阿拉西 斯尔克米德克 等 黑豆皮茶中酚酸类物质组成分析及抗氧化能力,&'++/,/,2,!.23',+,&//&2:'+:+/;',/3++/.&//&2&.3 ;./&',+, ;3&,/0!..+/0&2+/,&,+/+;+,,&2:'+:+/;'+ 3,/0.+;3&,/0 *+5

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1 第 卷第 期 年 月 上海交通大学学报 农业科学版! "#!$ %!%#%# "&'& 文章编号 黑豆皮茶中酚酸类物质组成分析及抗氧化能力 阿拉西 斯尔克米德克 冯子倩 李艳芳 刘来玉 胡保明 牛宇戈 俞良莉 上海交通大学农业与生物学院 上海 山西青玉油脂有限公司 太原 马里兰大学营养与食品科学系 马里兰 摘 要 为了研究黑豆皮茶加工前后总酚含量 酚类物质组成及抗氧化能力的变化 本文采用福林酚法测定 种种壳原料的总酚含量 经自由基清除实验确定总酚含量与抗氧化能力的关系 并应用 9%< 技术研究了黑豆皮加工前后的酚酸组成差异 结果发现总酚含量与过氧自由基和羟自由基清除能力成正相关 但是与 二苯 苦基肼,;./5';, '99 自由基的清除能力没有相关性 黑豆皮经焙炒加工后 总酚含量下降 清除过氧自由基和羟自由基的能力与原料相比分别降低 和 同时清除 99 自由基能力增加了 分离鉴定出 种酚酸 其中原儿茶酸等组分经烘炒后含量下降 阿魏酸含量升高 这些结果表明黑豆皮在加工前后自由基清除能力的变化可能与加工过程中酚酸物质的损失和部分抗氧化活性因子的暴露有关 为进一步开发应用黑豆皮茶提供了理论基础 关键词 黑豆皮茶 总酚含量 抗氧化能力 酚酸类物质 9%< 中图分类号 文献标识码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收稿日期 基金项目 国家自然科学基金青年科学基金项目 山西青玉油脂有限公司企业资助项目 作者简介 阿拉西 斯尔克米德克 女 硕士生 研究方向 功能性食品大分子研究 俞良莉 为本文通讯作者 女 教授 博士生导师 研究方向 食品功能成分研究 #*+,''5*

2 阿拉西 斯尔克米德克 等 黑豆皮茶中酚酸类物质组成分析及抗氧化能力,&'++/,/,2,!.23',+,&//&2:'+:+/;',/3++/.&//&2&.3 ;./&',+, ;3&,/0!..+/0&2+/,&,+/+;+,,&2:'+:+/;'+ 3,/0.+;3&,/0 *+5:3'+,..'&&2;./&',&*;&/+/.;&3&2&* +/,&,+/+,6,52+&3 # :'+:+/;'+&+';./&',&//+/,&,+/;./&',+,9%< 黑豆皮 又称乌衣 料豆衣 为豆科植物黑大豆的干燥成熟种皮 富含果胶 花青素 原花青素 维生素 黄酮及多种矿物质 具有一定的营养价值和药理 作用 其提取物在降血糖 降血脂以及延缓衰老 等方面都有重要作用 在黑豆加工过程中 豆皮常常被去掉 豆皮的营养价值和药用价值没有得到 充分的利用 随着我国居民生活水平的提高 消费观念的变化 茶饮料因其具有低热量 低脂肪 低糖 具有提神等功效备受人们关注 充分利用黑豆制品 如豆油 豆乳 豆粉等 生产加工过程中的副产物 黑豆皮制成黑豆皮茶产品 填补市场上黑豆皮可食用性的研究空缺 具有一定的市场价值和经济前景 研究表明 植物多酚含量及种类与其抗氧化性 能有关 天然植物多酚种类很多 包括简单结构的酚酸类 苯丙素 黄酮类等化合物 也包括高分子 聚合物 如木质素 大分子色素及单宁等 植物多酚的酚羟基中邻位酚羟基极易被氧化 对氧自由基具有较强的捕捉能力 表现较强清除自由基的能力和抗氧化性 黑豆皮中含有丰富的酚类物质等生 物活性成分 可作为天然来源的抗氧化剂 评价黑豆皮茶加工前后抗氧化性能及鉴定酚酸类化合物的种类和含量差异 可为黑豆皮茶作为功能性食品研发提供理论依据和技术支撑 目前多采用超高效液相色谱法 9% 测定植物酚酸种类和含量 $+& 等 借助 9% 鉴定出 种赤小豆中芥子酸 阿魏酸 对香豆酸 种酚酸的含量差异 & 等利用 9%< 检测出了牛蒡叶片中阿魏酸 绿原酸 咖啡酸 对香豆酸 苯甲酸 种酚酸 9% 具有高分力度 高灵敏度 快速分析等特点 再联合质谱技术 能够显著提高鉴定分析酚酸化合物的工 作效率 目前黑豆皮的化学成分报道主要集中 在花青素方面 对于其他成分尚有待于深入研 究 在热处理对酚酸含量的影响方面 等发现煮沸或蒸汽热处理都会使黑豆中没食子酸 原儿茶酸 对羟基苯甲酸 香草酸 香豆酸 芥子酸等酚酸含量减少 本文首次采用焙炒手段对黑豆皮进行处 理 并研究此处理对黑豆皮酚酸类组成的影响 本文通过福林酚法和 种抗氧化能力评价实验比较了食品中 种常用的种壳原料的总酚含量和抗氧化能力 及黑豆皮加工前后其总酚含量和抗氧化能力的变化 探讨了总酚含量与不同自由基清除能力间的相关性 同时采用 9%< 分析黑豆皮在焙炒加工前后酚酸类物质的含量变化 为进一步开发黑豆皮茶为功能食品提供理论基础 材料与方法 实验试剂 二苯 苦基肼 99 羟基 四甲基色烷 羧酸 3&'& 水溶性维生素 # 类似物 偶氮二 甲基丙基咪 二盐酸盐 9 荧光素 2'&3,/ 标准品原儿茶酸 ;3&&+.,+, 香草酸 6+/,', 对羟基苯甲酸 ;.53&5:/-&, +, 绿原酸.'&3&0/,+, 香豆酸 &*+3+ 丁香酸 53,/0,+, 阿魏酸 23',+, 芥子酸,/+;,+, 咖啡酸 +2,+, 购自美国,0*+'3,. 公司 双氧水 丙酮购自上海凌峰化学试剂有限公司 氯化铁 磷酸氢二钠 磷酸二氢钠 福林酚 碳酸钠 没食子酸购自国药集团化学试剂有限公司 超纯水经 <,',D 6+/+0 系统纯化 实验材料实验所用黑豆皮由山西青玉油脂有限公司提供 红豆 绿豆产自吉林省白城市洮南市 采集时间均为 年 月 车前壳样品产于大连长海县 采集时间为 年 月 由尹海波教授 辽宁中医药大学 鉴定 ) 实验方法 黑豆皮茶的制作工艺筛检黑豆皮 去除其中的豆瓣杂草 清洗去除沙土 清洗后的黑豆皮置于 > 烘箱 烘干. 冷却后的黑豆皮置于洁净锅中 > 条件下 以

3 上海交通大学学报 农业科学版 第 卷 3*,/ 的速度逆时针拌焙炒 *,/ 将加工而得的黑豆皮茶用粉碎机粉碎 过 目筛 样品制备方法对绿豆 红豆进行人工取皮 随后 黑豆皮 绿豆皮 红豆皮 车前壳原料均用粉碎机粉碎 过 目筛 将 0 的样品分散在 * 丙酮 水中 黑暗环境下放置. 过滤取上清液备用 总酚含量测定方法在碱性条件下 酚类物质可与福林酚试剂形成蓝色络合物 该络合物在 /* 下有最大吸收 在玻璃管中加入 * 超纯水 然后依次加入 空白试剂 没食子酸标准液 0* 及待测样品 稀释至合适浓度 再各加入 福林酚试剂和 碳酸钠溶液 避光反应. 用酶标仪测定 /* 下的吸光度 以没食子酸浓度和吸光度值做标准曲线 总酚含量 以没食子酸当量 *00 来表示 氧自由基清除实验 &50/ 3+,+' +:&3:,/0+;+,5% 该方法以偶氮类化合物 9 作为过氧自由基产生源 荧光素作为荧光探针!3&'& 作为定量标准 自由基破坏荧光探针 使荧光强度产生变化 抗氧化剂的存在可以抑制由自由基引起的荧光变化 抑制程度反映了它对自由基的抗氧化能力 在 孔板中准确移取 **&' 荧光素溶液 再依次加入 空白试剂!3&'& 标准液 浓度为 *&' 及待测样品 稀释至合适浓度 > 下预热 *,/ 预热结束后立即加入 *&'9 溶液启动抗氧化反应 在激发波长 /* 发射波长 /* 下连续测定. 清除氧化自由基的能力用!3&'& 当量 *&'0 来表示 99 自由基清除实验 3'+,699 +6/0,/0+;+,5% 99 自由基在有机溶液中呈现紫色 并且溶液在 /* 处有强烈吸收 当有外界自由基存在时 99 自由基可与外界电子配对 因而含量减少 溶液颜色变浅 99 自由基清除程度与溶液褪色程度呈定量线性关系 准确移取!3&'& 标准品 浓度为 *&' 和待测样品 稀释至合适浓度 到 孔板中 另外移取 溶剂作为空白对照 在各孔中迅速加入 **&'99 溶液启动抗氧化自由基反应 每隔 *,/ 自动测定吸光度 测定 *,/ 清除 99 自由基的能力用!3&'& 当量 *&'0 来表示 % 羟自由基清除实验.5&5'3+,+' +6/0,/0+;+,5% 该方法以 %' 和 反应产生羟自由基 荧光素 作为荧光探针!3&'& 作为定量标准 抗氧化剂可与羟自由基反应 引起荧光变化 准确移取 /*&' 荧光素溶液至 孔板中 依次加入 空白试剂!&'& 标准液 浓度为 *&' 及待测样品 稀释至合适浓度 然后各加入 新制 *&' 溶液和 **&'%' 溶液来启动抗氧化反应 在激发波长 /* 发射波长 /* 下连续测定. 清除羟自由基的能力用!3&'& 当量 *&'0 来表示 9%< 检测黑豆皮及黑豆皮茶中的酚酸类物质组成 酚酸类化合物提取 分别称取 0 黑豆皮原料及黑豆皮茶置于粗口玻璃管中 各加入 * *&'+ 含 **&'#! 和 抗坏血酸溶液 在 > 下震荡水解 *,/3*,/ 离心 *,/ 取上清液 加入 * %' *&' 使液体 ; 变为酸性 再用 * 乙酸乙酯萃取 次 合并萃取液 > 下旋转蒸发浓缩至干 加入 * 甲醇溶解蒸干后物质 保存于 ) > 冰 箱待分析 酚酸标准溶液的配制 分别称取 种酚酸化合物 没食子酸 原儿茶酸 对羟基苯甲酸 香草酸 绿原酸 丁香酸 香豆酸 阿魏酸 芥子酸 咖啡酸 标准品各 *0 于 * 容量瓶中 用甲醇溶解并定容至刻度 分别量取 * 标液混匀 作为混合标准品储备液 保存于 )> 冰箱待分析 9% 色谱条件 色谱柱 C,5 9% 4#%&'*/ **@ *** +3<,'2&3< 流动相 超纯水 含 甲酸 流动相 4 乙腈 含 甲酸 流速 **,/ 柱温 > 光电二极管列阵检测器 检测波长 /* 和 /* 梯度洗脱条件 *,/4*,/ 4*,/ 4*,/ 4 质谱条件 离子源 # 扫描范围 + 扫描时间 中间扫描时间 毛细管电压 /0+,6,&/ *&" 锥孔电压 " 碰撞电压 " 源温度 > 脱溶剂温

4 阿拉西 斯尔克米德克 等 黑豆皮茶中酚酸类物质组成分析及抗氧化能力 度 > 脱溶剂气流. 锥孔气流. 酚酸类化合物鉴定和含量测定 已制备的样品溶液及混合标准溶液 经 * 有机相滤膜过滤 自动进样 结果与讨论 * 类种壳类原料的总酚含量及抗氧化能力比较 图 为 种原料 黑豆皮 绿豆皮 红豆皮和车前壳的 丙酮 水提取物的总酚含量比较 其中 绿豆皮的总酚含量最高 黑豆皮和红豆皮总酚含量无显著差异 但均低于绿豆皮的总酚含量 种豆皮的总酚含量均显著大于车前壳 图 为 种原料 丙酮 水提取物的抗氧化性比较 清除过氧自由基和羟自由基的能力由大到小 依次是绿豆皮 黑豆皮 红豆皮 车前壳 结合总酚含量结果可知 种壳原料的总酚含量增加 其清除过氧自由基和羟自由基的能力也相对增强 即总酚含量与过氧自由基和羟自由基清除能力成正相关 红豆皮和黑豆皮清除 99 自由基的能力类似 均大于绿豆皮和车前壳 与提取物总酚含量高低没有直接关系 图 黑豆皮 绿豆皮 红豆皮及车前壳 丙酮 水提取物总酚含量比较 +: 表示不同样品在 水平上的差异显著性 下同,0!.&+';./&',&//&2:'+*/03 :+/;'+/.&2!" +&/+3+3+,&/&'6/ +:,/,+.,0/,2,+/&2.,23/+*;' +!.+*+:'& 清除自由基的机制主要有单电子转移,/0' '3&/3+/23#! 和氢原子转移.53&0/ +&*3+/23! 种 #! 机制指抗氧化剂能够给自由基提供电子使其生成带电的分子 即反 图 黑豆皮 绿豆皮 红豆皮及车前壳 丙酮 水提取物抗氧化性比较 % 代表氧自由基清除能力 % 代表羟自由基清除能力 % 代表 99 自由基清除能力 下同,0!.+/,&,+/+:,',5&*;+3,&/&2:'+*/0 3:+/;'+/.&2!" +&/+3+3+,&/&'6/ %+&50/3+,+'+:&3:,/0+;+,5%+.5&5'3+,+'+6/0,/0+;+,5%+3'+,6 99+6/0,/0+;+,5!.+*+:'& 映的是抗氧化剂以转移电子的方式来清除自由基的能力 99 自由基清除实验属于 #! 途径 99?99 )??! 反映的则是抗氧化剂以供氢的方式清除自由基的能力 即抗氧化剂提供氢 使自由基与氢结合 从而氧化能力降低??% 和 % 实验均为! 机制 植物多酚酚羟基中的邻位酚羟基极易供氢 对氧自由基具有较强的捕捉能力 表现较强过氧自由基和羟自由基清除能力 由此可以验证上述对图 图 的讨论 总酚含量与过氧自由基和羟自由基清除能力成正相关 但是与以电子转移为机制的自由基清除能力 如 99 自由基 没有相关性 99 自由基清除能力可能与种壳材料中的部分抗氧化活性成分的暴露程度有关 其中 黑豆皮和红豆皮中的部分成分具有更高给电子能力 故具有更好的 99 自由基清除能力 黑豆皮及黑豆皮茶的总酚含量及抗氧化能力比较 用 丙酮 水溶液分别提取黑豆皮原料和黑豆皮茶 测定 种提取物的总酚含量及清除过氧自由基 99 自由基和羟自由基的能力 由图 可知 黑豆皮原料的总酚含量为 *00 黑豆皮茶的总酚含量是 *00 经焙炒后黑豆皮的总酚含量下降了 由图 可知 黑豆皮茶清除过氧自由基和羟自由基的能力与原料相比分别降低

5 上海交通大学学报 农业科学版 第 卷 和 但是清除 99 自由基能力增加了 对于过氧自由基和羟自由基清除实验来说 黑豆皮茶的总酚含量减少 其清除过氧自由基和羟自由基的能力也相对较弱 即清除过氧自由基和羟自由基的能力大小与提取物总酚含量高低相一致 但是 99 自由基清除能力与总酚含量没有类似关系 99 自由基清除能力可能与黑豆皮中的抗氧化活性成分的暴露程度有关 焙炒可能引起相关清除因子的释放 提高了其利用度 图 黑豆皮原料及黑豆皮茶 丙酮 水提取物总酚含量比较,0!.&+';./&',&//&2:'+:+/;'+/:'+ :+/;'++&/+3+3+,&/&'6/ 图 黑豆皮原料及黑豆皮茶 丙酮 水提取物抗氧化性比较,0!.+/,&,+/&*;+3,&/:/:'+:+/;'+/ :'+:+/;'++&/+3+3+,&/&'6/ ) 酚酸类化合物分析 线性关系考察配置不同浓度梯度的酚酸标准溶液 按照方法 进样分析 以峰面积为横坐标 标准溶液的浓度 0* 为纵坐标 $ 绘制标准曲线 计算标准曲线的回归方程及相关系数 从表 可见 在一定样品浓度范围内 决定系数均在 之上 酚酸标准品浓度和相应的峰面积呈良好的线性关系 表 酚酸化合物的保留时间 质荷比及各标准曲线的回归方程 决定系数 线性范围 4#2! &"!!$#$##!! $" &"!!$##$$!%# 酚酸 9./&',+, 保留时间 *,/ /,&/,* 质荷比 *- ) < ,& 回归方程 03,&/ C+,&/ 决定系数 %&2,,/&2 3*,/+,&/ 线性范围 0* ),/+33+/0 没食子酸 +',+, + =5? ) 原儿茶酸 93&&+.,+, + =5) ) 香草酸 "+/,',+, + =5? ) 咖啡酸 %+2,+, + =5? ) 绿原酸 %.'&3&0/,+, + =5? ) 丁香酸 53,/0,+, +=5? ) 香豆酸 %&*+3+ +=5? ) 阿魏酸 3',+, + =5? ) 芥子酸,/+;,+, + =5) ) 对羟基苯甲酸 ;53&5:/-&,+, + =5? ) 黑豆皮及黑豆皮茶提取物中酚酸类化合物的含量测定 针对市场上黑豆皮功能性食品的研究空缺 实验室前期探究了黑豆皮茶的加工工艺 制备获得黑豆皮茶 以 种酚酸标准品进行质谱分析结果为对照 除咖啡酸和绿原酸 其余 种酚酸化合物在黑豆皮原料和黑豆皮茶中均被检测到 即没食子酸 原儿茶酸 对羟基苯甲酸 香草酸 丁香酸 香豆酸 阿魏酸和芥子酸 通过分析质谱结果 将峰面积代入 相应线性回归方程 得到黑豆皮原料及黑豆皮茶中 种酚酸的含量 由表 可知 黑豆皮经焙炒之后 酚酸种类没有发生变化 但含量有所变化 没食子酸 原儿茶酸 香草酸 丁香酸 香豆酸在黑豆皮茶的制作过程中均有损失 损失率范围为 阿魏酸含量升高 对羟基苯甲酸和芥子酸含量基本没有变化 在黑豆皮原料中含量最高的原儿茶酸在烘焙后含量损失量最大 由原来的 B00 减少为 B00

6 阿拉西 斯尔克米德克 等 黑豆皮茶中酚酸类物质组成分析及抗氧化能力 酚酸类物质清除自由基的活性与 键的强度有很大的关系 键强度越低 则抗氧化剂活性越高 反之 键强度越高 则抗氧化剂活性越低 在非极性溶剂中 抗氧化剂清除自由基主要通过抽氢反应进行 解离能越低 说明该化合 物越容易抽氢 其抗氧化活性越强 原儿茶酸是在本实验检测到的 种酚酸中 解离能最 低 黑豆皮在焙炒后原儿茶酸的大量损失可能是导致其对于过氧自由基和羟自由基的清除能力下降的原因之一 黑豆皮焙炒后 99 自由基清除能力的升高可能与部分抗氧化活性因子的暴露量和利用度的提高有关系 阿魏酸含量有所升高 猜测阿魏酸在 99 自由基清除方面提供了较多的抗氧化力 表 黑豆皮及黑豆皮茶中酚酸化合物的含量! &"!!$#"!*&"#$"!*&"# 酚酸 9./&',+, 黑豆皮 00 ) 4'+:+/;' 黑豆皮茶 00 ) 4'+:+/;'+ 含量变化率 + %&//.+/0,/03+ 没食子酸 +',+, B B ) 原儿茶酸 93&&+.,+, B B ) 香草酸 "+/,',+, B B ) 咖啡酸 %+2,+, 绿原酸 %.'&3&0/,+, 丁香酸 53,/0,+, B B ) 香豆酸 %&*+3+ B B ) 阿魏酸 3',, B B? 芥子酸,/+;,+, B B ) 对羟基苯甲酸 ;53&5:/-&,+, B B? 注 + ) 代表含量减少? 代表含量增加 代表未检测到 & + )3;3/&//3+?3;3/&//,/3+3;3/.6+'&'/& : ) 结论 通过比较 种种壳类原料的总酚含量和抗氧化能力的差异表现发现 总酚含量与过氧自由基和羟自由基清除能力呈正相关 但是与 99 自由基的清除能力没有相关性 这可能是因为植物多酚酚羟基中的邻位酚羟基极易供氢 对氧自由基具有较强的捕捉能力 表现出较强清除过氧自由基和羟自由基的能力 但是与以电子转移为机制的自由基清除能力 如 99 自由基 没有相关性 黑豆皮经焙炒后 总酚含量下降 清除过氧自由基和羟自由基的能力与原料相比分别降低 和 但是清除 99 自由基能力增加了 提示黑豆皮茶在制作过程中 酚类物质部分被破坏 并引起了部分自由基清除能力的降低 但部分抗氧化活性因子的暴露量和利用度有一定提高 利用 9%< 分析黑豆皮及黑豆皮茶提取物中的酚酸类化学成分组成 共分离鉴定出 种酚酸类物质 其中两者的原儿茶酸含量均最高 不同酚酸在黑豆皮茶的制作过程中变化不同 阿魏酸含量升高 对羟 基苯甲酸和芥子酸含量基本没有变化 其余酚酸含量都相应减少 其中原儿茶酸的大量损失与黑豆皮在加工后对于过氧自由基和羟自由基清除能力的下降有一定联系 本研究为充分开发利用黑豆资源 提高黑豆皮类加工副产品的附加值提供理论依据 参考文献.,/&*,5+A!&/+0+.,0*&&$#2 &2&+3+23&* :'+&5:+/&/3+,+' *+-;32&3*+/,/3+0"!"$&2 "!" $ #" 4%.+/0 A %/,&,+/+;+,5&2 &+.':+/+/.&':'+&5:+/,/3'+,&/&.,3,3,:,&/&2&+';./&',;./&', +,+/.&5+/,/+/,&2'+6&/ +" 5!""$ 9$ 0# 王巧环 江均平 傅慧敏 等 绿豆 红小豆和黑豆种皮 种元素分析 食品科学 下转第 页

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