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知匙姬
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1 2012 年第 70 卷化学学报 Vol. 70, 2012 第 6 期, 803~811 ACTA CHIMICA SINICA No. 6, 803~811 研究论文不同功能单体合成的谷胱甘肽分子印迹聚合物的研究辛瑜仝艳军杨海麟张玲张玉然陈亦王武 * ( 江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室无锡 ) 摘要采用分子印迹技术, 以谷胱甘肽为模板分子, 以丙烯酰胺甲基丙烯酸为功能单体制备分子印迹聚合物 ; 通过静态吸附试验, 探讨了合成分子印迹聚合物时模板分子与功能单体的物质的量比上样液 ph 值吸附平衡时间上样液浓度对聚合物吸附性能的影响 ; 实验结果表明 : 以丙烯酰胺甲基丙烯酸为功能单体制备谷胱甘肽分子印迹聚合物时, 谷胱甘肽与丙烯酰胺甲基丙烯酸的最适摩尔比分别为 1 5 和 1 4, 以及最适静态吸附条件为 : 上样液 ph 值分别为 3.0 和 5.0 左右 ; 上样液浓度分别为 1.50~2.00 g/l 和 1.00~1.50 g/l; 静态吸附平衡时间为 18 和 20 h 左右. 同时也探讨了分子印迹聚合物对谷胱甘肽结构类似物的吸附性能, 结果表明, 所合成的分子印迹聚合物对谷胱甘肽具有良好的选择性吸附能力. 同时也研究了分子印迹聚合物对酵母抽提物中谷胱甘肽的吸附性能, 以丙烯酰胺和甲基丙烯酸为功能单体制备的分子印迹聚合物对混合体系中谷胱甘肽的一次性提取率分别为 41% 和 77%. 分子印迹聚合物均表现出了较好的吸附特性, 为分离提纯谷胱甘肽提供一种可选择的途径. 关键词分子印迹 ; 谷胱甘肽 ; 谷胱甘肽分子印迹聚合物 ; 制备 ; 吸附条件 ; 酵母抽提液 ; 吸附性能 Study on the Glutathione Molecularly Imprinted Polymers with Different Functional Monomers Xin, Yu Tong, Yanjun Yang, Hailin Zhang, Ling Zhang, Yuran Chen, Yi Wang, Wu* (Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi ) Abstract Using glutathione (GSH) as template molecule, acrylamide (AM) and methacrylic acid (MAA) as functional monomer, different glutathione-molecularly imprinted polymers (GSH-MIPs) were developed and synthesized with molecularly imprinted technique. The effects for adsorption capacity, including molar ratio of template molecule-functional monomer, ph of loading buffer, adsorption equilibrium time and loading concentration were discussed in detail. The result demonstrated that the polymers with raw material mole ratios at 1 5 for GSH AM, and 1 4 for GSH MAA showed higher adsorption capacity, the optimal ph values for the adsorption of GSH-MIP AMs and GSH-MIP MAAs to GSH were 3.0 and 5.0, respectively; furthermore, the optimal GSH loading concentrations were 1.50~2.00 g/l for GSH-MIP AMs, and 1.00~ 1.50 g/l for GSH-MIP MAAs ; additionally, the adsorption equilibrium time was 20 h for GSH-MIP AMs and 18 h for GSH-MIP MAAs. In addition, the binding of GSH analogues were also applied to the synthesized poly- * wangwu@jiangnan.edu.cn Received July 15, 2011; revised November 8, 2011; accepted December 14, Project Supported by the Program of the Science and Technology Support Plan of Jiangsu Province (Nos. SBE , SBE ), the Program of the Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, China (No. KLIB-KF201005), A Project Funded by the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions, the 111 Project (No ) 年江苏省科技支撑 (No. SBE ) 2011 年江苏省科技支撑 (No. SBE ) 工业微生物重点实验室开放课题(No. KLIB-KF201005) 江苏省高校优势学科建设工程资助项目和 111 引智 (No ) 资助项目.

2 804 化学学报 Vol. 70, 2012 mers, and the results reflected that GSH-MIPs showed low recognition to these analogues. This protocol was further employed for the extraction and separation of GSH from yeast cells samples. The extraction recoveries of GSH-MIP AMs and GSH-MIP MAAs were 41% and 77%, respectively, it was of great potential in the purification of GSH. Keywords molecularly imprinting; glutathione; GSH-MIPs; preparation; adsorption conditions; yeast extracts; adsorption performance 分子印迹技术是结合高分子化学材料化学结构化学生物化学等学科而发展起来的一门交叉学科, 属于超分子化学中主客体化学的范畴 ; 是指为获得在空间上对模板分子具有选择识别位点聚合物的制备技术. 可以形象地描述为分子钥匙人工锁的技术 [1]. 分子印迹聚合物具有天然抗体无法比拟的稳定性低成本易制备可重复使用等优点, 因此已逐渐成为化学生物领域的研究热点, 在生化分离 [2,3] 生物传感器 [4,5] [6,7] [8,9] 模拟酶催化体系和临床药物分析等领域得到了蓬勃的发展. 谷胱甘肽是由谷氨酸半胱氨酸和甘氨酸通过肽键缩合而成的三肽化合物, 是一种用途广泛的活性短肽 ; 是生物体内的主要的抗氧化剂, 在体内参与多种代谢过程, 能够保护生物体内的细胞免受氧化和有毒物质的伤害, 因而在生物学医学保健美容食品等领域引起了人们日益广泛的重视. 目前分离纯化谷胱甘肽的方法主要有离子交换法 [10] 金属螯合亲和层析法 [11] 双水 [12] 相分离等 ; 采用离子交换法纯化谷胱甘肽时, 树脂再生较困难, 需要大量的酸和碱, 并且在纯化过程中, 色素采用多种有机溶剂进行萃取都难以除去, 始终贯穿于整个纯化过程 ; 金属螯合法纯化谷胱甘肽, 可能存在重金属的泄露, 在应用上受到很大的限制 ; 双水相体系可以提取蛋白质, 但提取收率较低, 并且造成严重的环境 [13] 污染. 李琼等首次以谷胱甘肽为模板分子, 丙烯酰胺为功能单体合成制备得到了谷胱甘肽分子印迹聚合物, 并应用于荧光传感器中, 但未对富集纯化谷胱甘肽的吸附条件进行系统的研究 ; 本研究则是以丙烯酰胺甲基丙烯酸为不同的功能单体制备分子印迹聚合物, 并对制备的不同谷胱甘肽分子印迹聚合物对谷胱甘肽的富集纯化条件进行了比较研究 ; 确定了制备谷胱甘肽分子印迹聚合物较理想的功能单体, 以及相应的最适吸附条件. 1 材料与方法 1.1 试剂与仪器谷胱甘肽 (GSH, 生化试剂, Beijing Biodee Biotechnology Co., Ltd); 甲基丙烯酸 (MAA, 国药集团化学试剂有限公司 ); 丙烯酰胺 (AM, 国药集团化学试剂有限公司 ); 乙二醇二甲基丙烯酸酯 (EGDMA, Sigma-Aldrich Chemical Co.); 偶氮二异丁腈 (AIBN, 上海试四赫维化工有限公司, 使用前采用乙醇进行重结晶 ); 二甲亚砜 (DMSO, 国药集团化学试剂有限公司 ). 扫描电子显微镜 ( 型号 Quanta-200, 荷兰 FEI 公司 ); 台式高速离心机 ( 型号 3K-15, SIGMA 公司 ); 傅里叶红外变换光谱仪 ( 型号 FA-0078, Thermo fisher scientific 公司 ). 1.2 聚合物的制备将 1 mmol 的 GSH 溶于 15 ml 的溶剂 DMSO 中, 超声混匀后, 过夜溶解 ; 然后进行分装, 每份 3 ml 溶解液 ( 含有 0.2 mmol 的 GSH). 按照模板分子功能单体 = 1 2; 1 4; 1 5; 1 8; 1 10 的摩尔比例加入相应量的功能单体 AM 和 MAA; 再按照功能单体交联剂 =1 5 的摩尔比加入相应量的交联剂 EGDMA, 以及一定量的引发剂 AIBN, 超声脱气后, 通入氮气, 在氮气状态下密封反应体系 ; 采用热引发的方式进行聚合反应, 在 60 下聚合 24 h. 将得到的聚合物进行粉碎研磨过筛, 氯化钠洗脱除去模板分子 ( 直至洗脱液中检测不到 GSH), 烘干, 得到谷胱甘肽分子印迹聚合物 ; 将采用不同功能单体 AM 和 MAA 制备得到的分子印迹聚合物分别命名为 GSH-MIP AMs 和 GSH-MIP MAAs, 并按照模板分子与功能单体的不同摩尔比 ( 模板分子功能单体 =1 2; 1 4; 1 5; 1 8; 1 10) 分别命名为 GSH-MIP AM1, GSH-MIP AM2, GSH-MIP AM3, GSH-MIP AM4, GSH-MIP AM5, GSH-MIP MAA1, GSH-MIP MAA2, GSH-MIP MAA3, GSH- MIP MAA4, GSH-MIP MAA5. 制备非印迹聚合物 (Non-molecularly Imprinted Polymers, NIPs) 时, 除不加入模板分子谷胱甘肽外, 其他步骤同上 [14,15], 并分别命名为 GSH-NIP AMs 和 GSH- NIP MAAs ( 即 GSH-NIP AM1-5 和 GSH-NIP MAA1-5 ). 1.3 聚合物物化性质的分析采用扫描电子显微镜对制备的聚合物进行形态学的分析 ; 采用傅里叶红外变换光谱仪对聚合物中的官能团进行研究分析, 在傅里叶光谱分析中采用 KBr 方法对样品进行处理.

3 No. 6 辛瑜等 : 不同功能单体合成的谷胱甘肽分子印迹聚合物的研究 GSH-MIPs 对谷胱甘肽的静态吸附试验采用静态吸附试验的方法分析 GSH-MIPs 对 GSH 的吸附特性, 通过测定吸附前后上样液中 GSH 浓度的改变, 来确定聚合物对 GSH 的吸附量 ; 一般来说, 聚合物对模板分子的吸附作用是特异性作用和非特异性作用的共同结果 [16], 进行非印迹聚合物的平行试验, 与分子印迹聚合物进行比较 ; 特异性吸附作用主要是由于分子印迹聚合物中存在模板分子特定的结合位点, 而非特异性吸附则通过测定非印迹聚合物对模板分子的吸附进行计算得到 ; 采用单位吸附量 (Q MIP, Q NIP ) 特异因子 α (Q MIP /Q NIP ) 评价分子印迹聚合物对模板分子的吸附特性. 其中 Q MIP ( 或 Q NIP ) 代表 MIPs( 或者 NIPs) 的单位吸附量, 特异因子 α=q MIP /Q NIP, 表示 MIP 的单位吸附量 /NIP 的单位吸附量, 其数值代表 MIPs 的吸附特异性不同摩尔比例的模板分子 - 功能单体 GSH-MIPs 对 GSH 的吸附 [17] 在大部分文献中模板分子功能单体交联剂的比例为参照这一比例, 设计了功能单体不同用量的单因素实验, 设计不同摩尔比例的模板分子与功能单体 ( 模板分子功能单体 =1 2, 1 4, 1 5, 1 8, 1 10), 制备分子印迹聚合物与非印迹聚合物. 采用制备的不同的 GSH-MIPs 及相应的 GSH-NIPs 进行实验, 研究不同的聚合物对 GSH 的静态吸附, 以确定模板分子与功能单体的最适摩尔比例. 称取 100 mg 的聚合物放入 15 ml 的离心管中, 将各聚合物粉末润湿后 ( 若采用样液润湿聚合物粉末, 会导致聚合物吸附量的不准确 ), 分别加入 5 ml 的浓度为 1.00 g/l 的谷胱甘肽上样液, 置于离心管架上, 振荡吸附一定时间, 进行离心 (2900 g, 10 min), 采用紫外可见分光光度计法分析测定上清液中 GSH 的含量, 进而计算不同摩尔比的聚合物对 GSH 的单位吸附量上样液 ph 值的分析配制浓度为 1.00 g/l 的 GSH 溶液 7 份, 采用盐酸或氢氧化钠调节上样液 ph 值约为 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 7.0, 9.0, 准确称取 100 mg 的聚合物放入 15 ml 的离心管中, 将各聚合物粉末润湿后, 分别加入 5 ml 上述 ph 值梯度的 GSH 上样液, 分别做三组平行实验 ; 在离心管架中振荡吸附一定时间后, 进行离心 (2900 g, 10 min), 采用紫外可见分光光度计分析测定平衡吸附液中 GSH 的游离浓度, 计算在不同 ph 值上样液条件下聚合物对 GSH 的吸附量, 从而可以计算出聚合物在不同 ph 值下对 GSH 的单位吸附量分子印迹聚合物吸附平衡时间的分析准确称取 100 mg 的聚合物置于 15 ml 的离心管中, 将各聚合物粉末润湿后, 分别加入 5 ml 的浓度为 1.00 g/l 的 GSH 上样液, 在离心管架中进行振荡吸附, 每两小时测定一次吸附液中 GSH 的游离浓度, 计算不同时间下聚合物对 GSH 的吸附, 进而计算不同时间下聚合物对 GSH 的单位吸附量上样液浓度的分析及分子印迹聚合物的 Scatchard 分析配制 0.01, 0.03, 0.05, 0.10, 0.50, 1.00, 1.50, 2.00, 3.00 g/l 不同浓度的 GSH 溶液, 各取 5 ml 的浓度梯度的 GSH 上样液, 分别加入到 100 mg 的聚合物中进行静态吸附试验 ( 同时做 GSH-NIPs 平行试验, 各聚合物粉末已润湿 ), 在离心管架中振荡吸附一定时间, 进行离心 (2900 g, 10 min), 测定平衡吸附液中 GSH 的游离浓度, 计算聚合物对谷胱甘肽的吸附量, 得到在不同浓度上样液条件下聚合物对 GSH 的单位吸附量 ; 另外, 根据 Scatchard 模型, 计算得到聚合物对模板分子的理论最大单位吸附量 Q max 以及解离常数 K d 分子印迹聚合物的特异选择性分析分别配制 1.00 g/l 的氧化型谷胱甘肽 GSSG 谷氨酸 Glu 甘氨酸 Gly 半胱氨酸 Cys 和还原型谷胱甘肽 GSH 溶液. 称取 5 份聚合物粉末 100 mg, 分别置于 15 ml 的离心管中, 先将各聚合物粉末润湿后, 加入 5.0 ml 的上述配制的各溶液, 然后将各离心管置于离心管架中进行振荡吸附一定时间后, 进行离心 (2900 g, 10 min), 采用茚三酮法测定各上清液中各物质的含量, 根据各物质的初始含量和各上清液中的含量, 计算聚合物对各物质的吸附量分子印迹聚合物再生性能的评价 GSH-MIPs 对 GSH 具有吸附特异性, 为了扩大谷胱甘肽分子印迹聚合物的应用, 对分子印迹聚合物的重复利用进行了研究. 在 GSH-MIPs 吸附 GSH 后, 将吸附的模板分子 GSH 洗脱下来, 再一次得到 GSH-MIPs, 如此反复, 具体操作为 : 准确称取 100 mg 再生后的分子印迹聚合物置于 15 ml 的离心管中, 将各聚合物粉末润湿后, 加入 5 ml 的浓度为 1.00 g/l 的 GSH 上样液, 振荡吸附一定时间后, 测定再生分子印迹聚合物对谷胱甘肽的吸附量, 判定再生分子印迹聚合物对 GSH 的吸附性能分子印迹聚合物对酵母抽提液中谷胱甘肽的富集按照上述探讨的最适吸附条件进行实验, 取 100 mg 的聚合物, 置于 15 ml 的离心管中, 将各聚合物粉末润湿后, 加入酵母抽提液 5 ml, 充分混匀后, 进行振荡吸附, 达到吸附平衡后进行离心 (2900 g, 10 min), 采用紫外可见分光光度计分析测定上清液中 GSH 的含量, 得到分子印迹聚合物对酵母抽提液中 GSH 的吸附结果.

806 2 Vol. 70, 2012 化学学报结果与讨论 2.1 谷胱甘肽分子印迹聚合物的制备 2.1.1 聚合物形态学结构的分析模板分子的结合. 非印迹聚合物的表面结构比较光滑[18,19]. 2.1.2 聚合物的傅里叶红外变换光谱研究傅里叶红外变换光谱一般分析的是原子之间振动的作用表现, 是一种成熟的定性定量分析技术, 可以提在聚合物的合成过程中, 得到聚合物的三维网状结供有关制备聚合物的内部结构的大量信息.

4 806 2 Vol. 70, 2012 化学学报结果与讨论 2.1 谷胱甘肽分子印迹聚合物的制备聚合物形态学结构的分析模板分子的结合. 非印迹聚合物的表面结构比较光滑[18,19] 聚合物的傅里叶红外变换光谱研究傅里叶红外变换光谱一般分析的是原子之间振动的作用表现, 是一种成熟的定性定量分析技术, 可以提在聚合物的合成过程中, 得到聚合物的三维网状结供有关制备聚合物的内部结构的大量信息. 在傅里叶红构识别结合位点会影响聚合物最后的性能, 扫描电子外变换光谱中有大量的吸收峰, 吸收峰的数目和强度与显微镜可以清楚地反映和记录这些微观特征, 是观察和分析物中存在的官能团有关. 将制备的分子印迹聚合物分析样品微观结构的一种方便易行的有效方法. 采用与非印迹聚合物进行比较(GSH-MIPAM3 和 GSH-NIPAM3 电子扫描显微镜对制备得到的聚合物的形态学进行观 GSH-MIPMAA2 与 GSH-NIPMAA2 进行比较)如图 2 所示, 印察分析. 本体聚合方法制备得到的混合物经过研磨过迹聚合物与非印迹聚合物没有较大的区别, 可能是由于筛洗脱烘干等步骤, 得到粉末状聚合物颗粒, 以 AM 在制备过程中模板分子 GSH 的含量较少的缘故(小于和 MAA 为功能单体制备的聚合物的物理状态分别如 3%). 红外图谱显示出以不同功能单体制备的聚合物的图 1 所示. 红外光谱图存在不同的吸收峰; 对于以丙烯酰胺为功能扫描电子显微镜图谱显示了分子印迹聚合物与非单体制备的聚合物的红外光谱图的分析, 丙烯酰胺中的印迹聚合物都为不规则形状聚合物存在, 主要与聚合物酰胺基未参与聚合物共价键的形成, 红外图谱 2A 中存的制备方法和研磨步骤有关; 同时, 显微镜图谱也显示在有酰胺基的特征吸收峰, 如 NH 的特征吸收峰(3300 了分子印迹聚合物与非印迹聚合物之间也存在较大的 cm 1), C N 的特征吸收峰(1420 cm 1). 以甲基丙烯酸不同, 由图 A 与图 C 可知, 由于模板分子的加入, 分子为功能单体制备的聚合物的红外光谱图 2B 中存在有羧印迹聚合物显示出更为疏松和粗糙的表面, 存在一些空基中 C O 的特征吸收峰(1732 cm 1)和 OH 的特征吸收穴结构, 初步认为是模板分子的特定空间结合位点; 另峰(3443 cm 1). 外, 虽采用本体聚合的方法制备聚合物, 也会有部分的模板分子结合位点位于聚合物表面, 以有利于聚合物与图 1 以丙烯酰胺甲基丙烯酸为功能单体制备的谷胱甘肽分子印迹聚合物的扫描电子显微镜图 Figure 1 The scanning electron micrographs of the selected polymers prepared with AM and MAA

5 No. 6 辛瑜等不同功能单体合成的谷胱甘肽分子印迹聚合物的研究 Figure 图 2 聚合物傅里叶红外光谱图的比较 Comparison of FITR maps of GSH-MIPs and GSH-NIPs 制备分子印迹聚合物最适摩尔比(模板分子-功能单体)的确定的结构上进行分析, 谷胱甘肽分子中含有羧基, 氨基和模板分子与功能单体摩尔比对聚合物的性能有很这些官能团与甲基丙烯酸之间存在较强的作用力, 可以大的影响, 当功能单体的用量较低时, 聚合物则无法形通过氢键与甲基丙烯酸中的羧基形成稳定的复合物, 产成完整的识别空穴, 无法实现功能单体与模板分子的多生较好的识别位点. 酰胺基, 根据不同结构的官能团形成氢键的能力推测, 位点结合; 当功能单体用量较高时, 功能单体过剩, 则会导致分子印迹聚合物的非特异性吸附增强, 破坏聚合物的印迹效果; 因此, 模板分子与功能单体的最适摩尔比, 可以提高分子印迹聚合物的选择性, 尤其是可以增强对结构类似物的区分能力[20]. 本实验以谷胱甘肽为模板分子, 分别以丙烯酰胺和甲基丙烯酸为功能单体, 通过优化模板分子与功能单体的配比, 筛选模板分子与功能单体的最适摩尔比. 设计了模板分子与功能单体不同的摩尔比, 分别为 GSH AM(MAA) 1 2; 1 4; 1 5; 1 8; 1 10 制备聚合物, 测定不同聚合物对谷胱甘肽吸附的单位吸附量, 如图 3 所示, 在以 AM 为功能单体制备聚合物时, 模板分子与功能单体摩尔比为 1 5 时制备的分子印迹聚合物对 GSH 的单位吸附量达到最大为 μmol/g, 特异因子也达到最大为以 MAA 图 3 为功能单体制备聚合物时, 模板分子与功能单体的最适性能 Figure 3 The effect of molar ratio of GSH to AM on the adsorption 摩尔比为 1 4, 聚合物的单位吸附量为 μmol/g, 特异因子为实验结果表明, 采用不同的功能单体制备分子印迹聚合物, 都存在其合成分子印迹聚合物的最适摩尔比 ; 另外, 采用功能单体 MAA 制备的 GSH-MIPs 显示较好的吸附特性. 从模板分子谷胱甘肽模板分子与功能单体不同摩尔比制备的聚合物的吸附 MIP1-GSH AM(MAA) 1 2; MIP2-GSH AM(MAA) 1 4; MIP3-GSH AM(MAA) 1 5; MIP4-GSH AM(MAA) 1 8; MIP5-GSH AM(MAA) 1 10

6 808 化学学报 Vol. 70, 聚合物静态吸附试验上样条件对分子印迹聚合物吸附性能的影响及 Scatchard 分析模板分子谷胱甘肽为两性电解质, 在不同的 ph 值下带有不同的电荷 ; 不同的 ph 值将会影响聚合物对 GSH 的吸附, 采用不同 ph 值的上样液进行实验, 以上样液的 ph 值为横坐标, 单位吸附量为纵坐标, 结果如图 4A 所示 : 在一定的上样液 ph 值范围内, 分子印迹聚合物的单位吸附量随着上样液 ph 值的增大而增加, 一旦超过该 ph 值范围, 分子印迹聚合物的单位吸附量则降低 ; 因此, 根据上样液 ph 值曲线, 以 AM 为功能单体制备的聚合物作为吸附介质时, 其上样液的最适 ph 值为 3.00 左右 ; 最大单位吸附量为 μmol/g. 以 MAA 为功能单体制备的聚合物对 GSH 进行吸附时, 其所需的上样液的最适 ph 值为 5.0, 相应的单位吸附量为 μmol/g. 两种功能单体制备的聚合物对 GSH 上样液的最适 ph 值存在一定的差异, 可能是由于两者功能单体本身酸碱性的不同, 而导致制备的聚合物的酸碱性也存在差异 ; 在合成聚合物时, 甲基丙烯酸中的羧基未参与共价键的合成, 制备的聚合物显示较强的酸性 ; 丙烯酰胺中的酰胺基同样未参与共价键的形成, 制备的聚合物偏向于中性 ; 因此吸附体系存在不同的酸碱性, 存在不同的最适上样液 ph 值. 采用本体聚合法制备聚合物, 模板分子的空间结合位点多位于聚合物网状结构的内部, 模板分子进入结合位点则需要一定的时间. 吸附时, 谷胱甘肽分子进入分子印迹聚合物则需要一定的时间, 若时间太短, 则不能吸附足够的谷胱甘肽分子 ; 若吸附时间太长则会降低吸附效率甚至有部分谷胱甘肽分子解吸游离 [21] ; 因此通过吸附不同时间的单位吸附量曲线来确定吸附谷胱甘肽的吸附平衡时间. 如图 4B 所示, 以 AM 为功能单体制备的聚合物的吸附平衡时间为 20 h, 以 MAA 为功能单体制备的聚合物作为吸附介质时, 在振荡吸附 18 h 后, 反应体系的单位吸附量趋于平衡. 两种功能单体制备的聚合物对谷胱甘肽的吸附平衡时间不同, 可能是由于两者形成的聚合物的内部网状结构存在差异, 而导致谷胱甘肽进入相应的识别结合位点的时间而不同. 在适当的上样液浓度范围内, 分子印迹聚合物的单位吸附量随着浓度的增大而增加, 而非印迹聚合物的单位吸附量趋于平衡 ; 但两者的单位吸附量之差随着上样液浓度的增加而增大, 说明分子印迹聚合物与非印迹聚合物的空间结构存在明显的差异, 这主要是由于分子印迹聚合物中存在模板分子的空间结合位点, 对模板分子具有记忆功能 ; GSH-MIPs 对 GSH 的这种记忆功能使得 GSH 可以与分子印迹聚合物中的互补空穴结合 ; 但上样液浓度继续增大, 使得 GSH 的分子数目增图 4 (A) 上样液 ph 值对聚合物吸附性能的影响, (B) 分子印迹聚合物吸附平衡时间, (C) 不同浓度上样液对聚合物吸附性能的影响 Figure 4 (A) The adsorption curve of GSH-MIPs for different ph of loading buffer, (B) the adsorption equilibrium time curve of GSH-MIPs, (C) the effect of GSH concentration of loading solution on the adsorption of polymers

7 No. 6 辛瑜等 : 不同功能单体合成的谷胱甘肽分子印迹聚合物的研究 809 加, 进入结合位点的竞争力增大, 分子之间的碰撞几率增加, 反而会使得分子印迹聚合物的单位吸附量不再增加 ; 因此通过测定不同上样液浓度的单位吸附量用于确定最适的上样液浓度. 由图 4C 可知, 以 AM 为功能单体制备的分子印迹聚合物的上样浓度在 1.50~2.00 g/l 时, GSH-MIP AM3 的单位吸附量趋于平衡, 不再随着上样浓度的增加而增加. 以 MAA 为功能单体制备 GSH-MIP MAA2, 在上样浓度为 1.00~1.50 g/l 时, 其单位吸附量趋于平衡. 在分子识别分析中, 常采用 Scatchard 模型对分子印迹聚合物的结合特性进行分析 [22~24]. Scatchard 方程可以写为 : Qmax[ C*] Q= (a) K + [ C *] d 经变换可以写为 : Q Q Qmax =- + (b) [ C*] K K d d 其中 K d 表示结合位点的平衡解离常数, Q max 表示结合位点的理论最大单位吸附量, [C*] 表示模板分子在上清液中的平衡浓度, 根据聚合物的单位吸附量和上清液中模板分子的平衡浓度可以绘制吸附等温曲线, 同时 Q/[C*] 对 Q 作图呈一良好的直线, 其斜率和截距分别为 -1/K d 和 Q max /K d, 表明在一定的浓度范围内, 分子印迹聚合物中存在一类等价的结合位点 ; 若 Q/[C*] 对 Q 明显呈非线性关系, 则表明分子印迹聚合物对模板分子的结合位点不是等价的, 但在曲线的两端分别有较好的直线关系, 即分子印迹聚合物对模板分子具有两种不同的结合位点, 这是因为模板分子中存在多种可以与功能单体作用的官能团. 根据斜率和截距可以求得解离常数 K d 和理论最大单位吸附量 Q max. 根据静态吸附实验数据, 绘制 Scatchard 曲线 ( 图 5), 从图中可以看出, Scatchard 曲线呈现良好的线性关系, 说明分子印迹聚合物对模板分子的结合位点是等价的, 对于专一性选择吸附而言, Scatchard 曲线的相关系数 R 越大, 表示专一性吸附越强 [25,26]. 根据图 5B1 中直线的斜率和截距, 得到以 AM 为功能单体制备的分子印迹聚合物的结合位点的最大单位吸附量 Q max 为 μmol/g, 平衡解离常数 K d 为 μmol/l; 并且 Scatchard 曲线的相关系数为 0.993, 说明分子印迹聚合物的结合位点的专一性很好. 由图 5B2 所示, 以 MAA 为功能单体制备的分子印迹聚合物对模板分子的识别位点的最大单位吸附量 Q max 为 μmol/g, 平衡解离常数 K d 为 μmol/l, 以及相应的相关系数为聚合物对模板分子的特异性吸附分析进一步研究分子印迹聚合物对模板分子的吸附特异性, 我们采用静态吸附试验对谷胱甘肽及其结构类似物进行检测, GSH-MIPs 对模板分子 GSH 具有较好的特异性. 谷氨酸甘氨酸和半胱氨酸都是 GSH 的组成部分, 在结构组成上, GSH 与三者有着相似的官能团结构, 但 GSH-MIPs 却只对 GSH 显示出更强的亲和力 ; 由图 6 可知, GSH-MIPs 与 GSH-NIPs 对谷氨酸 (Glu) 甘氨酸图 5 (A) GSH-MIPs 的吸附等温曲线, (B) GSH-MIPs 的 Scatchard 曲线 Figure 5 (A) Equilibrium adsorption of GSH-MIPs for GSH in a batch system. (B) Scatchard plot of GSH-MIPs

8 810 化学学报 Vol. 70, 2012 图 6 GSH-MIPs 对 GSH 及其结构类似物的特异性吸附的比较 Figure 6 The comparison of specificity adsorption of GSH-MIPs for GSH and analogues (Gly) 半胱氨酸(Cys) 和氧化型谷胱甘肽 (GSSG) 的吸附量基本相等, 但对模板分子 GSH 的吸附存在较大的差别, 这主要是由于在 GSH-MIPs 中不存在 GSH 类似物的特定结合位点, 而使得 GSH 结构类似物不能同 GSH 一样和特定的空间结合位点形成较强的作用力 ; 因此, GSH-MIPs 可以根据结构上的差别和特定的结合位点, 对模板分子 GSH 进行特异性地吸附. 另外, 分子印迹聚合物对半胱氨酸的吸附量稍高于对谷氨酸甘氨酸和氧化型谷胱甘肽的吸附, 可以解释为在半胱氨酸中含有与模板分子相同的官能团, 而谷氨酸甘氨酸和氧化型谷胱甘肽只有部分的官能团相同 ; 但分子印迹聚合物对半胱氨酸的吸附量又低于对谷胱甘肽的吸附量, 可能主要是由于半胱氨酸与谷胱甘肽在空间结构中存在差异分子印迹聚合物再生性能的评价分子印迹聚合物具有耐酸耐碱抵抗恶劣环境可重复利用等优点 ; 因此对分子印迹聚合物的再生性能进行研究, 更能体现分子印迹聚合物的应用价值. 分子印迹聚合物对模板分子的吸附率可以看做是 GSH-MIPs 重复利用的一个重要指标, 在 GSH-MIPs 反复利用后, 结果如图 7 所示. 由图 7 可知, GSH-MIPs 在重复利用 5 次后, 对模板分子 GSH 仍有较高的吸附性, 模板分子的吸附率仍高达 70% 以上, GSH-MIPs 重复利用性较好, 表现出较好的再生性能分子印迹聚合物对酵母中谷胱甘肽的分离提取谷胱甘肽分子印迹聚合物对谷胱甘肽具有特异的选择性, 同时具有较高的稳定性 ; 可以实现谷胱甘肽在样品 ( 如酵母抽提液 ) 中的分离提取, 可视为吸附性能较好的吸附剂 ; 并且关于谷胱甘肽分子印迹聚合物用于提取酵母抽提液中的谷胱甘肽还未见报道. 根据上述探讨图 7 GSH-MIPs 对 GSH 的吸附率与 GSH-MIPs 重复利用次数的关系 Figure 7 The relative of adsorption rate of GSH-MIPs on GSH to the cycling times of GSH-MIPs 的 GSH-MIPs 对 GSH 吸附的最适条件, 对酵母抽提液中 GSH 的初步提取, 结果如图 8 所示. 图 8 GSH-MIPs 对酵母抽提液中 GSH 的吸附 Figure 8 The adsorption of GSH in yeast cell samples 由图 8 可知, 在混合体系中, GSH-MIPs 对 GSH 也具有较好的吸附选择性, GSH-MIPs 对 GSH 的单位吸附量明显高于 GSH-NIPs 的单位吸附量 ; GSH-MIP AM3 和 GSH-MIP MAA2 对酵母抽提液中 GSH 的一次性提取率可以分别达到 41% 和 77%. 3 结论以谷胱甘肽为模板分子, 分别以丙烯酰胺和甲基丙烯酸为功能单体制备了一系列的分子印迹聚合物, 通过静态吸附实验考察了这些分子印迹聚合物对谷胱甘肽的吸附性能以及部分的最适上样条件 ; 同时也研究了 GSH-MIPs 对谷胱甘肽结构类似物吸附性能 GSH-MIPs 再生性能, 以及对酵母抽提物中的 GSH 的分离纯化, 表明 GSH-MIPs 可以特异性地吸附 GSH, 并且以甲基丙烯

9 No. 6 辛瑜等 : 不同功能单体合成的谷胱甘肽分子印迹聚合物的研究 811 酸为功能单体制备的分子印迹聚合物对 GSH 的印迹效果较好. 本研究开创的方法可为分离提纯混合体系中 GSH 提供一条新路径. References 1 Mullett, W. M.; Lai, E. P. Anal. Chem. 1998, 70, Takateru, M.; Takayuki, H. Anal. Chim. Acta 2007, 591, Del Sole, R.; Scardino, A.; Lazzoi, M. R.; Vasapollo, G. J. Appl. Polym. Sci. 2011, 120, Matsui, J.; Nicholls, I. A.; Karube, I. J. Org. Chem. 1996, 61, Gholivand, M. B.; Torkashvand, M. Talanta 2011, 84, Nicholls, I. A.; Ramstrom, O.; Mosbach, K. J. Chromatogr. A 1995, 691, Keçili, R.; Özcan, A. A.; Ersöz, A.; Hür, D.; Denizli, A.; Say, R. J. Nanopart. Res. 2011, 13, Levi, R.; McNiven, S.; Piletsky, S.; Cheong, S.; Yano, K.; Karube, I. Anal. Chem. 1997, 69, Djozan, D.; Farajzadeh, M.; Sorouraddin, S.; Baheri, T. Chromatographia 2011, 73, Kataoka, K.; Senoo, Y.; Tawabata, T.; Yoshimura, Y.; Soda, K. JP 06/056884, 1994 [Chem. Abstr. 1994, 121, 33295]. 11 Porath, J.; Carlsson, J.; Olsson, I.; Belfrage, G. Nature 1975, 258, Lin, D. Q.; Mei, L. H.; Zhu, Z. Q. 98 The Fourth National Solvent Extraction Academic Meeting, Guangzhou, 1998, p. 255 (in Chinese). ( 林东强, 梅乐和, 朱自强, 98 全国第四届溶剂萃取学术会议, 广州, 1998, p. 255.) 13 Li, Q.; Du, Y. L.; He, K. K.; Li, F. Chem. J. Chin. Univ. 2007, 28, 1059 (in Chinese). ( 李琼, 杜艳丽, 杨科珂, 李方, 高等学校化学学报, 2007, 28, 1059.) 14 Strikovsky, A. G.; Kasper, D.; Grun, M. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, Tse Sum Bui, B.; Haupt, K. Anal. Bioanal. Chem. 2010, 398, Rechichi, A.; Cristallini, C.; Vitale, U.; Ciardelli, G.; Barbani, N.; Vozzi, G.; Giusti, P. J. Cell. Mol. Med. 2007, 11, Komiyama, T. Molecular Imprinting From Fundamentals to Application, Trans.: Wu, S.-K.; Wang, P.-F., Science Press, Beijing, 2006, pp. 8~11 (in Chinese). ( 小宫山真, 分子印迹学从基础到应用, 吴世康, 汪鹏飞译, 科学出版社, 北京, 2006, pp. 8~11.) 18 Liu, J. Q.; Wulff, G. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, Gómez-Pineda, L. A.; Pina-Luis, G. E.; Cuán, Á.; Garcí a-calzón, J. A. React. Funct. Polym. 2011, 71, Lu, C. Y.; He, H. C.; Ma, X. X.; Zhang, J.; He, X. W. Acta Chim. Sinica 2004, 62, 799 (in Chinese). ( 卢春阳, 何海成, 马向霞, 张佳, 何锡文, 化学学报, 2004, 62, 799.) 21 Shi, X. Z.; Wu, A. B.; Qu, G. R.; Li, R. X.; Zhang, D. B. Biomaterials 2007, 28, Zheng, N.; Li, Y. Z.; Wang, Z. M.; Chang, W. B.; Li, T. J. Acta Chim. Sinica 2001, 59, 1572 (in Chinese). ( 郑宁, 李元宗, 王宗睦, 常文保, 李铁津, 化学学报, 2001, 59, 1572.) 23 Cirillo, G.; Curcio, M.; Parisi, O. I.; Puoci, F.; Iemma, F.; Spizzirri, U. G.; Restuccia, D.; Picci, N. Food Chem. 2011, 125, Sun, B. W.; Wu, L. Q.; Li, Y. Z. Acta Chim. Sinica 2004, 62, 598 (in Chinese). ( 孙宝维, 武利庆, 李元宗, 化学学报, 2004, 62, 598.) 25 Xin, Y.; Dong, D.-X.; Wang, T.; Li, R.-X. J. Chromatogr. B 2007, 859, Buszewski, B.; Ričanyová, J.; Gadzata-Kopciuch, R.; Szumski, M. Anal. Bioanal. Chem. 2010, 397, (A Lu, Y.)

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