出, 说明该方法具有较好的特异性本实验以含有 PDCoV 和 TGEV N 基因片段的重组质粒为模板进行了重复性实验, 次重复的结果一致, 显示出该方法具有较好的重复性, 且阳性重组质粒比病毒 RNA 稳定性好, 为下一步开发 PD- CoV 和 TGEV 检测试剂盒提供了阳性质控对照品用建立的 PDCoV 和 TGEV 双重 RT-PCR 方法对实验室收集的 5 份疑似病毒性腹泻病料进行了检测, 检出 PDCoV 阳性样品份, 阳性率是.0%,TGEV 阳性样品份, 阳性率是.76%, PDCoV 和 TGEV 混合感染阳性样品份, 阳性率 0.79%, 说明河南地区部分猪场存在 PDCoV 和 TGEV 感染, 并且存在共感染 05 年所报道的通过巣式 RT-PCR 检测中国江西的腹泻猪, 结果表明 PDCoV 单独感染率为.7%, 在猪腹泻样品中 PDCoV 的检测率为 58.% (Song et al., 05) 相比较本研究的 PDCoV 阳性检出率较低 (.%), 可能是因为不同地区 PDCoV 的流行情况不同, 也可能是因为猪腹泻样品采集的局限性 ( 样品采集和保存样品的代表性等 ), 关于 PDCoV 在河南省乃至全国的流行情况, 仍需要进行长期的动态监测将双重 RT-PCR 检测结果与单一 RT-PCR 检测结果进行了比较, 符合率 %, 表明所建立的双重 RT- PCR 敏感性与单一 RT-PCR 无明显差异, 可用于临床病料检测结论本研究建立的双重 RT-PCR 方法能特异敏感地鉴别检测 PDCoV 和 TGEV 两种病原, 与引起仔猪腹泻的 PEDV PBoV PRV 和 PRRSV 没有交叉反应, 对 PDCoV 和 TGEV 的最低检测量分别为. 0 和.68 0 copies/μl, 此方法简化了实验的操作, 缩短了检测时间, 为临床上对仔猪腹泻疫情的确切诊断提供了新的技术手段参考文献陈芳, 刘惠莉, 孙红立, 等多重 RT-PCR 检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒 [J]. 中国兽医学报, 5(): 9-. (Chen F, Liu H L, Sun H L, et al Multiplex RT-PCR for detection of Porcine transmissible gastroenteritis virus and Porene epidemic diarrheaa virus [J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 5(): 9-.) 逢凤娇, 俞正玉, 何孔旺, 等. 05. 猪 Deltacoronavirus RT- PCR 检测方法的建立及其应用 [J]. 中国预防兽医学报, 7(9): (Pang F J, Yu Z Y, He K W, et al. 05. Development and application of a RT- PCR assay for detection of Porcine deltacoronavirus[j]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 7(9): ) 李小康, 赵丽, 崔保安, 等多重 PCR 检测猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒的研究 [J]. 中国预防兽医学报, 9 (0): 7-0. (Li X K, Zhao L, Cui B A, et al Detection of Porcine parvovirus and Porcine pseudorabies virus by multiples polymerase chain reaction[j]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 9(0): 7-0.) Douglas M, Lindsey R, Yin J, et al. 0. Rapid detection, complete genome sequencing, and phylogenetic analysis of Porcine deltacoronavirus[j]. Emerging Infectious Diseases, 0(8): Homwong N, Jarvis M C, Lam H C, et al. 05. Characterization and evolution of Porcine deltacoronavirus in the United States[J]. Preventive Veterinary Medicine, (): 5-. Hu H, Jung K, Vlasova A N, et al. 05. Isolation and characterization of Porcine deltacoronavirus from pigs with diarrhea in the United States[J]. Journal of Clinical Micro-

9 新发 PDCoV 和 TGEV 双重 RT-PCR 检测方法的建立及初步应用 Establishment and Preliminary Application of Duplex RT-PCR for Detection of Emerging PDCoV and TGEV 96 biology, (): Jung K, Hu H, Eyerly B, et al. 05. Pathogenicity of Por cine deltacoronavirus strains in gnotobiotic pigs[j]. Emerging Infectious Diseases, (): Lee S, Lee C. 0. Complete genome characterization of Korean Porcine deltacoronavirus strain KOR/KNU- 0/ 0[J]. Genome Announcements, (6): e09-. Li G, Chen Q, Harmon K M, et al. 0. Full-length genome sequence of Porcine deltacoronavirus strain USA/IA/ 0/87[J]. Genome Announcements, (): e Ma Y, Zhang Y, Liang X, et al. 05, Origin, evolution, and virulence of Porcine deltacoronaviruses in the United States[J]. MBio, 6(): e Song D, Zhou X, Peng Q, et al. 05. Newly emerged Porcine deltacoronavirus associated with diarrhoea in swine in China: Identification, prevalence and full- length genome sequence snalysis[j]. Transboundary and Emerging Diseases, 6(6): Wang L, Byrum B, Zhang Y, et al. 0. Detection and genetic characterization of deltacoronavirus in pigs, Ohio, USA, 0[J]. Emerging Infectious Diseases, 0(7): 7-0. Woo P C, Lau S K, Lam C S, et al. 0. Discovery of seven novel mammalian and avian coronaviruses in the genus Deltacoronavirus supports bat coronaviruses as the gene source of Alphacoronavirus and Betacoronavirus and avian coronaviruses as the gene source of Gammacorona virs and Deltacoronavirus[J]. Journal of Virology, 86(7): ( 责任编辑王晓平 )

124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na

124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na 河南农业科学,2013,42(2):123-127 JournalofHenanAgriculturalSciences PCR PRRSV CSFV PCV2,, (, 450011) : 根据 TaqMan 复合荧光探针设计原则, 应用 Primer5.0 和 Oligo6.0 软件设计检测猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 猪瘟病毒 (CSFV) 和猪圆环病毒 2 型 (PCV2) 的特异性引物和探针,