2015医学版第五期彩

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1 第 41 卷第 5 期 2015 年 10 月 Journal of Lanzhou University(Medical Sciences) Vol.41 No.5 Oct 文章编号 : (2015) 肝细胞癌中 Kruppel 样因子 4 与叉头框蛋白 M1 基因表达相关性及临床意义田川 1, 叶庆旺 2, 姚姗姗 1, 高勇 1, 杨宁 2 1,3, 李琦 1. 同济大学附属东方医院肿瘤科, 上海第二军医大学附属东方肝胆医院肝外科, 上海上海交通大学附属第一人民医院肿瘤中心, 上海摘要 : 目的探讨人肝细胞癌中核转录因子 Kruppel 样因子 4 (KLF4) 与叉头框蛋白 M1 (FOXM1) 基因表达相关性, 以及两种转录因子表达对肝细胞癌生长和增殖的影响方法采用实时荧光定量 PCR 技术检测 50 例肝细胞癌患者肝癌组织及 8 株肝癌细胞中 KLF4mRNA 和 FOXM1 mrna 表达水平并分析其相关性 ;KLF4 过表达质粒和 KLF4 sirna 分别转染人肝癌细胞 Hep3B 和 BEL-7402, 采用实时荧光定量 PCR 蛋白印迹实验检测 KLF4 mrna FOXM1mRNA 及 KLF4 蛋白 FOXM1 蛋白表达水平 ; 通过 CCK8 实验检测 KLF4 和 FOXM1 基因对细胞增殖的影响结果肝癌组织和细胞中 KLF4 低表达, 而 FOXM1 高表达, 两者呈负相关 (r = ,P = 0.001);KLF4 基因过表达抑制肝癌细胞增殖, 而 FOXM1 基因过表达促进肝癌细胞增殖,FOXM1 基因过表达能恢复 KLF4 对肝癌细胞抑制增殖作用结论在肝细胞癌中,KLF4 和 FOXM1 基因表达呈负相关, 两者不同的表达水平可影响肝癌细胞的增殖关键词 : 肝细胞癌 ;Kruppel 样因子 4; 叉头框蛋白 M1; 增殖中图分类号 :R735.7 文献标识码 :A doi: /j.issn Study on correlation between KLF4 and FOXM1 and its clinical significance in hepatic cellular cancer Tian Chuan 1, Ye Qing-wang 2, Yao Shan-shan 1, Gao Yong 1, Yang Ning 2, Li Qi 1,3 1. Department of Oncology, Shanghai East Hospital of Tongji University School of Medicine, Shanghai , China 2. Department of Liver Surgery, Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital of Second Military Medical University, Shanghai , China 3. Department of Oncology, Shanghai First People's Hospital Affiliated Shanghai Jiaotong University, Shanghai , China Abstract:Objective To investigate the correlation between nuclear transcription Kruppel- like factor 4 (KLF4)and forkhead box protein M1(FOXM1)in human hepatocellular carcinoma and their effect on cell growth and proliferation. Methods KLF4 and FOXM1 mrna expression were detected by Real- time PCR in 50 cases specimens of hepatocellular carcinoma patients and 8 liver cancer cell lines, and the correlation between KLF4 and FOXM1 were analyzed. After BEL-7402 and Hep3B cell lines were transfected by KLF4 收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( , ); 上海市浦东新区卫生系统重点学科群建设项目 (PWZxq ); 上海市浦东新区卫生系统领先人才培养计划项目 (PWRL ) 作者简介 : 田川 (1987-), 男, 贵州沿河人, 硕士研究生, 研究方向为恶性肿瘤侵袭与转移机制, @qq.com; 李琦 (1974-), 男, 上海人, 副主任医师, 博士, 研究方向为恶性肿瘤侵袭与转移机制, leeqi2001@hotmail.com, 通信联系人 ; 杨宁 (1971-), 男, 上海人, 副主任医师, 博士, 研究方向为肝脏外科治疗研究, lancet00@163.com, 共同通信联系人

2 2 第 41 卷 overexpression plasmid and KLF4 sirna, KLF4 and FOXM1 expression was checked by Real- time PCR and Western blot. The effect of KLF4 and FOXM1 gene on cell proliferation was tested by CCK8 assay. Results Expression of KLF4 was decreased in primary HCC specimens and liver cancer cell lines, while expression of FOXM1 was increased, FOXM1 was negatively correlated with KLF4 (r =-0.462, P = 0.001). KLF4 overexpression can inhibit the proliferation of liver cancer cells,foxm1 overexpression can promote cells proliferation and restore the effect of KLF4 on proliferation of liver cancer cells. Conclusion The expressions of KLF4 and FOXM1 were negatively correlated in hepatocellular carcinoma, their expression levels can affect the proliferation of hepatocelluar carcinoma cells. Key words: hepatocelluar carcinoma; Kruppel-like factor 4; forkhead box protein M1; proliferation 原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一, 病死率高, 预后极差, 据 WHO 统计,2014 年列恶性肿瘤死亡率第 2 位, 约 50% 以上的肝癌病例发生在中国 [1-2] 肝细胞癌是最常见的原发性肝癌病理类型, 占原发性肝癌 75%~80% [3], 其发生发展的研究越来越受到人们的关注核转录因子 Kruppel 样因子 4 (Kruppel-like factor 4,KLF4) 是一种在消化道肿瘤中广泛表达 [4] [5] 的锌指转录因子 Li 等研究发现,KLF4 在肝细胞癌中是一种抑癌基因,KLF4 高表达可抑制细胞的增殖叉头框蛋白 M1 (forkhead box protein M1,FOXM1) 是叉头框基因家族中 50 多个转录 [6] [7] [8] 因子之一, 在乳腺癌胃癌小细胞肺癌等多种肿瘤组织中高表达, 是一种致癌因子, 参与细胞增殖生长血管生成转移及浸润等多个生物学过程, 是肿瘤治疗的潜在靶点 [9] 本研究通过检测 KLF4 和 FOXM1 基因在肝癌组织和肝癌细胞中的表达情况, 研究两者的相关性及对肝癌细胞增殖的影响, 探索 KLF4 和 FOXM1 基因在肝细胞癌发生发展中的作用以及两者之间的调控机制 1 材料和方法 1.1 组织标本收集 2015 年 1 月年 7 月期间手术切除的肝细胞癌组织标本 50 例, 所有组织标本的收集入库均得到病人或其授权委托人的同意并签订知情同意书, 经医院伦理委员会审核通过样本在 -80 C 冻存以同期手术切除的 2 例正常肝组织标本作为阴性对照 (vector 组 ), 所有标本均经病理学检查确诊患者临床资料见表细胞和主要试剂 Hep3B HepG2 Sk- hep- 1 BEL 表 1 50 例肝细胞癌患者的临床资料临床病理参数 n/ 例构成比 /% 性别男女年龄 / 岁 < 肿瘤直径 /cm > 病理分型肝细胞癌其他肝癌类型有无脉管癌栓有无分级 Ⅰ-Ⅱ 7 14 Ⅲ-Ⅳ 分化程度低未中高 7 14 有无乙肝有无 6 12 Huh7 人肝癌细胞株购于中国科学院上海细胞库, HCC-LM3 WRL68 和 LO2 肝癌细胞株和 KLF4 表达质粒由同济大学附属东方医院转化医学中心李砚东课题组惠赠 ;KLF4 sirna 由上海吉码生物技术有限公司合成, 其序列 5'-AUCGUUGAACUC- CUCGGUCUCUCUC-3';DMEM 培养基 ( 南京凯基生物公司 ), 胎牛血清 ( 美国 Gibco 公司 ), 转染试剂脂质体 2000 ( 美国 Invitrogen 公司 ),FOXM1 KLF4 和甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 (glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase,gapdh) 抗体 ( 美国 Santa Cruz 公司 ) Ⅰ

3 第 5 期田川, 等 : 肝细胞癌中 Kruppel 样因子 4 与叉头框蛋白 M1 基因表达相关性及临床意义细胞培养及传代 8 株细胞株用含 10% 胎牛血清和 1% 双抗的 DMEM 培养基于 37 C 5% CO 2 培养箱中培养, 细胞生长至 80%~90% 时, 用胰蛋白酶消化液进行消化, 常规传代培养, 实验时选取对数期生长的细胞 1.4 KLF4mRNA 和 FOXM1 mrna 表达水平检测细胞转染选取 Hep3B 和 BEL 细胞, 按脂质体 2000 试剂说明书进行转染实验分两组, 一组转染 vector/klf4 质粒 ; 另一组转染 nc/siklf4 细胞转染后继续培养 24 h 和 48 h 实时荧光定量 PCR 实验参照 Promega 公司说明书, 分别提取肝癌组织及细胞正常肝组织转染后细胞的总 RNA 进行实时荧光定量 PCR 引物由 Primer 5.0 软件设计并经局部相似性基本查询工具确认,KLF4 FOXM1 和 GAPDH 的上下游引物见表 2 实时荧光定量 PCR 扩增条件 :95 C 30 s 预变性,95 C 15 s,60 C 30 s, 共 40 个循环进行 PCR 反应, 最后 95 C 15 s,60 C 1 min,95 C 15 s 一个循环结束反应每次实验均重复 3 次, 每次均做空白对照 ( 以双蒸水代替 cdna 模板 ) 结果以 GAPDH 作为内参, 以相应的正常组织或对照组作为对照, 用 ΔΔCT 值法进行定量表 2 RT-PCR 所用的引物序列基因名称上游引物下游引物产物大小 /bp GAPDH 5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3' 5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3' 238 KLF4 5'-CCCAATTACCCATCCTTCCT-3' 5'-CGTCCCAGTCACAGTGGTAA-3' 1462 FOXM1 5'-ACGTCCCCAAGCCAGGCTC-3' 5'-CTACTGTAGCTCAGGAATAA-3' 检测 KLF4 mrna FOXM1mRNA 及 KLF4 蛋白 FOXM1 蛋白表达水平蛋白印迹实验检测 KLF4mRNA FOXM1 mrna 及 KLF4 FOXM1 蛋白表达水平分别提取未处理和处理后细胞的总蛋白样本, 蛋白定量后确定每个样品的上样量, 用聚丙烯酰胺凝胶电泳通过湿法转印将蛋白转移到硝化纤维膜上, 接着用脱脂奶粉封闭 1~3 h 用特异性的 KLF4 抗体和 FOXM1 抗体稀释后 4 C 孵育过夜, 磷酸盐缓冲液漂洗 3 次, 共 30 min, 然后用稀释的二抗孵育 2 h, 磷酸盐吐温缓冲液漂洗 3 次, 共 30 min GAPDH 作为参比蛋白同时检测织作为对照, 见图 1 由于 LO2 细胞来源于胎肝永生化细胞, KLF4 mrna 表达水平高于 FOXM1mRNA;KLF4 mrna 在肝细胞癌中表达水平低于正常肝脏组织 ; 而 FOXM1 mrna 在肝细胞癌中表达水平高于正常肝脏组织 1.6 统计学分析实验数据采用 SPSS 20.0 统计软件, 计数资料相关性采用 Pearson 相关分析,P < 0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 肝细胞癌中 KLF4mRNA 和 FOXM1 mrna 表达水平在 8 株人肝癌细胞中检测 KLF4mRNA 和 FOXM1 mrna 表达水平, 以 2 例人正常肝脏组图 1 肝癌细胞中 KLF4 mrna 和 FOXM1 mrna 表达水平 2.2 肝癌组织中 KLF4 与 FOXM1 的关系通过 Pearson 相关分析,KLF4 与 FOXM1 在肝癌组织中的表达呈负相关 (r = ,P = 0.001), 见图 KLF4 mrna 和 FOXM1 mrna 的表达转染 KLF4 过表达质粒与 KLF4 sirna 后, 利用实时荧光定量 PCR 法检测 Hep3B 和 BEL-7402

4 第 41 卷人肝癌细胞株中 KLF4 mrna 和 FOXM1 mrna 的表达结果显示转染 KLF4 过表达质粒与 KLF4 sirna 的 Hep3B 和 BEL-7402 肝癌细胞中 FOXM1 mrna 表达水平呈负相关, 见图 3 2.

4 4 第 41 卷人肝癌细胞株中 KLF4 mrna 和 FOXM1 mrna 的表达结果显示转染 KLF4 过表达质粒与 KLF4 sirna 的 Hep3B 和 BEL-7402 肝癌细胞中 FOXM1 mrna 表达水平呈负相关, 见图 KLF4 和 FOXM1 蛋白的表达图 2 50 例肝癌组织中 KLF4 与 FOXM1 表达水平的相关性分析将 KLF4 过表达质粒分别转染 Hep3B 和 BEL 细胞, 利用蛋白印迹实验检测肝癌细胞 Hep3B 和 BEL-7402 中 FOXM1 蛋白表达变化, 结果显示转染 KLF4 的 Hep3B 和 BEL-7402 细胞中 FOXM1 表达量降低, 而 KLF4 表达量升高, 见图 4 图 3 肝癌细胞 Hep3B 和 BEL-7402 中 KLF4 与 FOXM1 mrna 的表达 3 讨论图 4 过表达 KLF4 抑制肝癌细胞中 FOXM1 蛋白表达 2.5 KLF4 和 FOXM1 基因对肝癌细胞增殖能力的影响 KLF4 低表达抑制肝癌细胞增殖, 而 FOXM1 高表达促进肝癌细胞增殖, 且 FOXM1 高表达能恢复 KLF4 对肝癌细胞抑制增殖作用为了明确 KLF4 和 FOXM1 对肝癌细胞生长和增殖的影响, 应用 CCK8 法检测细胞增殖的情况, 发现 Hep3B BEL-7402 细胞转染 KLF4 后细胞增殖受到抑制 ; 转染 FOXM1 则促进增殖, 两者共转时肝癌细胞的增殖能力接近正常, 提示 FOXM1 过表达能恢复 KLF4 对肝癌细胞抑制增殖作用, 见图 5 ( 光密度值取 450 nm 处 ) KLF4 是一种主要在消化道表达的核转录因子, 通过调节下游靶基因的转录表达, 在细胞的周期调控细胞的增生分化中担任重要的角色, 与肿瘤发生发展有着密切的联系研究发现, KLF4 是一个双重功能转录因子, 针对不同的靶基因, 通过不同的作用机制发挥激活或抑制转录作用 [10-11] 有证据表明 KLF4 在肠道上皮中是一种 [5] 肿瘤抑制基因 Li 等研究中发现在肝细胞癌中 KLF4 呈低表达, 并存在 KLF4 DNA 甲基化, 提示 KLF4 在肝细胞癌中可能是一种抑癌基因 KLF4 通过调节一些与细胞周期调控及分化相关基因的表达在细胞的增殖调控中发挥重要作用 [12] KLF4 对多种促进转录的调节基因以及蛋白质和胆固醇的生物合成相关基因具有抑制作用, 这与其抗增殖的作用一致 [13] KLF4 是 G1/S 期和 G2/M 期检验点所需的重要因子 [14],DNA 损伤时,KLF4 对 p21 Cipl/Waf1 的诱导激活依赖于 p53, 是由于 KLF4 基因的启动子区含有 p53 的结合元件 ;DNA 损伤

5 第 5 期田川, 等 : 肝细胞癌中 Kruppel 样因子 4 与叉头框蛋白 M1 基因表达相关性及临床意义 5 a,b: 与 vector 组比较,P < 0.05 c,d: 与 vector 组比较,P < 0.05 图 5 KLF4 和 FOXM1 基因对肝癌细胞增殖能力的影响后,p53 表达的上调导致 KLF4 表达增加, 从而使 p21 Cipl/Waf1 的表达上调因此,KLF4 能够激活细胞周期检验点进而阻止异常细胞周期的继续, 对调 [15] 控细胞增殖具有重要作用 FOXM1 主要通过对有丝分裂的调控来刺激细胞的增殖, 在胚胎发育组织再生过程中起重要作用, 是调控细胞增殖抑制细胞凋亡的重要转录因子, 常高表达于包括肝细胞癌在内的多种恶 [16] 性肿瘤中, 参与肿瘤的发生发展过程研究表明,FOXMl 转录因子可通过影响细胞周期不同阶段而促进细胞增殖, 如可通过对其下游细胞 S 期激酶相关蛋白 2 [17] 周期素依赖性激酶 2 [18] 和周期素依赖性激酶 4 [19] 等靶基因的调节, 促进细胞周期 G1 期向 S 期 G2 期向 M 期过渡和诱导有丝分裂由此提示,FOXMl 基因可能通过参与细胞增殖调节在肝癌的发生发展过程中发挥重要作用本研究采用实时荧光定量 PCR 技术检测了 50 例肝细胞癌患者肝癌组织及 8 株肝癌细胞中 KLF4 和 FOXM1 的表达水平, 并分析两者之间的相关性结果发现, 在肝细胞癌患者肝癌组织和肝癌细胞中,KLF4mRNA FOXM1 mrna 及 KLF4 蛋白 FOXM1 蛋白表达水平呈负相关 : 在 Hep3B 和 BEL-7402 肝癌细胞中, 通过上调 KLF4 基因的表达,FOXM1 mrna 和蛋白水平降低 ; 相反, 下调 KLF4 表达,FOXM1 mrna 水平升高,KLF4 的表达可能影响 FOXM1 在肝癌细胞中的表达水平本研究从 mrna 和蛋白水平证实了 KLF4 与 FOXM1 的关系, 从细胞水平上验证了存在其相关性 ; KLF4 与 FOXM1 在肝癌的发生发展中可能起重要作用, 两者存在一定的关联性, 通过影响肝癌细胞的增殖在肝细胞癌的发生发展中起重要作用两者之间具体的调控机制尚不明确, 仍需进一步研究参考文献 [1] Loomba R, Yang H I, Su J, et al. Synergism between obesity and alcohol in increasing the risk of hepatocellular carcinoma: a prospective cohort study[j]. Am J Epidemiol, 2013, 177(4): [2] World Health Organization (2014). Liver cancer estimated Incidence, mortality and prevalence worldwide in 2012 [EB/OL]. aspx. [3] Perz J F, Armstrong G L, Farrington LA, et al. The contributions of hepatitis B virus and hepatitis C virus infections to cirrhosis and primary liver cancer worldwide[j]. J Hepatol, 2006, 45(4): [4] Krstic M, Stojnev S, Jovanovic L, et al. KLF4 expression and apoptosis- related markers in gastric cancer[j]. J BUON, 2013, 18(3): [5] Li Q, Gao Y, Jia Z, et al. Dysregulated Kruppel-like factor 4 and vitamin D receptor signaling contribute to progression of hepatocellular carcinoma[j]. Gastroenterology, 2012, 143(3): [6] Karunarathna U, Kongsema M, Zona S, et al. OTUB1 inhibits the ubiquitination and degradation of FOXM1 in breast cancer and epirubicin resistance[j]. Oncogene, 2015, Jul 6. [Epub ahead of print] [7] Song J G, Xie H H, Li N, et al. SUMO-specific protease 6 promotes gastric cancer cell growth via de- SUMOylation of FoxM1[J]. Tumour Biol, 2015, Jul 12. [Epub ahead of print] [8] Zhang J, Cui X, et al. FoxM1: a novel tumor biomarker of lung cancer[j]. Int J Clin Exp Med, 2015, 8(3):

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864 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 6 期 2016 年 6 月 of apoptosis related factors, decrease the incidence of adverse reactions, which is of great

864 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 6 期 2016 年 6 月 of apoptosis related factors, decrease the incidence of adverse reactions, which is of great 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 6 期 2016 年 6 月 863 曲妥珠单抗联合多西紫杉醇治疗 Her-2 阳性乳腺癌的临床研究 * 周永安, 刘训碧黄石市中心医院 ( 普爱院区 ) 乳腺肿瘤外科, 湖北黄石 435000 摘要 : 目的探析注射用曲