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1 2017 年 3 月第 50 卷第 3 期 Tobacco Science & Technology Mar Vol. 50 No. 3 烟籽油对高胆固醇血症大鼠胆固醇代谢的影响 侯小东 1, 梁惠 2, 张忠锋 1 *1, 张怀宝, 毛新新 1, 傅泳 2, 付秋娟 1 1, 杜咏梅 1. 中国农业科学院烟草研究所, 山东省青岛市崂山区科苑经四路 青岛大学公共卫生学院, 山东省青岛市市北区登州路 38 号 摘要 : 为研究烟籽油对大鼠血清胆固醇水平及肝脏中胆固醇代谢相关调控基因表达的影响, 以高胆固醇 饲料喂养的大鼠为动物模型, 随机分为对照组 ( 空白对照 模型对照 鱼油对照 ) 和实验组 ( 低 中 高剂量 烟籽油 ), 测定血清 TC TG HDL-C 和 LDL-C 水平 ;RT-PCR 检测肝脏中胆固醇代谢相关调控基因表达 ; 肝组织切片染色, 观察大鼠肝细胞脂肪变性 结果表明 :1 烟籽油能有效降低高胆固醇血症大鼠血清 TC 和 LDL-C 水平, 降低动脉硬化指数, 改善肝细胞脂肪变性 ;2 烟籽油可使高胆固醇血症大鼠肝脏中 HMGCR 基因下调表达,LDLR 基因上调表达 因此, 烟籽油具有明显的降低胆固醇作用, 其机制可能是 调控了肝脏中胆固醇代谢相关基因的表达 关键词 : 烟籽油 ; 高胆固醇血症 ; 胆固醇 ; 代谢 中图分类号 :R151.4;TS49 文献标志码 :A 文章编号 : (2017) Effects of tobacco seed oil on metabolism of cholesterol in rats with hypercholesterolemia HOU Xiaodong 1,LIANG Hui 2,ZHANG Zhongfeng 1,ZHANG Huaibao *1,MAO Xinxin 1,FU Yong 2, FU Qiujuan 1,DU Yongmei 1 1. Institute of Tobacco Research of CAAS,Qingdao ,Shandong,China 2. School of Public Health,Qingdao University,Qingdao ,Shandong,China Abstract: In order to investigate the effects of tobacco seed oil on serum cholesterol level and expressions of regulatory genes related to cholesterol metabolism in livers of rats,the levels of total cholesterol (TC), triacylglycerol (TG),high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) and low density lipoprotein cholesterol (LDL-C)in serum were determined by using rats fed with a high level cholesterol diet as animal models. The rats were randomly divided into control groups (blank control group,model control group,fish oil control group) and experimental groups (three groups fed with tobacco seed oil at low,middle and high doses, separately). The expressions of regulatory genes related to cholesterol metabolism in livers of rats were measured with real-time PCR method. Liver tissues were sliced and stained to observe the steatosis of hepatic cells of rats. The results showed that:1)tobacco seed oil effectively reduced the levels of TC and LDL-C in serum and atherogenic index of rats,improved hepatic steatosis. 2) Tobacco seed oil down-regulated the expression of HMGCR gene and up-regulated the expression of LDLR gene in livers of rats with hypercholesterolemia. Therefore,tobacco seed oil has a significant effect of lowering total cholesterol,the mechanism might be actioned by regulating the expressions of genes related to cholesterol metabolism in livers. Keywords: Tobacco seed oil;hypercholesterolemia;cholesterol;metabolism 收稿日期 : 修回日期 : 基金项目 : 中国农业科学院科技创新工程 (ASTIP-TRIC05) 作者简介 : 侯小东 (1981 ), 硕士, 助理研究员, 主要从事植物化学物功能研究 houxiaodong@caas.cn; * 通讯作者 : 张怀宝, zhanghuaibao@caas.cn 引文格式 : 侯小东, 梁惠, 张忠锋, 等. 烟籽油对高胆固醇血症大鼠胆固醇代谢的影响 [J].,2017,50(3): (HOU Xiaodong,LIANG Hui,ZHANG Zhongfeng,et al. Effects of tobacco seed oil on metabolism of cholesterol in rats with hypercholesterolemia[j]. Tobacco Science & Technology,2017,50(3):47-51.) DOI: /j. issn

2 年 植物油是从植物的果实 种子 胚芽中得到的 油脂, 含有多种不饱和脂肪酸 植物油中含有的 油酸是一种最常见的单不饱和脂肪酸, 研究发现 用油酸代替膳食中的饱和脂肪酸可以降低血浆胆 固醇水平 [1] 植物油中含有的亚油酸和 α- 亚麻酸 是人体必需的多不饱和脂肪酸, 研究发现, 其可以 降低胆固醇水平, 减少胆固醇在血管壁的沉积, 防 治动脉粥样硬化和脑卒中 [2] 烟籽油是从烟草种 子中榨取的植物油, 烟草种子营养丰富, 种子中油 脂的质量分数大约为 40%, 其中大部分为不饱和脂 [3] [4] 肪酸 Riemenschneider 等报道, 烟籽油中不饱 和脂肪酸的质量分数 >90%, 其中油酸的质量分 [5] 数为 15%, 亚油酸为 75% 侯小东等报道, 烟籽 油中总不饱和脂肪酸的质量分数为 89.38%, 油酸 亚油酸和亚麻酸的质量分数分别为 12.42% 75.36% 和 0.75%; 与葡萄籽油中此 3 种不饱和脂肪酸的质 量分数极其相似 [6] 因此, 推测富含不饱和脂肪 酸的烟籽油应该具有一定的降胆固醇的功能 随着人民生活水平的提高, 高血脂的发生率 呈明显上升趋势 [7-8] 大量研究表明, 膳食结构的 改变与动脉粥样硬化的发生 发展有着非常密切 的关系 [9] 调查显示, 中国居民膳食结构不合理, 畜肉类及油脂消耗过多, 动物性食物超量 [10-11], 膳 食中摄入饱和脂肪酸和胆固醇过多是引起高胆固 醇血症和动脉粥样硬化的重要因素 [12], 而调整膳 食结构, 减少膳食中胆固醇及饱和脂肪酸的摄入, 增加摄入单不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸, 可 以有效降低血清胆固醇水平 [13] 动物试验证明, 给大鼠喂养含 60% 亚油酸的饲料后, 大鼠肝脏中 参与脂肪酸合成的酶活性明显下降 [14], 而富含亚 油酸的葡萄籽油可以降低血清及肝组织中胆固醇 的质量分数 [15] 目前, 有关烟籽油的报道多集中在生物柴油 研发方面 [16-18], 而有关植物油生理功能方面的研 究尚未涉及 因此, 在本研究中通过动物试验的 方法探讨烟籽油对大鼠胆固醇代谢的影响, 旨在 为烟籽油的应用研究提供参考 1 材料与方法 1.1 材料 试剂和仪器 烟籽油 ( 参照文献 [8] 制备 ) SPF 级 SD 雄性 大鼠, 体质量 180~200 g[ 山东鲁抗动物中心, 合格 证号 :SCXK( 鲁 ) ] 自制高胆固醇饲料 [78.8% 基础饲料 ( 山东鲁 抗医药集团有限公司 ) 10.0% 蛋黄粉 ( 安徽亳州市 红日蛋制品有限责任公司 ) 10.0% 猪油 ( 驻马店市 顶升食品有限公司 ) 1.0% 胆固醇和 0.2% 胆酸钠 ( 北京华迈科生物技术有限公司 )]; 总胆固醇 (TC) 甘油三酯 (TG) 高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C) 低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C) 和 HE 染色液试剂盒 ( 南京建成生物工程研究所 ) BSA124S-CW 电子天平 ( 感量 g, 德国 Sartorius 公司 );DHG-2240A 电烘箱 ( 杭州蓝天化 验仪器厂 ); 全自动生化分析仪 ( 日本日 立高新技术公司 );RM 2255 切片机 ( 德国 Leica 公 司 );OLYMPUS IX71 倒置显微镜 [ 奥林巴斯 ( 中 国 ) 有限公司 ];TP800 型实时荧光定量 PCR 仪 TP600 型梯度 PCR 仪 ( 日本 TaKaRa 公司 ); NanoDrop-2000 微量分光光度计 [ 赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司 ] 1.2 方法 实验对象及分组 将实验大鼠适应性喂养 5 d 后, 按体质量随机 分为 6 组, 分别为基础对照组 高胆固醇模型组 鱼油组, 以及低剂量 中剂量 高剂量烟籽油组, 每 组 12 只, 每日以灌胃方式给予大鼠受试物, 实验 期间不限制饮食 饮水, 每周定时称量体质量 基 础对照组喂养基础饲料, 每日按照 2 g/kg 的剂量 标准灌生理盐水 ; 高胆固醇模型组喂养高胆固醇 饲料 ; 鱼油组喂养高胆固醇饲料, 并且每日按照 2 g/kg 的剂量标准灌胃鱼油 ; 低 中 高剂量烟籽油 组喂养高胆固醇饲料, 并且每日分别按照 2 4 和 6 g/kg 的标准灌胃烟籽油, 连续灌胃 6 w, 实验期 间不限制饮食 饮水 在第 6 周灌胃结束后, 于末 次禁食但不禁水 12 h 后, 用 7% 水合氯醛按 0.5 ml/100 g 的剂量腹腔注射麻醉, 测量体长并称量 体质量, 按照公式 (1) 计算 Lee s 指数 3 Lee s 指数 =( BW /BL) (1) 式中 :BW 为体质量,g;BL 为体长,cm 脂体比测定 将大鼠体内肾周围 生殖器周围脂肪以及肠 系膜脂肪全部取出, 按照公式 (2) 计算脂体比 脂体比 =FW/BW (2) 式中 :FW 为脂肪质量,g,BW 为体质量,g 血脂水平测定 取 4 ml 大鼠腹主动脉血至非抗凝管中, 以 r/min 离心 10 min, 取血清 采用全自动生化 分析仪检测血清胆固醇 (TC) 甘油三酯 (TG) 高 密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C) 和低密度脂蛋白胆固 醇 (LDL-C) 水平 按照公式 (3) 计算动脉粥样硬 化指数 (AI) AI=(TC-HDL-C)/HDL-C (3)

3 第 50 卷第 3 期 侯小东, 等 : 烟籽油对高胆固醇血症大鼠胆固醇代谢的影响 大鼠肝脏胆固醇代谢相关基因 HMGCR LDLR 和 CYP7A1 的表达 Trizol 法提取肝中的 mrna, 反转录得 cdna, -80 保存 应用 SYBR Green I 荧光染料嵌合法 对各样品的管家基因 GAPDH 和目的基因进行荧光定量 (PCR) 实验, 所用引物见表 1 通过管家基因的校正, 对各样品中目的基因的相对表达量进行分析 Tab.1 表 1 GAPDH HMGCR LDLR 和 CYP7A1 的引物序列 Primer sequences of GAPDH,HMGCR,LDLR and CYP7A1 基因 GAPDH HMGCR LDLR CYP7A1 正向引物 (5' 3') GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG TGGCAGGACGCAACCTCTAC GTGACAGTGTCCTCCCAAG AACCTGTGTGTGAGGGACCAG 反向引物 (5' 3') ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA AATAGTTACCACTGACCGCCAGAA GCTGACCATCTGTCTCGAG TTGCTTGAGATGCCCAGAGA 肝组织病理切片制备取血后, 将大鼠断头处死, 取完整肝脏称量后, 切取肝右叶中线处厚度约 2 mm, 固定在甲醛溶液中, 常规石蜡包埋, 制备肝脏组织病理切片后 HE( 苏木精 - 伊红染色法,Hematoxylin-eosin staining) 染色, 于倒置显微镜下观察各组大鼠肝脏细胞脂肪变性情况 统计学分析用 SPSS17.0 统计学软件对实验数据进行处理, 采用单因素方差分析, 所有实验数据均以 (X± S) 表示, 以 p<0.05 为有统计学意义 2 结果与分析 2.1 烟籽油对高胆固醇血症大鼠体质量 肝质量 脂体比和 Lee s 指数的影响由表 2 可知, 与空白对照组相比, 高胆固醇模型组 鱼油组, 以及高 中 低剂量烟籽油组肝质量 脂体比均显著升高, 差异有统计学意义 (p< 0.05); 与高胆固醇模型组相比, 鱼油组以及高 中 低剂量烟籽油组肝质量 脂体比均有所下降, 但差异无统计学意义 (p>0.05) 各组间大鼠体质量及 Lee s 指数没有差异 (p>0.05) Tab.2 表 2 实验大鼠的脂体比和 Lee s 指数 Fat weight/body weight ratios and Lee s indexes of experimental rats 组别 体质量 /g 肝质量 /g 脂体比 /% Lee s 指数 空白对照 ± ± ± ±0.03 高胆固醇模型组 ± ±3.91a ±1.13a ±0.18 鱼油组 ± ±2.91a 6.50±2.30a ±0.10 低剂量烟籽油组 ± ±3.46a 6.86±1.59a ±0.15 中剂量烟籽油组 ± ±3.31a 6.67±1.28a ±0.14 高剂量烟籽油组 ± ±3.50a 5.10±1.21a ±0.07 注 :1a 表示与空白对照组相比,p< 烟籽油对高胆固醇血症大鼠血脂的影响由表 3 可知, 与空白对照组相比, 高胆固醇模型组大鼠血清中 TG HDL-C 水平未见显著差异 (p>0.05), 而 TC LDL-C 水平及 AI 值明显升高 (p< 0.05), 说明高胆固醇模型造模成功 低 中 高烟籽油剂量组大鼠血清 TC LDL-C 水平明显低于高胆固醇模型组 (p<0.05), 而与空白对照组和鱼油组相比没有显著差别 (p>0.05);3 个烟籽油组大鼠血清 TG HDL-C 水平与空白对照 高胆固醇模型和鱼油组大鼠相比没有差别 (p>0.05) 3 个烟籽油组的 AI 值明显低于高胆固醇模型组 (p<0.05), 且 低于空白对照组 (p<0.05), 而与鱼油对照组相当 3 个烟籽油组间各项指标没有差异 2.3 烟籽油对高胆固醇血症大鼠肝脏胆固醇代谢相关基因表达的影响如表 4 所示, 鱼油组及低 中 高剂量烟籽油组大鼠肝脏 HMGCR 基因的表达显著低于空白对照组及高胆固醇模型组 (p<0.05); 鱼油组及低 中 高剂量烟籽油组大鼠肝脏 LDLR 基因的表达显著高于高胆固醇模型组 (p<0.05), 而与空白对照组相比没有差别 (p>0.05); 各组大鼠肝脏 CYP7A1 基因的表达没有差别 (p>0.05)

4 年 表 3 实验大鼠的血脂水平 Tab.3 Blood lipid levels of experimental rats 组别空白对照组高胆固醇模型组鱼油组低剂量组中剂量组高剂量组 TC/(mmol L -1 ) 1.36± ±0.84a ±0.25b ±0.31b 1.45±0.39b 1.45±0.45b TG/(mmol L -1 ) 0.59± ± ± ± ± ±0.20 HDL-C/(mmol L -1 ) 0.46± ± ± ± ± ±0.09 LDL-C/(mmol L -1 ) 0.13± ±0.14a 0.20±0.08b 0.22±0.09b 0.19±0.08b 0.19±0.06b AI 1.06± ±0.67a 0.47±0.14ab 0.52±0.15ab 0.43±0.14ab 0.41±0.13ab 注 :1a 表示与空白对照组相比,p<0.05;2b 表示与高胆固醇模型组相比,p<0.05 下同 表 4 实验大鼠肝脏胆固醇代谢相关基因的表达 清晰, 肝小叶结构完整, 无空胞样变 胞质溶解 核 Tab.4 Expressions of genes related to cholesterol 浓缩 核破裂等现象, 形态正常 ; 高胆固醇模型组 metabolism in livers of experimental rats 大鼠的肝脏呈弥散性脂肪变性, 细胞内及细胞间 组别空白对照组高胆固醇模型组鱼油组 HMGCR 基因 1.00± ± ±0.06ab LDLR 基因 1.00± ± ±0.19b CYP7A1 基因 1.00± ± ±0.25 隙可见大量的脂滴空泡, 胞浆内充满大小不等的脂肪滴, 细胞排列紊乱, 细胞核偏离中心, 胞质疏松或消失, 进一步证实了大鼠高胆固醇血症模型造模成功 与高胆固醇模型组相比, 鱼油组大鼠 低剂量组 0.48±0.07ab 1.15±0.17b 1.25±0.10 的肝细胞脂肪空泡大量减少, 核溶解现象明显减中剂量组 0.57±0.16ab 1.19±0.17b 1.20±0.29 少 烟籽油组与鱼油组相比, 肝脏组织形态并无高剂量组 0.62±0.08ab 1.14±0.18b 1.19±0.16 显著差别 ; 与高胆固醇模型组相比, 肝结构相对完 2.4 肝脏组织病理学变化实验大鼠的肝脏组织病理切片如图 1 所示 整, 脂变细胞数量 脂肪空泡 炎性浸润及核溶解均有一定的减少 3 个剂量烟籽油组间没有明显 可知, 空白对照组大鼠的肝细胞排列整齐, 细胞核 差别 a. 空白对照组 b. 高胆固醇模型组 c. 鱼油组 d. 低剂量烟籽油组 e. 中剂量烟籽油组 f. 高剂量烟籽油组图 1 实验大鼠肝脏病理切片 Fig.1 Liver pathological sections of experimental rats 3 结论与讨论本研究中发现, 高胆固醇饮食对大鼠的肝质量 脂体比影响较大, 模型对照组 鱼油组, 以及低 中 高剂量烟籽油组脂体比均超过空白对照组, 但烟籽油低 中 高 3 个剂量组可显著降低高 胆固醇血症大鼠血清 TC 和 LDL-C 水平, 作用效果与鱼油对照组 (2 g/kg) 相当, 说明烟籽油可有效地改善高胆固醇血症大鼠的血清胆固醇水平 通过研究胆固醇代谢相关基因发现, 烟籽油可明显降低大鼠肝脏 HMGCR 基因的表达, 增加 LDL 基因的表达, 而对 CYP7A1 基因的表达影响不显著

5 第 50 卷第 3 期 侯小东, 等 : 烟籽油对高胆固醇血症大鼠胆固醇代谢的影响 51 HMGCR 是胆固醇合成的限速酶基因,HMGCR 活性 [19] 增高会加快肝脏合成胆固醇的速度 LDLR 是一种细胞表面膜受体, 其作用是结合 LDL 或其他载脂蛋白, 将其携带的胆固醇酯内吞入细胞, 从而 [20] 调节胆固醇的体内平衡 CYP7A1 是胆固醇转化为胆汁酸途径的关键酶, 胆固醇在肝脏内受该酶催化生成 7α- 羟基胆固醇, 后经一系列反应转化 [21] 为胆汁酸 因此烟籽油调控机体胆固醇的机制可能是通过降低胆固醇内源合成 增强血液中胆固醇向肝细胞的转运来实现的, 但肝细胞摄取胆固醇后的代谢转化途径尚不清楚, 需要进一步深入研究 参考文献 [1] Rassias G,Kestin M,Nestel P J. Linoleic acid lowers LDL cholesterol without a proportionate displacement of saturated fatty acid[j]. European Journal of Clinical Nutrition,1991,45(6): [2] 姚健, 侯天德, 程昉, 等. 野山杏杏仁油影响大鼠血脂生物学效应的研究 [J]. 中兽医医药杂志,2009,28 (2): YAO Jian,HOU Tiande,CHENG Fang,et al. Study on blood lipid-depressing activities of almond oil in rats [J]. Journal of Traditional Chinese Veterinary Medicine,2009,28(2): [3] Rao P U. Nutrient composition of some less-familiar oil seeds[j]. Food Chemistry,1994,50(4): [4] Riemenschneider R W,Speck R M,Beinhart E G. Analysis and fatty acid composition of tobacco seed oils [J]. Journal of Oil & Fat Industries,1945,22(5): [5] 侯小东, 张怀宝, 张忠锋, 等. 烟籽油成分分析及体内抗氧化作用研究 [J]. 中国烟草科学,2016,37(4): HOU Xiaodong, ZHANG Huaibao, ZHANG Zhongfeng,et al. Analysis of tobacco seed oil and its antioxidant activities in vivo[j]. Chinese Tobacco Science,2016,37(4): [6] Sabir A,Unver A,Kara Z. The fatty acid and tocopherol constituents of the seed oil extracted from 21 grape varieties (Vitis spp.)[j]. Journal of the Science of Food and Agriculture,2012,92(9): [7] 王红彦, 王培昌. 北京地区健康人群血脂水平调查 [J]. 河北医药,2013,35(19): [8] 方志峰, 唐振柱, 陈兴乐, 等. 广西城乡居民血脂水平调查分析 [J]. 广西预防医学,2006,12(2): [9] Duval C,Augé N,Frisach M F,et al. Mitochondrial oxidative stress is modulated by oleic acid via an epidermal growth factor receptor-dependent activation of glutathione peroxidase[j]. Biochemical Journal, 2002,367(3): [10] 司国爱, 欧松, 郑希明, 等. 膳食结构对居民健康的影响调查 [J]. 广西预防医学,2006,12(3): [11] 张雷, 周晶, 罗明. 沈阳市居民膳食结构和营养状况的调查 [J]. 中国自然医学杂志,2009,11(1): [12] 尹岭, 张笑明, 李莉, 等. 茶油对兔血脂及动脉粥样硬化的影响 [J]. 食品科学,2011,32(7): YIN Ling,ZHANG Xiaoming,LI Li,et al. Effect of tea-seed oil on serum lipid level and atherosclerosis formation in rabbits[j]. Food Science,2011,32(7): [13] Oliver M F. It is more important to increase the intake of unsaturated fats than to decrease the intake of saturated fats:evidence from clinical trials relating to ischemic heart disease[j]. The American Journal of Clinical Nutrition,1997,66(S4):980S-986S. [14] James W P,Dauncey M J,Davies H L. Elevated metabolic rates in obesity[j]. The Lancet,1978,2:472. [15] 佟慧, 倪国成, 姚玲凤, 等. 山葡萄籽油降血脂的实验研究 [J]. 吉林中医药,1992(1): [16] Usta N. Use of tobacco oil methyl ester in turbocharged indirect injection diesel engine[j]. Biomass Bioenergy, 2005,28(1): [17] Giannelos P N,Zannikos F,Stournas S,et al. Tobacco seed oil as an alternative diesel fuel:physical and chemical properties[j]. Industrial Crops & Products, 2002,16(1):1-9. [18] Veljković V B,Lakićević S H,Stamenković O S,et al. Biodiesel production from tobacco (Nicotiana tabacum L.)seed oil with a high content of free fatty acids[j]. Fuel,2006,85(17/18): [19] 朱美林, 贾连群, 杨关林, 等. 脾虚状态对高胆固醇血症大鼠肝脏胆固醇代谢的影响及机制研究 [J]. 中华中医药杂志,2015,30(8): ZHU Meilin,JIA Lianqun,YANG Guanlin,et al. Study on the effects of spleen deficiency state on liver cholesterol metabolism in rat with hyperlipidemia and its mechanism[j]. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy,2015,30(8): [20] 胡箭, 李元. 低密度脂蛋白受体研究进展 [J]. 国外医学 ( 药学分册 ),2000,27(6): [21] 张文青, 张月明, 朱虎虎. 抗性淀粉对大鼠肝脏胆固醇代谢相关基因表达的影响 [J]. 营养学报,2007,29 (5): ZHANG Wenqing,ZHANG Yueming,ZHU Huhu. Study on effect of resistant starch on expression of genes associated with cholesterol metabolism in rat liver [J]. Acta Nutrimenta Sinica,2007,29(5): 责任编辑茹呈杰

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