中国动物传染病学报年 9 月 herds. The information obtained from these investigations can be used to outline prevention and control of viral diseases. Keywords: S

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1 中国动物传染病学报,9(): - Chinese Journal of Animal Infectious Diseases 研究论文年国内部分省份猪场常见病毒性疾病的病原学调查童武,, 周艳君, 肖少波, 童光志, 陈焕春 (. 华中农业大学动物医学院, 武汉 ;. 中国农业科学院上海兽医研究所, 上海 ) 摘要 : 随着规模化养猪业的发展, 传染性疾病越来越多, 混合感染或多重感染十分普遍, 给疾病的诊断和预防带来很大困难本文将我们实验室年分别采自福建广西河南上海内蒙浙江江苏和山西等地发病猪场的 8 份病料, 通过 RT-PCR 和 PCR 方法对其进行猪繁殖与呼吸综合征病毒 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, ) 猪繁殖障碍的猪瘟病毒 (Classical swine fever virus, CSFV) 猪圆环病毒 (Porcine circovirus type,pcv) 猪细小病毒 (Porcine parvovirus, PPV) 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,prv) 细环病毒 (Torque teno virus,ttv) 等病毒检测结果表明在所检的病料中 PCV 和 TTV 的阳性率比较高, 分别为 9.%.% 和 9.% 有些地方 TTV 的阳性率高达 %; 同时, 还存在很普遍的与 PCV 与 TTV PCV 与 TTV 等混合感染, 混合感染率分别为.%.% 8.%; 以及 PCV 与 TTV 的三重感染率为.9% 同时对部分阳性病料的 GP 和 nsp 基因分别进行测序, 分析测序结果表明病料中的的 GP 和 nsp 序列与 HuN 株的相应序列的亲缘关系分别在 98.% 和 9.% 以上, 且在 nsp 区域都存在个不连续氨基酸的缺失, 说明现在临床中所流行的可能仍是与高致病性基因型相似的病毒通过本文可以及时了解当前养猪场的病毒性疾病的流行情况, 为猪场病毒性疾病的防控提供依据关键词 : 猪病毒性疾病 ; 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ; 流行病学中图分类号 :S8. : S8. 文献标志码 :A 文章编号 :-()-- EPIDEMIOLOGICAL ANALYSIS OF SWINE VIRAL DISEASES IN SOME OF PROVINCES IN TONG Wu,, ZHOU Yan-jun, XIAO Shao-bo, TONG Guang-zhi, CHEN Huan-chun (.Colledge of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University,Wuhan,China;. Shanghai Veterinary Research Institute,CAAS, Shanghai, China ) Abstract: Infectious diseases have become the major problem with the development of large-scale pig industry in China. Multiple infections often occur on many pig farms. In the present study, 8 samples collected from pigs of eight provinces in were tested in PCR or RT-PCR for porcine reproductive and respiratory syndrome virus (), classical swine fever virus(csfv), porcine circovirus type (PCV), porcine parvovirus (PPV), pseudorabies virus (PRV) and Torque teno virus (TTV). The results showed that positive rates for PCV, and TTV were 9.%,.% and 9.%, respectively. In some swine herds, positive rate of TTV infection was %. In addition, mixed infections were found common with.% for /PCV,.% for /TTV, 8.% for PCV/TTV and even.9% for PCV/TTV/. Furthermore, sequence analysis of GP and nsp genes from some of positive samples revealed 98.% or 9.% identities with those of the highly pathogenic (HP- ) HuN strain and a discontinued deletion of amino acids in nsp region, indicating widespread of HP- in pig 收稿日期 :-9- 基金项目 : 国家生猪现代产业技术体系建设项目 (NYCYTX-9) 资助作者简介 : 童武, 男, 硕士研究生, 预防兽医学专业通信作者 : 陈焕春, vet@mail.hzau.edu.cn

2 中国动物传染病学报年 9 月 herds. The information obtained from these investigations can be used to outline prevention and control of viral diseases. Keywords: Swine viral disease; Porcine reproductive and respiratory syndrome vivus (); epidemiology 从世纪 9 年代初起中国国内的养猪业迅速发展, 与此同时疾病也越来越多, 特别是病毒性疾病也越来越受到人们的关注引起猪繁殖障碍的猪瘟病毒 (Classical swine fever virus, CSFV) 猪细小病毒 (Porcine parvovirus, PPV) 乙型脑炎病毒 (Japanese encephalitis virus, JEV) 猪繁殖与呼吸综合征病毒 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, ) 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,prv) 等, 引起仔猪腹泻的猪传染性胃肠炎病毒 (Transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV) 猪流行性腹泻病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus,pedv) 轮状病毒(Rotavirus,RV) 等以及现在较为流行的猪圆环病毒 (Porcine circovirus,pcv) 细环病毒(Torque teno virus, TTV) 等病毒性疾病都是现今临床中猪重要的病毒性疾病 [,] 近几年来很多大规模性流行的传染病都是由病毒引起的, 如年全国爆发的人的非典型性肺炎 (SARS), 年爆发的高致病性禽流感, 以及年中国南方地区大面积爆发的高致病性蓝耳病可见, 病毒性疾病是当前阻止养猪业发展的一大难题, 而且现今临床中混合感染比较常见王天户等 [] [] 分别利用 RT-PCR 和 PCR 方法, 对来自山东及周边地区 8 家猪场的份临床病例进行了和 PCV 的检测, 结果发现 PCV 和混合感染病例 8 份, 阳性率达.% 王礞礞等 [] 通过 PCR 及巢式 PCR 方法, 对来自广东福建和江西等个省的 8 份血液样品和组织样品进行了 TTV TTV PCV 检测, 结果表明猪群中 TTV 和 TTV 阳性率分别为.% 和 8.%, 二者的混合感染率为.%; PCV 和 TTV 的混合感染率为.%;PCV 和 TTV 的混合感染率为.8%; 另外, 还有一些样品为三重感染, 占.% 材料与方法. 病料年我们实验室采集到的病料主要来自福建广西河南上海内蒙浙江江苏山西等省市发病猪场的各个阶段的猪, 包括哺乳保育期仔猪育肥猪及其种猪大多以发烧精神沉郁厌食为主要临床症状病料主要有四种类型 : 血液内脏组织 ( 肺脾腹股沟淋巴结 ) 精液及粪便. 试剂试剂盒及引物 AMV 逆转录酶 TaqDNA 聚合酶 RNA 酶抑制剂各种浓度的 dntp oligo (dt) 8 primer, GB Buffer,pMD -8T Vector, DNA Marker DL 等均为宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司产品 ;RNA 提取试剂盒购自 QIGEN 公司 ; 组织 / 细胞基因组 DNA( 小量 ) 提取试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司本研究所用到的所有引物均为本实验室之前设计保存的引物, 引物序列见表表 PCR 检测引物序列 Table Primers sequences for PCR amplification 病原 Pathogen 引物名称 Primers 引物序列 Sequences of primers S 片段大小 (bp) Size of PCR product(bp) ORFup ORFdown 'CTGTGCTATCATTGCAGAAGTCGT' 'TGGCAATTTGAATGTTCAAGTATG' CSFV PCV NSPup NSPdown CSFVup CSFVdown N N 'CAACACCCAGGCGACTTCAGAAATG' 'CCAAGTCAGCATGTCAACCCTATC' 'TTCCTACCGGCTGTCCTTTGGGCCAACT' 'TGATAGTTGAACCGGCTTTGGC' 'TGAAGTAACGGGAGTGGTAGGAG' 'TGGAGAAGGAAAAATGGCATC' 9 8

3 第 9 卷第期童武等 : 年国内部分省份猪场常见病毒性疾病的病原学调查续上表病原 Pathogen 引物名称 Primers 引物序列 Sequences of primers 片段大小 (bp) Size of PCR products(bp) PPV PRV TTV PPV PPV gbf gbu C C C C 'TCAATACTTGGGGGAGGG' 'GTGTTCCTGGGTGTTGGTC' '-CCAGTCCCAGGCCACCGTGAAGTG-' '-ATCGCCGTGCTCTTCAAGGAGAAC-' 'AGTTACACATAACCACCAAACC' 'ATTACCGCCTGCCCGATAGGC' 'CCAAACCACAGGAAACTGTGC' 'CTTGACTCCGCTCTCAGGAG'. 核酸的提取本实验室核酸提取均采用试剂盒进行提取 RNA 的提取参照 QIGEN 公司 RNA 提取试剂盒说明 ;DNA 的提取参照上海华舜生物技术有限公司, 组织 / 细胞基因组 DNA( 小量 ) 提取试剂盒说明. 反转录采用 μl 体系, 全过程都在冰上操作依次加入 : Reverse Transcriptase Buffer μl dntp Mix ( mmol/l each) μl RNase inhibitor.μl oligo (dt) 8 primer μl AMV Reverse Transciptase μl RNA 样品. μl 混匀后, 室温放置 min 后移入水浴恒温槽中保温 h 后置入冰上冷却 min, 此反应液可立刻用于 PCR 反应或 - 保存备用. PCR 本文章所检测的各种病毒, 除了 PRV 以外都按照以下体系进行 PCR(μL 体系 ): Buffer μl dntp Mix (. mmol/l each). μl 上游引物. μl 下游引物. μl Taq 酶. μl ddh O. μl cdna/dna μl [-] 由于 TTV 在病料中的病毒滴度比较低, 所以本实验室检测 TTV 一般采用套式 PCR 的方法进行检测第一次和第二次 PCR 反应的体系参照上述反应体系第一次 PCR 的模板用 DNA, 第二次 PCR 的模板是第一次 PCR 的产物 [] PRV 按如下体系进行反应 : GB Buffer μl dntp Mix (. mmol/l each) μl 上游引物. μl 下游引物. μl Taq 酶. μl ddh O.88 μl DNA μl 将上述 PCR 反应体系配好后置于 PCR 仪上, 分别按下述条件进行反应 ( 表 ) 病原 Pathogen 预变性 Pre-denaturing 表各种病原的 PCR 反应条件 Table Conditions for PCR amplification 变性 Denaturing 退火 Anealing 延伸 Extension 再延伸 Extension s s CSFV s s PCV s s PPV 9 min 9 s s s min PRV 8 s s TTV () s s TTV () s s 保存 Store. GP 和 nsp 基因序列分析我们把 PCR 结果阳性的病料, 按地域, 每个地方选 ~ 个样品, 用检测引物把的 GP 与 nsp 基因分别克隆出来, 然后连 pmd -8T Vector 载体, 转化 DHa 大肠杆菌, 挑阳性菌落送测序每份样品都是同时测 GP 与 nsp 的序列结果. 临床样品检测结果由我们的检测结果可以看出 PCV TTV 的感染率都很高, 分

中国动物传染病学报年 9 月别为 9.%.% 和 9.% 特别是 TTV, 很多出 PRV 各地都存在二重混合感染的情况主要以地方的阳性率可高达阳性率最低的也高达 +PCV +TTV 以及 PCV+TTV CSFV 的总体感染率不算很高但不同地方的混合感染较常见混合感染率分别为. 的差异还是非常明显上海市和河南省的送检样品. 8.

9 表表临床样品检测结果总结表 Table Summary of detecting results of clinical samples 地区样品数 Region No.

4 中国动物传染病学报年 9 月别为 9.%.% 和 9.% 特别是 TTV, 很多出 PRV 各地都存在二重混合感染的情况主要以地方的阳性率可高达阳性率最低的也高达 +PCV +TTV 以及 PCV+TTV CSFV 的总体感染率不算很高但不同地方的混合感染较常见混合感染率分别为. 的差异还是非常明显上海市和河南省的送检样品. 8. 不同地区混合感染率比例相差非中 CSFV 阳性率都在以上而福建浙江常明显如江苏省和 PCV 的混合感染率江苏山西省送检病料的 CSFV 均未检出 PPV 和高达而山西省没有检出 +PCV 的混 PRV 的阳性率都很低仅广西和内蒙古分别检出合感染 PCV 和 TTV 的三重感染情况来例 PPV 阳性病料而各地送检病料中均未检也存在感染率为.9 表表临床样品检测结果总结表 Table Summary of detecting results of clinical samples 地区样品数 Region No.of samples CSFV PCV PPV PRV TTV +PCV +TTV PCV +TTV +PCV +TTV 福建 ( 份 ) 广西份河南 8 份上海份 8 8 内蒙份浙江份 8 江苏份 9 8 山西份总计 8 份 9(9.%) (.%) (.%) (.8%) (%) (9.%) (.%) 8(.%) 8(8.%) (.9%). 部分样品测序结果分析将克隆好的阳性质粒 HuN 株的相应序列的同源性分别都在 98. 和送往英潍捷基上海贸易有限公司测序测序 9. 以上图图且和 HuN 株结果通过 DNAstar 软件分析发现临床上流行的一样与经典毒株 CH-a 相比在 nsp 上都存在的 GP 与 nsp 基因与高致病性个不连续的氨基酸缺失图图测序样品与 HuN GP 的同源性比较 Fig. Identities of GP genes between HuN and clinical samples

5 童武等年国内部分省份猪场常见病毒性疾病的病原学调查第 9 卷第期图测序样品与 HuN nsp 的同源性比较 Fig. Identities of nsp genes between HuN and clinical samples CH-a AGATTTTGCT...GTCCCGACCGATGACGCCCTTGAGTGAGCCAATTTTTGTGTCTGCACCGCGACACAAATTTCAGCAGGTGGAAGAAGCGAATCCGGCGG GG HuN AGAA--ACT...G A GG 8GXNN WGAA--ACT...G A GG 8GXNN- 8GXNN-8 8GXNN- 8GXNN- 8GXNN- 8GXNN-9 8GXNN- 9SHNH- 9HNMY8 9HNMY- 9HNMY- 9HNMY-9 NMCF-ZZJB FJZZ FJ 8GXNN AGAM--ACT...G A GG 图样品与 HuN 及 CH-a nsp 序列比对结果 Fig. Comparison of nsp of s HuN, CH-a and clinical samples 同时我们也分别针对 GP 与 nsp 的亲缘关系做了简单的进化树分析由进化树可见所有样品的 GP 与 nsp 测序结果都和高致病性猪蓝耳病病毒株处于同一分支因此我们推测现在临床中所流行的病毒仍是与高致病性基因特征相似的病毒图图讨论通过本试验的检测结果使我们了解到现今养猪场内常见的病毒性疾病的流行情况这给以后的病毒性疾病的防制提供了依据众所周知病毒性疾病与细菌性疾病不同用抗生素类药物就可以控制病毒性疾病的控制主要还是靠疫苗接种然而疫苗

6 中国动物传染病学报年 9 月 FJZZ-GP.seq HuN--F G P.seq 9SHNH-GP.seq GD GP.seq JX GP.seq HuN- GP.seq 8GXNN-GP.seq FJ-GP.seq 8GXNN-GP.seq HuB GP.seq 8GXNN9-GP.seq 9HNMY-GP.seq HeB GP.seq NMCF-ZZJB-GP.seq 8GXNN-GP.seq 9HNMY-9-GP.seq WUH GP.seq 9HNMY-8-GP.seq 8GXNN-GP.seq HLM-9, GP.seq SD-9, GP.seq 8GXNN8-GP.seq 8GXNN-GP.seq 8GXNN-GP.seq 8GXNN-GP.seq SX-9, GP.seq HLJ-9,GP.seq 9HNMY-GP.seq CH GP.seq VR--9-USA U89.seq PA8--Canada AF8.seq B-98-USA AF89.seq SE--Austria AY8(GP).seq LV-9-Netherlands M9.seq Euro.seq. Nucleotide Substitutions (x) 图根据 GP 基因序列所绘制的进化树 Fig. Phylogenetic tree based on GP gene of s JX NSP.seq WuH NSP.seq SX-9, NSP.seq 8GXNN--NSP.seq HeB NSP.seq 9HNMY--NSP.seq 8GXNN--NSP.seq 8GXNN--NSP.seq 8GXNN-9-NSP.seq 8GXNN--NSP.seq HLM-9, NSP.seq SD-9, NSP.seq HLJ-9, NSP.seq HuB NSP.seq GD NSP.seq 8GXNN--NSP.seq 9HNMY-9-NSP.seq FJZZ-NSP.seq HuN--F NSP.seq 9HNMY8-NSP.seq 9SHNH--NSP.seq FJ-NSP.seq 9HNMY--NSP.seq NMCF-ZZJB-NSP.seq 8GXNN-8-NSP.seq HuN- N SP.seq 8GXNN-NSP.seq 8GXNN-NSP.seq VR--9-USA U89.seq PA8--Canada AF8.seq B-98-USA AF89.seq CH NSP.seq Euro.seq LV-9-Netherlands M9.seq.8 Nucleotide Substitutions (x) 图根据 nsp 基因序列所绘制的进化树 Fig. Phylogenetic tree based on nsp of s

7 第 9 卷第期童武等 : 年国内部分省份猪场常见病毒性疾病的病原学调查的接种也不是随便乱接种的, 得有一个合理的免疫程序要制定出一个合理的免疫程序, 首先要了解当地的疫病流行情况, 再结合养猪场的实际情况来制定本试验所有的检测病料均是来自各地的发病猪场检测结果表明送检病料中 PCV 和 TTV 的阳性率很高, 并且还存在多重混合感染的情况临床上单纯感染猪的死亡率不算很高, 单纯感染 PCV 的猪的死亡率很低, 单纯感染 TTV 的猪往往不表现任何临床症状通常两种或三者病原混合感染死亡率会升高, 到底是哪种病毒对猪只死亡率升高起主要作用仍不十分清楚感染后会引起猪的免疫抑制, 免疫系统一旦抑制以后机体的抵抗力必然降低, 从而使其他病原有机可乘, 这可能是众多病原与混合感染的重要原因从我们的检测结果来看, 不同的病毒在不同地区的流行性还是存在着很大的差异, 如福建省广西省河南省上海市内蒙古浙江省江苏省山西省 PCV 的感染率分别为 8.% 9.%.% 9.% % % 8%.9%, 说明病毒的流行性存在一定的地域差异性所以临床中如果要进行活体动物或其畜产品的转运, 一定做好检疫工作同时对病毒性疾病的防控要因地制宜, 坚持预防为主防治结合的原则通过我们的测序结果可以看出现在临床中流行的 GP 和 nsp 和高致病性的 HuN 株的核苷酸同源性很高, 且在 nsp 区都存在个不连续氨基酸的缺失, 由此我们推测现在临床中流行的仍是与高致病性具有相似遗传特征的病毒那为什么没有出现像年那样的大面积的爆发呢, 可能和疫苗的接种有关系自年高致病性爆发以来, 针对高致病性的疫苗也不断的被研制出 [8], 对高致病性的防控起到了积极的作用参考文献 [] 王礞礞, 周艳君, 陈宗艳, 等. 我国猪群中 TTV 的鉴定及其分子流行病学分析 [J]. 中国预防兽医学报,9, (): -. [] Zhu C X, Shan T L, Hua X G, et al. Molecular detection and sequence analysis of feline Torque teno virus (TTV) in China[J]. Virus Res,, (-): -. [] Opriessnig T, Shen H G, Meng X J, et al. A live-attenuated chimeric PCV vaccine is transmitted to contact pigs but is not upregulated by concurrent infection with PPV and and is efficacious in a PCVa--PPV challenge model[j]. Clin Vaccine Immunol,, 8(8): -8. [] 王天户, 娄中子, 刘思当. 猪繁殖障碍与呼吸道综合征病毒和猪圆环病毒型混合感染的流行病学调查及综合诊断 [J]. 中国畜牧兽医,, (): 98-. [] 谢志勤, 谢芝勋, 廖敏, 等. RT-PCR 检测猪瘟病毒方法的建立与应用 [J]. 畜牧与兽医,, (): -. [] 李春阳, 单松华, 华修国. 应用 RT- PCR 技术快速检测鉴定猪瘟病毒 [J]. 上海交通大学学报,, (): - 9. [] 芦银花, 许立华, 陈溥言, 等. 猪圆环病毒型及猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速检测 [J]. 中国病毒学,, 8(): 8-8. [8] An T Q, Tian Z J, Zhou Y J, et al. Comparative genomic analysis of five pairs of virulent parental/attenuated vaccine strains of [J]. Vet Microbiol,, 9(-): -.

124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na

124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na 河南农业科学,2013,42(2):123-127 JournalofHenanAgriculturalSciences PCR PRRSV CSFV PCV2,, (, 450011) : 根据 TaqMan 复合荧光探针设计原则, 应用 Primer5.0 和 Oligo6.0 软件设计检测猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 猪瘟病毒 (CSFV) 和猪圆环病毒 2 型 (PCV2) 的特异性引物和探针,

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