细小病毒 2 和火鸡细小病毒 TP1-2012/HUN 毒株之间的同源性分别为 42.4% 和 37.9%, 因此把这 3 种病毒归为一个新的属 Chapparvovirus 2017 年我国 Xing 等 [4] 也从 2014 年保存的广东省 2 个商品代猪场的猪血清中检测到了 PPV-7

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夙瞿
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1 猪细小病毒 7 型 Taqman 实时荧光 PCR 检测方法的建立与应用张志 1, 张丽丽 1,2, 刘爽 1, 单虎 2, 李晓成 1, 王树双 (1. 中国动物卫生与流行病学中心, 山东青岛 ;2. 青岛农业大学, 山东青岛 ) 摘要 : 猪细小病毒 7 型 (Porcine parvovirus 7,PPV-7) 是近年新发现的一种细小病毒亚型为建立 PPV-7 快速准确的检测方法, 以 PPV-7 病毒全基因组为模板, 设计合成 1 对引物和 1 条 Taqman 探针, 建立了 PPV-7 Taqman 实时荧光定量 PCR 检测方法本方法的标准曲线分析显示, 其常数为 , 敏感性可以达到 46 个病毒拷贝 /μl, 批内和批间重复性试验的变异系数均小于 2% 用猪圆环病毒 2 型 3 型, 猪细小病毒 1 型, 猪伪狂犬病病毒等病原进行特异性试验, 证实本方法不能从这些病毒中检测出特异性条带, 表明本研究建立的 PPV-7 实时荧光 PCR 方法具有特异性强敏感性高重复性好的特点用临床样品对该方法进行了应用性评价, 从 96 份样品中检出 52 份 PPV-7 阳性样品, 证实了本方法在生产实际应用的可行性关键词 : 猪细小病毒 7 型 ; 实时荧光定量聚合酶链式反应 ;Taqman 探针中图分类号 :S 文献标识码 :A 文章编号 : X(2018) DOI : /j.issn X Development and Application of Taqman Real-time PCR Method for Detection of Porcine Parvovirus 7 Zhang Zhi 1,Zhang Lili 1,2,Liu Shuang 1,Shan Hu 2,Li Xiaocheng 1,Wang Shushuang 1 (1. China Animal Health and Epidemiology Center,Qingdao,Shandong ,China ; 2. Qingdao Agricultural University,Qingdao,Shandong ,China) Abstract :Porcine parvovirus 7(PPV-7)is a subtype of parvovirus newly discovered in recent years. In order to establish a rapid and accurate detection method for PPV-7,a pair of primers and a Taqman probe were designed and synthesized using the whole genome of PPV-7(KU563733)as a template,and a real-time quantitative PCR method for the detection of PPV-7 was established. The standard curve analysis showed its constant was and the minimum detection limit was 46 copies/μl. For the intra-assay and inter-assay reproducibility tests,all the coefficients of variation were less than 2%. Using the developed method to conduct specificity tests,specific bands couldn't be detected from porcine circovirus type 2 and 3,porcine parvovirus type 1 and porcine pseudorabies virus. These results indicated that the PPV-7 real-time fluorescent PCR method had strong specificity,high sensitivity and reliable reproducibility. Its application was also evaluated by usage of clinical samples. Among 96 samples,52 of them were detected positive for PPV-7,which further confirmed the wide feasibility of this method. Key words :porcine parvovirus 7 ;real time PCR ;Taqman probe 1 猪细小病毒 (Porcine parvovirus,ppv) 属于细小病毒科, 是一种单股非囊膜线性 DNA 病毒, 基因组大小为 4~6.3 kb [1] PPV 最早发现于 1965 年, 基金项目 : 国家科技基础性工作专项 (2012FY111000) 通信作者 : 李晓成主要引起母猪不孕不育, 以及产死胎或木乃伊胎等繁殖障碍症状, 是影响养猪业的重要疫病之一 2016 年 Palinski 等 [3] [2] 首次从美国健康猪的棉拭子中, 通过基因组测序鉴定出一种新的 PPV 亚型病毒, 并将其命名为 PPV-7 该病毒的 ORF 与狐蝠 90

2 细小病毒 2 和火鸡细小病毒 TP1-2012/HUN 毒株之间的同源性分别为 42.4% 和 37.9%, 因此把这 3 种病毒归为一个新的属 Chapparvovirus 2017 年我国 Xing 等 [4] 也从 2014 年保存的广东省 2 个商品代猪场的猪血清中检测到了 PPV-7, 表明我国已有 PPV-7 感染的存在, 且至少可以追溯到 2014 年以前本实验室在前期工作中用普通 PCR 方法也鉴定并分离到一株 PPV-7 病毒为进一步了解 PPV-7 在我国猪场的流行状况, 本研究以此病毒为参考毒株, 构建了 PPV-7 Taqman 实时荧光 PCR 方法, 并选择我国部分省市的猪场样品进行了实际检测本方法的建立为开展 PPV-7 流行病学调查监测和诊断等提供了技术支撑 1 材料与方法 1.1 样品来源 96 份猪病料 : 来自福建山东河南等省份, 表现发热腹泻流产等临床症状的发病猪群 1.2 病毒 PPV-7 病毒株 SD10: 本实验室鉴定和分离 ; 猪圆环病毒 2 型 (PCV-2) 猪圆环病毒 3 型 (PCV-3) 猪伪狂犬病病毒 (PRV) 猪细小病毒 1 型 (PPV-1): 本实验室分离鉴定和保存 1.3 主要试剂 Real Time Taq 试剂盒 (RR390A) pmd-18t vector 和 DH5α 感受态细胞 : 宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司产品 ; 病毒 DNA 提取试剂盒 (DNAZol): Life 公司产品 1.4 引物设计 [10] 参考 PPV-7 基因组序列 (KU563733) 和文献的检测方法, 并在其基础上进行改进, 设计 1 对新引物 PPV7-F1 和 PPV7-R1, 以及 1 条荧光探针引物 PPV7-P1 序列分别为 : PPV7-F1:5'-GAGGCGGTGATGGAGCAGA T-3'; PPV7-R1:5'- CTCCAGGACCACCACATCCC -3'; PPV7-P1:5'-FAM-CGCCGCGCGCATGTTG- CTCTCG-BHQ1-3' 引物由宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司合成 1.5 样品 DNA 提取根据 DNAzol 说明书, 从猪样品中提取总基因组 DNA, 20 保存备用 1.6 阳性标准品制备以引物 PPV7-F1 和 PPV7-R1 为扩增引物, 以阳性样品 SD10 提取的 DNA 为模板进行 PCR 扩增 ; 将 PCR 扩增产物克隆到 pmd-18t 载体中, 再转化至 DH5α 感受态细胞进行蓝白斑筛选 ; 挑取阳性克隆测序, 提取质粒并测定浓度, 将此质粒的浓度调整为 15 ng/μl( 即 copies/μl), 作为 PPV-7 标准品进行相关的荧光 PCR 试验 1.7 荧光 PCR 方法建立以阳性 PPV-7 的标准品样品为模板, 建立荧光 PCR 方法配制的荧光 PCR 反应体系包括 :Premix EX-Taq 反应液 12.5 μl, 上游引物 (10 μmol/l) 下游引物(10 μmol/l) 和荧光探针 (5 μmol/l) 各 1 μl,dna 标准品 2 μl, 用 ddh 2 O 补充至 25 μl 荧光 PCR 的反应扩增条件为 :95 预变性 3 min,45 个扩增循环 (95 5 s s),60 读取荧光 1.8 标准扩增曲线建立和敏感性试验将浓度为 15 ng/μl 的 PPV-7 阳性质粒标准品分别进行 10 倍倍比稀释, 然后以 10-2 ~10-8 等 7 个稀释度为模板, 进行荧光定量 PCR 扩增 ; 将各浓度得到的 Ct 值为纵坐标, 以稀释倍数的负对数为横坐标, 制作标准曲线, 在此基础上确定荧光 PCR 的敏感性和最小检测极限 1.9 特异性试验用建立的 PPV-7 荧光 PCR 方法, 同时扩增 PCV-2 PCV-3 PRV PPV-1 等提取的 DNA 模板, 观察本方法检测其他病原时的荧光 PCR 反应结果, 评价本方法的特异性 1.10 重复性试验将已知浓度的 PPV-7 阳性标准品分别稀释至和 10-8, 分别进行组间和组内重复性试验组内重复性试验时, 每个浓度分别用本方法重复检测 3 次 ; 组间重复性试验时, 分别在 3 个时间, 用本方法重复检测 3 次, 最后对检测结果进行统计学分析, 评价本方法的重复性 91

3 1.11 实际应用采用建立的荧光 PCR 方法, 对从临床采集的 96 份猪样品进行检测, 通过扩增的阳性结果, 评价本方法在实际生产应用中的可行性 2 结果与分析 2.1 阳性标准品制备和浓度测定以 PPV-7 病毒株 SD10 提取的 DNA 为模板, 用引物 PPV7-F1 和 PPV7-R1 进行扩增, 扩增到一条大小为 117 bp 的特异性条带该特异性条带与 pmd18-t 载体连接和转化 DH5ɑ 感受态细胞后, 从板上随机挑选 6 个白色菌落, 提取质粒 DNA, 再用 PCR 进行鉴定, 发现这 6 个样品中, 有 4 个可以检测到 117 bp 大小的目的基因将其中 3 条最亮条带对应的质粒样品送去测序, 并与 PPV-7 参考毒株 KU 进行同源性分析, 发现这 3 条带与 PPV-7 参考毒株的同源性均为 100%, 表明这 3 个质粒均含有 PPV-7 将这 3 份质粒混样进行浓度测定, 发现为 μg/μl; 再用 TE 缓冲液调整浓度为 15 ng/μl, 并以此作为 PPV-7 阳性标准品, 命名为 PPV7-SD10 同时将质粒 pmd18-t 空白载体也稀释成 15 ng/μl 作为阴性标准品 2.2 荧光 PCR 方法建立本研究中, 引物和探针的加样体积分别以和 2 μl 加样另外, 反应条件筛选时选择 3 个指标进行不同组合, 变性时间选择了 95 1 min 2 min 3 min 和 5 min, 退火温度按照 55~62 间隔 1, 同时变性时间从 10 s 到 30 s 将这些不同的反应条件组合交叉进行试验, 通过多次试验优化后, 获得最佳反应体系和最佳反应条件, 即每一种引物均加入 0.5 μl, 反应条件为 95 预变性 3 min, 45 个扩增循环 (95 5 s s),60 读取荧光, 此时获得的反应结果最好 2.3 特异性试验以阳性标准品 PPV7-SD10 的 10-5 稀释的 DNA 为模板, 进行荧光 PCR 扩增, 结果可以扩增出一条特异性的 S 形曲线, 同时用建立的荧光探针方法对 PCV2 PCV3 PRV 和 PPV-1 等其它 DNA 病毒进行扩增, 结果均没有扩增出特异性条带, 表明本方法对 PPV-7 具有较好的特异性, 对其它 DNA 病毒无扩增交叉反应 ( 图 1) 图 1 PPV-7 荧光 PCR 方法的特异性 2.4 标准曲线和敏感性试验将构建好的 PPV7-SD10 阳性标准品 10 倍倍比稀释后的 DNA 为模板进行荧光 PCR 扩增, 发现随着模板拷贝数的降低, 扩增的 Ct 值逐渐增加, 当稀释度达到原模板浓度的和 10-8 时, 扩增的 Ct 值分别为和 35.01, 扩增曲线仍然为一条典型的 S 形曲线, 但当稀释倍数递减为 10-9 时, 荧光 PCR 扩增不出典型的 S 型曲线, 表明本方法的检测极限是样品的 10-9 稀释倍数 ( 图 2) 以等不同浓度的反对数为横轴, 以对应的 Ct 值为纵轴制作标准曲线 ( 图 3), 可图 2 荧光探针方法的敏感性试验结果 92

图 3 荧光探针方法的标准曲线以得到相关的回归方程 :y=4.154 6x+4.292 8, 相关系数 R 2 =0.999 2, 说明 Ct 值与拷贝数之间呈现非常强的线性关系, 表明本方法稳定性好对不同浓度的模板使用本方法进行检测, 均可以得到较好的试验结果 2.

4 图 3 荧光探针方法的标准曲线以得到相关的回归方程 :y= x , 相关系数 R 2 = , 说明 Ct 值与拷贝数之间呈现非常强的线性关系, 表明本方法稳定性好对不同浓度的模板使用本方法进行检测, 均可以得到较好的试验结果 2.5 重复性试验用上述稀释倍数为的标准品为模板 DNA, 进行组间和组内重复性试验, 重复 3 次后进行统计分析, 发现 3 次重复的变异系数 (CV) 均小于 2%, 表明本方法的重复性较好 ( 表 1 图 4) 表 1 不同浓度模板进行 PPV-7 荧光 PCR 重复性的变异结果组内重复性组间重复性稀释倍数 Ct 平均值变异系数 /% Ct 平均值变异系数 /% 1: ± ± : ± ± : ± ± : ± ± : ± ± : ± ± 阴性对照 ND ND ND ND 注 :ND 表示未检出 2.6 实际应用用建立的荧光方法, 对 96 份猪样品进行检测, 发现有 52 份样品扩增出典型的 S 型曲线 ( 图 5), 与阳性样品结果一致, 阳性率为 54.2%, 表明本方法是可行的, 可用于 PPV-7 的流行病学调查和监测 3 讨论 PPV 在猪群中普遍存在, 是猪群常见的多发性疫病 [5] 最近几年, 随着检测技术的发展, 除发图 4 荧光 PCR 方法的重复性试验结果图 5 荧光探针 PCR 检测临床样品 PPV-7 的结果现了经典的猪细小病毒 (PPV-1) 以外, 还陆续发现了 PPV2 PPV7 等不同的亚型 [6-9], 因此建立这些 PPV 亚型的快速准确方便的检测方法具有重要意义尽管病原检测有 PCR 纳米 PCR SYBR Green 荧光 PCR 等方法 [10-12], 但基于 Taqman 探针的实时荧光 PCR 方法仍然是检测病原最常用的方法它具有特异性强敏感性高的特征, 在病原检测领域广为应用猪瘟口蹄疫等一大批动物疫病病原检测都已建立了实时荧光 PCR 技术 [13-14] 本研究建立的 PPV-7 荧光 PCR 方法的最低检测极限是 45 个病毒拷贝 /μl, 显示出极高的检测敏感性这一检测极限与孙文超等 [12] 建立的 SYBR Green 荧光 PCR 方法能检测出 50 个病毒拷贝 /μl 的检测极限基本一致另外, 本研究建立的荧光 PCR 方 93

5 法也表现出良好的特异性, 完全可以与经典 PPV-1 和其他猪病病原区别开, 从而为 PPV-7 的流行病学调查和监测提供了有效技术支撑在临床病料的实际应用中, 本方法也表现出了较好的效果, 从 96 份病料中检测出 52 份阳性病料, 阳性检出率达 54.2% 这一结果虽然比孙文超等 [12] 检出的 71.88% 略低, 但高于 Xing 等猪血清中检出的 32.8% 这些结果表明我国猪群的 PPV-7 感染状况较为严重另外本研究采集的阳性病料来自山东江西广西等省份, 可以看出 PPV-7 在我国猪群中流行较为广泛, 须引起重视但是, 本研究仅仅是针对送检病料进行了被动监测, 其检测结果的代表性不够全面, 还需要开展更系统的流行病学调查和主动监测, 进一步摸清 PPV-7 在我国猪群的感染和流行规律作为 2016 年新鉴定和检测到的一种血清型, PPV-7 仍存在致病机制不清流行规律不明, 检测方法匮乏等诸多需要解决的问题本文建立的实时荧光 PCR 方法有助于 PPV-7 的早期诊断和发现, 对于该病原的监视和流行趋势判断都有重要意义 4 结论本研究以 PPV-7 全基因组为模板, 设计合成引物和 Taqman 探针, 建立了 PPV-7 Taqman 实时荧光定量 PCR 检测方法本方法对 PPV-7 具有较好的特异性, 对其它 DNA 病毒无扩增交叉反应 ; 其最低检测极限为 45 个病毒拷贝 /μl, 具有极高的检测敏感性 ;3 次重复试验的变异系数 (CV) 均小于 2%, 重复性较好因此, 本方法可用于 PPV-7 的流行病学调查和监测, 对于该病原的监视和流行趋势判断具有重要的技术支撑意义参考文献 : [1] STRECK A F,CANAL C W,TRUYEN U. Molecular epidemiology and evolution of porcine parvoviruses [J]. Infection,genetics and evolution,2015,36(12): [2] MENGELING W L,PEJSAK Z,PAUL P S. Biological assay of attenuated strain NADL-2 and virulent strain NADL-8 of porcine parvovirus [J]. American journal of [4] 在 veterinary research,1984,45(11): [3] PALINSKI R M,MITRA N,HAUSE B M. Discovery of a novel Parvovirinae virus,porcine parvovirus 7,by metagenomic sequencing of porcine rectal swabs [J]. Virus genes,2016,52(4): [4] XING X,ZHOU H,TONG L,et al. First identification of porcine parvovirus 7 in China [J]. Archives of virology,2018,163(1): [5] XIAO C T,GERBER P F,GIMÉNEZ-LIROLA L G, et al. Characterization of porcine parvovirus type 2(PPV2) which is highly prevalent in the USA[J]. Veterinary microbiology,2013,161(3/4): [6] OPRIESSNIG T,XIAO C T,GERBER P F,et al. Identification of recently described porcine parvoviruses in archived North American samples from 1996 and association with porcine circovirus associated disease [J]. Veterinary microbiology,2014,173(1/2):9-16. [7] HUANG L,ZHAI S L,CHEUNG A K,et al. Detection of a novel porcine parvovirus,ppv4,in Chinese swine herds [J]. Virology journal,2010,7(1):333. [8] XIAO C T,GIMENEZ-LIROL L G,JIANG Y H,et al. Characterization of a novel porcine parvovirus tentatively designated PPV5 [J]. Plos one,2013,8(6):e [9] NI J,QIAO C,HAN X,et al. Identification and genomic characterization of a novel porcine parvovirus (PPV6)in china[j]. Virology journal,2014,11(1): 203. [10] 邹敏, 李陆梅, 宫晓, 等. 猪细小病毒 PCR 检测方法的建立与应用 [J]. 中国动物检疫,2016,33(8): [11] 崔宇超, 彭永刚, 马兴杰, 等. 猪细小病毒高效纳米 PCR 检测方法的建立 [J]. 中国预防兽医学报,2014, 36(4): [12] 孙文超, 韩继成, 谢长占, 等. 猪细小病毒 7 型 SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测方法的建立 [J]. 中国预防兽医学报,2017,39(8): [13] 梁晓艳, 万东山, 郭兰英. 多重荧光 RT-PCR 技术检测猪流感病毒猪乙型脑炎病毒猪瘟病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒方法的建立 [J]. 中国动物检疫, 2015,32(4): [14] 于新友, 李天芝. 猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法双重荧光 RT-PCR 检测方法的建立及应用 [J]. 中国动物检疫,2018,35(4): ( 责任编辑 : 朱迪国 ) 94

124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na

124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na 河南农业科学,2013,42(2):123-127 JournalofHenanAgriculturalSciences PCR PRRSV CSFV PCV2,, (, 450011) : 根据 TaqMan 复合荧光探针设计原则, 应用 Primer5.0 和 Oligo6.0 软件设计检测猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 猪瘟病毒 (CSFV) 和猪圆环病毒 2 型 (PCV2) 的特异性引物和探针,

细小病毒 2 和火鸡细小病毒 TP1-2012/HUN 毒株之 间的同源性分别为 42.4% 和 37.9%, 因此把这 3 种 病毒归为一个新的属 Chapparvovirus 2017 年我国 Xing 等 [4] 也从 2014 年保存的广 东省 2 个商品代猪场的猪血清中检测到了 PPV-7

细小病毒 2 和火鸡细小病毒 TP1-2012/HUN 毒株之间的同源性分别为 42.4% 和 37.9%, 因此把这 3 种病毒归为一个新的属 Chapparvovirus 2017 年我国 Xing 等 [4] 也从 2014 年保存的广东省 2 个商品代猪场的猪血清中检测到了 PPV-7