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阅龛巳满
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1 348 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2015, 50 (3): 稳定同位素内标对人血浆样品中伊伐布雷定和 N- 去甲基伊伐布雷定测定的影响 1, 刘冬芹 2, 余京华 1, 张逸凡 1, 钟大放 1, 何玲 2, 陈笑艳 1* (1. 中国科学院上海药物研究所, 上海 ; 2. 中国药科大学药学院, 江苏南京 ) 摘要 : 建立液相色谱串联质谱 (LC-MS/MS) 法同时测定人血浆中伊伐布雷定和 N- 去甲基伊伐布雷定, 并考察稳定同位素内标 d 3 - 伊伐布雷定对待测物测定的影响血浆样品经乙腈沉淀蛋白处理后, 经 Capcell PAK C 18 柱 (100 mm 4.6 mm, 5 μm) 分离, 以甲醇 5 mmol L 1 醋酸铵溶液为流动相采用电喷雾电离源 (ESI 源 ), 多反应监测模式进行正离子检测实验中考察了伊伐布雷定同位素峰 [M+H+3] + 对内标峰面积的影响以及内标的同位素纯度对伊伐布雷定测定的干扰, 通过选择合适的内标浓度满足了方法选择性和线性范围的要求方法验证结果表明, 测定伊伐布雷定和 N- 去甲基伊伐布雷定线性范围分别为 0.100~60.0 ng ml 1 和 ~20.0 ng ml 1 各待测物的日内日间精密度以及准确度均符合生物样品分析相关要求本方法成功应用于硫酸氢伊伐布雷定缓释片的人体药动学研究关键词 : 稳定同位素内标 ; LC-MS/MS; 伊伐布雷定 ; N- 去甲基伊伐布雷定中图分类号 : R917 文献标识码 : A 文章编号 : (2015) Effects of stable isotope labeled internal standard on determination of ivabradine and N-demethylivabradine in human plasma LIU Dong-qin 1, 2, YU Jing-hua 1, ZHANG Yi-fan 1, ZHONG Da-fang 1, HE Ling 2, CHEN Xiao-yan 1* (1. Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai , China; 2. College of Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing , China ) Abstract: This study aims to develop a liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method for the simultaneous determination of ivabradine and N-demethylivabradine in human plasma, and investigate effects of stable isotope labeled (SIL) internal standard (IS) on ivabradine. The analytes and IS were extracted from plasma by protein precipitation with acetonitrile, and chromatographied on a Capcell PAK C 18 (100 mm 4.6 mm, 5 μm) column using a mobile phase of methanol and 5 mmol L 1 ammonium acetate. Multiple reaction monitoring with electrospray ionization (ESI) was used in the positive mode for mass spectrometric detection. The effect of ivabradine isotope peak [M+H+3] + on IS and the effect of SIL IS purity on ivabradine were evaluated. An appropriate concentration of SIL IS was chosen to permit method selectivity and linearity of the assay over the required range. The standard curves were demonstrated to be linear in the range of to 60.0 ng ml 1 for ivabradine, and to 20.0 ng ml 1 for N-demethylivabradine. The intra and inter day precision and accuracy were within the acceptable limits for all concentrations. Besides, the interaction between IS and ivabradine did not impact the determination of analytes. This method was successfully applied to a pharmacokinetic study of hydrogen sulfate ivabradine sustained release tablets on Chinese healthy volunteers. 收稿日期 : ; 修回日期 : * 通讯作者 Tel / Fax: , xychen@simm.ac.cn

2 刘冬芹等 : 稳定同位素内标对人血浆样品中伊伐布雷定和 N- 去甲基伊伐布雷定测定的影响 349 Key words: stable isotope labeled internal standard; LC-MS/MS; ivabradine; N-demethylivabradine 液相色谱串联质谱 (LC-MS/MS) 技术因具有高灵敏度和高选择性的特点, 广泛应用于生物样品中药物或代谢产物的定量分析 [1] 与 HPLC-UV 方法不同, LC-MS/MS 方法在生物样品分析时面临的技术挑战之一是基质效应美国 [2] [3] [4] 欧盟和我国在生物分析方法验证的指导原则中均明确指出, LC-MS/ MS 方法在整个分析过程中需通过适当的方法减少基质效应的影响, 以保证方法的精密度与准确度通过选择合适的样品预处理方法优化色谱分离条件可以有效地克服基质效应, 但这往往需要花费较长的时间待测物的结构类似物, 特别是稳定同位素内标, 由于与待测物有着相似的物理化学性质色谱保留时间和质谱裂解方式一致, 可以有效地校正基质效应, 保证分析结果的准确性和重现性 [5 9] 近年来随着稳定同位素在 LC-MS/MS 方法的应用, 人们逐渐意识到同位素内标纯度和待测物的同位素分布对测定的影响 [10, 11], 但缺少有效的评价系统本文以伊伐布雷定人血浆样品 LC-MS/MS 分析方法为例, 探讨同位素内标对测定结果的影响伊伐布雷定 (ivabradine, 结构见图 1A) 是首个特异性减慢心率的药物, 主要用于治疗对 β 受体阻断剂禁忌或不能耐受的稳定型心绞痛 [12 15] N- 去甲基伊伐布雷定 (N-demethylivabradine, 结构见图 1B) 是其主要的活性代谢产物 [16] 目前市售盐酸伊伐布雷定片需每日服用 2 次, 血药浓度波动较大, 可能影响疗效或增加药物不良反应发生率将伊伐布雷定制成缓释制剂后, 可减少给药次数, 并使血药浓度较长时间保持在有效范围内因此, 伊伐布雷定缓释制剂的开发具有重要的临床意义进行伊伐布雷定缓释片人体药动学研究的关键是对血浆样品中伊伐布雷定 [17 20] 及活性代谢物浓度进行测定目前, 已有文献报道采用 LC-MS/MS 法测定血浆中伊伐布雷定或其代谢物伊伐布雷定分子中含有 27 个碳原子, 其同位素峰 [M+H+3] + 丰度比为 0.75%, 可能会干扰市售的稳定同位素内标 d 3 - 伊伐布雷定测定材料与方法药品和试剂硫酸氢伊伐布雷定对照品 ( 含量 100%, 批号 RS ) N- 去甲基伊伐布雷定 ( 含量 97.6%, 批号 ) 硫酸氢伊伐布雷定缓释片 ( 规格 : 10 mg/ 片, 批号 P ) 均由江苏恒瑞医药股份有限公司提供 ; 盐酸伊伐布雷定片 ( 规格 : 5 mg/ 片, 批号 : ) 购自法国 Les Laboratoires Servier; d 3 - 伊伐布雷定 ( 化学纯度 98.0%, 同位素纯度 98.8%, 批号 4-AKT-77-1) 购自加拿大 TRC 公司 ; 甲醇 ( 美国 Sigma 公司 ) 乙腈 ( 德国 Merck 公司 ) 醋酸铵 ( 美国 ROE 公司 ) 均为色谱纯 ; 去离子水由 Millipore 纯水仪制备仪器美国 Applied Biosystems 公司的 API 4000 型三重四极杆串联质谱仪 ; 配备电喷雾电离源 (ESI 源 ); 日本岛津公司的岛津液相色谱系统, 包括 LC- 20AD 型二元液相泵, SIL-HT A 型自动进样器和美国 Agilent 公司的 Agilent 1100 柱温箱色谱条件分析柱 : Capcell PAK C 18 色谱柱 (100 mm 4.6 mm, 5 μm, 日本资生堂公司 ); 预柱 : C 18 保护柱 (4.0 mm 3.0 mm, 5 μm, 美国 Phenomenex 公司 ); 流动相 : 甲醇 5 mmol L 1 醋酸铵水溶液, 梯度洗脱 (0~2.0 min, 甲醇 45%~85%; 2.0~4.5 min, 甲醇 85%; 4.5~5.0 min, 甲醇 85%~45%; 5.0~5.5 min, 甲醇 45%); 流速 : 0.6 ml min 1 ; 柱温 : 40 ; 进样量 : 10 μl 质谱条件离子源为 ESI 源 ; 正离子模式检测 ; 源喷射电压为 5 kv; 离子源温度为 450 ; 离子源气体 1 (N 2 ) 压力为 40 psi (1 psi 6.9 kpa); 离子源气体 2 (N 2 ) 压力为 40 psi; 气帘气体 (N 2 ) 压力为 10 psi; 扫描方式为多反应监测 ; 各待测物的离子反应分别为 : m/z m/z ( 伊伐布雷定 ) m/z m/z (N- 去甲基伊伐布雷定 ) m/z m/z (d 3 - 伊伐布雷定 ) 标准系列样品和质控样品的制备分别精密称取伊伐布雷定和 N- 去甲基伊伐布雷定对照品各两份, 一份用于标准系列样品的制备, 一份用于质控样品的制备分别以甲醇溶解并定容至 10 ml, 分别获得浓度均为 1.00 mg ml 1 左右的储备液, 以空白血浆稀释各储备液, 获得一定浓度的标准系列样品和质量控制 (QC) 样品本实验标准系列样品中伊伐布雷定 / N- 去甲基伊伐布雷定质量浓度分别为 : 0.100/ / / / / /10.0 和 60.0/20.0 ng ml 1 QC 样品中伊伐布雷定 /N- 去甲基伊伐布雷定的质量浓度分别为 : 0.100/ ng ml 1 ( 定量下限 ) 0.300/0.150 ng ml 1 ( 低浓度 ) 8.00/1.00 ng ml 1 ( 中浓度 ) 和 48.0/16.0 ng ml 1 ( 高浓度 )

3 350 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2015, 50 (3): 血浆样品预处理向 100 μl 血浆中加入内标溶液 (10.0 ng ml 1 d 3 - 伊伐布雷定 ) 20.0 μl 和乙腈 300 μl, 涡流 1 min, 离心 5 min ( r min 1 ), 取 10.0 μl 上清液进行 LC-MS/MS 分析稳定同位素内标和待测物相互影响考察取定量上限 (ULOQ) 样品 100 µl, 除不加内标溶液外, 按血浆样品预处理项下操作, 进行 6 样本分析同时另取空白样品 100 µl, 只加入内标溶液, 按血浆样品预处理项下操作, 进行 6 样本分析以 ULOQ 样品中监测的内标峰面积的平均值与零点样品内标峰面积的平均值的比值作为伊伐布雷定对内标 d 3 - 伊伐布雷定影响的评定标准以零点样品中待测物峰面积的平均值与定量下限 (LLOQ) 中待测物峰面积平均值的比值作为 d 3 - 伊伐布雷定对伊伐布雷定影响的评定标准方法学验证选择性取 6 个不同来源的人空白血浆样品和 1 份溶血的空白血浆样品以及相应人空白血浆配制的 LLOQ 样品进行 LC-MS/MS 分析, 考察是否有干扰测定标准曲线样品按血浆样品预处理项下操作, 以每个待测物浓度为横坐标, 待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标, 用加权 (W = 1/x 2 ) 最小二乘法进行回归运算, 求得的标准曲线的相关系数 (r 2 ) 均大于 0.99 定量下限取 LLOQ 血浆样品, 进行 6 样本分析, 连续测定 3 天, 并根据当日标准曲线计算每一样本测得浓度, 计算该浓度的日内和日间精密度精密度与准确度取伊伐布雷定 /N- 去甲基伊伐布雷定低中高浓度的 QC 样品, 按血浆样品预处理项下操作, 每个浓度进行 6 样本分析, 分别在 3 日内测试, 测定日内日间精密度和准确度回收率取低中高三个浓度血浆样品, 按血浆样品预处理项下操作, 每一浓度进行六样本分析同时另取人空白血浆 100 µl, 除不加内标溶液外, 按血浆样品预处理项下操作, 取全部上清液, 加入相应浓度对照质控溶液 ( 伊伐布雷定 /N- 去甲基伊伐布雷定的溶液浓度分别为 1.50/ / /80.0 ng ml 1 ) 和内标溶液, 涡流混匀后进样分析, 获得相应峰面积 (n = 3) 以提取后的色谱峰面积与未经提取获得的色谱峰面积之比计算处理回收率基质效应取 6 个受试者空白血浆及 1 份溶血空白血浆 100 μl, 除不加内标溶液外, 按血浆样品预处理项下操作, 取全部上清液, 加入相应浓度对照质控溶液 ( 伊伐布雷定 /N- 去甲基伊伐布雷定的溶液浓度分别为 1.50/0.750 和 240/80.0 ng ml 1 ) 和内标溶液, 涡流混匀后进样分析, 获得相应峰面积 (A) 同时另取 100 μl 水代替空白血浆, 按上述方法处理, 获得相应峰面积 (B) 以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算基质效应, 计算公式为 A/B 100% 以分析物和内标的基质效应比值计算内标归一化的基质效应稳定性考察了伊伐布雷定 /N- 去甲基伊伐布雷定低高两浓度血浆样品室温放置 8 h, 经历 3 次冷冻 - 解冻循环, 20 放置 49 天和处理后室温放置 24 h 的稳定性人体药物动力学研究临床试验经浙江大学医学院附属第一医院伦理委员会批准, 选取 20 名健康成年受试者, 签署知情同意书后, 采取 2 周期随机交叉自身对照试验, 每周期清洗期为 6 天受试者随机分成受试制剂组 (10 mg/ 片, 国内某公司 ) 参比制剂组 (5 mg/ 片, 法国 Les Laboratoires Servier 公司 ) 分别口服受试制剂和参比制剂各 10 mg, 在服药前及服药后和 48 h 采集静脉血 3~ 5 ml 于肝素管中, 立即在 r min 1 下离心 10 min, 获得的血浆样品于 20 冷冻保存采用 Phoenix WinNonlin 6.1 软件以非房室模型法计算各待测物的药动学参数结果 1 质谱分析伊伐布雷定和其活性代谢物的结构中都含有碱性氮原子, 质谱电离时易获得质子, 优先选择正离子检测方式在正离子检测模式下, 伊伐布雷定 N- 去甲基伊伐布雷定及内标 d 3 - 伊伐布雷定主要生成 [M+H] + 峰, 质荷比分别为 m/z m/z 和 m/z 选择性对 [M+H] + 峰进行产物离子扫描分析, 三者生成的主要碎片离子均为 m/z 和 m/z 262.2, 通过对碰撞能量和去簇电压的条件优化, 选择 m/z 作为定量分析时监测的产物离子, 各待测物及内标的 [M+H] + 产物离子全扫描质谱图见图 1 伊伐布雷定和 d 3 - 伊伐布雷定的同位素峰分布见表 1, Q1 全扫描质谱图见图 2 其中伊伐布雷定的同位素峰 [M+H+3] + 丰度比为 0.75%, 其质荷比与内标 d 3 - 伊伐布雷定 [M+H] + 峰相同

4 刘冬芹等 : 稳定同位素内标对人血浆样品中伊伐布雷定和 N- 去甲基伊伐布雷定测定的影响 351 Figure 1 Product ion mass spectra of protonated molecules obtained from ivabradine (A), N-demethylivabradine (B), and IS d 3-ivabradine (C) Table 1 Mass and isotopic abundance of ivabradine and d 3- ivabradine Ion Ivabradine d 3-Ivabradine Mass Abundance/% Mass Abundance/% M M M M M M Figure 2 Q1 full scan of spectra of ivabradine (A) and d 3- ivabradine (B) 2 稳定同位素内标纯度对测定的影响尽管 d 3 - 伊伐布雷定的同位素纯度为 98.8%, 但实验中发现当同位素内标的血浆浓度为 10.0 ng ml 1 时, 零点样品中检测到的伊伐布雷定的浓度为 ng ml 1, 与伊伐布雷定定量下限浓度相当, 导致低浓度测定结果相对偏差 > 41.6% 实验中将同位素内标血浆浓度分别降为 6.00 和 2.00 ng ml 1, 零点样品中检测到的伊伐布雷定峰面积分别相当于 LLOQ 样品中伊伐布雷定峰面积的 30.4% 和 12.9% ( 图 3) 因此, 选择 2.00 ng ml 1 d 3 - 伊伐布雷定作为内标, 方法的选择性标准曲线各点的精密度和准确度均符合生物样品方法验证指导原则的相关规定 [2 4] 因此, 本实验最终选用 d 3 - 伊伐布雷定的血浆浓度为 2.00 ng ml 1 3 待测物同位素分布对内标的影响参考文献 [17 20], 最初将伊伐布雷定的定量上限设为 100 ng ml 1, 测定时发现高浓度点测定浓度偏低, 准确度为 91.8%, 其内标的峰面积比其他浓度点 Figure 3 The effect of d 3-ivabradine on ivabradine. A: Blank sample spiked with ng ml 1 ivabradine, ng ml 1 N-demethylivabradine and 2.00 ng ml 1 IS; B: Blank plasma only with 2.00 ng ml 1 IS; C: Blank plasma only with 6.00 ng ml 1 IS; D: Blank plasma only with 10.0 ng ml 1 IS. Peaks I, II and III refer to ivabradine, N-demethylivabradine, and d 3- ivabradine, respectively 高 7.1% 在不加入内标的定量上限样品中检测 [M+H+ 3] + m/z 177.2, 其响应为 d 3 - 伊伐布雷定响应的 7.8% 降低伊伐布雷定定量上限至 60.0 ng ml 1, 其响应为 3.4%, 低于其他标准曲线样品内标响应的 5% ( 图 4), 满足方法选择性接受标准 [2 4] Figure 4 The effect of ivabradine on d 3-ivabradine. A: Plasma concentration of 100 ng ml 1 ULOQ sample without IS; B: Plasma concentration of 60.0 ng ml 1 ULOQ sample without IS. Peaks I and II, refer to ivabradine and d 3-ivabradine, respectively 4 方法学验证 4.1 选择性结果表明, 空白血浆中的内源性物质

5 352 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2015, 50 (3): 不干扰伊伐布雷定 N- 去甲基伊伐布雷定及内标 d 3 - 伊伐布雷定的测定 d 3 - 伊伐布雷定不干扰伊伐布雷定 N- 去甲基伊伐布雷定的测定典型色谱图见图 5 Figure 5 Typical MRM chromatograms of ivabradine, N- demethylivabradine, and IS d 3-ivabradine. A: Human blank plasma; B: Blank plasma spiked with IS; C: LLOQ sample spiked with IS; D: Human plasma sample spiked with IS after an oral administration of one hydrogen sulfate sustained-release tablet of 10 mg; Peak I III refer to ivabradine, N-demethylivabradine, and d 3-ivabradine, respectively 4.2 标准曲线测定伊伐布雷定的线性范围为 0.100~60.0 ng ml 1, N- 去甲基伊伐布雷定的线性范围为 ~20.0 ng ml 定量下限结果得 LLOQ 浓度伊伐布雷定的日内精密度为 5.9%, 日间精密度为 6.9%, 准确度为 99.5%; N- 去甲基伊伐布雷定的日内精密度为 11.5%, 日间精密度为 11.2%, 准确度为 98.7% ( 表 2) 该结果表明 LC-MS/MS 法测定血浆中伊伐布雷定和 N- 去甲基伊伐布雷定定量下限分别可达 ng ml 1 和 ng ml 精密度与准确度日内日间精密度和准确度结果见表 2 伊伐布雷定每一浓度水平的 QC 样品的日内精密度均小于 2.9%, 日间精密度均小于 4.5%, 准确度在 97.1%~104% 之间 ; N- 去甲基伊伐布雷定每一浓度水平 QC 样品的日内精密度均小于 6.2%, 日间精密度均小于 5.9%, 准确度在 102%~104% 各待测物 QC 样品测试结果均符合生物样品测定有关要求 [2 4] 4.5 回收率伊伐布雷定在低中高三浓度的回收率分别为 (88.4 ± 6.2) % (91.0 ± 4.8) % 和 (90.1 ± 1.9) %; N- 去甲基伊伐布雷定在低中高三浓度的回收率分别为 (91.6 ± 6.3) % (100 ± 3.4) % 和 (97.1 ± 2.5) % 4.6 基质效应伊伐布雷定在低高两浓度的基质效应分别为 103% 和 102%, 相对标准差分别为 1.5% 和 1.3%; N- 去甲基伊伐布雷定人血浆样品的低高两浓度的基质效应分别为 96.4% 和 101%, 相对标准差分别为 2.4% 和 1.1%; 内标 d 3 - 伊伐布雷定的基质效应为 97.5%, 相对标准差为 1.5% 结果表明, 待测物在本实验选择的色谱和质谱条件下, 可忽略基质效应的影响 4.7 稳定性结果表明, 在上述条件下, 血浆样品中伊伐布雷定和 N- 去甲基伊伐布雷定均稳定, 数据见表 3 Table 3 Stability data of ivabradine and N-demethylivabradine in human plasma under various storage conditions ( n = 3), Bench top (8 h) Ivabradine /ng ml 1 N-demethylivabradine /ng ml x ± s/ng ml ± ± ± ± 0.7 Accuracy/% Autosamplers (24 h) x ± s/ng ml ± ± ± ± 0.2 Accuracy/% Three freeze-thaw cycles x ± s/ng ml ± ± ± ± 0.2 Accuracy/% days at -20 C x ± s/ng ml ± ± ± ± 0.4 Accuracy/% Table 2 The intra- and inter-day precision and accuracy values of the LLOQ and QC samples of ivabradine and N-demethylivabradine (n = 18) Item Ivabradine /ng ml 1 N-demethylivabradine /ng ml Mean /ng ml SD /ng ml Accuracy /% Intra-day precision /% Inter-day precision /%

6 刘冬芹等 : 稳定同位素内标对人血浆样品中伊伐布雷定和 N- 去甲基伊伐布雷定测定的影响人体药物动力学研究此方法应用于硫酸氢伊伐布雷定缓释片的人体药物动力学研究伊伐布雷定和 N- 去甲基伊伐布雷定单次给药后的药物时间曲线见图 6 与普通片剂相比, 硫酸氢伊伐布雷定缓释片达峰时间明显延长 ( 伊伐布雷定 t max 从 1.33 h 延长到 4.63 h, N- 去甲基伊伐布雷定 t max 从 1.42 h 延长到 6.21 h), 达峰浓度明显降低, 但二者 AUC 均无显著性差异, 表明受试制剂硫酸氢伊伐布雷定缓释片具有缓释特征 Figure 6 Mean plasma concentration-time curves of ivabradine (A) and N-demethylivabradine (B) in human plasma after a single oral dose of 10 mg extend-release tablet and ordinary tablets in Chinese healthy volunteers. n = 20, x ± s 讨论稳定同位素内标由于与待测物具有几乎完全一致的化学性质, 被认为是 LC-MS/MS 定量分析方法最理性的内标稳定同位素内标可以校正待测物在样品提取和 LC-MS/MS 分析中引起的波动但由于稳定同位素内标合成过程中不能达到 100% 的同位素纯度, 可能会影响待测物的测定本实验中通过降低稳定同位素内标的浓度来减少同位素纯度不高的影响, 但有时过低的内标浓度会影响方法的线性和准确度因此, 在同位素内标合成时应避免采用与待测物有关的物质作为合成稳定同位素内标的主要原料, 以提高同位素纯度另外, 在 LC-MS/MS 测定中, 待测物的自然同位素分布对内标的干扰可能转化为内标, 错误地增加内标峰面积, 而伴随着待测物响应的相对减少为了解决这一问题, 本文提出 3 种改进措施 : 一是调整待测物的定量上限或内标浓度 ; 二是采用同位素标记数更多的稳定同位素内标, 如 d 4 - 伊伐布雷定伊伐布雷定的同位素 [M+H+4] + 丰度比仅为 0.08%, 因此即使伊伐布雷定和 d 4 - 伊伐布雷定血浆浓度相差 100 倍, 进行 MRM 分析时伊伐布雷定同位素峰对 d 4 - 伊伐布雷定的影响也不足 1%, 基本可忽略 ; 三是采用稳定同位素内标的重元素峰 [M+H+1] + 作为前体离子在本实验中, 若选择 d 3 - 伊伐布雷定的同位素峰 [M+H+1] + (m/z 473.3) 作为内标定量反应的前体离子时, 在不加内标的定量上限 (60.0 ng ml 1 ) 样品中, 检测到内标峰面积仅为 2.00 ng ml 1 平均内标峰面积的 1.1%, 影响可忽略综上, 选择稳定同位素作为内标建立 LC-MS/MS 生物样品定量分析方法时, 除采用零点样品考察内标对待测物影响外, 还应使用不加内标的定量上限 (60.0 ng ml 1 ) 样品评价待测物同位素分布对内标的影响在方法开发初期, 本实验也对色谱条件进行了优化, 尝试采用不同配比的流动相考察对待测物色谱的影响当以乙腈 5 mmol L 1 醋酸铵溶液 (40 60) 为流动相, 色谱柱选用 XDB C 18 柱 (150 mm 4.6 mm, 5 μm) 时, 待测物在死时间附近出峰, 且有明显拖尾现象流动相更换为甲醇 5 mmol L 1 醋酸铵溶液 (30 70), 色谱柱更换为 Capcell PAK C 18 柱 (100 mm 4.6 mm, 5 μm), 峰形得到明显改善但伊伐布雷定仍接近死时间出峰改用梯度洗脱后, 伊伐布雷定与 N- 去甲基伊伐布雷定在色谱柱上有良好的分离, 且在柱上有明显保留本实验成功建立了同时测定人血浆样品中的伊伐布雷定和 N- 去甲基伊伐布雷定的 LC-MS/MS 方法, 并系统评价了稳定同位素内标与待测物之间的交叉影响通过优化质谱条件色谱条件和预处理方法, 本实验在 5.5 min 内实现原形和代谢物同时分析, 显著提高了分析通量本文也报道了硫酸氢伊伐布雷定缓释片的人体药动学特征 References [1] Deng P, Chen XY, Zhong DF. Quantification of polar drugs in human plasma with liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J]. Bioanalysis, 2009, 1: [2] US Food and Drug Administration. Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation (draft) [S/OL]. Rockville,

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