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1 复旦学报 医学版 血清 ((. 水平对肝细胞癌 患者预后判断的临床价值 马晓路 谈绮文 彭颖斐 张春燕 吴 炯 郭 玮 潘柏申 复旦大学附属中山医院检验科 上海 摘要 目的 评估血清 3&377 水平与肝细胞癌 $!! '- 患者术后复发转移和预后的相关性 方法 收集 至 年间 例在复旦大学附属中山医院进行 - 根治切除患者的术前血清以及其中 例术后 个月的血清 随访至 年 月 采用 %.1) 方法定量检测 - 患者术前以及术后血清 377 水平 分析 377 高 低组患者主要临床相关资料差异 并评价其与患者复发 预后的相关性 结果 年内共有 人发生复发 年复发率为 5 高 377 组 年无瘤生存率显著低于低 377 组 5 '( 5 复发低危亚组中高 377 组复发率高于低 377 组患者 包括单个肿瘤 5'(5 无卫星灶 5 '(5 无血管侵犯 5 '(5.) 5 '(5 两组患者的临床病理特征的差异无统计学意义 多因素结果提示高 377 为术后无瘤生存的独立预后因素 - 为 51 为 受试者工作特征曲线分析显示术前血清 377 水平对预测 - 患者术后复发具有较好的特异性 5 术后 377 持续维持在高水平的患者具有更高的复发率 5 结论 术前血清高水平 377 预示 - 患者早期复发率高 血清 377 水平可有效预测 - 切除术后患者的预后 监测 377 可以帮助临床制定最有效的 - 治疗方案 关键词 肝细胞癌 -377 预后 血清标志物 中图分类号 文献标志码 )0""& $#$##% ((.#"!'' #%!# )4&*)( /&%(#&;-)($&+#6 +)(&"$!!". %!#$%&' * "#$!#"" "!' 3&377$!! '-"!!!" "!!"!"'"!!'"-"!##!!"!#;$#"$$"!!"!"! "$!!""! ' $!!" &" 6%.1) "" $!"!! "!377"!'!'$"&$#!"!'!, $#$ 377" $!, 377!! - '3!#$&!""!!!$&!!!!" "5-#$ 377!""#!$!&!'!#!"" **!"'! $377!""#! 5'(5"$!!$#$ 377 十二五 国家科技支撑计划 )1 国家临床重点检验专科建设项目!!"#$!%&',"$2"&$""$

2 复旦学报 医学版 年 月!"""$!$#$!!" #"!!!$$"$377!""!!!"",#!"#"#'!5'(5," """5 '(5," "!" 5 '(5. "# ) 5 '(5 ( "#$# $!!"" ",$ #!"!""!$ 377 "!#"!!** -51!!# $!!""!"""$ $!!377$$#$" 5!#!!!!""$!'$#$377"!!"$$#$"!!!,,"5#'#-#$!!"!' 377"""$!!! -!!!"377"!#"!!! -" '!#377$#$'"'!"!#" (&)$!! '377!#"""!' '!! *")+)!!& " "#'# *"#'$&'$%# "*)'",8'#./0.#(&5&'#''$##2 肝细胞癌 $!! '- 是最常见的恶性肿瘤之一 发病率在恶性肿瘤中位居世界第 位 死亡率居第 位 我国占全球肝癌发病率及死亡率的一半 且发病率正在逐年升高 手术切除是目前 - 根治性治疗的主要手段 但是 - 根治性切除术后 年内仍有 55 的患者出现转移复发 转移复发是 - 患者术后的主要死亡原因 它已成为进一步提高肝癌治疗效果的 最主要障碍 根据回顾性临床研究显示 肝内复发呈现双时相性 大部分复发时间发生于接受手术后 年内 之后复发率趋于平缓 故将术后 年内 的复发定义为早期复发 在临床工作中通过分子标志物预测个体复发和预后危险度 进而指导临床监测与治疗 显示出其至关重要的作用 传统的临床病理评价如肿瘤形态 组织病理学特征和肿瘤分期包含信息量有限 并不能非常有效地预测 - 切除术后患者的复发转移风险 因此 临床迫切需要一些新的生物学标志来判断 - 患者术后转移复发的危险度 进而指导临床个体化治疗 近期研究显示 3&377 是 + 信号途径中重要的分泌型抑制因子 在肿瘤的发生 发展中起重要作用 成年人体内几乎不表达 377 仅 在胎盘和胚胎组织中可检测到 等研究显示 - 患者中 377 水平高于健康对照 *# 等对 377 诊断 - 进行性能评价 显示 其敏感性为 5 特异性高达 5$ 等组织的大规模多中心 377 研究发现 377 联合甲 胎蛋白 $&!) 诊断 - 的敏感性为 5 特异性为 5 受试者工作特征曲线!!!#$!!"6 下面积 为 等通过微列阵分析发现 377 在 - 组织中表达量明显高于癌旁组织 在 - 患者血清中也检测到高浓度 377 同时 - 组织中 377 上调水平与患者预后具有相关性 在早期和 ) 阴性患者中具有极高的转移复发预示价值 因此 377 可能是一个潜在的 - 肿瘤诊断和预后评估的标志物 血清标志物具有易检测 可重 复 侵入少的特点 在临床诊断以及预后评估中占有重要的地位 然而 血清 377 水平对于 - 切除术后患者转移复发风险尤其是早期肝内复发风险的预测价值尚未见报道 本研究旨在定量检测 - 患者血清 377 水平 评估 377 对肝癌患者术后早期复发和预后的相关性 为 - 患者转移复发预测评估提供新的血清学参考指标 资料和方法 研究对象 本研究前瞻性入组 至 年在复旦大学附属中山医院进行 - 根治切除患者 例 其中男 例 女 例 年龄为 岁 依据 年版原发性肝癌诊疗规范! 标准病理组织学诊断为 - 术前均未接受过放疗 化疗等相关治疗 采集 - 患者术前血清标本 所有患者

3 马晓路 等 血清 377 水平对肝细胞癌 - 患者预后判断的临床价值 术后每 个月随访肿瘤标志物 超声 * 等检测肿瘤有无转移复发 采集患者资料 包括年龄 性别 肝炎背景 肝功能状态 是否肝硬化 甲胎蛋白 ) 肿瘤数量 肿瘤大小 有无包膜 有无卫星灶 微血管侵犯 %' " 分级和. 分期 终点事件定义为术后一年发生肝内复发 复发时间 '!!!** 定义为手术当日到最初 发现复发时之间的时间间隔 在此 名入组患者中 名同意接受术后 个月随访再次抽血检测 本研究得到复旦大学附属中山医院伦理委员会批准 并获得患者知情同意 入组标准 符合 - 诊断 年龄 周岁 接受根治性切除术 术后病理证实为 - 排除标准 既往有其他恶性肿瘤史 合并有其他恶性肿瘤 术前无影像学资料 术后病理证实非干细胞肝癌诊断 无随访资料或失访 标本采集 术前一天抽取待检者静脉血 '. 置于未加抗凝剂含分离胶试管 3) 中 待凝血后 # 离心 ' 分离血清 置 9 冰箱保存备用 用于检测 377 蛋白 肿瘤标志物和肝功能实验室检测指标 术后 个月门诊随访时同样方法采集外周血 并分离血清 冻存于 9 冰箱保存备用 血清 ((. 检测 按照 377 定量检测 %.1) 试剂盒 3"'""() 说明书操作 双抗夹心测定 377 蛋白浓度 在预包被 377 单克隆抗体的 %.1) 板上加入. 样本稀释液 随后加入标准品或 稀释的血清样本. 标准曲线采用复孔加样 并留取一孔只加稀释液作为空白对照 经室温孵育 $ 洗板 次后加入. 辣根过氧化物酶标记的兔抗 377 多克隆抗体 室温孵育 $ 洗板 次后加入. 含过氧化氢和联苯胺的底物溶液 避光室温孵育 ' 显色 加入. 终止液后 '' 双波长检测各孔吸光度 值 标准品为人重组 377 蛋白 标准曲线浓度依次为 #'.#'. #'.#'.#'.#'. 和 #'. 采用 参数.#" 拟合曲线对 377 蛋白浓度进行定量 血清肝炎和肿瘤标志物检测 使用 $!% 全自动电化学发光分析仪 $!' 进行乙肝表面抗原 $""! #-")#) 检测 检测试剂采用 $ 原厂配套试剂 $!' 血清肝功能生化检测 使用 -1*)-1 自动化生化仪 -$ 和 %4 4%& "' 进行肝功能 $&#$ 分级相关检测项目 包含总胆红素,!,* 白蛋白,'). 谷丙转氨酶 #'&!!"'").* 凝血酶原时间!$! ',* 其中 *). 与 ).* 采用 $ 检测试剂盒 $!'* 采用 "' 原厂检测试剂盒 "' 统计学分析 采用 1) 软件进行统计学分析 研究定量资料若符合正态分布 用 描述 若不符合 则采用中位数 四分位间距 描述 连续变量两组间比较采用 检验 等级变量比较采用 检验或 "$! 精确概率法分析 采用多因素 64 回归模型分析影响长期预后的独立危险因素 - 值和 5 可信区间!1 关联强度 生存分析采用 7&! 法 为差异有统计学意义 结 果 患者中血清 ((. 表达水平 例 - 患者血清中均可测得 377 表达 血清 377 中位水平为 #'. 四分位间距 #'. 患者临床基本资料比较 患者的临床特征信息如表 所示 平均年龄 岁 岁 其中男性 人 5 女性 人 5 巴塞罗那分期!!!. ) 期即早期 - 患者 名 5 期即中晚期 - 患者 名 5 术后 年随访时间内有 人发生复发 术后 年复发率为 5 由于血清 377 水平呈偏态分布 因此采用 百分位数 #'. 作为高 377 水平的 & 值 决定值 将 例患者根据血清 377 水平分为两组 377 水平 #'. 为高 377 组 #'. 为低 377 组 对比发现两组患者在年龄 性别 -")# $&#$ 分级 是否肝硬化 ) 水平 肿瘤数量 肿瘤大小 有无包膜 有无卫星灶 微血管侵犯 %' " 分级和. 分期等方面差异均无统计学意义 表

4 复旦学报 医学版 年 月 表. 临床特征与术前血清 ((. 关系 *.'#)#'#!"'$'" #!!% ((. $!!"" )# " 377 #'. 377 #'. ' -")# (# " $&#$ ).!!!$"" ( " ).*. ) #'. *'!',! # *'!"2'' *'!" ' ( "" ( " 8"!" ( " %' ""#. )!! ( " ).*)!"'"))$&!.!!!3773& 术前血清 ((. 水平高低和无瘤生存的相关性 在 个月的随访中 高 377 组 例患者无瘤生存时间显著低于低 377 组 两组的无瘤生存时间分别为 天和 天 年累积无瘤生存率分别为 5 和 5 图 图. 术前 ((. 水平与无瘤生存率的相关性,$.'#)#!!% ((.# %' 血清 ((. 水平在低复发风险亚组中的预测价值 在复发低危亚组中 高 377 组复发率高于低 377 组患者 包括单个肿瘤 5 '( 5 无卫星灶 5 '(5 无血管侵犯 5 '(5. ) 期 5 '(5 图 影响术后肿瘤复发因素的 7 回归分析 采用 64 比例风险模型对各种风险预测因素 包括年龄 性别 -")#$&#$ 分级 是否肝硬化 ) 水平 肿瘤数量 肿瘤大小 有无包膜 有无卫星灶 微血管侵犯 %' " 分级. 分期和术前血清 377 水平与转移复发的关系 单因素分析显示卫星灶 - 为 51 为 血管侵犯 - 为 5 1 为. 分期 - 为 51 为 和术前血清 377 水平 - 为 51 为 是影响 - 早期复发的危险因素 多因素分析发现仅卫星灶 - 为 51 为. 分期 - 为 51 为 和术前血清 377 水平 - 为 5 1 为 可作为影响 - 早期复发的独立危险因素 表

5 马晓路 等 血清 377 水平对肝细胞癌 - 患者预后判断的临床价值 图 低危组术前 ((. 水平与无复发生存率的关系,$'#)#!!((.#'!'#')#+$! 表 影响术后肿瘤复发因素的 7 回归分析 *##%'7$##'&'#!"'$'"!"!""!"" )# () () () () -")# () ().!!!$"" () () $&#$ () () ).* () () ) () () *'!',! () () *'!"2 () () *'!" () () "" 8"!" %' ""# () (). 377 ).*)!"'"))$&!.!!!3773&--2!!

6 复旦学报 医学版 年 月 ((. 预测早期复发的 曲线分析 使用 6 曲线对术前血清 377 预测早期复发的效能进行评估 结果显示 377 预测早期复发的 6 曲线下面积为 灵敏性为 5 特异性为 5 结果显示血清 377 水平对于评估早期复发具有较好的特异性 图 ) 术前术后血清 ((. 变化预测早期复发的价值 例入组患者中 名患者术后 个月随访时采集外围血并进行了血清 377 的检测 结果显 示 相较于术前 术后外周血 377 水平显著下降 中位浓度 #'.'(#'. 图 根据 377 检测结果 可将配对的 例患者分成 组 术前低 术后也是低 377 水平 术前高 术后低 377 水平 术前高 术后也是高 377 水平 组人群的复发率分别是 55 5'( '( '( 图 图 / 术前 ((. 水平评估早期复发的 曲线分析及术前 术后 ((. 水平动态变化对复发的影响,$/#'& "'&#!##&!!((.#!$#$## &#%"#$((.### )6!""!!3773"!, 377!",!!!"!#" "# 377!'!!!"$!""$#$377!" 377! '$#$!"" 377! 讨 论 伴随 - 防治的不断深入 很多 - 患者尚在早期即被发现和治疗 但现有标准多是基于影像学检查和病理形态学分级 不能完全反映肿瘤的生物学特性 判断预后的灵敏性和特异性还有待提高 难以适应目前分子诊断和分型的需要 因此 寻找新的能够充分反映 - 生物学特性的预后判断与治疗分子标志物 并在此基础上对 - 进行分子分型研究成为 - 患者进行个体化防治的关键环节 通过大量 - 预后分子标志物的研究 众多新型 - 预后标志物被发现 血清标志物具有易检测 可重复 非侵入性 标本用量以及人为干扰少等优点 且无需复杂的标本前处理 故其在 - 的 诊断和预后预测中均占有重要的地位 尽管目前已有多种 - 预后潜在分子标志物被报道 主要包括血清标志物 )3 和组织标志物 细 胞角蛋白 细胞角蛋白 )(7 骨桥蛋白 分子标志物 '! () 但是目前对于这些标志物的使用仍缺乏临床共识 因此 挖掘新的 - 血清预后标志物势在必行 377 作为 + 信号通路抑制剂受到广泛研究 377 是一种分泌性糖蛋白 相对分子质量! 约为 377 通过 + 受体.! 结合从而阻断.! 介导的 + & 信号传递 是 + 信号通路的重要抑制因子 大量研究显示 377 表达异常与肿瘤的发生 发展相关 "" 等报道骨髓瘤细胞分泌 )(7. 升高伴破骨细胞活性增强 因此血清 )(7. 可作为多发性骨髓瘤复发预测指标 多发性骨髓瘤患者可引起血清 377 和 )(7. 水平升高 导致多发性骨髓瘤患者发生弥漫性骨质疏松和高钙血症等全身反应 / 等发现在 -.)&) 的伴随下细胞毒性 * 细胞可以直接识别骨髓瘤细胞表面的 377 肽段并发起攻击 因此 377 可能是一个潜在的多

7 马晓路 等 血清 377 水平对肝细胞癌 - 患者预后判断的临床价值 发性骨髓瘤抗原 并可用于免疫靶向治疗 -! 等在 377 的表观遗传学研究中发现肾癌患者 377 表达沉默 377 再表达可在肾癌中导诱细胞凋亡和细胞周期阻滞 等 报道 - 组织 377 高表达患者远期预后较差 377 单独或联合 & 可作为 - 预后预测标志物 本研究对 例 - 患者进行了术前血清 377 水平检测 研究术前血清 377 与 - 患者接受根治性切除术后肿瘤早期肝内复发之间的关系 相关回顾性研究显示 - 术后复发被定义成两类 术后 年内发生的早期复发以及术后 年后 发生的晚期复发 由于本研究的随访时间相对较短 所以将重点事件定义为术后 年内发生的早期复发 我们首先发现血清高水平 377 与 - 术后患者早期复发率显著高于低 377 患者 由于目前对于早期 - 患者的预后判断仍是困扰临床医师的一个难题 因此我们进一步探究 377 在预测早期肝癌患者术后复发中的价值 结果显示在.) 的早期肝癌患者中 377 高水平患者早期复发率显著高于低水平患者 且差异具有统计学意义 除此以外在多个 - 低危复发组包括单个肿瘤 无卫星灶 以及无血管侵犯 - 患者亚组中 术前高 377 也预示着术后高肿瘤复发风险 通过多因素 模型以及 6 分析证实术前血清 377 水平是预示 - 早期复发的独立风险因素 - 为 5 1 为 并且具有较高的预测特异性 5 这些结果提示了 377 是一个理想的 - 尤其是早期 - 根治性术后预测复发风险预测血清学标志物 我们还收集了 例配对术前术后血清 发现术后 377 水平较术前有显著下降 提示 377 可以做为一个理想的监测手术治疗疗效的血清学标志物 根据 377 动态变化与患者预后之间的分析 我们发现术后维持高血清 377 水平的患者早期复发率显著高 提示了对 - 患者进行 377 术前术后动态检测可以筛选出高危患者 从而可以更有针对性地对这些患者制定术后辅助治疗方案 降低复发率 提高预后 本研究中血清 377 预后判断点定为 百分 位数 #'. 低于 $ 等研究报道的 377 诊断 - 的 & 值为 #'. 造成预后判断值远低于诊断值的原因可能由于文献中 377 检测采用的手工包被 %.1) 检测系统 而本研究采用的则是 377%.1) 预包被检测系统 %.1) 检测体系的差异可能导致了本研究 377 预后判断值较低 本研究为首次通过术前血清 377 水平预测 - 根治切除术后患者短期无瘤生存以及早期复发风险 术前血清高水平 377 预示 - 患者预后不良 尽管存在单中心 样本量小以及随访时间较短等不足之处 但是本研究仍为进一步探究血清 377 水平与 - 患者预后相关性奠定了基础 为临床提供了 - 辅助预后预测的血清标志物新线索和依据 综上所述 我们相信检测血清 377 可以有效地筛选出具有高转移复发风险的患者 协助临床针对这些高危患者制定更加有效的个体化肿瘤监测和治疗方案 从而提高肝癌综合治疗的疗效 参 考 文 献 #("$$' 3')!""" *,!!!).!-!! ' "!( # )$!%!!!!!!!"! $!! '!#"$!'" *$ 7!$ -! 3! ",#!!" ""'#'!" 1' #7(""+"##) '' $' ''-' "- %-!" -#$ "!'+"##! * (', ** )!+$,! 3&"!#!""!''$! *#%7(# 16# "!' 377 " #",'!! $!! ' #$$0! $/#4!!' 377"!,'!!!$#"" $!! '!#&"'!" "0! #44!%!"" 377 " "" $ "'!,& '!!#"" $!! '",! 下转第 / 页

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