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本安
5 years ago
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1 国际流行病学传染病学杂志年月第卷第期!" #$% &' () 论著多重荧光定量聚合酶链反应对呼吸道感染患儿支原体和衣原体感染的诊断价值李海华李静楼亚玲马志红钟婧郁峰戴利成 33 浙江省湖州市中心医院儿科李海华郁峰湖州市分子医学重点实验室李静马志红钟婧戴利成药剂科楼亚玲通信作者戴利成 ")" # )3"))$$)3)!)) 摘要目的探讨多重荧光定量 +, 技术 -./ 探针法在检测呼吸道感染住院患儿中肺炎支原体 / 肺炎衣原体 + 和沙眼衣原体 +- 的应用价值方法构建质粒标准品梯度稀释后进行扩增建立标准曲线检测多重荧光定量 +, 方法的扩增效率并验证其敏感性特异性和重复性收集 0 例疑似呼吸道感染住院患儿的咽拭子样本采用多重荧光定量 +, 技术检测 /+ 和 +- 基因片段其中 1 例样本同时进行 // 和 / 的血清学检测评价该方法在临床检测中的应用价值结果本实验中 /+ 和 +- 三种病原体的引物和探针的扩增效率分别达到 ) 和 1 三种病原体的最低检出浓度分别为 00 和 0 2 与其他已知病原体不存在交叉反应不同批次间三种病原体的扩增 + 值的变异系数均小于 3 份样本中多重检测出和阳性率分别为 ) 份!)""#$! 份和 $) # 份 $" 份样本中 // 阳性检出率为 $$) #+/ 阳性检出率为 ) # 结论多重荧光定量 +, 方法可以为临床幼儿呼吸道感染病原体的早期检测提供快速可靠的辅助诊断依据关键词聚合酶链反应呼吸道感染肺炎支原体肺炎衣原体沙眼衣原体基金项目湖州市公益性技术应用研究 345 湖州市重点科技创新团队项目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

2 8 国际流行病学传染病学杂志年月第卷第期!" #$% &' () $ $ )88; $ $ )24; $ $) 8 $ $ 3 $ $! +,+ )24; )2; $" ) -3 +,0 3 " ' "! 3 " "3 3 $ "!") + $ "3 " 0$ "!"!"!"# 93 "!" 0$"3 +"! -"3 $! (+! " 7 93 "!" 0$"3 +"! ""3-57,5 呼吸道感染是幼儿常见的感染性疾病其中肺炎支原体 + 肺炎衣原体,+ 和沙眼衣原体,- 是引起非典型症状肺炎的重要病原体由于这些病原体引起的呼吸道感染症状不典型影像学检查不易快速鉴别诊断目前这三种病原体的检测主要有免疫学方法和分离培养法而免疫学方法特异性不高分离培养比较耗时都不易快速确定病原体影响临床早期诊断和有效治疗也导致了耐药菌株的不断增加近几年核酸检测技术逐渐应用于微生物检测和研究中为临床诊断食品监测等领./ 域提供快速可靠的依据本实验通过多重荧光定量 +,0 方法检测呼吸道感染患儿咽拭子样本中的 +,+ 和,- 基因片段并评价该方法在临床检测中的应用价值材料与方法一主要试剂和仪器设备,-,+ 和 + 核酸检测试剂盒默乐生物公司 # - 1- ", - 质粒抽提试剂盒生物安全柜 ( 低温高速离心机荧光定量 +,0 仪 6 紫外分光光度计 60 二实验用菌株 +447#,+072#,-081# 核酸序列和金黄色葡萄球菌 417 肺炎克雷伯杆菌均来源于 -,, 解脲支原体呼吸道合胞病毒腺病毒来源于湖州市中心医院检验科大肠杆菌 #94 感受态细胞来源于湖州市分子医学重点实验室保存菌种三样本收集收集 5 年月至 54 年月在湖州市中心医院儿科住院的具有咳嗽和发热等呼吸道感染症状患儿咽拭子样本样本采集在患儿入院 3 内完成根据患者临床相关信息从中筛选出诊断结果为支气管肺炎婴儿肺炎和新生儿肺炎病例样本 4 例进行多重荧光定量 +,0 实验检测本实验内容经湖州市中心医院医学伦理委员会批准四样本处理样本处理在生物安全柜中进行采用热裂解法提取咽拭子样本的核酸 #( 具体步骤如下将收集的咽拭子置于 : 的生理盐水中反复洗涤后弃掉咽拭子吸取咽拭子悬液 55 : 至新的离心管中同时加入 4 : 内标核酸序列离心半径 55 离心 5 弃去上清 7 在沉淀中加入 44 : 裂解工作液震荡重悬瞬时离心后置 55 水浴中 5 取出后震荡混匀离心 5 离心半径 55 吸取上清至新的离心管标记保存备用采用生理盐水作为抽提样本核酸 #( 的阴性对照五多重荧光定量 +,0 扩增效率和灵敏度实验采用试剂盒提供的引物序列表分别以 +,+ 和,- 的核酸 #( 为模板进行 +,0 扩增构建重组质粒转化感受态菌株 #94 扩增培养后提取重组质粒进行基因测序然后将质粒按照 5 梯度稀释作为模板扩增以构建标准品曲线检测每对引物和探针的扩增效率和灵敏度 +,0 反应采用 4 : 体系进行扩增 +,0 缓冲液 2)5 : 引物探针混合液 )5:#( 聚合酶 5)4 : 灭菌水 )4 : 模板分别为梯度稀释的重组质粒扩增反应条件如下然后进行 5 个循环扩增 1 4 $48

3 国际流行病学传染病学杂志年月第卷第期!" #$% &' () 引物 0 0/ / (/ 表实验所用引物和探针序列序列 +,-. & $ & & 00 1$ & 0 1$ & $ : /01 产物长度 ' 注 / 肺炎支原体 0/ 肺炎衣原体 0 沙眼衣原体 (/ 阳性对照扩增六特异性实验参考样本处理方法提取解脲支原体呼吸道合胞病毒腺病毒金黄色葡萄球菌肺炎克雷伯菌的核酸 #( 同时以生理盐水作为核酸抽提对照在上述 /01 扩增体系中分别加入解脲支原体呼吸道合胞病毒腺病毒金黄色葡萄球菌肺炎克雷伯菌的核酸 #( 为模板同时加入灭菌水生理盐水抽提物和阳性质控品作为阴性和阳性对照模板采用上述条件进行扩增反应检测多重荧光定量 /01 的特异性七稳定性实验分别稀释 /0/ 和 0 的核酸 #( 以其为模板进行扩增分别比较不同稀释批次 #( 扩增进行多重荧光定量 /01 的重复性和稳定性检测每个病原体 #( 检测至少重复 5 次计算 5 次实验 0 值的变异系数八咽拭子样本的多重荧光定量 /01 检测多重荧光定量 /01 反应参考试剂盒说明书进行采用 + ; 扩增体系 /01 缓冲液 6)5 ; 引物探针混合液 )5 ;#( 聚合酶 5)+ ; 灭菌水 )+ ; 样本强阳性质控品弱阳性质控品生理盐水抽提物各 +)5 ; 作为反应模板同时加 +)5 ; 灭菌水作为 /01 扩增的阴性对照模板扩增反应条件如下 +5 + 然后进行 5 个 6 循环扩增 + $+9 质控标准强阳性质控品的 0 值均位于 5)55+)55 弱阳性质控品 0 值均位于 )55-)55/01 阴性对照靶基因 0-)55 或为阴性根据质控品的 0 值分布其中 / 阳性的荧光参考值是 -)60/ 阳性的荧光参考值是 -)0 阳性的荧光参考值是 -+)5 结果一多重荧光定量 /01 的扩增效率灵敏度特异性重复性检测结果将构建的 /0/ 和 0 的重组质粒按照 5 的比例稀释 + 个梯度即浓度从 ; 到 55 ; 以其为模板进行扩增建立的标准曲线见图 / 0/ 和 0 引物和探针的扩增效率分别达到 5)56)5 和 )95 根据 - 种重组质粒的最低稀释浓度和质控品的 0 值范围多重荧光定量 /01 对于 /0/ 和 0 的最低检出浓度分别为 +5+ 和 + ; 以其他已知病原体的核酸 #( 为模板进行扩增结果显示本实验多重荧光 /01 的引物和探针与其他病原体均不存在交叉反应结果见图根据 5 次不同稀释批次 #( 的多重荧光定量 /01 扩增结果三种病原体的 #( 扩增 0 值的变异系数均小于 - 表示本实验中的多重荧光定量 /01 反应具有良好的重复性二 /0/0 三种病原体的多重 /01 检测实时荧光定量 /01 检测操作严格按照试剂盒说明书进行在 + 份咽拭子样本中分别检测出 /0/ 和 0 阳性样本 -6 份份和份检出率分别为 -)95 )99 和 )6+ 同时检测出 / 和 0/ 双阳性样本 + 份检出率为 -)-- 种病原体的扩增见图 - 三三种病原体实验室荧光定量 /01 检测与临床检测的比较根据收集样本的临床血清学检测资料 + 份样本中有 9 份样本同时进行了血清学的 / 和 0/ 检测其血液样本采集于入院内并与荧光定量 /01 检测结果相比较结果显示 9 份样本中 / 的阳性检出率为 )6+0/

0 国际流行病学传染病学杂志年月第卷第期!" #$% &' () 0.) 0 0).) ).) 0 0).) ) 0.) 0 0).) ) 注肺炎支原体肺炎衣原体 2 沙眼衣原体图和 2 扩增的标准曲线 0.) 0.) 0.) 0.).).).).).).).).) + - + - 0 0 0 0+ 0- 循环注 2 沙眼衣原体肺炎衣原体肺炎支原体 ( 阳性对照扩增图多重荧光定量特异性扩增检测的阳性检出率为 )+, - 份血清学检测样本中有.

论测方面更具有优势近年来多重荧光定量技术也逐渐应用于呼吸道病原体的检测中与和 2 的研究也陆续见诸报道而与 2 相关的实验主要集中于生殖系统疾病的检测幼儿呼吸道感染方面的检测鲜有报道本实验采用多重荧光定量试剂盒同时检测呼吸道感染患儿呼吸道和 2 0 种病原体的基因片段首先检测了试剂盒的扩增效率灵敏度

4 0 国际流行病学传染病学杂志年月第卷第期!" #$% &' () 0.) 0 0).) ).) 0 0).) ) 0.) 0 0).) ) 注肺炎支原体肺炎衣原体 2 沙眼衣原体图和 2 扩增的标准曲线 0.) 0.) 0.) 0.).).).).).).).).) 循环注 2 沙眼衣原体肺炎衣原体肺炎支原体 ( 阳性对照扩增图多重荧光定量特异性扩增检测的阳性检出率为 )+, - 份血清学检测样本中有. 份样本进行了针对支原体感染的冷凝集试验检测其中有份样本的检测效价 /0 冷凝集试验的阳性检出率为 1+, 讨实时荧光定量技术是世纪末发展起来的分子检测方法以其高灵敏度高特异性操作简便等优点迅速应用于实验研究和病原体检测而多重荧光定量技术可以同时检测多个目标分子解决了检测样本通量问题因此在多种病原体的检论测方面更具有优势近年来多重荧光定量技术也逐渐应用于呼吸道病原体的检测中与和 2 的研究也陆续见诸报道而与 2 相关的实验主要集中于生殖系统疾病的检测幼儿呼吸道感染方面的检测鲜有报道本实验采用多重荧光定量试剂盒同时检测呼吸道感染患儿呼吸道和 2 0 种病原体的基因片段首先检测了试剂盒的扩增效率灵敏度特异性和稳定性结果显示本实验采用的多重荧光定量体系具有较高的扩增效率和 2 0 种引物和探针的扩增效率分别达到 1),+)1, 和 )-,0 种病原体的最低检出浓度分别为.. 和. 345 与其他已知的病原体不存在交叉反应 0 种病原体的 #(6 扩增值的变异系数均小于 0, 表示本实验中的多重荧光定量反应具有良好的重复性临床咽拭子样本中三种病原体的检测结果显示和的阳性检出率高于对应的免疫血清学检测而且发现和混合感染的病例目前湖州市中心医院在幼儿呼吸道感染 2 检测方面尚没有具体的检测方法因此本研究中病原体 2 的检出率仍待进一步的确认. 0 2 ( 循环循环循环注肺炎支原体肺炎衣原体 2 沙眼衣原体 ( 阳性对照扩增. 0 2 ( ( 图 2 阳性样本扩增和对照扩增情况

5 国际流行病学传染病学杂志年月第卷第期!" #$% &' () 本实验中收集的咽拭子样本和患者用于临床检测血液样本均采集于入院后内由于血清 +, 的产生直至检测出阳性结果需要周左右的时间根据本实验的检测结果多重荧光定量 -./ 方法采用咽拭子样本进基因水平的检测不受患儿免疫状态的影响而且取样方便适宜于患者早期检测和大量样本的初筛检测有利于快速鉴别病原体然而咽拭子收集到的细胞数量有限多重荧光定量 -./ 方法只是对病原体特异核酸片段的扩增并不能表明病原体是否具有感染活力因此仍需要与传统的病原体检测方法相结合以提高检测结果的准确性综上所述多重荧光定量 -./ 检测方法以其特异性敏感性稳定性高通量以及简便快捷的特点可以作为一种快速有效的检测手段用于幼儿呼吸道感染病原体的早期检测和诊断参考文献 01 侯瑞生王丽张勤等 ) 多重 -./ 技术及其在病原体检测中的应用 01) 中华全科医学 ) / ) 5 "! 6 $ " " + "01). 7 -" 8 8) : /; ( ) /!!! "!"! $) $ $ $01) "888 ) #8)<;$)88)8) )) 01 $ - ($$,# 7 5( ) /!"! +$ $+ " "$01) ) # 8)8<-5) ) 01 李瑾申红卫秦萌等 ) 新型多重 -./ 方法及其在呼吸道病毒诊断上的应用 01) 病毒学报 8 ===) 2 4, ) 6 -./$ "$ $ $$ +$$01). 8 ===) 01 + > 9 5 $ ). "! 6 -./ $! "! $!"$ 01), 8 ==) # 8)88<;)=) 0=1 >5 5>.? >. ) #"!! "# $) " " $"$ $+ $+ ' 6 -./ $$01) #+,"'!" #$ 8 8 ) # 8)8=<;)+"')88))8) 01 程鹏飞唐景峰程弘夏等 ) 淋病奈瑟菌沙眼衣原体细小脲原体多重荧光定量 -./ 检测方法的建立及临床应用 01) 中国生物制品学杂志 8 8 ).+ -& + ) # " " "!! $" -./ $! $ $ "! $ # %! &'01). 9 +" $ 8 8 ) 01 >$ 5 A" / ;$. ) #! 6 :9/ + -./! "+! # $)? 6"! #(501)!" #$ 88 = 8) 01 /$ 7 # ( $$. )!? 5 $ 6 -./ $$! $ $ "! $ #! # '# 01) 5-,% 8% 8 =) #8)<)8) 收稿日期 8=88

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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8 国际流行病学传染病学杂志 年 月第 卷第 期!" #$% &' () $ $ )88; $ $ )24; $ $) 8 $ $ 3 $ $! +,+ )24; )2; $" ) -3 +,0 3 " ' "! 3 " "3 3 $ "!") + $ "3 " 0$ "!"!"!"# 93 "!"

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