茂县土地岭大熊猫走廊带

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1 中国组织工程研究第 16 卷第 42 期 出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research October 14, 2012 Vol.16, No.42 doi: /j.issn [ 吕芳彪, 杨慧兰. 单纯疱疹病毒 Ⅱ 型潜伏相关转录体真核表达载体的构建及表达 [J]. 中国组织工程研究,2012,16(42): 单纯疱疹病毒 Ⅱ 型潜伏相关转录体真核表达载体的构建及表达 * 吕芳彪 1 2, 杨慧兰 1 华南理工大学生物科学与工程学院, 广东省广州市 ; 2 解放军广州军区广州总医院皮肤科, 广东省广州市 吕芳彪, 男, 1988 年生, 湖南省永州市人, 华南理工大学在读硕士, 主要从事病毒分子生物学的研究 lvfangbiao@ 163.com 通讯作者 : 杨慧兰, 博士, 教授, 解放军广州军区广州总医院皮肤科, 广东省广州市 huilany@ medmail.com 中图分类号 :R318 文献标识码 :B 文章编号 : (2012) 收稿日期 : 修回日期 : ( /W T) 文章亮点 : 实验通过 PCR 成功扩增了单纯疱疹病毒 Ⅱ 型潜伏相关转录体开放读码框 1 基因, 然后将其连接到带有绿色荧光蛋白基因标记的 pegfp-c2 载体上, 构建了 pegfp- 开放读码框 1 真核表达载体, 并实现了其在 Vero 细胞中表达, 这在国内外尚属首次 关键词 : 单纯疱疹病毒 Ⅱ 型 ; 潜伏相关转录体 ; 开放读码框 1; 真核表达载体 ; 转染 ; 体外表达 缩略语 : 单纯疱疹病毒 :herpessimplexvirus,hsv; 潜伏相关转录体 :latency associated transcript,lat 摘要 背景 : 单纯疱疹病毒 Ⅱ 型潜伏相关转录体开放读码框 1 真核表达载体的构建可以为研究单纯疱疹病毒 Ⅱ 型潜伏相关转录体开放读码框 1 在病毒潜伏复发中的功能奠定基础 目的 : 构建含存单纯疱疹病毒 Ⅱ 型潜伏相关转录体开放读码框 1 的真核表达载体, 并通过转染非洲绿猴肾细胞 (Vero), 验证载体的体外表达情况 方法 : 根据单纯疱疹病毒 Ⅱ 型潜伏相关转录体开放读码框 1 基因序列设计一对引物, 以单纯疱疹病毒 Ⅱ 型 333 标准株基因组为模板 PCR 法扩增出开放读码框 1 基因, 克隆至真核表达载体上, 并进行酶切鉴定以及测序 ; 利用 X-fect 转染试剂盒将重组质粒 pegfp-c2/ 潜伏相关转录体开放读码框 1 转染 vero 细胞,RT-PCR 检测其 mrna 水平的表达, 并用荧光倒置显微镜观察融合蛋白的表达 结果与结论 : 开放读码框 1 基因的体外扩增目的片段为 741 bp, 所构建的真核表达载体 pegfp-c2/ 潜伏相关转录体开放读码框 1 经双酶切鉴定, 与预期大小一致, 测序结果与 NCBI 收录的开放读码框 1 基因序列一致 ; 重组质粒 pegfp-c2/ 潜伏相关转录体开放读码框 1 转染 vero 细胞后,RT-PCR 验证有目的基因的转录, 荧光显微镜观察到融合蛋白在转染的 Vero 细胞中表达 表明成功构建 pegfp-c2/ 潜伏相关转录体开放读码框 1 真核表达载体, 并且实现其在非洲绿猴肾细胞 (Vero) 中的表达 Construction and expression of a herpes simplex virus type II latency-associated transcript eukaryotic expression vector Lü Fang-biao 1, Yang Hui-lan 2 Abstract BACKGROUND: The construction of herpes simplex virus (HSV-II) latency-associated transcript (LAT) open reading frame 1 (ORF1) (pegfp-c2/lat ORF1) eukaryotic expression vector can lay a foundation for the study of the function of HSV-2 LAT ORF1 in the virus latency and recurrence. OBJECTIVE: To construct pegfp-c2/lat ORF1 eukaryotic expression vector and to verify its expression in vitro through the transfection of African green monkey kidney cells. METHODS: A PCR primer was designed according to DNA sequencing of pegfp-c2/lat ORF1. HSV-Ⅱ333 standard plant genome was used as the template and ORF1 gene was amplified by PCR method and subcloned into the pegfp-c2 eucaryotic experssion vector. And then enzyme digestion and DNA sequencing were used for identifying the recombinant plasmid pegfp-orf1. Finally, the recombinant plasmid pegfp-c2/lat ORF1 was transfected into Vero cells in vitro by X-fect transfection kits. Fusion green fluorescent protein expression was observed by inverted fluorescence microscope and its mrna expression levels were detected by reverse transcription PCR. RESULTS AND CONCLUSION: In vitro amplified targeted DNA fragment was 741 bp in length and the size of pegfp-c2/lat ORF1 eucaryotic experssion vector constructed was conformed to the expectation, moreover, its sequencing results were conformed to those of ORF1 gene sequencing included by NCBI. Recombinant plasmid pegfp-c2/lat-orf1 was verified by reverse transcription PCR after transfected into Vero cells, and green fluorescent protein expression in the transfected Vero cells was determined by fluorescence microscope. These results suggest that the pegfp-c2/lat ORF1 eucaryotic experssion Vector have successfully constructed and realized its expression in African green monkey kidney cells (Vero cells). 7866

2 吕芳彪, 等. 单纯疱疹病毒 Ⅱ 型潜伏相关转录体真核表达载体的构建及表达 Lü FB, Yang HL. Construction and expression of a herpes simplex virus type II latency-associated transcript eukaryotic expression vector. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2012;16(42): 引言 单纯疱疹病毒分属于疱疹病毒科 α 亚科, 包 括单纯疱疹病毒 (herpessimplexvirus,hsv)Ⅰ 型 (HSV-I) 和 Ⅱ 型 (HSV-Ⅱ) 两个血清型, 两型病 毒的碱基序列有 70% 的同源性 HSV-I 感染主要 引起眼角膜炎 致死性脑炎 [1] ;HSV-Ⅱ 主要感 染躯干下部皮肤及黏膜, 通过破损皮肤及黏膜 感染人体后, 主要引起生殖器疱疹 [2] HSV-Ⅱ 的感染非常普遍, 全球 HSV-Ⅱ 的携带者约 10 亿, 且每年约有 万的新人感染 HSV-Ⅱ [3] 初次感染后,HSV-Ⅱ 病毒潜伏在人的骶尾神经 节中, 并可伴随各种非特异性刺激而激活, 导 致复发感染 由于 HSV-Ⅱ 的这种嗜神经潜伏及 复发机制还未阐明, 到目前为止尚无有效的药 物或疫苗能彻底治愈生殖器疱疹 潜伏相关转录体 (latency associated transcript, LAT) 是 HSV 在潜伏感染时惟一大量 表达和可被检测到的基因, 被认为在 HSV 潜伏 的建立 维持和激活过程中起重要作用 [4-7] 已 有研究表明,HSV-I LAT 是通过其编码的蛋白发 挥该作用 [7-9], 但与其同源性很高的 HSV-Ⅱ LAT 是否也是通过编码蛋白发挥此作用却鲜有报 道 HSV-Ⅱ LAT 含有 3 个开放阅读框, 分别为 ORF1 ORF2 和 ORF3 [10], 本实验旨在构建含 有 HSV-Ⅱ LAT ORF1 的 pegfp-c2/lat-orf1 真核表达载体, 并在 Vero 细胞中瞬时表达成功, 以开展对 HSV-Ⅱ LAT ORF1 作用机制的研究, 为探讨 HSV-Ⅱ LAT ORF1 在 HSV-Ⅱ 潜伏复发 中的作用奠定基础 1 材料和方法 设计 : 单一样本观察 时间及地点 : 实验于 2011 年 4 至 10 月在解 放军广州军区广州总医院医学实验科完成 材料 : 病毒株 菌株 细胞及质粒 HSV-Ⅱ 333 标准株 E.coli Top10 非洲绿 猴肾细胞 (Vero) 及质粒 pegfp-c2 均为本实 验室保存 试剂 主要试剂 : PfxDNA 聚合酶 PureLink Hipure Plasmid Maxiprep kit 及 TRIzol 病毒基因组提取试剂盒 质粒小提 试剂盒 胶回收试剂盒及 T 4 DNA 连接酶 胎牛血清, 及 RPMI-1640 培养基 EcoRI KpnI 胰酶 Giboc, 转染试剂盒 Xfect 方法 : 引物的设计与合成 : 根据 GenBank 上的 HSV-Ⅱ 333 株 LAT ORF1 序列, 用 Primer Premier5.0 设计 PCR 引物并添加酶切位点和保 护碱基 上游引物 P1:5 -TAG CGA ATT CAT GCC TCG GGT CTC CTC TTC CTG-3 下划线为 EcoRI 酶切位点 ; 下游引物 P2:5 -TCA TGG TAC CTT TGT TAT TGA CTT TCT TAC CTT G-3 下划线为 KpnI 酶切位点 内参 β-actin 上游 引物 P3:5 -CGT ACC ACT GGC ATC GTG AT-3, 内参 β-actin 下游引物 P4:5 -GTG TTG GCT GAC AGG TCT TTG-3 引物由上海 Invitrogen 公司合成 来源 上海 Invitrogen 公司 TaKaRa( 大连 ) Hyclone 公司 NEB 公司 Clontech Vero 细胞的培养 : 用含体积分数 10% 胎牛血 清的 RPMI-1640 培养基在 37 体积分数 5%CO 2 及饱和湿度条件下对 Vero 细胞进行常 规培养, 两三天以 1 3 进行 1 次传代 病毒的接种及基因组的提取 :HSV-Ⅱ 感染 Vero 细胞后, 于显微镜下观察细胞病变 待 70%-80% 细胞发生病变时收集细胞, 反复冻融 使细胞充分裂解, 低速离心后取上清液, 用病 毒基因组提取试剂盒提取 HSV-Ⅱ 基因组 LAT ORF1 片段的 PCR 扩增 : 以提取的 HSV-Ⅱ333 株基因组为模板,PCR 扩增 ORF1 反应体系如下 :10 pfx 扩增缓冲液 2.5 μl, 2.5 mmol/l dntp 混合液,2 μl,50 mmol/l MgSO μl, 上游引物 (10 μmol/l)1μl, 下 游引物 (10 μmol/l)1 μl, 模板 1 μl,pfxdna 聚 合酶 0.3 μl,10 PCR 加强缓冲液 5 μl, 补灭菌 蒸馏水至 25 μl, 瞬时离心混匀 PCR 反应条件 1 School of Biological Science and Engineering, South China University of Technology, , Guangdong ; 2 Department of Dermatology, General Hospital of Military Area Command of Chinese PLA, , Guangdong Lü Fang-biao, Studying for master s degree, School of Biological Science and Engineering, South China University of Technology, , Guangdong lvfangbiao@163.com Corresponding author: Yang Hui-lan, Doctor, Professor, Department of Dermatology, General Hospital of Military Area Command of Chinese PLA, , Guangdong Supported by: National Natural Science Foundation of China, No * Received: Accepted: ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 7867

3 吕芳彪, 等. 单纯疱疹病毒 Ⅱ 型潜伏相关转录体真核表达载体的构建及表达 为 94 7 min;94 30s,55 20 s,72 45 s, 共 35 个循环 ;72 再延伸 5 min 后冷却至 4 并设立空白对照 : 除不加病毒基因组外, 其余相同 反应完毕后 1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物 pegfp-c2 质粒和 ORF1 片段双酶切及酶切产物回收 : 将回收纯化的目的片段和提取的 pegfp-c2 质粒用限制性内切酶 EcoRI 和 KpnI 分别双酶切, 并回收酶切产物 双酶切反应体系如下 :10 NEB 缓冲液 5 μl,pegfp-c2 质粒 15 μl (ORF1 片段 15 μl),100 BSA 0.5 μl,ecori 1 μl 和 KpnI 1 μl, 补灭菌蒸馏水至 50 μl,37 水浴过夜 反应完毕后 1.0% 琼脂糖凝胶电泳, 切胶, 分别回收线性载体和 ORF1 片段, 具体回收步骤参照 TaKaRa 胶回收试剂盒说明书 ORF1 片段与 pegfp-c2 质粒的连接及转化 :ORF1 片段与 pegfp-c2 质粒连接反应体系如下 :ORF1 片段酶切回收产物 7 μl,pegfp-c2 质粒酶切回收产物 1 μl,t 4 DNA 连接酶 0.5 μl,t 4 DNA 连接酶 Buffer 1 μl, 补灭菌蒸馏水至 10 μl, 瞬时离心后放入 PCR 仪中 16 连接过夜 连接产物转化至预先用 CaCl 2 法制备的大肠杆菌 TOP10 感受态细胞中, 均匀涂布于含 60 mg/l 卡那霉素的 LB 固体培养基上, 静置 30 min, 再倒置培养 h 重组质粒提取和鉴定 : 菌落 PCR 鉴定 : 将含卡那霉素的 LB 固体培养基上长出的阳性克隆菌落编号, 再挑取这些阳性菌落, 进行菌落 PCR 除模板外,PCR 反应体系和反应条件及循环参数与扩增 ORF1 片段相同 以 HSV-Ⅱ 基因组为模板做阳性对照 用 1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测目标条带 重组质粒的双酶切及测序鉴定 : 选取只能扩增出与阳性对照有一致条带的重组质粒, 进行 EcoRI 和 KpnI 双酶切 酶切体系和 pegfp-c2 质粒双酶切相同, 酶切条件为 37 水浴酶切过夜 酶切产物用用 1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测 将同一阳性克隆的菌液送至上海英俊公司用 pegfp-c2 质粒的通用引物测通 重组质粒转染 Vero 细胞 : 待 6 孔板中的细胞生长密度达到 80%-90% 时, 用 Xfect 转染试剂盒分别将 pegfp-c2/lat-orf1 pegfp-c2 转染至 Vero 细胞 具体方法参照 Clontech 公司的 Xfect TM Transfection Reagents 说明书 48h 后荧光倒置显微镜下观察融合蛋白的表达情况 RT-PCR 鉴定 LAT ORF1 在 Vero 细胞中的表达 : 转染 48 h 后, 于荧光显微镜下观察 Vero 细胞中绿色荧光蛋白的表达情况, 并收获细胞提取总 RNA 反转录合成 cdna, 以此为模板,PCR 扩增 ORF1 及 β-actin 反应 体系为 :10 Pfx 扩增缓冲液 2.5 μl,10 mmol/l dntp 混合液 0.5 μl,50 mmol/l MgSO μl, 引物 P1 P2 或 P3 P4 各 1 μl, 反转录产物 cdna 1 μl,10 PCR 加 强液缓冲液 5 μl,pfx DNA 聚合酶 0.3 μl, 加双蒸水至 25 μl 扩增 ORF1/β-actin 基因的条件为 :94 预变性 7 min;94 变性 30 s,55 退火 20 s,72 延伸 45 s, 共 35 个循环 ;72 再延伸 5 min 后冷却至 4 PCR 产 物经 1% 琼脂糖电泳鉴定 主要观察指标 :1 目的片段的扩增结果 2 重组质 粒 pegfp-c2/lat ORF1 的酶切和测序鉴定结果 3 重 组质粒 pegfp-c2/lat ORF1 在 Vero 细胞中的表达及 鉴定结果 2 结果 2.1 目的片段的扩增结果以提取的 HSV-Ⅱ 333 标准 株基因组为模板, 扩增出的条带和目标条带大小 ( 加酶切 位点和保护碱基共 741 bp) 一致, 见图 bp M 1 2 M: DL2000 marker; 1: PCR product of ORF1; 2: Negative control Figure 1 PCR product of the target fragmentlatency-associated transcript open reading frame 1 (ORF1) 图 1 目的片段 LAT ORF1 的 PCR 产物 2.2 重组质粒 pegfp-c2/lat ORF1 的酶切和测序鉴 定重组质粒经限制性内切酶 EcoRI 和 KpnI 双酶切, 可 以获得大小约 和 4.7 kb 的条带, 见图 2 说明目的 片段已经成功插入真核表达载体 pegfp-c2 将上海英 俊测序结果与 GenBank 中的 HSV-Ⅱ 333 标准株 (M )LAT ORF1 序列比较, 完全一致, 表明重组 质粒 pegfp-c2/lat ORF1 构建成功 7868

4 吕芳彪, 等. 单纯疱疹病毒 Ⅱ 型潜伏相关转录体真核表达载体的构建及表达 M M bp bp 转染 48 h 后, 用荧光倒置显微镜观察重组质粒在 Vero 细胞中的表达情况, 发现 pegfp-c2/lat ORF1 融合绿色荧光蛋白在 Vero 细胞中有表达, 表现为强绿色荧光, 表明重组质粒 pegfp-c2/lat ORF1 可在 Vero 细胞中表达 RT-PCR 结果表明只有转染重组质粒 pegfp-c2/lat ORF1 的 Vero 细胞所提取的 RNA 才能扩增出 LAT ORF1 基因, 而 β-actin(452bp) 在转染了两种质粒的 Vero 细胞所提取的 RNA 中均可扩增出来 M: DL2000 marker; 1: Plasmid pegfp-c2/lat ORF1; 2: Plasmid pegfp-c2/lat ORF1 digested with Kpn I; 3: Plasmid pegfp-c2/lat ORF1 digested with Kpn I and EcoRI; 4: wide range marker Figure 2 The recombinant plasmid of herpes simplex virus latency-associated transcript open reading frame 1 (pegfp-c2/lat ORF1) by enzyme digestion 图 2 重组质粒 pegfp-c2/lat ORF1 的酶切 2.3 重组质粒 pegfp-c2/lat ORF1 在 Vero 细胞中的 表达及鉴定见图 3, 见图 Figure 3 Expression of plasmid pegfp-c2/ latency-associated transcript open reading frame 1 in Vero cells at 48 h after transfection 图 3 转染 48 h 后 pegfp-c2/lat-orf1 在 vero 细胞中的表达 M M M: DL2000 marker; 1: Plasmid pegfp-c2/lat ORF1; 2: Plasmid pegfp-c2/lat ORF1 digested with Kpn I; 3: Plasmid pegfp-c2/lat ORF1 digested with Kpn I and EcoRI; 4: wide range marker Figure 4 Identification of latency-associated transcript open reading frame 1 expression in Vero cells by using reverse transcription PCR 图 4 RT-PCR 鉴定 LAT ORF1 基因在 Vero 细胞中的表达 3 讨论 HSV 是人类常见的病毒性疾病病原体之一, 人体是其惟一的自然宿主 近年来研究表明 HSV-Ⅱ 感染可显著增加人类免疫缺陷病毒感染概率, 并和宫颈癌的发生有关 [11] HSV-Ⅱ 嗜神经潜伏使它可以逃避免疫系统监视而难以根除 目前这种潜伏复发机制尚未明确, 是彻底解决 HSV-Ⅱ 感染这一医学难题的瓶颈所在 LAT 的发现给研究者们揭开 HSV-Ⅱ 潜伏感染的神秘面纱带来了新的希望 国外的许多研究结果证明 LAT 对 HSV 的潜伏激活至关重要, 但学者对 LAT 具体的作用机制仍有分歧, 主要集中在以下几个方面 :1 反义 RNA 分子机制 :LAT 通过下调立即早期蛋白 ICP0 的表达, 从而使病毒处于潜伏感染状态 [12] 2microRNA 水平上的抗凋亡作用 [13-16] : 在病毒潜伏阶段,LAT 编码 microrna 作用其靶基因, 发挥 RNA 干扰效应进而抑制神经元细胞的凋亡, 使病毒持续潜伏感染 3 蛋白水平上的抗凋亡作用 [7,17] :LAT ORF 编码了与 ICP0 有类似功能的蛋白, 该蛋白以级联调控的方式调节早期基因和晚期基因的有序表达, 从而激活潜伏的病毒, 且该蛋白瞬时表达后即发挥作用, 存在时间很短, 难以检测 HSV-Ⅱ 起主要作用的 LAT 含有 3 个开放读码框, 分别为 ORF1,ORF2,ORF3, 本实验以 ORF1 为研究对象, 选用 pegfp-c2 为载体, 构建真核表达载体 pegfp-orf1 EGFP 是一种新型的报告基因, 检测方便, 定位准确, 荧光稳定, 且对宿主细胞无任何毒害, 具有共用性和通用性, 不受受体范围的限制, 可以在胚胎或转基因动物模型中表达等优势 本实验成功构建了真核表达载体 pegfp-orf1, 将其转染进 Vero 细胞,RT-PCR 鉴定了 LAT ORF1 在 Vero 细胞中的表达, 并且在荧光显微镜下观察到了融合蛋白的表达 目前国内外还没有将 HSV-Ⅱ LAT ORF1 克隆进 pegfp-c2 真核表达载体的报道, 该重组载体的成功构建尚属首次, 它可以为进一步研究 HSV-Ⅱ LAT ORF1 在 HSV-Ⅱ 潜伏复发中的作用机制和生物学功能提供重 ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 7869

5 吕芳彪, 等. 单纯疱疹病毒 Ⅱ 型潜伏相关转录体真核表达载体的构建及表达 要的分子工具和试验基础 4 参考文献 [1] Bedadala GR,Pinnoji RC,Palem JR,et al.thyroid hormone controls the gene expression of HSV-1 LAT and ICP0 in neuronal cells.cell Research.2010;20(5): [2] Johnston C,Saracino M,Kuntz S,et al.standard-dose and high-dose daily antiviral therapy for short episodes of genital HSV-2 reactivation: three randomised,open-label,cross-over trials.2012;379(9816): [3] Centers for Disease Control and Prevention (CDC)..Seroprevalence of herpes simplex virus type 2 among persons aged years United States, MMWR Morb Mortal Wkly Rep.2010;59(15): [4] Jin L,Carpenter D,Moerdyk SM,et al.cellular FLIP can substitute for the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript gene to support a wild-type virus reactivation phenotype in mice.j Neurovirol.2008;14(5): [5] Jiang XZ,Chentoufi AA,Hsiang CH,et al.the Herpes Simplex Virus Type 1 Latency-Associated Transcript Can Protect Neuron-Derived C1300 and Neuro2A Cells from Granzyme B-Induced Apoptosis and CD8 T-Cell Killing.J Virol.2011; 85(5): [6] Bertke AS,Patel A,Imai Y,et al.latency-associated Transcript (LAT) Exon 1 Controls Herpes Simplex Virus Species-Specific Phenotypes: Reactivation in the Guinea Pig Genital Model and Neuron Subtype-Specific Latent Expression of LAT.J Virol.2009;83(19): [7] Carpenter D,Henderson G,Hsiang C,et al. Introducing point mutations into the ATGs of the putative open reading frames of the HSV 1 gene encoding the latency associated transcript (LAT)reduces its anti apoptosis activity.microb Pathog.2008; 44(2): [8] Henderson G,Jaber T,Carpenter D,et al.identification of herpes simplex virus type 1 proteins encoded within the first 1.5 kb of the latency-associated transcript.journal of NeuroVirology.2009;15(5): [9] Branco FJ,Fraser NW. Herpes simplex virus type 1 latency associated transcript expression protects trigeminal ganglion neurons from apoptosis.j Virol.2005;79(14): [10] Krause PR,Ostrove JM,Straus SE. The nucleotide sequence, 5 end, promoter domain,and kinetics of expression of the gene encoding the herpes simplex virus type 2 latency-associated transcript.j Virol.1991;65(10): [11] Szostek S,Zawilinska B,Kopec J,et al.herpesviruses as possible cofactors in HPV-16-related oncogenesis.acta Biochimica Polonica.2009;56(2): [12] Chen SH,Lee LY,Garber DA,et al.neither LAT nor open reading frame Putations increase expression of spliced or intron containing ICP0 transcripts in mouse ganglia latently infected with herpes simplex virus.j Virol.2002;76: [13] Jurak I,Kramer MF,Mellor JC,et al.numerous Conserved and Divergent MicroRNAs Expressed by Herpes Simplex Viruses 1 and 2.J Virol.2010;84(9): [14] Tang S,Bertke AS,Patel A,et al.an acutely and latently expressed herpes simplex virus 2 viral microrna inhibits expression of ICP34.5, a viral neurovirulence factor.proc. Natl.Acad.Sci.USA 2008;105(31): [15] Tang S,Patel A,Krause PR,et al.novel less-abundant viral micrornas encoded by herpes simplex virus 2 latency-associated transcript and their roles in regulating ICP34.5 and ICP0 mrnas.j Virol.2009;83(3): [16] Umbach JL,Wang K,Tang S,et al.identification of Viral MicroRNAs Expressed in Human Sacral Ganglia Latently Infected with Herpes Simplex Virus 2.J Virol.2010;84(2): [17] Thomas SK,Lilley CE,Latchman DS,et al.a protein encoded by the herpes simplex virus (HSV) type 1 2-kilobase latency-associated transcript is phosphorylated, localized to the nucleus, and overcomes the repression of expression from exogenous promoters when inserted into the quiescent HSV genome.j Virol.2002;76(8): 来自本文课题的更多信息 -- 基金声明 : 国家自然科学基金资助项目 ( ) 作者贡献 : 本课题由第一作者设计及实施, 由通讯作者评估, 盲法评估 利益冲突 : 课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助 伦理要求 : 未涉及与相关伦理道德冲突的内容 文章概要 : 文章要点 : 构建 HSV-Ⅱ LAT ORF1 真核表达载体 pegpf-orf1, 实现其在 Vero 细胞中的表达 关键信息 : 成功构建 pegfp-c2/hsv- Ⅱ LAT ORF1 真核表达载体, 通过 RT-PCR 验证了其 mrna 水平的表达, 并用荧光倒置显微镜观察到了融合蛋白的表达 为研究 HSV-Ⅱ LAT ORF1 的功能奠定了基础 研究的创新之处与不足 : 实验只构建了 pegfp-c2/hsv-Ⅱ LAT ORF1 真核表达载体,HSV- Ⅱ LAT ORF1 在潜伏复发中的功能还有待进一步研究 作者声明 : 文章为原创作品, 数据准确, 内容不涉及泄密, 无一稿两投, 无抄袭, 无内容剽窃, 无作者署名争议, 无与他人课题以及专利技术的争执, 内容真实, 文责自负 7870

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