前言阴离子交换纯化馏分通常含有高浓度的盐, 如氯化钠 (NaCl) 或溴化钠 (NaBr) 在分子生物学和分子诊断中, 聚合酶链式当使用 IP-RPLC 对这些馏分进行分析时, 1 反应 (PCR) 基因沉默以及相关技术都高浓度的盐会削弱寡核苷酸参与离子配对需要标准的和经修饰的合成寡核苷酸此的能

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罄语申
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应用简报生物制剂与生物仿制药无需手动纯化直接分析合成的寡核苷酸使用 Agilent InfinityLab 二维液相色谱解决方案进行在线脱盐和离子对反相液相色谱分析作者 Sonja Krieger 和 Clarissa Dickhut 安捷伦科技有限公司 Waldbronn,Germany 摘要由亚磷酰胺化学法合成的寡核苷酸通常使用离子对反相液相色谱 (IP-RPLC)

1 应用简报生物制剂与生物仿制药无需手动纯化直接分析合成的寡核苷酸使用 Agilent InfinityLab 二维液相色谱解决方案进行在线脱盐和离子对反相液相色谱分析作者 Sonja Krieger 和 Clarissa Dickhut 安捷伦科技有限公司 Waldbronn,Germany 摘要由亚磷酰胺化学法合成的寡核苷酸通常使用离子对反相液相色谱 (IP-RPLC) 和阴离子交换色谱进行分析和纯化在 IP-RPLC 分析中, 阴离子交换纯化馏分的高含盐量会削弱寡核苷酸参与离子配对的能力这就需要在 IP-RPLC 分析之前对样品进行脱盐, 这一步骤通常使用离心过滤器手动完成本应用简报展示了高盐浓度溶液中寡核苷酸的直接二维液相色谱分析 : 在第一维 ( 1 D) 中进行在线脱盐, 随后在第二维 ( 2 D) 中进行 IP-RPLC 分析在该设置中, 二维液相色谱的使用提高了工作流程速度, 同时避免了手动的样品前处理过程

2 前言阴离子交换纯化馏分通常含有高浓度的盐, 如氯化钠 (NaCl) 或溴化钠 (NaBr) 在分子生物学和分子诊断中, 聚合酶链式当使用 IP-RPLC 对这些馏分进行分析时, 1 反应 (PCR) 基因沉默以及相关技术都高浓度的盐会削弱寡核苷酸参与离子配对需要标准的和经修饰的合成寡核苷酸此的能力, 从而导致保留时间变化峰分裂外, 合成寡核苷酸在作为治疗剂治疗各种以及峰流穿 5 为了对阴离子交换纯化馏疾病 ( 例如癌症和病毒性疾病 ) 方面的重分进行成功的 IP-RPLC 分析, 需要在分要性日益突显 2 寡核苷酸类药物包括反析前对样品进行脱盐 5, 而这一过程通常义寡核苷酸小干扰 RNA (sirna) 和适手动完成配体反义寡核苷酸和 sirna 均通过阻本应用简报展示了高盐浓度溶液中寡核苷止 mrna 翻译从而阻止蛋白质合成适酸的直接二维液相色谱分析, 这一盐浓度配体通过形成适配体 - 蛋白质复合物, 从与寡核苷酸合成后阴离子交换纯化馏分中而抑制蛋白质的生物学功能 3 的盐浓度相当二维液相色谱分析的第一寡核苷酸通常通过亚磷酰胺化学法合成 2,4 维用于在线脱盐, 随后在第二维中进行可获得的纯度通常大于 7%, 合成后存 IP-RPLC 分析在该设置中, 二维液相色在的常见杂质包括缺失或增加序列的寡核谱的使用可以节省时间并避免手动的样品苷酸连同未完全去保护的产物缺失嘌呤前处理步骤省去手动样品前处理步骤可碱基的寡核苷酸以及其他降解产物 2 通以提高重现性, 且可以避免样品前处理过常使用离子对反相液相色谱 (IP-RPLC) 和程中的样品损失阴离子交换色谱对合成的去保护寡核苷酸进行分析分离与纯化 2,4 实验部分设备 Agilent 129 Infinity II 二维液相色谱系统包括以下模块 : 两台 Agilent 129 Infinity II 高速泵 (G712A) Agilent 129 Infinity II Multisampler (G7167B), 配备冷却装置 ( 选件 #1) 两台 Agilent 129 Infinity II 高容量柱温箱 (G7116B) 两台 Agilent 129 Infinity II 二极管阵列检测器 (G7117B), 配备 1 mm 最大光强卡套式流通池 (G ) Agilent 129 Infinity 阀驱动 (G117A), 带二维液相色谱阀主动溶剂调制 (G4243A) 两个 Agilent 129 Infinity 阀驱动 (G117A), 配备带 4 µl 定量环的多中心切割阀 (G ) 软件 Agilent OpenLab CDS ChemStation 版, 版本 C.1.8 [21] 以及二维液相色谱软件, 版本 A.1.4 SR1 色谱柱 Agilent PLRP-S 1 Å, mm, 3 µm( 部件号 PL ) Agilent AdvanceBio 寡核苷酸色谱柱,2.1 5 mm, 2.7 µm( 部件号 ) 2

3 化学品所有试剂纯度均为液相色谱级甲醇购自 Merck (Darmstadt, Germany) 新制超纯水来自配置.22 µm 膜式终端过滤器 (Millipak) 的 Milli-Q 超纯实验室水纯化系统 (Millipore, Merck (Darmstadt, Germany)) 乙酸铵和六氟异丙醇 (HFIP) 购自 Merck (Darmstadt, Germany) 三乙胺 (TEA) 和氨水分别购自 Fluka (Steinheim, Germany) 和 VWR (Darmstadt, Germany) 样品与样品前处理将寡核苷酸分离度标准品 RNA 和 DNA 样品溶于水得到的储备液用水或 2 mol/l NaCl 溶液按 1:1 进一步稀释, 使水或 1 mol/l NaCl 溶液中具有相同浓度的寡核苷酸 1 mol/l NaCl 的寡核苷酸溶液用于模拟具有高盐浓度的阴离子交换纯化馏分使用 Microcon YM-3 离心过滤器以及 3 kda NMWCO (Millipore, Merck (Darmstadt, Germany)) 按以下步骤对 1 mol/l NaCl 的寡核苷酸溶液进行手动脱盐 : 将 1 mol/l NaCl 的寡核苷酸溶液 (2 µl) 转移到样品储液槽,14 g 离心 3 分钟, 以浓缩寡核苷酸并洗脱盐分将 2 µl 水转移到样品储液槽, 14 g 离心 3 分钟以进行清洗将样品储液槽颠倒放入一个干净的样品瓶,1 g 离心 3 分钟, 以使浓缩物转移到样品瓶中用水将浓缩物复溶, 最终体积约为 2 µl 寡核苷酸分离度标准品 ( 部件号 ): 14 mer:rcrarcrurgrararurarcrcrararu 17 mer:rurcrarcrarcrurgrararurarcrcrararu 2 mer:rurcrarurcrarcrarcrurgrararurarcrcrararu 21 mer:rgrurcrarurcrarcrarcrurgrararurarcrcrararu RNA 样品 (RNA/2 -OMethyl 混合 ; 安捷伦 NSAD 合成 ): 5 -GuGcCaAcCuGaUgCaGcU-3, 大写字母 :RNA, 小写字母 :OMethyl DNA 样品 ( 完全硫醇化 ; 安捷伦 NSAD 合成 ): 5 -ugcaccctggataccauuu-3, 大写字母 :DNA, 小写字母 :OMethyl 方法一维分析参数值色谱柱 AdvanceBio 寡核苷酸色谱柱,2.1 5 mm, 2.7 µm A) 4 mmol/l HFIP + 15 mmol/l TEA 水溶液溶剂 B) 溶剂 A/ 甲醇 (5:5 v:v) 梯度流速温度 6 C 检测进样寡核苷酸分离度标准品 : min 时 B 为 16% 7 min 时 B 为 3% 13 min 时 B 为 34% 14 min 时 B 为 1% 停止时间 :18 分钟后运行时间 :3 分钟.4 ml/min 26/4 nm, 参比 36/1 nm,2 Hz 进样量 :5 µl 样品温度 :1 C 进样针清洗 : 用水 : 乙腈 (9:1) 溶液清洗 3 秒钟 RNA 和 DNA 样品 : min 时 B 为 16% 1 min 时 B 为 7% 1.5 min 时 B 为 1% 停止时间 :14.5 分钟后运行时间 :3 分钟 3

4 二维液相色谱分析色谱柱 PLRP-S, mm, 3 µm 溶剂梯度流速温度 6 C 检测进样第一维 A) 5 mmol/l 乙酸铵水溶液, 用氨水调至 ph 7 B) 甲醇 min 时 B 为 2% 2 min 时 B 为 2% 3 min 时 B 为 7% 5 min 时 B 为 7% 5.1 min 时 B 为 2% 该梯度重复三次以减少交叉污染停止时间 :19 分钟后运行时间 : 关闭在 2 D 泵中设置停止时间和后运行时间, 软件会自动将停止时间延长至所有切割均完成 2 D 分析.4 ml/min 26/4 nm, 参比 36/1 nm,2 Hz 为保护流通池不受阀切换产生的压力脉冲的影响, 在 1 D DAD 和 2D-LC 阀门之间安装压力释放工具包 (G ) 进样量 :5 µl 样品温度 :1 C 进样针清洗 : 用水 : 乙腈 (9:1) 溶液清洗 3 秒钟第二维色谱柱 AdvanceBio 寡核苷酸色谱柱,2.1 5 mm, 2.7 µm 溶剂温度 6 C 检测二维液相色谱模式流速采样表 ASM 第二维梯度 A) 4 mmol/l HFIP + 15 mmol/l TEA 水溶液 B) 溶剂 A/ 甲醇 (5:5 v:v) 26/4 nm, 参比 36/1 nm,2 Hz 中心切割.4 ml/min 二维液相色谱用 1 D 色谱图作为参比色谱图将中心切割设置为基于时间寡核苷酸分离度标准品 :2.79 分钟 RNA 样品 :2.88 分钟 DNA 样品 :3.4 分钟 ASM 毛细管 :55-13 ( mm) 启用 ASM(ASM 因子 :5) 冲洗样品定量环 3 次 (1.54 min) 寡核苷酸分离度标准品 :. min 时 B 为 1% 1.54 min 时 B 为 1% 1.55 min 时 B 为 16% 8.55 min 时 B 为 3% min 时 B 为 34% min 时 B 为 1% 第二维梯度停止时间 :19.55 分钟第二维周期 :22.55 分钟 RNA 和 DNA 样品 :. min 时 B 为 1% 1.54 min 时 B 为 1% 1.55 min 时 B 为 16% min 时 B 为 7% 12.5 min 时 B 为 1% 第二维梯度停止时间 :16.5 分钟第二维周期 :19.5 分钟结果与讨论图 1 展示了水 ( 图 1A) 和 1 mol/l NaCl 溶液 ( 图 1B) 中寡核苷酸分离度标准品的一维 IP-RPLC 分析图 1B 清楚地显示注入的寡核苷酸溶液中的高浓度盐会削弱其参与离子配对的能力, 从而导致峰分裂以及峰流穿 ( 可看见较大的进样峰 ) 从图 2 经脱盐的寡核苷酸溶液的 IP-RPLC 分析可以看出, 用离心过滤器对 1 mol/l NaCl 的寡核苷酸分离度标准品溶液进行手动脱盐后可避免峰分裂以及峰流穿然而, 使用离心过滤器进行手动脱盐是一个费时费力的过程, 通常耗费约 75 分钟此外, 手动脱盐后单个寡核苷酸的强度比发生了变化, 这很可能是由较小的寡核苷酸部分损失所致使用配备主动溶剂调制的 129 Infinity II 二维液相色谱系统的中心切割二维液相色谱可实现高盐浓度溶液中寡核苷酸的直接分析二维液相色谱分析的第一维用于在线脱盐, 随后在第二维中进行 IP-RPLC 分析 4

5 6 A 21 mer mer 17 mer 2 mer B 图 1. 寡核苷酸分离度标准品的一维 IP-RPLC 分析 ;(A) 寡核苷酸分离度标准品水溶液 ;(B) 1 mol/l NaCl 的寡核苷酸分离度标准品溶液 ; 运行空白并进行基线扣除后获得的色谱图 6 21 mer mer 2 mer mer 图 2. 使用离心过滤器手动脱盐后 1 mol/l NaCl 的寡核苷酸分离度标准品溶液的一维 IP-RPLC 分析 ; 运行空白并进行基线扣除后获得的色谱图 5

6 图 3 和图 4 分别展示了水和 1 mol/l NaCl 溶液中寡核苷酸分离度标准品的分析结果在第一维中, 寡核苷酸在 PLRP-S 色谱柱上有效保留, 而盐被洗脱至废液随后寡核苷酸作为单峰从第一维中洗脱并转移到第二维进行 IP-RPLC 分析在第二维中成功地对寡核苷酸进行了 IP-RPLC 分析二维液相色谱分析在第一维和第二维中都表现出了良好的保留时间和峰面积精度, 如图 3 和图 4 的内插表格所示 ( 保留时间和峰面积精度由六次连续分析获得 ) 图 3. 寡核苷酸分离度标准品水溶液的二维液相色谱分析 ;A) 1 D 色谱图 ;B) 2 D 色谱图 ; 保留时间和峰面积精度由六次连续分析获得 ; 运行空白并进行基线扣除后获得的色谱图图 4. 1 mol/l NaCl 的寡核苷酸分离度标准品溶液的二维液相色谱分析 ;A) 1 D 色谱图 ;B) 2 D 色谱图 ; 保留时间和峰面积精度由六次连续分析获得 ; 运行空白并进行基线扣除后获得的色谱图 6

7 与一维 IP-RPLC 方法相比, 二维液相色谱法包括第一维在线脱盐和第二维 IP-RPLC 分析, 耗时增加约 4.5 分钟, 但无需样品前处理而一维 IP-RPLC 分析所需的手动脱盐, 耗时接近 75 分钟同时考虑样品前处理和样品分析所需的时间, 二维液相色谱法将给定方案所需的时间从接近 96 分钟减少到了 26 分钟这相当于将工作流程的速度提高了三倍以上此外, 二维液相色谱法无需进行样品前处理, 从而节省了人力图 5 和图 6 分别展示了 RNA 样品和 DNA 样品的一维 IP-RPLC 分析从图 5B 所示的峰分裂和峰流穿可以看出, 当注入 1 mol/l NaCl 的 RNA 样品溶液后, 高盐浓度会削弱寡核苷酸参与离子配对的能力对 1 mol/l NaCl 的 RNA 样品溶液进行手动脱盐后, 可成功进行 IP-RPLC 分析 ( 图 5C) 对于 1 mol/l NaCl 的 DNA 样品溶液来说, 高盐浓度对进样溶液的影响不明显, 只能观察到一个小的流穿峰 ( 图 6B) 7 A B C 图 5. RNA 样品的一维 IP-RPLC 分析 ;A) RNA 样品水溶液 ;B) 1 mol/l NaCl 的 RNA 样品溶液 ;C) 经离心过滤器手动脱盐后的 1 mol/l NaCl 的 RNA 样品溶液 ; 运行空白并进行基线扣除后获得的色谱图 7

8 A B C 图 6. DNA 样品的一维 IP-RPLC 分析 ;A) DNA 样品水溶液 ;B) 1 mol/l NaCl 的 DNA 样品溶液 ;C) 经离心过滤器手动脱盐后的 1 mol/l NaCl 的 DNA 样品溶液 ; 运行空白并进行基线扣除后获得的色谱图图 7 和图 8 分别展示了 1 mol/l NaCl 的 RNA 样品和 DNA 样品溶液的直接二维液相色谱分析结果在第一维中对 RNA 和 DNA 进行了有效的保留和脱盐, 随后在第二维中成功地进行了 IP-RPLC 分析在第二维中可观察到一些杂质从主要化合物中分离出来, 如图 7 和图 8 第二维色谱图中的内插图所示 ( 将基线放大 ) 根据对 1 mol/l NaCl 的 RNA 和 DNA 样品溶液进行二维液相色谱分析所得到的主峰和检测到的杂质的峰面积, 可计算出两种样品的纯度均接近 96% 该值与使用离心过滤器手动脱盐后再进行一维分析并按相同方式进行计算所得出的纯度值一致 8

9 图 7. 1 mol/l NaCl 的 RNA 样品溶液的二维液相色谱分析 ;A) 1 D 色谱图 ;B) 2 D 色谱图, 2 D 色谱图中的内插图将基线进行了放大 ; 运行空白并进行基线扣除后获得的色谱图图 8. 1 mol/l NaCl 的 DNA 样品溶液的二维液相色谱分析 ;A) 1 D 色谱图 ;B) 2 D 色谱图, 2 D 色谱图中的内插图将基线进行了放大 ; 运行空白并进行基线扣除后获得的色谱图 9

10 结论使用配备主动溶剂调制的 129 Infinity II 二维液相色谱系统的中心切割二维液相色谱分析可实现高盐浓度溶液 ( 如寡核苷酸合成后得到的阴离子交换纯化馏分 ) 中寡核苷酸的直接分析在第一维中实现有效的在线脱盐后, 在第二维中进行 IP-RPLC 分析比起经离心过滤器手动脱盐后再进行一维 IP-RPLC 分析, 二维液相色谱法可使工作流程的速度提高三倍以上此外, 无需进行样品前处理可节省人力参考文献 1. Mangano; et al. Composition dependent separation of oligonucleotides by capillary electrophoresis in acidic buffers with application to the quality control of synthetic oligonucleotides. Journal of Chromatography A, 1999, 848, Zimmermann; et al. Synthetic oligonucleotide separations by mixed-mode reversed-phase/ weak anion-exchange liquid chromatography, Journal of Chromatography A, 214, 1354, Mustonen; et al. Oligonucleotide-based pharmaceuticals: Non-clinical and clinical safety signals and non-clinical testing strategies, Regulatory Toxicology and Pharmacology, 217, 9, Shanagar. Purification of a synthetic oligonucleotide by anion exchange chromatography: Method optimization and scale-up, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 25, 64, Cramer, F.; Herzberg. Purity Analysis and Impurities Determination by Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography, In: Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products; Bonilla and Srivatsa, eds.; CRC Press Taylor and Francis Group, Boca Raton, 211, 查找当地的安捷伦客户中心 : 免费专线 : , ( 手机用户 ) 联系我们 : LSCA-China_8@agilent.com 在线询价 : 本文中的信息说明和指标如有变更, 恕不另行通知安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 6 月 1 日, 中国出版 ZHCN

前言仪器间的方法转移对不同行业的所有实验室而言都是一项重要课题 1 尤其对于制药行业中的经验证方法, 仪器间的方法转移是必经过程, 但对于其他行业中的 QA/QC 也同样重要仪器间方法转移的一个示例是将常规液相色谱方法从 Agilent 1100 系列四元液相色谱仪等旧设备转移到 Agilent

前言仪器间的方法转移对不同行业的所有实验室而言都是一项重要课题 1 尤其对于制药行业中的经验证方法, 仪器间的方法转移是必经过程, 但对于其他行业中的 QA/QC 也同样重要仪器间方法转移的一个示例是将常规液相色谱方法从 Agilent 1100 系列四元液相色谱仪等旧设备转移到 Agilent 从 Agilent 1100 系列四元液相色谱仪到 Agilent 1260 Infinity II 液相色谱仪的方法转移抗组胺药物分析的等效性证明应用简报小分子药物作者 Sonja Krieger 安捷伦科技公司 Waldbronn, Germany 摘要对所有实验室而言, 将常规液相色谱方法从原有设备转移到新仪器都是一项重要课题本应用简报介绍了用于抗组胺药物分析的常规液相色谱方法从 Agilent