<453A5CD7EED6D5B8E55CB7D6CEF62E703635>

Size: px

Start display at page:

Download "<453A5CD7EED6D5B8E55CB7D6CEF62E703635>"

灌斟岑
5 years ago
Views:

1 477 余婷婷, 鲁晓翔 *, 连喜军, 张彦青 ( 天津商业大学生物技术与食品科学学院, 天津市食品生物技术重点实验室, 天津 ) 本实验主要研究玉米须黄酮的组成成分采用颜色反应薄层层析与紫外扫描光谱三种方法对玉米须黄酮类化合物进行初步分析颜色反应显示玉米须提取物为黄酮类物质 ; 层析结果显示其主要成分是木樨草素芹菜素与刺芒柄花素 ; 紫外扫描结果显示, 玉米须黄酮类物质主要为黄酮及异黄酮, 且黄酮结构中 5 位和 7 位有羟基, B 环上有 3'- 羟基 4'- 羟基实验结果说明, 玉米须黄酮的主要成分是木樨草素芹菜素与刺芒柄花素玉米须 ; 黄酮 ; 颜色反应 ; 薄层层析 ; 紫外扫描 Composition Analysis of Flavonoids from Corn Silk with Thin-layer Chromatography and Ultraviolet Spectrophotometry YU Ting-ting,LU Xiao-xiang*,LIAN Xi-jun,ZHANG Yan-qing (College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, Tianjin , China) Abstract:The experiment aimed to analyze the main components of flavonoids from corn silk by using color reaction, thinlayer chromatography (TLC) and ultraviolet (UV) spectral scanning. Color reactions proved the extract from corn silk be to flavonoids, According to TLC results, the flavonoids from corn silk are mainly composed of luteolin, formononetin and apigenin. The results of UV scanning showed that the flavonoids of corn silk are mainly flavones and isoflavones. There are 5-hydroxy and 7-hydroxy in the structure of the flavones, and the B ring has the 3'-hydroxy and 4'-hydroxy. Key words:corn silk;flavonoids;color reaction;thin-layer chromatography;uv scanning 中图分类号 :TS201.1 文献标识码 :A 文章编号 : (2008) 玉米是我国主要粮食作物之一, 玉米须是玉米的干燥花柱和柱头玉米须含有多种对人体有益的化学成 [1] 分, 如多糖黄酮甾醇等现代药理研究证实, 玉米须有利尿降血压降血糖抗癌抑菌及增 [2] 强免疫功能等作用我国玉米须资源丰富, 但目前对 [3] 其利用较少黄酮类化合物是一类重要的天然有机化合物近年来, 研究人员对黄酮类物质进行了广泛而深入的研究, 发现黄酮具有许多生理功能, 如对心血管系统的作用抗肝脏毒作用抗炎作用雌性激素样作用和抗病毒 [4] 作用为进一步开发利用玉米须资源, 探索玉米须黄酮生物活性的物质基础, 本研究对玉米须中的黄酮类物质进行了初步的探讨 1 材料与方法 1.1 材料与试剂玉米须购于天津市协和药店无水乙醇聚酰胺三氯化铝亚硝酸钠硝酸铝氢氧化钠氨水硼酸四氢硼钠乙酸镁甲醇正丁醇乙酸乙酯甲酸三氯甲烷芦丁槲皮素橙皮苷刺芒柄花素芹菜素绿原酸木樨草素乙酸钠硅胶板聚酰胺薄膜均为分析纯或光谱纯, 购于天津市凯通化学试剂有限公司及天津市诺奥科技发展有限公司 1.2 仪器与设备收稿日期 : 基金项目 : 天津市科技攻关项目 (06YFGPNC03800) 作者简介 : 余婷婷 (1984-), 女, 本科生, 主要从事食物资源研究与开发 tingting6665@163.com * 通讯作者 : 鲁晓翔 (1962-), 女, 教授, 硕士, 主要从事天然产物研究与开发 lxxiang@tjcu.edu.cn

2 , Vol. 29, No. 11 食品科学分析检测 Unic7200 紫外可见分光光度计尤尼科 ( 上海 ) 仪器有限公司 ;AUY1200 分析天平上海精密科学仪器有限公司 ;DKZ-1 型电热恒温振荡水槽上海精宏实验设备有限公司 ;RE-52A 旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂 ; KDC-1042 低速离心机科大创新有限公司 ;XMTB 数显温控仪余姚市东方电工仪器厂 ; 紫外光探测器天津市分析仪器厂 ;SB-2 型薄层色谱仪天津市分析仪器厂 ; 层析缸 1.3 方法芦丁标准曲线的绘制配制 0.1mg/ml 的芦丁标准液精密吸取芦丁标准液 ml 分别置于比色管中, 然后各对应加入 ml 70% 乙醇 ; 再依次各加入质量分数 5% 的亚硝酸钠 0.5ml, 混匀, 放置 6min; 加质量分数 10% 硝酸铝 0.5ml, 混匀, 放置 6min; 加质量分数 4% NaOH 4ml, 混匀, 放置 [5] 15min; 于波长 510nm 处测, 绘制标准曲线样品液的制备工艺流程 : 玉米须清洗烘干粉碎称量 70% 乙醇提取离心过柱吸附样品液操作要点 : 称取样品粉末 5.00g, 加入 100ml 70% 的乙醇, 在 50 的水浴锅中提取 2h, 取出, 离心 (4000r/ min)10min, 收集上清液, 得粗提液取粗提液 50ml, 分两次过聚酰胺柱, 流速 2 滴 /s,70% 的乙醇洗脱, 收 [6] 集洗脱液, 并测定其此液作为颜色反应的样品液鉴别实验颜色反应样品液的显色反应 : 取 2ml 样品液于试管中, 在波长 254nm 紫外灯下观察, 记录颜色再用玻璃棒蘸取少许样品液与滤纸上, 进一步确定颜色并记录氨水反应 : 取 2ml 样品液及 2ml 氨水于试管中, 混匀, 在 254nm 紫外灯下观察以下步骤同样品液的显色反应氢氧化钠反应 : 取 2ml 样品液及 2ml NaOH 溶液于试管中, 混匀, 在 254nm 灯下观察以下步骤同样品液的显色反应三氯化铝反应 : 取 2ml 样品液与 2ml 1% 的三氯化铝乙醇液, 混匀, 在 254nm 处观察以下步骤同样品液的显色反应硼酸反应 : 取 2ml 样品液与 1ml 5% 的硼酸溶液于试管中, 在 254nm 灯下观察以下步骤同样品液的显色反应硼氢化钠反应 : 取 2ml 样品液与 2ml 2% 的硼氢化钠溶液于试管中, 在 254nm 处观察以下步骤同样品液的显色反应醋酸镁反应 : 取 2ml 样品液与 1ml 1% 的醋酸镁溶液于试管中, 在 254nm 处观察以下步骤同样品液的显色反应薄层层析 [7] 样品液制备 : 称取玉米须粉 8.00g, 用 100ml 甲醇转移至索氏提取器中, 在 90 下提取至无色, 浓缩, 定容到 25ml, 备用对照品液制备 : 用甲醇分别配制 0.5mg/ml 的槲皮素溶液刺芒柄花素溶液芹菜素溶液木樨草素溶液和绿原酸溶液 ; 另配制 2mg/ml 的橙皮苷溶液与芦丁溶液展开系统的选择 : 实验对展开系统进行了选择各展开系统见表 1 表 1 展开系统 Table 1 Development system of TLC 展开系统体积比正丁醇 : 醋酸 : 水 4:1:5 甲醇 : 氯仿 : 乙酸乙酯 : 乙酸 4:5:1:1 乙酸乙酯 : 甲酸 : 水 8:1:1 氯仿 : 甲醇 8.5:1.5(15:1) 乙酸乙酯 : 丁酮 : 甲酸 : 水 5:3:1:1 点样展开与显色 : 用毛细管将 10μl 样品液,10μl 精制样品液,5μl 芦丁液,10μl 槲皮素液,5μl 橙皮苷液和 10μl 绿原酸液点到硅胶板上 ; 另用毛细管将 10μl 的精制样品液,10μl 木樨草素液,10μl 刺芒柄花素液与 20μl 芹菜素和刺芒柄花素的混合液点到另一硅胶板上 ; 在聚酰胺薄膜上进行相同的点样操作点样后, 将硅胶板或聚酰胺薄膜分别置于装有不同展开系统的层析缸中展开用 3% 三氯化铝醇溶液显色, 并于紫外分析仪下观察, 记录, 并计算 Rf 值 Rf = X / L (1) 式中,X 为分离出的黄酮类化合物移动距离 (cm); L 为展开剂移动的距离 (cm) 紫外光谱扫描 [8] 取精制提取液 0.5ml, 用甲醇定容至 50ml, 为测试液样品及对照品光谱 : 取 2~3ml 测试液及由层析实验选定的对照品液, 分别在 200~500nm 范围扫描, 保存图谱三氯化铝与三氯化铝 / 盐酸光谱 : 取 2~3ml 测试液, 加 6 滴三氯化铝试液, 混匀后立即在波长 200~ 500nm 范围内扫描, 保存图谱试液中再加入 3 滴盐酸, 并立即在相同波长扫描, 保存图谱甲醇钠光谱 : 取 2 ~3ml 测试液, 加 3 滴甲醇钠, 混匀, 立即在 200~500nm 范围进行扫描, 保存图谱 5min 后再测光谱, 以检测黄酮的分解情况醋酸钠与醋酸钠 / 硼酸光谱 : 将 6 滴醋酸钠加到 2~ 3ml 测试液中, 摇匀, 两分钟后在 200~500nm 范围扫

3 479 描 5min 后测第二个光谱, 以检查分解情况试液中加入 6 滴硼酸, 摇匀, 再测第三个光谱, 保存图谱 2 结果与分析 2.1 标准曲线的绘制 R 2 = y=11.306x R 2 = 芦丁浓度 (mg/ml) 图 1 芦丁标准曲线 Fig.1 Standard curve of rutin 由此得到芦丁标准曲线回归方程为 Y = x - 031(R 2 =0.9985) 经测定, 样品液黄酮浓度为 0.142mg/ml 2.2 颜色反应结果与分析在紫外灯下观察得到表 2 所示的结果表 3 黄酮类化合物的 R f 值 Table 3 R f values of flavonoids compounds 化合物木犀草素刺芒柄花素芹菜素样品 X(cm) L(cm) R f 由图 2 及表 3 可知, 样品的 Rf 值为时, 与木樨草素芹菜素刺芒柄花素的 Rf 值接近, 显色后发现各斑点都具有黄酮类化合物的典型亮黄色荧光, 由此可判断样品中含有木樨草素芹菜素刺芒柄花素或含有这三种物质的类似物 2.4 提取物的紫外光谱特征及分析黄酮和黄酮醇具有相同的基本结构, 以甲醇和乙醇为溶剂, 其紫外光谱在 240~400nm 间通常有两个吸收带, 即 290~380nm 区的带 Ⅰ 与 240~280nm 区的带 Ⅱ 分子中取代基的性质位置和数目决定吸收带的波长强度和波谱形状各对照品的光谱各对照品的光谱见图 3 表 2 黄酮类化合物的颜色反应 Table 2 Color reactions of flavonoids compounds 试剂颜色结论样品有黄绿色荧光有黄酮类化合物样品 + 氨水淡黄绿色有黄酮类化合物样品 + 氢氧化钠深黄绿色有黄酮类化合物样品 + 三氯化铝黄色荧光有黄酮黄酮醇异黄酮样品 + 硼酸黄色荧光斑点有 5-OH 黄酮或 2-OH 查耳酮样品 + 硼氢化钠深且亮黄色无双氢黄酮样品 + 乙酸镁淡黄色荧光有黄酮黄酮醇或异黄酮类图 3 刺芒柄花素图谱 Fig.3 Scanning spectrum of formononetin 从颜色反应可以看出, 玉米须精提物中的黄酮类化合物含有黄酮 5-OH 黄酮或是 2-OH 查耳酮, 这与张 [7] 慧恩等的结果一致 2.3 薄层层析结果与分析筛选到的展开系统为氯仿 : 甲醇 =15:1, 使用聚酰胺薄膜时的效果好于用硅胶板的分离效果实验结果如下图 2 所示其相应的 R f 值如表 3 所示由图 3 可知, 刺芒柄花素的甲醇溶液在波长 nm 处有一最大吸收峰为带 Ⅱ, 在波长 300nm 处有一大吸收峰为带 Ⅰ, 符合异黄酮在甲醇溶液中吸收峰特征图 4 木犀草素图 Fig.4 Scanning spectrum of luteolin 木樨草素 ;2. 样品浓缩液 ;3. 刺芒柄花素 ;4. 芹菜素 + 刺芒柄花素图 2 薄层色谱图 Fig.2 Thin-layer chromatogram of flavonoids sample and standards of luteolin, formononetin and apigenin 由图 4 可以看出, 木樨草素的甲醇溶液在波长 nm 处有一最大吸收峰为带 Ⅰ, 在波长 nm 处有一大吸收峰为带 Ⅱ, 在波长 nm 处有一弱的尖峰, 符合黄酮类化合物在甲醇溶液中的吸收峰特征

4 , Vol. 29, No. 11 食品科学分析检测图 5 芹菜素图 Fig.5 Scanning spectrum of apigenin Fig.8 图 8 三氯化铝 / 盐酸图谱 Scanning spectrum of aluminum chloride-hydrochloride 由图 5 可以看出, 芹菜素的甲醇溶液在波长 nm 处有一最大吸收峰为带 Ⅰ, 在波长 nm 处有一大吸 [9] 收峰为带 Ⅱ, 这与 Cristea D 等的研究结果一致, 符合黄酮类化合物在甲醇溶液中的吸收峰特征样品的紫外光谱图 6 样品图谱 Fig.6 Scanning spectrum of sample 由图 6 可以看出, 玉米须黄酮精提物甲醇溶液的紫外吸收光谱具有黄酮类化合物的特征吸收峰, 即具有在 290~380nm 之间的吸收带 Ⅰ 和在波长 240~280nm 之间的吸收带 Ⅱ 在波长 nm 处有一最大吸收峰为带 Ⅱ, 在波长 nm 处有一最大吸收峰为带 Ⅰ, 与典型的黄 [10] 酮类化合物的紫外可见光谱图非常相近因此, 可确定玉米须黄酮精提物中含有黄酮类化合物样品液中加入三氯化铝与三氯化铝 / 盐酸的光谱在玉米须黄酮精提物的甲醇溶液中加入不同的诊断试剂后, 在波长 200~500nm 范围进行扫描实验结果如图 7 8 所示图 7 三氯化铝图谱 Fig.7 Scanning spectrum of aluminum chloride 由图 7 可见, 玉米须黄酮精提物甲醇溶液加入三氯化铝后, 带 Ⅰ 带 Ⅱ 的吸收峰分别在波长 nm, 其中 Ⅰa 为 nm 弱小肩峰其中, 带 Ⅰ 红移 35nm 三氯化铝试剂在甲醇中与黄酮分子中羟基的反应有两种方式 : 一是与 3- 羟基或 5- 羟基以及 4- 羰基鳌合, 且鳌合形式较稳定, 在酸中不分解 ; 另一种是与相邻双羟基反应形成不稳定的铝化合物若是一种化合物中同时含有 3- 羟基或 5- 羟基及相邻双羟基, 则在三氯化铝的甲醇溶液中, 两种反应均能发生, 但当加入酸时, 相邻双羟基铝化物分解, 释放出原来的羟基, 而 3- 羟基或 5- 羟基以及 4- 羟基的鳌合部分不变由图 8 可见, 在上述体系中再加入盐酸, 其带 Ⅰ 带 Ⅱ 吸收峰在波长 nm, 带 Ⅰa 的吸收峰为 390nm, 对照其在甲醇中的带 Ⅰ, 带 Ⅰ a 红移了 28nm(<55nm), 说明精提物中只有 5- 羟基, 没有 3- 羟基与图 7 相比, 图 8 中带 Ⅰ 紫移了 18nm, 根据图 8 的特征可知, 该黄铜类化合物在 B 环上有邻二酚羟基分析原因是分子中含有 3- 羟基或 5- 羟基的黄酮, 加入三氯化铝后引起紫外变化, 加盐酸不变 ; 分子中含有相邻双羟基的化合物 ( 无 3- 羟基或 5- 羟基者 ) 由于三氯化铝的影响所产生的光谱变化, 加酸后可恢复到光谱分子中若同时含有 3- 羟基或 5- 羟基以及相邻双羟基的黄酮, 加入三氯化铝试剂所产生的光谱移动较大, 加酸后移动较小, 且光谱的移动是由于分子中存在 3- 羟基或 5- 羟基分子中不含 3- 羟基的 5- 羟基化合物, 在三氯化铝 / 盐酸的作用下, 带 Ⅰ a 与甲醇中的带 Ⅰ 的差异为 28~ 55nm 其位移的大小与分子中 B 环的羟基数有关 ; 在 B 环上具有 3,4 - 相邻羟基的黄酮甲醇溶液中加入三氯化铝试剂后带 Ⅰ 向长波方向移动, 加酸后又恢复到短波样品液中加入甲醇钠的光谱甲醇钠使黄酮化合物分子中酸性最强的羟基电离, 因此, 该试剂主要用来判断自由的 4 - 羟基的存在由图 9 可以看出, 样品液中加入甲醇钠后, 以图 6 为对照, 带 Ⅰ 由波长 nm 增加到波长 nm, 红移了 41nm, 可断定其结构中有 4 - 羟基存在因为, 如

5 481 果黄酮或黄酮醇的羟基取代衍生物加入碱后, 带 Ⅰ 向长波方向移动 40~65nm, 且强度不减弱或是有所增加, 通常表示分子中有 4 - 羟基存在样品液中加入醋酸钠与醋酸钠 / 硼酸的光谱 Fig.11 图 9 甲醇钠图谱 Fig.9 Scanning spectrum of methanol sodium 图 10 醋酸钠图谱 Fig.10 Scanning spectrum of sodium acetate 图 11 醋酸钠 / 硼酸图谱 Scanning spectrum of sodium acetate-boric acid 由图 10 可以看出, 样品液醋酸钠甲醇溶液的带 Ⅰ Ⅱ 吸收峰分别在波长 nm, 其中带 Ⅰ a 为 nm 将图 11 与图 6 对照, 带 Ⅰ 的变化不大, 但带 Ⅱ 的变化较大, 红移了 9nm, 可以断定其结构中有 7- 羟基其原因可能是醋酸钠比乙醇钠及氢氧化钠的碱性弱, 它只能使酸性较强的酚羟基形成氧负离子在黄酮分子中,3,7- 位羟基及 4 - 羟基的酸性比其他位羟基强, 所以醋酸钠溶液中能成为氧负离子而使黄酮分子的紫外光谱发生变化具有 3 - 羟基的黄酮化合物在醋酸钠的影响下, 主要使带 Ⅰ 移向长波, 对带 Ⅱ 没有影响, 其带 Ⅰ 的位移规律性较差, 鉴定价值也不大醋酸钠使 7- 羟基黄酮类的带 Ⅰ 及带 Ⅱ 均向长波移动, 并提高带 Ⅱ 的吸收强度黄酮类化合物在醋酸钠溶液中带 Ⅱ 的改变有助于鉴别 7- 羟基一般 7- 羟基黄酮在醋酸钠的影响下带 Ⅱ 会增加 5~20nm 在图 11 中, 样品液在加入醋酸钠后再加入硼酸, 其带 Ⅰ Ⅱ 的峰值分别为 nm 并且 Ⅰ a Ⅱ b 为 nm 以图 6 作对照, 带 Ⅰ 由 nm 增加到 nm 红移了 16nm, 据此可以推断 B 环有相邻二酚羟基结构由图 10 确定结构中有 4 - 羟基, 故化合物结构中还含有 3 - 羟基分析原因是, 硼酸能与有机化合物分子中相邻二羟基生成复合物黄酮分子中的邻二羟基 (5,6- 双羟基除外 ) 能和醋酸钠 - 硼酸作用, 而使其紫外光谱发生变化综上所述, 可以确定玉米须中的黄酮类物质主要为黄酮及异黄酮, 且该黄酮的结构中,5 位和 7 位有羟基, 3 位无羟基, 且 B 环上有 3 - 羟基 4 - 羟基 3 结论本实验利用颜色反应薄层层析紫外光谱扫描三种方法, 对玉米须黄酮类化合物成分进行了初步研究实验结果表明, 玉米须黄酮为以木樨草素芹菜素和刺芒柄花素或这三种物质的类似物为主要成分的混合物参考文献 : [1] MAHATO S B, KUNDU A P. Review article number C-NMR spectra of pent acyclic triterpenoids: A compilation and some salient features[j].photochemistry, 1994, 37(6): [2] 徐燕, 梁敬钰. 玉米须的化学成分研究 [J]. 中草药, 2006(6): [3] 王英平. 玉米须化学成分及抗氧化作用研究 [D]. 长春 : 吉林农业大学, [4] 王伟江. 越橘健视饮料的研制 [J]. 食品科技, 2005, 30(12): [5] 李志洲, 刘军海. 草莓中黄酮的提取及其抗氧化性研究 [J]. 食品研究与开发, 2007, 28(7): [6] 徐德峰, 张卫明, 孙小明, 等. 洋葱皮中黄酮类化合物的初步分析 [J]. 食品科技, 2006, 31(8): [7] 张慧恩, 徐德平. 玉米须黄酮类成分的研究 [J]. 中药材, 2007,30(2): [8] 于智峰, 王敏, 王军, 等. 苦荞黄酮大孔吸附精提物的结构鉴定 [J]. 食品与发酵工业, 2006, 32(12): [9] CRIDTEA D, BAREAU I, VILAREM G. Identification and quantitative HPLC analysis of the main flavonoids present in weld (Reseda luteola L.)[J]. Dyes and Pigments, 2003, 57(3): [10] 田燕. 紫外 - 可见光谱在黄酮类鉴定中的应用 [J]. 大连医科大学学报, 2002(3): 陈晓, 蒋新宇, 刘佳佳. 中草药成分分离分析技术与方法 [M]. 北京 : 化学工业出版社, 2006:

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.