6 期李法君, 等 :microrna 在水产动物中的研究进展 977 发卡状结构, 成为前体 (pre-);pre 在 Exprotin-5 复合物的协助下通过核孔复 合物到达细胞质中 (2)pre- 在细胞质中由 Dicer 剪切成为 19~25nt 的双链 结构, 随后 双链 中的一条链在解旋

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1 第 40 卷第 6 期水产学报 Vol. 40, No 年 6 月 JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA June, 2016 文章编号 : (2016) 综述 DOI: /jfc microrna 在水产动物中的研究进展 1, 李法君 2, 李明爽 3, 付春鹏 1, 李群峰 1, 罗永巨 4 2 *, 傅洪拓 (1. 潍坊科技学院, 山东寿光 ; 2. 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心, 农业部淡水渔业和种质资源利用重点实验室, 江苏无锡 ; 3. 全国水产技术推广总站, 北京 ; 4. 广西水产科学研究院, 广西南宁 ) 摘要 :s 是一类在真核生物中广泛存在的非编码小分子 RNA, 通过与靶 mrna 互补配对在转录水平上对基因的表达进行负调控, 导致 mrna 的翻译抑制或降解 大量研究表明, 在躯体发育 癌症 细胞分化 细胞增殖与凋亡 脂肪代谢等方面发挥作用 近来在水产动物中, 有关 的研究取得了众多的科研成果, 然而对其进行全面总结的报道较缺乏 本文综述了 在水产动物中的研究进展, 结果显示 在水产动物中表现为多样化的生物学功能, 本文也对其研究前景进行了展望, 旨在为以后更好地研究水产动物 的功能提供参考 关键词 : 鱼类 ; 甲壳动物 ; 水产动物 ;; 负调控中图分类号 : Q 786;S 文献标志码 : A MicroRNA () 是一类长度为 19~25 个核 苷酸 (nt)( 一般为 22 个 nt) 的内源性非编码小分子单 链 RNA [1-4], 可以与靶基因的 3 非翻译区 (untranslated regions,utr) 结合从而抑制靶基因的翻译或降 解靶基因 1993 年在秀丽隐杆线虫 (Caenorhabditis elegans) 时序性发育调控过程中发现了首个 (lin-4) [5] ;2000 年又在线虫中找到了第 2 个 调控时序性发育的 基因 let-7 [6] 此后研究 人员逐渐认识到 是一类在真核生物细胞 中广泛存在, 在多种生化途径中发挥作用的具 有高度的保守性 时序性 组织特异性的转录 后调控因子 这些调控途径包括发育 [7-8] 免 疫 [9-10] 癌症发生 [11-12] 细胞分化 [13-14] 细胞增殖 和凋亡 [15-17] [18-19] 脂肪代谢等 近来在水产动物 中有关 的研究也取得了众多成果, 但国 内外尚缺乏对其进行全面总结的报道, 鉴于 此, 本文对 在水产动物中的研究进行了综述, 以期为以后更好地研究水产动物 的功能提供参考 1 的合成及作用机制作为 21 世纪生命科学领域重大发现之一, 大量研究表明, 是一类由基因组 DNA 转录生成的非编码蛋白质的调控 RNA 序列 在动物细胞中编码 的 DNA 序列多位于基因间隔区和基因内含子区域 的合成分为细胞核内和细胞质中 2 个阶段 :(1) 首先在细胞核内, 基因在 RNA 聚合酶 Ⅱ 的作用下形成较长的茎环结构, 称为初级 (pri-); 此时的 pri- 在 5 端有帽子结构,3 端有一个多聚腺苷酸尾巴 随后 pri- 在 Drosha- DGCR8 复合物的作用下形成长度约 60~70 个 nt 的 收稿日期 : 修回日期 : 资助项目 : 国家自然科学基金 ( ); 中央级基本科研业务费专项 (2015JBFM11); 江苏省农业科技自主创新资金 [CX(15)1012-4]; 江苏省水产三新工程 (D ); 无锡市科技发展资金 (CLE02N1514) 通信作者 : 傅洪拓, fuht@ffrc.cn

2 6 期李法君, 等 :microrna 在水产动物中的研究进展 977 发卡状结构, 成为前体 (pre-);pre 在 Exprotin-5 复合物的协助下通过核孔复 合物到达细胞质中 (2)pre- 在细胞质中由 Dicer 剪切成为 19~25nt 的双链 结构, 随后 双链 中的一条链在解旋酶的作用下分 解, 另一条链则成为成熟的 分子 成熟 的单链 与 Argonaute 蛋白和 Dicer 结合形成 RNA 诱导的沉默复合物 (RNA-induced silencing complex,risc) [20-22] RISC 复合物与靶 mrna 的 3 UTR 的碱基结 合, 对靶基因进行降解或翻译抑制 如果 与靶 mrna 完全匹配, 则 RISC 复合体降解 该 mrna; 若二者序列部分匹配, 尤其是 的 5 端 2~8 个被称为种子序列 (seed sequence) 的碱 基与靶 mrna 完全匹配, 则通过抑制靶 mrna 的 翻译来沉默该基因 ( 图 1) [23] 图 1 的合成和作用机制 Fig. 1 Generating and action mechanism of [23] 2 水产动物 信息的获取 对水产动物进行目标组织的 测序是获 得 信息的主要途径 水产动物 的 组织测序一般分为两种情况 其一, 对某个组 织或者几个组织的混合样本进行测序 ; 其二, 设置实验组和对照组, 对两者分别测序找出其 中差异表达的 进行分析 前者在于获取 目标组织的 信息, 后者侧重分析 对目标基因的调控机制 水产动物中相应的组织或组织混合池 [24] 测序如下 :Chen 等研究了刺参 (Apostichopus japonicus) 夏眠阶段肠道中 表达情况, 共 发现 308 个保守,18 个新的 其中 mir-200-3p 等 7 个 在夏眠阶段的肠道中高 度表达, 暗示这些 可能参与了转录抑制 [25] 与细胞分化的过程 Wei 等对光棘球海胆 (Strongylocentrotus nudus) 的雌雄生殖腺 口部肌 肉 肠和管足等 5 个组织的 进行了检测, 共发现 345 个保守,70 个 为海胆所 [26] 特有 Mi 等进一步检测了光棘球海胆雌雄生 殖腺中的, 结果显示分别有 47 个和 51 个 在雄性和雌性性腺中特异性表达 类似的 组织测序在软体动物的太平洋牡蛎 (Crassostrea gigas) [27] 栉孔扇贝 (Chlamys farreri) [28] 食用牡蛎 (Ostrea edulis) [29] 太平洋牡蛎 (Crassostrea gigas) [30] 欧洲帽贝 (Patella vulgata) [31] ; 甲壳动物的蚤状溞 (Daphnia pulex) [32] 明钩虾 (Parhyale hawaiensis) [33] 日本囊对虾 (Marsupenaeus japonicus) [34-35] 斑节对 虾 (Penaeus monodon) [36] 克氏原螯虾 (Procambarus clarkii) [37-38] 大西洋中脊盲虾 (Rimicaris exoculata) [39] 罗氏沼虾 (Macrobrachium rosenbergii) [40] 中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis) [41] 拟穴 青蟹 (Scylla paramamosain) [42] 三疣梭子蟹 (Portunus trituberculatus) [43] ; 鱼类中的尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus) [44] 虹鳟 (Oncorhynchus mykiss) [45] 鲤 (Cyprinus carpio) [46] 等多个物种中均 有所报道 详细 测序物种 组织及筛选 出的重要 信息见表 1 除了直接的组织测序, 通过生物信息学对已 有物种的 序列进行分析比对也是获取 [47] 信息的方法之一 例如, 柳承璋等通过 生物信息学方法对蚤状溞 进行了数据发 掘, 分析得到 252 个 pre-, 可编码 262 个功 [48] 能, 发现 6 个 簇 ;Yang 等通过生 物信息学总结了虹鳟的 及其靶基因, 共 发现 196 个 分别属于 124 个家族, 这些 的靶基因有 2466 个, 其功能涉及代谢 细 胞分化等多个方面 Barozai [49] 在大西洋鲑 (Salmo salar) 中发现 102 个 分属 46 个家族, 靶基因

3 978 水产学报 40 卷 有 258 个, 这些基因主要参与免疫 生长 转录 调控等过程 是在真核生物中广泛存在的调控因 子 当前有关水产动物 调控机制的研究 虽取得了初步成果, 但尚有众多功能基因的转 录水平调控不甚清晰 要阐明其调控机制, 获得 序列是首要任务, 因此, 无论是组织测 序还是生物信息学分析, 都为研究水产动物功 能基因的转录调控提供了基本的 数据 3 水产动物 的功能 无论是诸如棘皮动物 软体动物此类的低等 无脊椎水产动物, 还是像鱼类一样的高等脊椎 水产动物, 作为普遍存在的转录后调控机制, 均在其体内实施多种生物学功能 3.1 免疫 免疫反应是一个复杂而精细的调控系统, 一 方面, 动物体需要对外源性刺激做出迅速而准 确的反应 ; 另一方面, 又要避免对机体造成过 度损伤 只需通过几个碱基互补便可发 挥作用, 因此在免疫反应中, 快速 精 细而又柔和的调控就显得至关重要 研究人员通过用灿烂弧菌 (Vibrio splendidus) 感染刺参 (in vivo) 和用脂多糖诱导刺参体腔细胞 (in vitro) 的方法证实,miR-92a [50],miR-31 [51], mir-200 [52] 在刺参的免疫系统中发挥作用 [29] Chen 等在急性病毒性坏死病毒 (acute viral necrobiotic virus,avnv) 侵染的栉孔扇贝中发现 37 个 较对照组显著差异表达 ; 在牡蛎包纳 [29] 米虫 (Bonamia ostreae) 侵染食用牡蛎和灿烂弧 [30] 菌侵染太平洋牡蛎中也存在类似的现象 现有 [35] 的甲壳动物中,Huang 等对感染对虾白斑综合 征病毒 (white spot syndrome virus,wssv) 的日本 囊对虾血淋巴进行 测序, 较对照组在实 [53] 验组中发现 31 个差异表达 Huang 等进 一步研究证实, 日本囊对虾的 mir-7 能与 WSSV 的早期基因 wsv477 的 3 UTR 结合从而降低其转录 水平, 将人工合成的 mir-7 注射到感染 WSSV 的 日本囊对虾体内,72 h 之后可使 WSSV 的数量减 [38] 少 1000 倍 Ou 等在颤抖病螺原体 (Spiroplasma [42] eriocheiris) 侵染克氏原螯虾,Li 等在副溶血性 弧菌 (Vibrio parahaemolyticus) 侵染拟穴青蟹的实 验中也分别发现 33 个和 161 个显著差异表达 无脊椎动物缺乏后天获得特异性免疫功能的 能力, 不产生免疫球蛋白 如甲壳动物是依靠 血细胞吞噬和包囊化作用发挥其免疫防御机 [54] 能 Labreuche 等进一步阐述了对虾可能存在 的 抗病毒机制 : 病毒分子侵染对虾, 使 感染细胞核内产生 Ars2 和 Pasha 两种相互作用的 蛋白,Ars2 和 Pasha 复合物及相关蛋白将 pri- 剪切成 pre-, 在细胞质中 DCR1 将 pre- 加工成成熟的双链, 与 AGO1 及相 关因子组成复合物与靶基因结合, 调控靶基因 的表达 [55] 鱼类中,Sha 等在用鳗弧菌 (Vibrio anguillarum) 侵染的半滑舌鳎 (Cynoglossus semilaevis) 的肝脏 头肾 脾和肠中发现 10 个显著差异表达 [56] Xu 等在嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila) 侵 [57] 染的草鱼 (Ctenopharyngodon idella),zhang 等在 肿大细胞病毒 RBIV-C1 侵染的牙鲆 (Paralichthys [58] olivaceus),qi 等在聚肌苷酸胞苷酸 (poly(i:c)) 侵 染的大黄鱼 (Larimichtly crocea) 的实验中也发现存 在类似的差异性表达 不同于无脊椎动物, 鱼 类免疫系统包括先天性的或非特异性的防御系 统, 以及获得性的或特异性的防御系统, 从而 表明 在鱼类免疫系统的分子机制更接近 于哺乳动物 现有研究证实, 在免疫过程中, 细胞的 可以通过作用于病毒基因或有利于病毒 基因复制的寄主基因来抑制病毒的增殖 因 此, 在水产动物的免疫反应中, 上述发生显著 差异表达的, 很有可能是与病毒的核酸 序列或者是有利于某个病毒复制的寄主基因相 结合, 在数量和结合程度上影响其表达, 从而 达到抵御外来入侵的目的 研究 在水产 动物免疫反应中的分子机制, 有助于我们从源 头上阐明某些水产动物疾病的病原和发病机制, 为从根本上防治这些疾病提供一个新的切入点 3.2 器官形成 鱼类眼睛的发育是一个多因子参与的复杂生 物学过程, 而 在其中的调控作用不可或 [59] 缺 Kapsimali 等在斑马鱼 (Danio rerio) 中研究发 现,miR-181a 和 mir-181b 在斑马鱼的视网膜细胞 中特异性表达,miR-92b 和 let-7b 则在睫状体边缘 区域细胞中表达,miR-9 在眼睛内核层的无长突

4 6 期李法君, 等 :microrna 在水产动物中的研究进展 979 细胞和睫状体边缘区域细胞中表达,miR-204 和 mir-184 则在水晶体中表达, 表明上述 参 [60] 与了斑马鱼眼睛的发育过程 Ivan 等在青 (Oryzias latipes) 中的研究表明,miR-204 与靶基因 Meis2 在 水晶体和视网膜的形成过程中发挥作用 [61] Ramachandran 等研究证实 let-7 的调控对于斑马 [62] 鱼视网膜的发育同样不可或缺 Xia 等对尖吻 鲈 (Lates calcarifer) 的 9 个组织 测序发现, mir 和 mir 在尖吻鲈眼睛组织中高度 表达, 而 mir 和 mir 在眼睛组织中特 异性表达, 表明这些 可能参与了尖吻鲈 眼的形成过程 视网膜从前脑发育而来, 其中 要经历复杂的细胞分化过程 则被视为 具有重要应用潜质的调控神经干细胞增殖和分 化的新成员, 能对视网膜中的细胞命运进行调 控 上述过程在脊椎动物中都是类似的, 而其 中具体的调控机制尚未明确 斑马鱼作为模式 生物, 基因组测序工作已经完成, 为研究上述 过程奠定了坚实的数据基础 因此, 在斑马鱼 中开展 在眼形态发生过程的作用机制研 究, 可以为研究脊椎动物, 特别是人类眼睛的 发育提供很好的借鉴和参考 在脊椎动物胚胎发育的过程中, 心脏是最早 形成且行使功能的器官 斑马鱼易培养, 胚胎 数量多, 且完全透明, 便于观察, 是研究鱼类 心脏发育的理想材料 mir-138 是斑马鱼心脏发 育过程中不可缺少的调控因子, 在胚胎发育过 程中,miR-138 负调控 aldh1a2 和 cspg2 基因的表 达, 沉默 mir-138 可使斑马鱼心室肌细胞出现缺 陷, 此结果表明 mir-138 参与斑马鱼心脏的形成 过程 [63] mir-218 通过 Slit/Robo 信号系统调控心脏 前体细胞向中轴迁移会聚的过程, 是斑马鱼心 脏环化的重要调控因素 [64] ; 另有研究表明,miR- 128 还可以和转录因子 Tbx5 基因结合参与到心脏 细胞分化和心脏瓣膜形成的过程中 [65] 此外, mir-21 也在心脏瓣膜的形成过程中发挥作用 [66] [67] Lalwani 等分别通过沉默和过度表达 mir-142-3p 发现,miR-142-3p 在斑马鱼心脏血管的发育 重塑 再生等方面发挥作用 作为循环系统中最重要的器官, 心脏的发育 过程一直是人们研究的热点问题 在哺乳动物 中相关研究表明,miR-1 和 mir-133 在心脏发育过 程中发挥关键作用 而至今还未见 mir-1 和 mir- 133 在鱼类心脏发育过程有调控作用的报道 这 可能与鱼类和哺乳动物的心脏构造不同有关 在鱼类中除斑马鱼外, 其他鱼类心脏的发育模 式还少有研究 作为水产动物中为数不多的模 式生物, 阐释 在斑马鱼心脏发育中的作 用, 无疑对研究其他鱼类的心脏发育研究有重 要的参考意义 鱼类骨骼要经历软骨化和硬骨化的过程, 此 过程受多种转录因子的调控, 如 Sox9 [68],Runx2 [69] 等 mir-140 在斑马鱼的软骨组织中特异性表 达, 并且 Sox9 是 mir-140 的上游调控因子 [70], 此结 果揭示,miR-140 是 Sox9 调控体系的一部分 ; 而 mir-204 和 mir-211 则负调控 Runx2 基因的表达 [71] 以上结果表明, 是调控鱼类骨骼形成的 重要因素 近来, 在动物骨骼发育过程 中的作用越来越受到重视, 研究发现, 一般是通过多个信号 (Hn,Twist,BMP 和 FGF 等 ) 通路来调控骨骼发育 [72] 水产动物骨骼发育过程 中, 是否通过以上信号通路发挥作用还 需进一步研究 3.3 发育 [73] Chen 等在蚤状溞中发现 mir-8 等 5 个 在不同的发育时期差异性表达, 表明这 5 个 在蚤状溞生长发育过程中发挥作用 斑马 鱼胚胎阶段的研究表明,miR-430 从受精卵就开 始转录, 在囊胚期转录水平达到高峰, 主要负 责降解受精卵中的驻留 ( 原来卵母细胞遗留的 ) 母系基因 [74-75] 进一步研究表明,miR-430 还参与 了斑马鱼原肠胚和脑室的形成过程 [76] mir- 206 则通过丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase,mapk) 信号体系调控原肠胚的形 成 [77] mir-314 是驻留, 在卵母细胞中高 度表达, 其在斑马鱼早期神经系统的形成过程 中发挥作用 [78] 而其他一些驻留 ( 如 mir- 24,miR-30,miR-126,miR-146,miR-221) 的功 能尚未可知 [79-80], 还需深入研究 受精卵是生命 过程中的开始点, 受精完成后大部分驻留蛋白 的功能已经结束, 因此随着胚胎不断发育, 这 部分驻留蛋白将会被降解, 而 可能是其 降解的动力 动物的生殖嵴起源于中胚层, 具有双向性发 育的特点 原始的生殖细胞通过细胞迁移, 到 达正在发育的生长嵴处, 与不同的生殖嵴细胞 结合, 继而分别发育成精巢或卵巢 斑马鱼中

5 980 水产学报 40 卷 研究表明, 正常的生殖细胞会在胚胎发育时期 与其他细胞集中在身体中线, 然后开始向将来的生 殖腺迁移,SDF-1 和 Cxcr4b 则是性腺细胞从发生 位置迁移到日后性腺的 路标 和 盲公棒 [81] 而 mir-430 通过调控 SDF1a 的表达在性腺的形成过 程中发挥作用 [82] 由此可见, 从起始阶段 就调控性腺的发育 鲽形目鱼类在生长发育过程中要经历一个从 两侧对称体型到扁平体型变化的阶段, 而 在此过程中发挥作用 在大西洋庸鲽 (Hippoglossus hippoglossus) [83] [84] 和褐牙鲆不同发育 时期的 测序结果表明, 多个 在变 形的过程中呈差异性表达 进一步研究发现, Let-7 是参与牙鲆躯体形变过程的 之一 [85] 褐牙鲆的多个 mrna 的 3 UTR 都存在 Iet-7 的结合 位点 [86], 可见 Let-7 可以作用于多个基因, 参与包 括 : 蛋白质合成 信号转导 免疫和细胞周期 等一系列过程图 这与鲽形目躯体形变是一个 复杂的过程 ( 此过程中必然会涉及上述的生物学 过程 ) 相一致 3.4 生长 脊椎动物肌肉的生长分化过程中需要 Hedgehog 信号途径 胰岛素样生长因子 (insulin-like growth factor,igf) 信号途径 视黄酸信号途径等多种 因子的调控 肌肉中成肌细胞的增殖和分化受 生肌调节因子 (myogenic regulatory factors,mrf) 调控 MyoD 是 MRF 家族的一员, 主要参与肌肉 分化过程 对尼罗罗非鱼的研究表明,miR- 203b 负调控 MyoD 基因的表达 [87] 对斑马鱼的研 究则表明,let-7,miR-19 和 mir-130 参与了肌管 由增长向衰减的转变过程 [88] 在骨骼肌的生成过 程中, 肌细胞分化为慢肌纤维和快肌纤维,miR- 214 通过结合靶基因 Sufu(suppressor of fused) 正调 控慢肌纤维表型, 而 Sufu 是 Hedgehog 信号的负调 控因子 Hedgehog 信号是肌细胞特化所必需的, 所以 mir-214 通过 Hedgehog 信号来指定肌细胞的 命运 [89] ; 已有的研究表明,Sox6 基因促进快肌纤 维的分化, 而 mir-499 则通过负调控 Sox6 基因来 维持慢肌纤维的分化 [90] 在骨骼肌的形成过程中存在 IGF-1/IGF-1R (IGF-1 受体 ) 和 mir-133 相互调控的负反馈机制, IGF-1 可以促进 mir-133 表达, 而 mir-133 反过来 则可以抑制 IGF-1R 的转录水平 [91] 在尼罗罗非鱼 中 mir-206 负调控靶基因 IGF-1 表达, 抑制 mir- 206 可以促进尼罗罗非鱼的生长 [92], 此结果暗示 可能参与了鱼类的下丘脑 - 垂体调控系 统 另有研究表明, 骨骼肌中 mir-1,mir-27a, mir-133a 和 mir-206 随着尼罗罗非鱼的生长, 表 达量逐渐升高 [93] ; 而 mir-1 等 8 个 ( 见表 1) 在 鲤鱼中也存在类似的现象 [94], 表明这些 可 能与转录调控因子结合调控鱼类生长 水产动物是人们重要的蛋白质来源, 肌肉的 生长发育也是水产科研人员研究的一个重要课 题 在水产动物中寻找鉴定新的, 并对 其靶基因进行标识, 会进一步丰富水产动物肌 肉细胞增殖 定向分化 肌肉纤维膨大的分子 机制, 进而为改善某些水产动物肌肉的品质奠定 理论基础, 最终可以提高水产养殖的效益 鱼类的生长除了内因 ( 基因 ) 调控之外, 摄 食 营养等外因也起着关键作用 研究表明 也参与到外因诱导的生长调控途径中 肌纤维细胞由胚胎发育早期的成肌细胞经过增 殖和肥大形成, 大鼠中的研究表明 mir-1/133 是 成肌细胞肥大的负调控因子 [95] 虹鳟幼体发育要 经历内源性营养 混合营养和外源性营养 3 个阶 段 研究发现,miR-1/133 在虹鳟的肌肉中特异 表达, 且在此 3 个阶段中表达量逐渐下降, 表明 随着鱼类的开口摄食,miR-1/133 通过调控肌细 胞的形成参与鱼类的生长过程 [96] [97] Zhu 等分别 对禁食和饱食后的鳜 (Siniperca chuatsi) 开展研究, 结果发现 mir-10c 等 7 个 在骨骼肌中差异表达, 表明这些 可能参与了肌肉的生长过程 通过以上结果可以发现, 随着鱼类食物的摄 入和生长过程食性的转换, 表达会发生 明显变化, 这些可能与所摄取的食物有关 本 文推测这些 很可能会调控与营养代谢相 关的基因, 而食物摄入 食性转换则诱导并影 响了上述 的表达 3.5 生殖 水产动物的性腺是其繁衍生殖的物质基础, 有关性腺发育的调控机制也是水产动物研究的 前沿领域 众多的生化过程参与其中, 也在性腺的发育过程中扮演重要角色 雄性大 [98] 西洋庸鲽性成熟要早于雌性,Bizuayehu 等发 现, 同龄 (5 龄 ) 的雌雄个性相比 ( 精巢成熟而卵巢 未成熟 ),let-7a,mir-143,mir-202-3p 在精巢中

6 6 期李法君, 等 :microrna 在水产动物中的研究进展 981 的表达量要高于卵巢 对雌鱼幼体进行雄性化 处理过程中,let-7a 和 mir-143 表达量上升, 如果 终止雄性化处理, 则 let-7a 和 mir-143 表达量又恢 复到原来水平 表明 let-7a, mir-143 和 mir-202-3p 参与了性腺发育的过程 斑马鱼中的研究发 现,miR-17a 和 mir-430b 调控卵泡发育和卵母细 胞的成熟 [99] 尼罗罗非鱼中的研究表明,miR p 和 mir-727-3p 在卵巢中的表达量高于精 巢, 而 mir-132a 和 mir-212 则呈现相反的表达趋 势 [100] [101] Song 等通过对中华绒螯蟹卵巢的 测序分析发现,miR-2 和 mir-133 在卵母细胞减数 分裂成熟过程中出现差异表达, 表明 可 能在转录后水平调控细胞周期蛋白 B(cyclin B) 的 表达 卵巢是雌性动物最重要的生殖器官, 在人类 中的研究已经证实, 与卵巢癌的发病密 切相关, 可见 是调控卵巢正常发育的关 键因子 鱼类中的卵巢发育分为多个阶段, 包 括卵子发生 卵泡发育 卵巢退化等多个生理 过程, 每个阶段 所起的作用也不尽相同 然而, 在水产动物中关于此方面的研究还相对 薄弱 需要特别指出的是, 在水产动物中, 有 关 在雄性精巢发育过程中的作用还少有 研究 哺乳动物的研究表明, 一方面参 与了调控精子形成早期相关蛋白的翻译过程 [102], 另一方面与生殖细胞的凋亡密切相关 总之, 调控水产动物性腺发育的研究刚刚起步, 随着 研究的逐步深入, 其中具体的调控机制将会逐 渐明确 3.6 调节渗透压 [43] Lv 等在低盐胁迫三疣梭子蟹的鳃中发现 12 个较对照组显著差异表达的, 这些 的靶基因主要参与离子转运和甲壳素代 谢等调节渗透压的过程 渗透胁迫转录因子 1(osmotic stress transcription factor 1,OSTF1) 在鱼 类的渗透压调节过程中起着重要作用 尼罗罗 非鱼中的研究发现,miR-429 通过调控 OSTF1 基 因的表达来调节血浆中的离子浓度 [103] ; 另外的 研究证实, 降低 mir-30c 的表达, 可使罗非鱼血 浆中的离子失衡, 表明 mir-30c 也是重要的渗透 压调节因子 [104] 在斑马鱼中的胚胎发育过程中, mir-8 家族在离子细胞中高度表达, 通过调节 Nherf1 基因的表达来调控 Na + 的转运 [105] 广盐性的水产种类, 例如, 凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 在海水和淡水中均可进行 人工养殖, 其渗透压的调节机制尚不明确, 从 上述研究的结果来看, 在其中的调控作 用不容忽视 更重要的是, 我国幅员辽阔, 盐 碱地区众多, 这些地区多不适宜农作物种植, 因此荒废 对盐碱地的水质 离子成分进行分析, 针对具体物种的渗透压调节机制, 必要时补充 相关离子, 进行水产养殖可以提高盐碱地区的 经济效益 因此研究水产动物的渗透压调节机 制, 特别是 在其中的作用就显得尤为关 键 3.7 代谢 [106] Ordas 等在感染鼠伤寒沙门菌 (Salmonella typhimurium) 的斑马鱼胚胎中沉默 mir-146, 引起 载脂蛋白基因的表达量上升, 表明 mir-146 参与 [107] 了脂类的代谢过程 Tang 等通过在尼罗罗非 鱼中饲喂维生素 E 发现,miR-21 等 8 个 在实 验组高丰度表达, 表明这 8 个 参与了维生 素 E 的代谢过程 脂肪是鱼类的供能物质, 对鱼 体组织的修补 新组织的生长至关重要 在脊 椎动物中已有研究表明, 参与了脂肪代 谢的过程 [18-19] 虽然在水产动物中有关脂肪代谢 的研究尚少, 根据 的作用机制可以分析 发现 : 通过与靶基因的作用, 影响脂类 的生成 运输和氧化分解等过程, 从而调节水 产动物体脂类的代谢平衡 开展此方面的研究 对于理解 的多功能性和解析水产动物营 养物质的代谢过程均具有重要意义 3.8 其他功能 珍珠形成 [108] Jiao 等对马氏珠母贝 (Pinctada martensii) 闭壳肌 鳃 珍珠囊 肝脏等 8 个组织 的混合样品进行了 测序及分析, 预测 mir 和 mir-0046 可能会参与生物矿化 ( 珍珠形成 ) [109] 的过程 ;Jiao 等进一步确认,miR-2305 可以结 合靶基因 pearlin 在珍珠的形成过程中发挥作用 [110] Zheng 等在上述 测序数据的基础上, 继 续挖掘了可能参与马氏珠母贝珍珠形成的, 结果表明,pm-miR-2386 和 pm-mir- 13b 是另外 2 个可能在珍珠形成过程发挥作用的 作为一种古老的有机宝石, 珍珠由软 体动物的珍珠层分泌而成, 阐释 在珍珠

7 982 水产学报 40 卷 矿化过程中的作用将有助于明确此过程所蕴含 的分子机制, 进一步提高珍珠的产量和品质 色素沉淀 [111] Yan 等在鲤中发现,miR-429 在红色鲤中的表达量要显著高于白色个体 在 红色鲤鱼中沉默 mir-429, 可使其肤色变淡, 表 明 mir-429 参与了色素沉淀过程 目前关于鱼类 体色是如何随鱼体生长保持动态平衡的原因尚 不清楚, 比较认可的观点是, 干细胞不断分化 为新的色素细胞, 从而使体色在鱼体生长过程 中保持稳定 [112] 据此推测,miR-429 可能参与了 干细胞向色素细胞转化的某个反应 内参基因 [113] Xu 等发现草鱼的 mir-126-3p 等 7 个 呈稳定的表达, 可以作为内参基因使 用 综上所述, 在水产动物中呈现多样的 生物学功能 通常情况下, 与已知功能 的靶基因结合, 通过调控靶基因的表达来实现 自己的生物学功能 4 展望 靶基因的确定 作为新发现的一类基 因表达调控因子, 目前通过大规模深度测序, 新 的发现相对来说比较容易 很多水产 动物的组织均进行了 测序, 且获得了大 量的 序列数据, 但是其中大部分 序列的靶基因尚未确定 虽然在挖掘 靶基因方面存在多种方法如生物信息学 方法 差异表达谱分析法 mirisc 免疫共沉淀 法等 [114], 但每种方法都有其不足之处, 且 存在多个靶基因的特性 因此在水产动物中开 发高通量特异的 灵敏度高的 靶基因筛 选与鉴定方法已成为当前亟待研究的课题 的保守性 作为模式生物, 斑马鱼中 大量的 功能已被阐述, 这为研究其他鱼 类的 功能提供了很好的借鉴和参考 这 里就包括在脊椎动物中功能保守的, 而 这些保守的 在软体动物和甲壳动物中是 否存在相似的功能, 现在来看, 结果并不像我 们想象的那么乐观 如上所述,miR-1 和 mir-133 在其哺乳动物的心脏发育过程发挥关键作用, 而其在鱼类心脏发育过程中的作用还未见报 道 因为软体动物和甲壳动物隶属于无脊椎动 物, 特别是甲壳动物处于无脊椎动物向脊椎动 物进化的过渡阶段, 独特的进化地位决定了 功能的特殊性 仍就心脏发育而言, 软体动物和甲壳动物的心脏结构明显不同于鱼类, 而 mir- 138,miR-218, 和 mir-21 等在斑马鱼心脏发育过程中起作用的 是否会在软体动物和甲壳动物的心脏发育中发挥作用, 还需进一步研究 的多功能性 (1) 行为 : 在果蝇最新的研究中首次揭示了一种控制精确行为的 microrna-mir-iab4/8 如果 mir-iab4/8 发生了突变, 果蝇幼虫被颠倒之后就难以恢复自己的方位 [115] 此结果揭示了 功能的多样性 目前在水产动物中, 关于与行为有关的 尚无报道 开展此方面的研究将有助于解析水产动物的某些行为 ( 如婚配 捕食 逃避敌害 ) 的分子机制 (2) 性别决定 : 软体动物作为重要的经济动物, 其双壳类物种中有雌雄同体和性变现象 [116], 在这些物种的雌雄生殖腺的分化和性逆转的过程中, 是否参与了上述过程尚未见报道 鱼类作为低等的脊椎动物, 性别决定因子复杂多样, 温度 激素等外因均可对鱼类的性别分化产生影响, 而在此过程中 的作用还鲜有研究 参考文献 : [ 1 ] Qu K, Wang Z, Lin X l, et al. MicroRNAs: Key regulators of endothelial progenitor cell functions [J]. Clinica Chimica Acta, 2015, 448: [ 2 ] He Y, Ju C, Zhang X. Roles of small RNAs in the immune defense mechanisms of crustaceans [J]. Molecular Immunology, 2015, 68(2): [ 3 ] Wheeler B M, Heimberg A M, Moy V N, et al. The deep evolution of metazoan micrornas [J]. Evolution &Development, 2009, 11(1): [ 4 ] Takacs C M, Giraldez A J. MicroRNAs as genetic sculptors: fishing for clues [J]. Seminars in Cell &Developmental Biology, 2010, 21(7): [ 5 ] Lee R C, Feinbaum R L, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14 [J]. Cell, 1993, 75(5): [ 6 ] Reinhart B J, Slack F J, Basson M, et al. The 21- nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans [J]. Nature, 2000, 403(6772):

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13 988 水产学报 40 卷 identifying microrna targets in animals[j], Journal of [J]. Fish & Shellfish Immunology, 2012, 33(2): 436- [115] [116] [117] Biology, 2014, 31(2): (in Chinese). Picao J, Johnston J, Landgraf M, et al. MicroRNAencoded behavior in Drosophila [J]. Science, 2015, 350(6262): Heller J. Hermaphroditism in molluscs [J]. Biological Journal of the Linnean Society, 1993, 48(1): Li C, Feng W, Qiu L, et al. Characterization of skin [118] [119] 441. Yang L, Yang G, Zhang X. The mir-100-mediated pathway regulates apoptosis against virus infection in shrimp [J]. Fish &Shellfish Immunology, 2014, 40(1): Flynt A S, Li N, Thatcher E J, et al. Zebrafish mir-214 ulceration syndrome associated micrornas in sea modulates hedgehog signaling to specify muscle cell cucumber Apostichopus japonicus by deep sequencing fate [J]. Nature Genetics, 2007, 39(2): Research progress of in aquatic animals LI Fajun 1, 2, LI Mingshuang 3, FU Chunpeng 1, LI Qunfeng 1, LUO Yongju 4, FU Hongtuo 2 * (1. Weifang University of Science and Technology, Shouguang , China; 2. Key Laboratory of Freshwater Fisheries and Germplasm Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi China; 3. National Fisheries Technical Extension Center, Beijing , China; 4. Guangxi Academy of Fishery Sciences, Nanning , China) Abstract: MicroRNAs (s) are a class of small non-coding RNA molecules that negatively regulate gene expression at the post-transcriptional levels by base pairing with target mrnas which leads to mrna cleavage or translational repression in eukaryotes. A large number of studies show that s play a vital role in physical development, cancer, cell differentiation, proliferation and apoptosis, lipid metabolism. Recently, numerous research findings about s have been gained in aquatic animals. However, no comprehensive summary has been reported in this aspect so far. This paper reviews the recent research progress of s in aquatic animals. The results show that s present diverse biological functions in aquatic animals. The aim of this review is to provide basic references for analysing prospects of further development about s in aquatic animals. Key words: fish; crustacean; aquatic animals; ; negative regulation; Corresponding author: FU Hongtuo. fuht@ffrc.cn Funding projects: National Natural Science Foundation of China ( ); the Freshwater Fisheries Research Center, China Central Governmental Research Institutional Basic Special Research Project from the Public Welfare Fund (2015JBFM11); Fund of Independent Innovation of Agricultural Sciences of Jiangsu province [CX (15)1012-4]; the three aquatic projects of Jiangsu Province (D ); the Science and Technology Development Fund of Wuxi (CLE02N1514).

14 6 期李法君, 等 :microrna 在水产动物中的研究进展 989 棘皮动物 Echinodermata 软体动物 Mollusca 甲壳动物 Crustacean 物种 species 刺参 A. japonicus 光棘球海胆 S. nudus 太平洋牡蛎 C. gigas 栉孔扇贝 C. farreri 食用牡蛎 O. edulis 太平洋牡蛎 C. gigas 珠母贝 P. martensii 蚤状溞 D. pulex 明钩虾 P. hawaiensis 日本囊对虾 M. japonicus 表 1 水产动物的 Tab. 1 in aquatic animals 组织 tissue 数量 number of 肠 ( 夏眠阶段 ) 308 个保守, 18 个新的 血细胞 40 个保守的, 86 个新的 ( 皮肤溃烂 ) 重要 principal 靶基因 target gene 功能 function 参考文献 reference 7 个 在实验组和对照组差异性表达 [24] 组织测序 mir-31 和 mir-2008 在实验组和对 [117] 组织测序 照组呈差异性表达 mir-92a MEGF, SMURF 免疫反应 [50] 备注 remark mir-31 Ajp105 免疫反应 [51] mir-200 AjTollip 免疫反应 [52] 雌雄生殖腺 口部肌肉 肠 管足 345 个保守, 70 个新的 雌雄生殖腺 184 个, 其中分别有 47 和 51 个 在雄性和雌性性腺中特异性表达 消化道 鳃 闭壳肌 血细胞等 9 个组织和受精卵 囊胚期 担轮幼虫期等 12 个不 100 个 pe- 分子转录位点, 19 个新的 pr- PC-5p-4087, PC-3p-29066, PC-5p , PC-5p-6321, PC-3p-6677, PC-3p 等 mir-2012, mir-34, let-7, let-7a, PC- 5p-15829_327 等 ( 雄性性腺 )mir- 92a, mir-71, mir-219, mir-2007, mir-2004 等 ( 雌性性腺 ) cgi-mir-1991, cgi-mir p, cgi-mir-33-5p 等 [25] 组织测序 [26] 组织测序 [27] 组织测序 同发育时期 血细胞 (AVNV 侵染 ) 57 个保守, 11 个新的 37 个 在实验组和对照组差 [28] 组织测序 异性表达 血细胞 63 个 在实验组和对照组差 [29] 组织测序 ( 牡蛎包纳米虫侵染 ) 异性表达 血淋巴 71 个保守, 128 个新的 22 个 在实验组和对照组差 [30] 组织测序 ( 灿烂弧菌侵染 ) 异性表达 闭壳肌 鳃 珍珠 205 个保守, 53 个新的 mir p, mir-666, mir-466i, [108] 组织测序 囊 肝脏等 8 个组织的 mir-629, mir-2305, mir-0046 等 混合池 mir-2305 pearlin 珍珠形成 [109] 成体 205 个 分别隶属于 188 个不 dma-mir-276, dma-mir-279, dmamir-317, [32] 成体测序 同的家族 dma-mir-745 等 mir-8, mir-9, mir-12, mir-92, 生长发育 [73] mir-100 胚胎阶段 55 个保守的, 20 个新的 mir-2, mir-12, mir-87, mir-275, [33] 组织测序 mir-276, mir-279, mir-307, mir- 750, mir-1175 mir-306 等 血细胞 35 个保守的, 20 个新的 mja-mir-156, mja-mir-164, mjamir-402, [34] 组织测序 等 血淋巴 48 个, 15 个新的 31 个 在实验组和对照组差 [35] 组织测序 (WSSV 侵染 ) 异性表达 mir-7 wsv477 免疫反应 [53] mir-100 Trypsin 细胞凋亡 [118]

15 990 水产学报 40 卷 鱼类 Pisces 续表 1 物种 species 斑节对虾 P. monodon 组织 tissue 眼柄 肝脏 血细胞 血淋巴 卵巢的 cdna 文库 克氏原螯虾 (P. clarkii) 肝脏 ( 饲喂大黄素 ) 大西洋中脊盲虾 R. exoculata 罗氏沼虾 M. rosenbergii 中华绒螯蟹 E. sinensis 拟穴青蟹 S. paramamosain 三疣梭子蟹 P. trituberculatus 尼罗罗非鱼 O. niloticus 数量 number of 106 个保守的, 5 个新的 重要 principal mir-4152, mir-466k, mir-32, lin-4, mir-1346, mir 个 在实验组和对照组差异性表达 血细胞 30 个保守的, 48 个新的 33 个 在实验组和对照组差 ( 颤抖病螺原体侵染 ) 异性表达 肌肉 159 个保守, 34 个新的 rex-novel-19, rex-novel-9, rex-novel 10, rex-novel-11 等 鳃 肝脏 3 个保守, 27 个新的 G-m0005, G-m0008/H-m0016, G- m0011/h-m0027, G- m0015, G- m0005, G-m0008/H-m0016, G- m0011/h-m0027 等 靶基因 target gene 功能 function 参考文献 reference 备注 remark [36] 组织测序 [37] 组织测序 [38] 组织测序 [39] 组织测序 [40] 组织测序 精巢 15 个新的 mir-21-5p, mir-184, mir-let-7c, [41] 组织测序 mir-17-3p, mir-17-5p 等 mir-2, mir-133 cyclin B 减数分裂 [101] 组织测序 卵巢 55 个保守, 136 个新的 脑 心脏 肌肉 鳃等 7 个组织的混合池 ( 副 溶血性弧菌侵染 ) 鳃 ( 低盐胁迫 ) 不同发育阶段的混合池 133 个保守, 8 个新的 161 个 在实验组和对照组差异性表达 16 个保守, 51 个新的 12 个 在实验组和对照组差异性表达 197 个保守, 27 个新的 mir-1, mir-206, mir-7, mir-9, mir-122 等 mir-203b MyoD 肌肉分化 [87] [42] 组织测序 [43] 组织测序 [44] 组织测序 幼体 稚鱼 成体 老龄 4 个阶段的骨骼肌 25 个保守 mir-1, mir-27a, mir-133a, mir- [93] 组织测序 206 在不同的发育阶段差异性表达 mir-21, mir-223, mir-146a, mir- 代谢 [107] 125b, mir-181a, mir-16, mir-155 and mir-122 mir-429 OSTF1 渗透压调节 [103] mir-30c Hsp70 渗透压调节 [104] 虹鳟 O. mykiss 肌肉 心脏 大脑 肾脏等个组织的混合池 50 个保守, 4 个新的 mir-429, mir-192, mir-215, mir p, mir-199-5, mir-133, mir- 499 等 mir-1/133 生长 [96] [45] 组织测序 鲤 C. carpio 脑 皮肤 肾脏 肌肉等 11 个组织的混合池 92 个保守, 21 个新的 mir-124-5p, mir-460b-5p, mir-150, mir-140-3p, mir-204, mir-22, s0013-5p, s0011-5p, s0010-5p, mir-541, mir-727-5p, and mir p 等 [46] 组织测序,

16 6 期李法君, 等 :microrna 在水产动物中的研究进展 991 续表 1 物种 species 组织 tissue 数量 number of 1 龄鱼的骨骼肌 188 个保守, 7 个新的 重要 principal mir-1, mir-21, mir-26a, mir-27a, mir-133a-3p, mir-206, mir-214, mir-222 在不同的发育阶段差异性表达 靶基因 target gene 功能 function 参考文献 reference mir-429 Foxd3 色素沉淀 [111] 备注 remark [94] 组织测序 尖吻鲈 L. calcarifer 青鰆 (O. latipes) 半滑舌鳎 C. semilaevis 草鱼 C. idella 大西洋庸鲽 H. hippoglossus 鳃 脑 眼 肾脏等 9 个组织 肝脏 头肾 脾 肠 ( 鳗弧菌侵染 ) 脾 肾 肝脏 肠 血液 ( 嗜水气单胞菌侵染 ) 囊胚 形变早期 形变高峰期 幼体等 8 个发育时期 59 个保守, 63 个新的 152 个保守, 67 个新的 61 个保守, 124 个新的 199 个保守, 1 个新的 mir-183-1, mir-183-2, mir-184-1, mir 等 mir-204 Meis2 眼睛形成 [60] 10 个 在实验组和对照组差异性表达 21 个 在实验组和对照组差异性表达 mir-126-3p, mir-101a, mir-451, mir-22a, mir-146, mir-142a-5p and mir-192 let-7a, mir-9, mir-19b, mir-24, mir-122, mir-124, mir-145, mir- 430c 内参基因 [113] let-7a, mir-143, mir-202-3p 性腺发育 [98] [62] 组织测序 [55] 组织测序 [56] 组织测序 [83] 组织测序 牙鲆 P. olivaceus 脾 ( 肿大细胞病毒 RBIV-C1 侵染 ) 251 个保守, 130 个新的 121 个 在实验组和对照组差异性表达 10 个不同的发育时期 140 个保守 66 个 在变形阶段差异性表 达 Let-7 ( 鲆鲽类 ) 躯体形变 [85] [57] 组织测序 [84] 组织测序 大黄鱼 L. crocea 鳜 S. chuatsi 斑马鱼 D. rerio 胸腺 前肾 脾 肝脏 (poly(i:c) 侵染 ) 158 个保守, 376 个新的 112 个 在实验组和对照组差异性表达 mir-10c, mir-107a, mir-133a-3p, mir-140-3p, mir-181a-5p, mir- 206, mir-214 生长 [97] mir-146 IRAK1 IRAK6 脂类代谢 [106] mir-430 SDF1a 胚胎发育 生殖 嵴的形成 [58] 组织测序 [74];[76];[82] mir-206 prickle1a 胚胎发育 [77] mir-314 神经系统形成 [78] mir-314 Sufu 肌肉形成 [89] let-7, mir-19 和 mir-130 肌肉形成 [88] mir-499 Sox6 肌肉形成 [90]

17 992 水产学报 40 卷 续表 1 物种 species 组织 tissue 数量 number of mir-181a, mir-181b, mir-92b, let- 7b, mir-9, mir-204, mir-184 重要 principal 靶基因 target gene 功能 function 参考文献 reference 眼睛形成 [59] let-7 眼睛形成 [61] 备注 remark mir-138 aldh1a2, cspg2 心脏形成 [63] mir-218 Robo1, Robo2 心脏形成 [64] Tbx5 心脏形成 [65] mir-21 Sprout, pdcd4 心脏形成 [66] mir-142-3p Chd5 心脏形成 [67] mir-204/mir-211 Runx2 骨骼形成 [71] mir-214 生长 [119] mir-133 生长 [91] mir-206 IGF-1 生长 [92] mir-17a 和 mir-430b 性腺发育 [99] mir-138 Nherf1 调节渗透压 [105] Notes:MEGF. multiple epidermal growth factor-like domains protein 6; SMURF. E3 ubiquitin-protein ligase SMURF2; Ajp105. P105 of A. Japonicus; AjTollip. Toll-interacting protein of A. Japonicus;WSSV. White Spot Syndrome Virus; AVNV. acute viral necrobiotic virus; cspg2. chondroitin sulfate proteoglycan 2; sprout. sprout homolog; pdcd4. programmed cell death 4; abhd5. α/β hydrolase domain 5; OSTF1. Osmotic stress transcription factor 1