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1 中国组织工程研究与临床康复第 15 卷第 46 期出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research November 12, 2011 Vol.15, No.46 葡萄糖调节蛋白 78 真核表达载体及稳定转染人视网膜色素上皮细胞株的构建李漫丽 1, 戚卉 2, 孙蕾 3 2, 吴雅臻 Construction of human glucose regulated protein 78 eukaryotic expression vector and expression in retinal pigment epithelium cells Li Man-li 1, Qi Hui 2, Sun Lei 3, Wu Ya-zhen 2 Abstract BACKGROUND: Glucose regulated protein 78 (grp78) is a molecular chaperone protein, which is mostly located on the endoplasmic reticulum, and protects cells from cell apoptosis. OBJECTIVE: To construct the pegfp-grp78 fusion protein eukaryotic expression vector and to detect their expression in human retinal pigment epithelium (RPE) cell lines. METHODS: The encoding fragment of human grp78 gene was obtained from a recombinant plasmid POTB7-grp78 using PCR, and it was digested by restriction enzymes Hind Ⅲ and Kpn Ⅰ. Then the purified grp78 gene fragment was inserted into the GFP expression vector PEGFP-N1, and the recombinant plasmid PEGFP-grp78 was identified by PCR analysis and DNA sequencing. The recombinant plasmids were transfected into RPE cells by lipofectamin. RPE cell lines with grp78 stable expression were established by G418 selection. The expression of grp78 gene was detected by RT-PCR. The expression of fusion proteins was assayed by fluorescence microscopy. RESULTS AND CONCLUSION: We successfully constructed the expression vector of pegfp-grp78 fusion protein and the sequence results were matched to the cdna of human grp78. Stably transfected RPE cell line was established and grp78 was expressed successfully. Li ML, Qi H, Sun L, Wu YZ. Construction of human glucose regulated protein 78 eukaryotic expression vector and expression in retinal pigment epithelium cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(46): [ 摘要背景 : 葡萄糖调节蛋白 78 是存在于内质网上最多的分子伴侣蛋白, 具有保护细胞对抗细胞调亡的作用目的 : 构建携带并正确表达外源性人葡萄糖调节蛋白 78 基因的重组真核表达载体, 建立葡萄糖调节蛋白 78 基因稳定转染的人视网膜色素上皮细胞系方法 : 扩增人葡萄糖调节蛋白 78 全长编码序列, 将该目的基因与真核表达载体 PEGFP-N1 进行定向连接, 其产物转化细菌感受态细胞, 以 PCR 方法鉴定阳性克隆, 并进行测序和分析比对, 获得融合蛋白表达质粒载体 pegfp-grp78 通过阳离子脂质体介导将重组质粒 pegfp-grp78 转染入体外培养的人视网膜色素上皮细胞, 经 G418 筛选, 建立稳定表达细胞系结果与结论 : 体外培养的人视网膜色素上皮细胞株作为真核细胞表达系统, 经荧光显微镜和 RT-PCR 方法检测,G418 筛选的稳定转染细胞系中 GFP 大量表达, 葡萄糖调节蛋白 78 mrna 的表达量是正常视网膜色素上皮细胞的 4 倍左右, 表示脂质体介导的 pegfp-grp78 质粒成功转染视网膜色素上皮细胞, 并高效稳定表达葡萄糖调节蛋白 78 关键词 : 葡萄糖调节蛋白 78; 真核表达载体 ; 稳定转染 ; 绿色荧光蛋白 ; 视网膜色素上皮细胞 doi: /j.issn 李漫丽, 戚卉, 孙蕾, 吴雅臻. 葡萄糖调节蛋白 78 真核表达载体及稳定转染人视网膜色素上皮细胞株的构建 [J]. 中国组织工程研究与临床康复,2011,15(46): [ 1 Henan Province Institute of Zhengzhou , Henan Province, China; 2 Department of Second Hospital of Jilin University, Changchun , Jilin Province, China; 3 Department of Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin , Heilongjiang Province, China Li Man-li, Doctor, Attending physician, Henan Province Institute of Zhengzhou , Henan Province, China limanli1980@sina. com Correspondence to: Wu Ya-zhen, Professor, Department of Second Hospital of Jilin University, Changchun , Jilin Province, China Received: Accepted: 引言葡萄糖调节蛋白 78 (M r ,glucoseregulated protein,grp78), 又名结合蛋白, 属于热休克蛋白 70 家族, 是存在于内质网上最多的分子伴侣蛋白, 被认为是细胞应激反应的标志性分子, 具有保护细胞, 对抗细胞凋亡的作用, 通过化学诱导剂或转基因技术等使 grp78 高表达可望为抵抗细胞凋亡提供新途径 [1-5] 本实验构建以绿色荧光蛋白 (green Fluorescent protein,gfp) 为标记物的人 grp78 基因真核表达载体 pegfp-grp78, 并转染体外培养的人视网膜色素上皮细胞, 建立 grp78 基因稳定转染的视网膜色素上皮细胞系, 为进一步研究 grp78 抗细胞凋亡等功能提供工具 1 材料和方法设计 : 细胞分子学水平体外基因重组实验时间及地点 : 于 /10 在吉林大学第二医院中心实验室及 / 在河南省眼科研究所中心实验室完成材料 : 人视网膜色素上皮细胞株 (D407) 来 ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 8671

2 李漫丽, 等. 葡萄糖调节蛋白 78 真核表达载体及稳定转染人视网膜色素上皮细胞株的构建 1 河南省眼科研究所, 河南省郑州市 ; 2 吉林大学第二医院眼科, 吉林省长春市 ; 3 哈尔滨医科大学第四附属医院眼科, 黑龙江省哈尔滨市李漫丽, 女, 1980 年生, 河南省洛阳市人, 汉族,2008 年吉林大学毕业, 博士, 主治医师, 主要从事眼底病研究 limanli1980@ sina.com 通讯作者 : 吴雅臻, 教授, 吉林大学第二医院眼科, 吉林省长春市中图分类号 :R318 文献标识码 :B 文章编号 : (2011) 收稿日期 : 修回日期 : ( /GW S) 自广州中山大学眼科中心试剂 : 试剂及仪器来源 E.Coli DH5α 菌株吉林大学第二医院中心实验室保存 Pegfp-N1 Vector POTB7- Clontech 公司 grp78 DMEM 培养基小牛血清 Gibco 公司胰蛋白酶 G418 限制性内切酶 Hind Ⅲ Kpn NEB 公司 Ⅰ 和 T 4 DNA ligase 脂质体 Lipofectamine 2000 invitrogen Plasmid 抽提 Kit QIAGEN 胶回收 Kit Takara 实验方法 : grp78 基因的扩增 : 以克隆载体 POTB7- grp78 为模板,PCP 反应获取 grp78 cdna 引物设计合成 : 根据 GenBank 中收录的人 grp78 全长编码基因序列 (ACCESSION NM_005347) 设计一对特异性 PCR 引物 : 上游 :5 -CCC AAG CTT ATG AAG CTC TCC CTG GTG G-3, 含保护碱基和 Hind Ⅲ 酶切位点 (AAGCTT); 下游 :5 -GGG GTA CCG TCA ACT CAT CTT TTT CTG CTG TAT C- 3, 含保护碱基和 Kpn Ⅰ 酶切位点 (GGTACC) 引物由上海吉凯基因技术有限公司合成, 预计 PCR 产物大小 bp 根据试剂盒说明配制 50 µl PCR 反应体系,PCR 反应条件 :94 预变性 4 min; 之后 94 ( 变性 )30 s 55 ( 退火 )30 s 72 ( 延伸 )2 min, 循环 30 次,72 终延伸 10 min,4 冷却反应结束后, 取 PCR 产物 5 µl, 经 1.2% 琼脂糖凝胶电泳, 溴化已锭染色, 紫外灯下观察重组质粒的构建与鉴定 : 采用 PCR 产物纯化试剂盒分别回收纯化 pegfp-n1 和 grp78 cdna 的 PCR 产物片段, 按内切酶使用说明书分别建立 grp78 cdna 及 pegfp-n1 的 Hind Ⅲ 和 Kpn Ⅰ 双酶切反应体系, 进行酶切反应, 反应产物以琼脂糖凝胶电泳进行分离鉴定, 回收 DNA, 纯化试剂盒纯化并进行紫外定量根据 T 4 连接酶说明书配制 10 µl 连接体系于 4 12 h 连接反应, 制备克隆连接液, 即将人 grp78 的 PCR 酶切产物连接入酶切的真核表达载体 pegfp-n1 将重组质粒转化入大肠杆菌感受态细胞, 随机挑选卡那霉素抗性的转化克隆, 进行菌落 PCR, 鉴定阳性克隆 ; 将含重组质粒的阳性克隆进行正反双向测序鉴定, 测序正确的重组子命名为 pegfp-grp78 人视网膜色素上皮细胞的准备及 G418 最小致死量测定 : 以人视网膜色素上皮细胞作为目的基因转染用靶细胞, 细胞培养条件 : 体积分数 5%CO 2 的 37 培养箱中, 用含体积分数 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基贴壁培养, 用含 0.25% 胰蛋白酶以 L -1 的浓度和 1 3 比率传代培养取生长状态良好的对数生长期细胞接种至 24 孔板, 细胞融合至 50%~60% 时, 加入含有不同浓度的 G418 培养液, 使 G418 的终浓度分别为 :0,100,200,300,400,500, 600,700,800,900,1 000 mg/ L 每二三天更换一次培养液,10 d 左右根据细胞死亡情况确定 G418 对人视网膜色素上皮细胞的最小致死剂量脂质体介导法视网膜色素上皮细胞的转染和筛选 :1 细胞准备 : 选取生长状态良好的对数生长期视网膜色素上皮细胞, 接种于 24 孔培养板中, 分为 3 组 : 空白对照组 pegfp-n1 空质粒转染组 pegfp-grp78 重组质粒转染组每组 24 个孔, 每孔约个细胞, 培养基 500 µl, 放入体积分数 5%CO 2 的 37 培养箱中培养 24 h, 待细胞融合达到 90% 2 转染溶液配制 : A 液 :10 µg pegfp-grp78 质粒 DNA 加入 50 µl 无血清培养液 ;B 液 :2 µl Lipofectamine 加入 50 µl 无血清培养液 ; 合并 A 液和 B 液, 置于室温下静置 30 min 让脂质体包裹质粒同样方法配制 pegfp 空质粒转染溶液 3 细胞转染 : 细胞经无血清无抗生素的培养液洗 2 次, A B 混合液加入无血清无抗生素培养液中, 混匀后加入细胞培养孔中, 放入体积分数 5% CO 2 的 37 培养箱中培养 6 h 后弃去转染液, 加入体积分数 10% 胎牛血清的培养液继续培养 4 稳定表达 grp78 基因的细胞克隆筛选 : 继续培养 72 h 后, 细胞传代, 接种在 60 mm 的培养皿, 加入含 G418 的选择培养基, 培养 14 d 后, pegfp-grp78 重组质粒转染组细胞有明显克隆形成, 用胰酶消化法转移细胞克隆, 分别扩增培养, 建立稳定转染的细胞系稳定转染靶细胞的鉴定 : 选取稳定转染的视网膜色素上皮细胞, 采用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的表达情况 : 在荧光显微镜下, 随机选择一视野, 以蓝色激光激发, 观察发出绿色荧光的细胞并摄像 ; RT-PCR 方法检测转染细胞中 grp78 mrna 的表达 :1 细胞总 RNA 提取 : 将去培养基的 24 孔板加 PBS 漂洗 2 次, 吹打, 离心细胞, 取的 8672 P.O. Box 1200, Shenyang cn.zglckf.com

李漫丽, 等. 葡萄糖调节蛋白 78 真核表达载体及稳定转染人视网膜色素上皮细胞株的构建 www.crter.org 细胞加 trizol 1.

dntp Buffer MLV 反转录酶 Rnase inhibitor, 按照试剂盒说明书配制 20 µlrt 反应体系 ; 稍离心, 封口膜封口,42 水浴 90 min 行反转录反应 ; 100 沸水浴 3 min 以灭活 MLV 反转录酶 ;cdna 立即 PCR 或 -70 保存 3PCR 反应 : 引物设计 : 上游 : GAT AAT CAA CCA ACT GTT AC, 下游

反应结束后, 每组取 PCR 产物 5 μl, 进行 1.2% 的琼脂凝胶电泳检测并摄像 ; 经图像分析系统测定吸光度值,grp78 mrna 定量应用半定量法, 即目的基因产物吸光度值和内参照吸光度值比 (A 值 ), 实验重复 3 次, 取平均值以空载体转染的视网膜色素上皮细胞作为对照 2 结果 2.

3 李漫丽, 等. 葡萄糖调节蛋白 78 真核表达载体及稳定转染人视网膜色素上皮细胞株的构建细胞加 trizol 1.0 ml, 用加样器吹至液体澄清且无细胞团块, 按试剂盒操作具体方法, 进行氯仿分离异丙醇 RNA 沉淀体积分数 75% 乙醇 RNA 洗脱 RNA 再溶解, 提取细胞总 RNA, 提取的 RNA 保存于 -70 超低温冰箱中, 或立即用于反转录 2 反转录反应 :EP 管中加入 3 µl 模板 RNA,1 µl Oligo d(t) 引物, 稍离心,95 水浴 10 min; 加入 dntp Buffer MLV 反转录酶 Rnase inhibitor, 按照试剂盒说明书配制 20 µlrt 反应体系 ; 稍离心, 封口膜封口,42 水浴 90 min 行反转录反应 ; 100 沸水浴 3 min 以灭活 MLV 反转录酶 ;cdna 立即 PCR 或 -70 保存 3PCR 反应 : 引物设计 : 上游 : GAT AAT CAA CCA ACT GTT AC, 下游 :GTA TCC TCT TCA CCA GTT GG, 预计扩增片段长度为 577 bp; β-actin 作为内参照, 扩增片段长度为 360 bp; 按照试剂盒说明配制 50 μl PCR 反应体系,PCR 循环参数 :94 预变性 5 min,94 ( 变性 )1 min,55 ( 退火 )1 min, 72 ( 延伸 )1 min, 循环 30 次,72 终延伸 10 min; 反应结束后, 每组取 PCR 产物 5 μl, 进行 1.2% 的琼脂凝胶电泳检测并摄像 ; 经图像分析系统测定吸光度值,grp78 mrna 定量应用半定量法, 即目的基因产物吸光度值和内参照吸光度值比 (A 值 ), 实验重复 3 次, 取平均值以空载体转染的视网膜色素上皮细胞作为对照 2 结果 2.1 PCR 扩增 grp78 基因结果根据 grp78 基因的引物设计,PCR 扩增的完整 grp78 基因片段加上两端酶切位点序列理论上应为 bp 大小, 包括了完整的 grp78 基因片段 Grp78 基因的 PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳, 结果显示, 其基因片段大小与预计相符, 表明已获得 grp78 基因片段, 见图 1 用 PCR 进行阳性克隆鉴定, 电泳图谱见图 2, 可见挑取的克隆通过 PCR 扩增, 所得的 PCR 片段与预期大小 410 bp 一致将阳性克隆测序, 测序结果经 blast 分析, 证实所插入的目的片段与 genebank 检索的人 grp78 的 cdna 序列 (Accession NM_005347)100% 匹配, 证明 PCR 过程无突变发生 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp : Negative control; 2: Empty vector; 3: Positive control (Internal control); 4: Marker; 5-10: pegfp-n1-grp78 Figure 2 PCR identification of positive clone 图 2 阳性克隆 PCR 鉴定结果电泳图谱 2.3 视网膜色素上皮细胞的培养及对 G418 的耐受在倒置显微镜下观察, 体外培养的视网膜色素上皮细胞生长旺盛, 呈多角形, 细胞紧密排列成簇生长 ; 转染组视网膜色素上皮细胞加入 G418 后第 4 天,700~ mg/l 质量浓度孔内出现细胞死亡现象, 第 10 天, 400 mg/l 质量浓度孔内可见少数细胞存活生长, 500 mg/l 及以上质量浓度孔内均无细胞生长因此, 400 mg/l G418 可作为视网膜色素上皮细胞 neo 基因的筛选浓度, 见图 bp a: Normal cultured RPE cells From top to bottom 5 kb, 3 kb, 2 kb, 1.5 kb,1 kb, 750 bp, 500 bp, 250 bp 1: marker; 2: PCR product Figure 1 Product gel electrophoresis of glucose regulated protein 78 gene by PCR method 图 1 葡萄糖调节蛋白 78 基因 PCR 产物凝胶电泳图谱 b: Few RPE cells could be seen at 10 d after 0.4g/L G418 selection Figure 3 G418 selection of of retinal pigment epithelial (RPE) cells ( 200) 图 3 视网膜色素上皮细胞的 G418 筛选 ( 200) 2.2 阳性克隆 PCR 鉴定结果重组质粒 pegfp-grp78 ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 8673

www.crter.org 李漫丽, 等. 葡萄糖调节蛋白 78 真核表达载体及稳定转染人视网膜色素上皮细胞株的构建 2.

M 1 2 100 bp 250 bp 500 bp 750 bp β-actin grp78 M: Marker; 1: Normal cells; 2: Plasmid transfected cells a: Early formation of monoclony after G418 screening transfected with RPE cells Figure 6

selection of gene transfested retinal pigment epithelial cells ( 200) 图 4 基因转染视网膜色素上皮细胞的 G418 筛选 ( 200) 2.

fluorescent protein in retinal pigment epithelial cells under fluorescence microscope ( 200) 图 5 荧光显微镜观察 GFP 在视网膜色素上皮细胞中的表达 ( 200) 2.

4 李漫丽, 等. 葡萄糖调节蛋白 78 真核表达载体及稳定转染人视网膜色素上皮细胞株的构建 2.4 转染细胞的筛选和稳定转染细胞系的建立 Grp78 融合基因转染后的视网膜色素上皮细胞中加入含有 400 mg/l G418 的选择培养液,14 d 后有明显克隆形成, 见图 4 所示, 用胰酶消化法转移细胞克隆进行扩增培养, 建立 grp78 稳定转染视网膜色素上皮细胞系色素上皮细胞 grp78 的表达量是对照组细胞的 4 倍左右, 表明获得稳定高效表达 grp78 的视网膜色素上皮细胞系 M bp 250 bp 500 bp 750 bp β-actin grp78 M: Marker; 1: Normal cells; 2: Plasmid transfected cells a: Early formation of monoclony after G418 screening transfected with RPE cells Figure 6 Expression of glucose-regulated protein 78 grp78 in retinal pigment epithelial cells tested by RT-PCR 图 6 转染视网膜色素上皮细胞细胞葡萄糖调节蛋白 78 表达的 RT-PCR 电泳图 b: Cells increased in monoclony Figure 4 G418 selection of gene transfested retinal pigment epithelial cells ( 200) 图 4 基因转染视网膜色素上皮细胞的 G418 筛选 ( 200) 2.5 pegfp-grp78 融合蛋白在视网膜色素上皮细胞中的表达在荧光显微镜下观察, 在 pegfp-grp78 转染细胞组, 视网膜色素上皮细胞中存在荧光蛋白表达, 发出明亮的绿色荧光, 见图 5 所示, 说明基因融合后未引起报告基因 EGFP 的移码突变, 可以认为基因的融合表达获得成功对照组细胞中未见 GFP 阳性表达 Figure 5 Expression of green fluorescent protein in retinal pigment epithelial cells under fluorescence microscope ( 200) 图 5 荧光显微镜观察 GFP 在视网膜色素上皮细胞中的表达 ( 200) 2.6 转染细胞 grp78 表达的 RT-PCR 检测结果经 RT-PCR 产物凝胶电泳分析, 见图 6, 结果显示, 稳定转染 pegfp-grp78 的细胞 grp78 条带密度与 β-action 的吸光度比为 1.12±0.04, 对照组细胞 grp78 条带密度与 β-action 的吸光度比为 0.27±0.04, 稳定转染组视网膜 2.7 对视网膜色素上皮细胞的毒性作用下形态学观察 : 正常视网膜色素上皮细胞贴壁能力强, 排列紧密, 长满后表现为接触抑制 ; 转染 pegfp 空质粒后细胞小部分出现胞体稍变圆, 但大部分细胞仍状态良好转染了 pegfp-grp78 质粒的细胞体积明显变小, 贴壁能力减弱, 可见少量漂浮的死亡细胞, 此趋势随时间的延长而明显 3 讨论目前的研究已经明确了 grp78 的生物学特性和细胞保护作用,grp78 的表达多少对决定应激细胞的结局如抵抗适应损伤或凋亡等有重要作用, 所以这方面的研究无论在科学理论还是在应用前景上都具有重大意义 [6-14] 学者们尝试了多种办法来增加 grp78 的表达, 以获得其在细胞损伤过程中的保护作用, 如组织器官缺血预处理药理学方法化学诱导剂等, 但这些方法同时会给机体带来一些不良刺激, 使临床应用受到限制 ; 随着分子生物学和基因工程技术的不断发展, 通过病毒或其他载体转染 grp78 基因到细胞中, 使之大量表达起到保护作用, 从而避免缺血预处理和热应激等本身的不良刺激, 可为抗细胞凋亡提供一条途径 [15-19] 为深入研究 grp78 的抗细胞凋亡作用, 作者以克隆载体 POTB7-grp78 为模板, 采用 PCR 的方法, 克隆人 grp78 全长编码基因, 经过酶切, 连接至真核表达载体 pegfp-n1, 经测序后确定成功构建了以绿色荧光蛋白为报告基因的 grp78 真核细胞表达重组体 pegfp-grp78, 可对 grp78 基因的表达蛋白质的定位, 真正做到活体原位实时检测, 对于研究 grp78 的功能及调控机制有重要作用, 为进一步研究其生物学功能和作用机制提供有效工具为了检测构建的重组质粒是否能在哺乳动物细胞中稳定表达目的蛋白质, 作者选用 8674 P.O. Box 1200, Shenyang cn.zglckf.com

5 李漫丽, 等. 葡萄糖调节蛋白 78 真核表达载体及稳定转染人视网膜色素上皮细胞株的构建新型阳离子脂质体 lipofectin 2000 作为基因转移的载体, 将已经构建好的 grp78 真核表达质粒 pegfp-grp78 转染体外培养的人视网膜色素上皮细胞, 通过 G418 筛选建立稳定转染细胞系, 用荧光显微镜和 RT-PCR 的方法, 观察融合蛋白的表达情况根据本实验结果发现, 脂质体对细胞无明显损伤作用, 在加入 G418 筛选之前, 未出现大量的细胞死亡现象, 经过筛选后的单克隆细胞, 扩增和传代中也未发现细胞活力的明显下降, 表明脂质体介导质粒转染视网膜色素上皮细胞是安全的重组质粒转染细胞后稳定转染细胞株的建立, 主要是根据质粒上带有的耐药基因而选择相应的药物进行筛选所得 [20-22] 本实验选用的是 pegfp-n1 质粒载体, 该载体具有 neo 基因, 可以采用 G418 来筛选已成功转染了该载体的靶细胞,G418 是稳定转染最常用的抗性筛选试剂, 已在基因转移基因敲除抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用由于不同的细胞系对 G418 的选择浓度有较大的差异, 本实验进行了 G418 作用于视网膜色素上皮的浓度筛选, 根据结果, 认为 400 mg/l 对视网膜色素上皮细胞筛选较为合适, 经过 G418 筛选, 获得了人 grp78 基因稳定转染的人视网膜色素上皮细胞系本部分研究是转基因治疗的预研究, 通过脂质体介导转染技术将体外培养的人视网膜色素上皮细胞株作为真核细胞表达系统, 经荧光显微镜和 RT-PCR 方法检测,G418 筛选的稳定转染细胞系中 GFP 大量表达, grp78 mrna 的表达量是正常视网膜色素上皮细胞的 4 倍左右, 表示脂质体介导的 pegfp-grp78 质粒成功转染视网膜色素上皮细胞, 并高效稳定表达 grp78, 该稳定转染细胞可应用于下一步的实验研究 4 参考文献 [1] Zhang Y,Sun LG.Guowai Yixue:Shengli Bingli Kexue yu Linchuang Fence. 2005;25(3): 张莹, 孙黎光.Grp78 的研究进展 [J]. 国外医学 : 生理病理科学与临床分册,2005,25(3): [2] Little E,Ramakrishnan M,Roy B,et al.(grp78 and GRP94): funtions,gene regulation,and applications.crit Rev Eukaryot Gene Expr.1994;4:1-18. [3] Takahashi H,Wang JP,Zheng HC,et al.overexpression of GRP78 and GRP94 is involved in colorectal carcinogenesis.methods Enzymol.Histol Histopathol.2011;26(6): [4] Raghubir R,Nakka VP,Mehta SL.Endoplasmic reticulum stress in brain damage.apoptosis. 2011;16(3): [5] Ouyang YB,Xu LJ,Emery JF,et al.overexpressing GRP78 influences Ca2+ handling and function of mitochondria in astrocytes after ischemia-like stress.curr Opin Cell Biol.2011; 23(2): [6] You YW,Hao L,Chen XM.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2008;12(11): 游言文, 郝莉, 陈雪梅. 脂质体介导基因转染人精子膜蛋白 PH20 DNA 疫苗质粒向小鼠骨骼肌导入 [J]. 中国组织工程研究与临床康复,2008,12(11): [7] Duan Q,Wang Q,Qi QS.Shengming de Huaxue.2007;27(1): 段青, 王倩, 祁庆生, 绿色荧光蛋白在蛋白质研究中的应用 [J]. 生命的化学,2007,27(1): [8] Yang H,Ye ZQ,Chen ZQ,et al. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010,14(23): 杨欢, 叶章群, 陈志强, 等. 稳定表达绿色荧光的大鼠胚胎来源肝干细胞 [J]. 中国组织工程研究与临床康复,2010,14(23): [9] Hao FY.Beijing:Beijing Daxue Chubanshe 郝福英. 分子生物学实验技术 [M]. 北京 : 北京大学出版社,2003. [10] SiTu ZQ,Wu JZ. Beijing:Shijie Tushu Chubanshe 司徒镇强, 吴军正. 细胞培养 [M]. 北京 : 世界图书出版社,1996. [11] Guo NH,Zhang JS,Xie YJ.Yaoxue Jinzhan. 2000;24(1):1-5. 郭炳华, 张钧寿, 谢跃进. 阳离子脂质体介导基因转移的研究进展 [J]. 药学进展,2000,24(1):1-5. [12] Han SW,Zhang YD,Wan XP,et al.zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010,14(20): 韩世伟, 张阳德, 万小平, 等. 重组外源性人热休克蛋白 70 基因真核表达载体的构建及鉴定 [J]. 中国组织工程研究与临床康复,2010, 14(20): [13] Chaum E,Yin J,Yang H,et al.quantitative AP-1 gene regulation by oxidative stress in the human retinal pigment epithelium. J Cell Biochem. 2009;108(6): [14] Mannermaa E,Reinisalo M,Ranta VP,et al.filter-cultured ARPE-19 cells as outer blood-retinal barrier model.eur J Pharm Sci. 2010; 40(4): [15] Lee AS.The glucose-regulated proteins:stress induction and clinical applications.trends Bionchemi Sci.2001;26(8): [16] Franklin TB,Krueger-Naug AM,Clarke DB,et al.the role of heat shock proteins Hsp70 and Hsp27 in cellular protection of the central nervous system.int J Hyperthermia.2005;21(5): [17] Zhang LH,Yang XL,Zhang X et al.association of elevated GRP78 expression with increased astrocytoma malignancy via Akt and ERK pathways. Brain Res. 2011;1371: [18] Hardy B,Raiter A.Peptide-binding heat shock protein GRP78 protects cardiomyocytes from hypoxia-induced apoptosis.j Mol Med. 2010;88(11): [19] Buchkovich NJ,Maguire TG,Paton AW.The endoplasmic reticulum chaperone BiP/GRP78 is important in the structure and function of the human cytomegalovirus assembly compartment.j Virol. 2009; 83(22): [20] Yeung BH,Kwan BW,He QY,Glucose-regulated protein 78 as a novel effector of BRCA1 for inhibiting stress-induced apoptosis. Oncogene. 2008;27(53): [21] Sun PL,Zhou JH,Lv SX.Establishment of stable cell line and expression and purification of HIV gp120 in Drosophila S2 cells.bing Du Xue Bao ;26(6): [22] Li J,Wang R,Shi W,et al.construction of eukaryotic expression vector containing foot-and-mouth disease virus VP1 gene and its expression in dendritic cells.xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi.2009;25(9): ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 8675

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽