上海中医药杂志 年第 卷第 期 HJ TCM N V N C含量低密度脂蛋白胆固 行操作检测 TC TG HDL 材料与方法 C含量根据 F dw d公式计算 LDL C TC 醇 LDL 材料 动物 D雄性大鼠 只PF级周龄体 HDL C TG ± 购自上海西普尔 必凯实验动物有限 质量 实 时

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1 上海中医药杂志 2016 年第 50 卷第 11 期 SH.J.TCMNov.,2016;Vol.50No DOI: /j 冠心康对高脂血症大鼠肝脏胆固醇稳态分子表达的动态影响 章怡 1, 刘萍 2, 张娜 2 2, 徐华英 1. 上海中医药大学附属龙华医院重症监护室 ( 上海 );2. 上海中医药大学附属龙华医院内科 ( 上海 ) 摘要 目的观察冠心康对高脂血症大鼠肝脏胆固醇稳态分子表达的动态影响 方法 96 只大鼠随机取 24 只作, 给予普通饲料 ; 另 72 只给予高胆固醇饮食, 并随机分为 3 组 : 模型组,, 于第 周处死大鼠, 采用生化法检测血脂水平, 实时荧光定量 PCR 及 Westernbloting 方法检测低密度脂蛋白受体 (Ldlr) 1 型清道夫受体 (Srb1) 羟甲基戊二酰辅酶 A 还原酶 (Hmgcr) 固醇调节元件结合蛋白 2(Srebp2) 基因及蛋白水平 结果与模型组比较, 冠心康治疗 4 周 8 周 12 周后血清胆固醇及低密度脂蛋白有下降趋势, 但差异无统计学意义 (P>0.05) 与模型组比较, 冠心康可显著上调高脂血症大鼠肝脏 Ldlr 基因及蛋白表达水平 (P<0.05); 并于治疗 4~8 周和 8~12 周后, 显著上调高脂血症大鼠肝脏 Srebp2 基因及蛋白表达水平 (P<0.05), 且随着时间延长表达逐渐上升 结论冠心康可动态调节高脂血症大鼠肝脏 Ldlr 基因及蛋白表达从而调节血脂水平, 且可能通过调节 Srebp2 基因及蛋白水平, 调节胆固醇稳态, 调节血脂水平 关键词 胆固醇稳态 ; 高脂血症 ; 冠心康 ;Srebp2;Ldlr DynamicefectsofGuanxinkangonthemoleculeexpresionofhepaticcholesterolhomeostasisin hyperlipidemiarats ZHANGYi yi 1,LIUPing 2,ZHANGNa 2,XUHua ying 2 1.IntensiveCareUnit,LonghuaHospitalAfiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai, ;2.DepartmentofInternalMedicine,LonghuaHospitalAfiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChinese Medicine,Shanghai, Abstract:Objective ToobservethedynamicefectsofGuanxinkangonthemoleculeexpresionofhepaticcholesterolhomeostasisinhyperlipidemiarats. Methods 96SDratswererandomlydivided,amongwhich24ratsweresetasthenormalcontrolgroupandtreatedwithnormaldiet,72ratsweretreatedwithhigh cholesteroldiettoinducehyperlipidemiaandthenrandomlydividedintothemodelgroup,simvastatingroup,guanxinkanggroup.ratsweresacrificedat4th,8th and12thweek.thelevelsofbloodlipidweredetectedbybiochemistry,thegeneandproteinexpresionlevelsoflow densitylipoproteinreceptor(ldlr),scavenger receptorclasbtype1(srb1),hmg CoAReductase(Hmgcr)andsterolregulatoryelement bindingprotein2(srebp2)weredeterminedbyreal timefluorescence quantitativepcrandwestern blot.results Comparedwiththemodelgroup,theserumlevelsofcholesterolandlowdensitylipoproteinweredecreasedafterthe treatmentwithguanxinkangfor4weeks,8weeksand12weeks,butthediferencewasnotstatisticalysignificant(p>0.05).comparedwiththemodelgroup, Guanxinkangsignificantlyup regulatedthegeneandproteinexpresionlevelofldlrintheliverofhyperlipidemiarat(p<0.05),andsignificantlyup regulatedthe geneandproteinexpresionlevelofsrebp2intheliverofhyperlipidemiarataftertreatmentfor4 8weeksand8 12weeks(P<0.05),withatime dependent manner.conclusion GuanxinkangcandynamicalyregulatethegeneandproteinexpresionofLdlrintheliverofhyperlipidemiaratstocontrolthebloodlipid level,andmayregulatethecholesterolhomeostasisbyadjustingthegeneandproteinlevelofsrebp2. Keywords:cholesterolhomeostasis;hyperlipidemia;Guanxinkang;Srebp2;Ldlr 高胆固醇血症是引起心血管疾病与代谢类疾病的独立风险因子, 尽早积极主动地调节高胆固醇血症具有重要的医学意义 研究表明, 胆固醇合成 吸收增 [ 基金项目 ] 国家自然科学青年基金资助项目 ( ); 上海市科委实验动物研究资助项目 ( ) [ 作者简介 ] 章怡, 女, 博士, 副主任医师, 主要从事中西医结合心血管疾病的诊治研究 加, 或是排泄 分解 利用减少, 均可导致胆固醇稳态的破坏, 从而使血胆固醇水平升高 [1] 我们课题组以往的研究表明, 冠心康具有调节血脂 抗动脉粥样硬化的作用 [2 4], 但尚未从整体观角度动态观察冠心康调节肝脏胆固醇代谢稳态的作用 基于此, 本研究从肝脏胆固醇稳态相关基因信号通路环节, 研究冠心康对高胆固醇血症状态下的肝脏胆固醇代谢的动态影响, 探讨冠心康可能作用靶点

2 上海中医药杂志 年第 卷第 期 HJ TCM N V N C含量低密度脂蛋白胆固 行操作检测 TC TG HDL 材料与方法 C含量根据 F dw d公式计算 LDL C TC 醇 LDL 材料 动物 D雄性大鼠 只PF级周龄体 HDL C TG ± 购自上海西普尔 必凯实验动物有限 质量 实 时 荧 光 定 量 PCR 检 测 Ld Hm 公司动物生产许可证号码 CXK 沪 基 因 表 达 药物与试剂 在 线 软 件 合 成 见 表 委 托 L f 中药复方冠心康 生黄芪 上 下 游 引 物 序 列 采 用 P m 薤白 制半夏 益母草 丹参 全瓜蒌 z 试剂盒 T h n 公司上海合成部完成 按照 T 购自上海中医药大学附属龙华医院中药房 辛伐 说明书抽提肝脏总 RNA 逆转录反应体系 μ 反应 他汀 m 片批号 杭州默沙东制药有 n PCR扩增反应 条件为 m 限公司 μ 反 应 程 序 为 体系为 血清总胆固醇 TC 三酰甘油 TG 高密度脂蛋 基因相对表达量分析方法 采用 研究所 T z 美国 L f T h n 公司 反转录试剂 ΔΔCT法分析 以正常组作为对照组以 G dh和 β n基因 C均值作为内参组ΔC C 目的基因 C 内参基因 盒 P m nk 和 PCR试剂盒 YBR RT 其中 C值为扩增 n个循环基因的荧光数值δδc C试剂盒均购自南京建成生物工程 白胆固醇 HDL P m xext q T RN H P u I I 日本 T K RB 株式会社 抗体英国 A m公司 LDLR 抗体美 国 C m n h m 公 司 β n抗 体美 国 m A d h公司 BCA蛋白质定量检测试剂盒上海 目的基因相对表达量 ΔΔCT ΔCT实验组 ΔCT对照组 表 大鼠上 下游引物序列 基因 mrna I D Ld NM NM 碧云天 生 物 技 术 有 限 公 司 免 疫 印 迹 化 学 发 光 试 剂 ECL试剂盒美国 P 公司 仪器 E x 型酶标仪美国 B TEK公司 E x 型自动洗板机美国 B TEK公司 R型冷 冻台式离心机德国 EPPENDORF公司 ABI F 型实时荧光定量 PCR系统美国 A db m公 u Ch m M 多色荧光 化学发光成 像 系 统美 国 司 F Hm NM NM G d h NM P n m 公司 分组 造模及干预 只大鼠采用随机数字表随 n NM β 只作给予普通饲料 另 只给予 机取 k 高胆固醇饮食 高脂饲料配方为 胆固醇 胆酸钠 k 丙基硫氧嘧啶 k 精制糖 k 猪油 k 并随机分 只 只 只 为模型组 正常组与模型组均给予蒸馏水灌胃 按每日 μ 灌胃给药按每日生药含量 k灌胃给药 分别在如下 个时间窗口灌胃 第 时间窗口 高胆固醇血症形成初期 给予高胆固 醇摄入 周从第 周给药 第 时间窗口 高胆固 醇血症形成期 给予高胆固醇摄入 周从第 周 给药 第 时间窗口 高胆固醇血症进展期 给予高胆 固醇摄入 周从第 周给药 在满 周 周和 引物序列 上游 AGGACGAGATCCACATTTGC 下游 GTGAGAAAGCGTCCTTCCTG 上游 GTTCGTTGGGATGAACGACT 下游 ATTCGGGTGTCATGAATGGT 上游 AGAATATAGCGCGTGGGATG 下游 GACATACAGCCAAAGCAGCA 上游 CACCTGTGGAGCAGTCTCAA 下游 TGCCAGAGTGTTGTCCTCAG 上游 TGCCACTCAGAAGACTGTGG 下游 TTCAGCTCTGGGATGACCTT 上游 AGCCATGTACGTAGCCATCC 下游 ACCCTCATAGATGGGCACAG 产物 W n n检测 Ld 蛋白表达 采用 RI PA裂解液裂解肾上腺组织依据 BCA蛋白质 定量试剂方法进行蛋白定量采用 D PAGE凝 胶电泳分离蛋白并进行 PVDF转膜与 脱脂奶粉封 闭加 入 一 抗 抗 体 稀 释 Ld 抗 体 稀释 抗 体 稀 释 β n抗 体 稀释 过夜用 TBT洗涤再加入相应 G二抗 稀 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 I 释孵 育TBT洗 涤ECL化 学 发 光 显 影最 后 用 F u Ch mm多色荧光 化学发光系统扫描成像与半定 量分析 统计学方法 应用 P 统计软件分析处理 周时分别对大鼠腹腔麻醉腹主动脉取血后分离主 实验数据 计量资料以 x±表示组间比较采用单因 动脉 肝脏 保存 素方差分析或重复测量数据的方差分析对实验指标进 检测指标及方法 为差异有统计学意义 行统计 以 P 血 脂 含 量 结果 按 照 总 胆 固 醇 TC 三 酰 甘 油 TG 高密度脂蛋白 HDL C试剂盒所提供的方法进 对高脂血症大鼠血脂的影响 与比

3 上海中医药杂志 年第 卷第 期 H J TCMN V N 较喂养高脂饲料各组大鼠血清 TC水平在 个时间窗 表 各 组 大 鼠 血 清 HDL C含 量 比 较 n x± 且随着造模时间延长血清 口均显著升高 P mm L TC水平逐渐升高 与比较辛伐他汀治疗 周 周 周可显著下调血清 TC水平 P 冠心康治 ± ± ± 疗后 血 清 TC 有 下 降 趋 势但 差 异 无 统 计 学 意 义 ± ± ± ± ± ± ± ± ± P 见表 与比较模型组大鼠血清 TG在第 周 显著升高 P 其他时间窗口各组 TG均无显著 见表 性变化 P C在第 与比较模型组大鼠血清 HDL 周显著下降 P 其他时间窗口各组 HDL C 均无显著性变化 P 见表 与比较 个时间窗口各组高脂饲料喂 C均显著上升 P 与模型组 养大鼠血清 LDL 周 注 与比较 P 表 各 组 大 鼠 血 清 LDL C含 量 比 较 n x± mm L 周 周 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 周 ± ± C显 著 下 降 比 较辛 伐 他 汀 治 疗 周 后 LDL 注 与比较 P P 与比较 P 冠心康治疗后 LDL C有下降趋势但差异 P 对高脂血症大鼠肝脏 Ld 基因及蛋白表达的影 无统计学意义 P 见表 表 各组大鼠血清 TC含量比较 n x± mm L 周 周 周 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 注 与比较 P P 与比较 P 表 各组大鼠血清 TG含量比较 n x± mm L 与比较各组高脂饲料喂养大鼠肝脏 Ld 基因表达在第 周和 周显著下降 P 与比较冠心康治疗 周后 Ld 基因 见表 表达显著上调 P 表 各组大鼠肝脏 Ld 基因表达 n x± 周 周 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 周 ± ± 周 周 ± ± ± ± ± ± ± ± ± 蛋白表达显著低于正常组 P 组大鼠肝脏 Ld ± ± ± 与模型组比较冠心康治疗 周后 Ld 蛋白表达 注 与比较 P 周 响 注 与正常 对 照 组 比 较 P P 与 高 脂 模 型 组 比 较 P 肝脏 Ld 蛋白表达检测结果显示造模第 周各 显著上调 P 见图 注 C n为m d为 m为gx k为 与比较 P P 与比较 P 图 各组大鼠肝脏 Ld 蛋白相对表达量

4 上海中医药杂志 年第 卷第 期 HJ TCM N V N 对高脂血症大鼠肝脏 基因表达的影响 与 与模型组比较冠心康治疗 周和 周 比较大鼠肝脏 基因表达 后 基因表达显著上调 P 见表 在第 周显著下降 P 见表 表 各组大鼠肝脏 基因表达比较 n x± 表 各组大鼠肝脏 基因表达比较 n x± 周 周 周 周 周 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 周 ± ± 注 与比较 P 与比较 P 肝脏 蛋白表达检测结果显示造模第 周 注 与比较 P 对高脂血症大鼠肝脏 基因及蛋白表达的 周大鼠肝脏 蛋白表达显著低于正常组 P 与比较各组高脂饲料喂养大鼠肝 与模型组比较冠心康治疗 周和 周 影响 脏 基因表达在第 周和 周均显著下降 P 后 蛋白表达显著上调 P 见图 注 C n为m d为 m为gx k为 与比较 P 与比较 P 图 各组大鼠肝脏 蛋白相对表达量 对高脂血症大鼠肝脏 Hm 基因表达的影响 总胆固醇和低密度脂蛋白在 个时间窗口均显著升高 与比较各组高脂饲料喂养大鼠肝脏 Hm P 且随着造模时间延长血清胆固醇水平逐 基因表达在第 周和 周显著下降 P 与模 渐升高 结果显示高脂血症模型成立与既往及国内 型组比较冠心康与辛伐他汀治疗后对 Hm 基因表 外研究一致 且与比较各组高脂饲料 达无显著影响 P 见表 喂养大鼠肝脏 Ld 基因表达在第 周和 周显著下 表 各组大鼠肝脏 Hm 基因表达比较 n x± 降 P 证实高脂血症大鼠体内 Ld 基因表达 周 随着造模时间延长逐渐降低并与高脂血症形成密切 周 周 ± ± ± ± ± ± 胆固醇的代谢受到多种因素精密调节使血胆固 ± ± ± 醇水平稳定在一定水平形成 稳态 胆固醇合成 吸 ± ± ± 注 与比较 P 讨论 收增加或是排泄 分解 利用减少均可导致胆固醇稳 态的破坏从而使血胆固醇水平升高 血液中高胆固 醇对机体产生重要的影响比如胆固醇代谢异常会导 高胆固醇血症是引起心血管疾病与代谢类疾病的 独立风险因子 相关 致脂肪肝 动脉粥样硬化等疾病的发生 生理状态下 高胆固醇血症在我国的患病率逐渐 机体如需保持胆固醇的稳态有多条信号通路参与维 升高临床上采用中西医结合防治该病是控制高胆固 稳 研究表明 条主要信号转导途径的调控构 醇血症的有效措施 成了脂代谢的复杂而精细的调控网络即过氧化物酶 本研究采用高胆固醇饲料建立高脂血症大鼠模 型并与比较喂养高脂饲料各组大鼠血清 体增 殖 物 激 活 受 体 PPAR 信 号 途 径 肝 X 受 体 信号途径和固醇调节元件结合蛋白 REBP LXR

5 上海中医药杂志 2016 年第 50 卷第 11 期 SH.J.TCMNov.,2016;Vol.50No 信号途径等 胆固醇是细胞膜和血浆脂蛋白的重要组成成分, 调控膜的流动性和通透性 生理状态下, 胆固醇代谢主要在肝脏用于合成胆汁酸而被代谢, 各种原因引起的上述信号分子异常表达, 将导致肝脂代谢紊乱, 引起胆固醇 稳态 被破坏 [13 15] 本研究表明, 与比较, 各组高脂饲料喂养大鼠肝脏 Srebp2 基因表达在第 8 周和 12 周均显著下降 (P<0.05); 肝脏 Srebp2 蛋白表达检测结果显示, 造模第 4 周 8 周大鼠肝脏 Srebp2 蛋白表达显著低于 (P<0.05); 与比较, 各组高脂饲料喂养大鼠肝脏 Hmgcr 基因表达在第 4 周和 12 周显著下降 (P<0.05) 表明各组高脂血症大鼠存在 SREBPs 信号失调, 且随着造模时间变化而变化, 从而使胆固醇 稳态 遭到破坏 我们课题组以往的研究表明, 以 金匮要略 中瓜蒌薤白半夏汤为基础加减化裁而成的冠心康具有益气健脾 祛痰降浊 活血化瘀之功效, 对临床高脂血症疗效确切, 且对高脂血症模型大鼠与 ApoE -/- 小鼠动脉粥样硬化的形成均具有一定的防控作用, 尤其对胆固醇与低密度脂蛋白的下调作用显著 [2 4] 与比较, 冠心康治疗后血清胆固醇和 LDL 有下降趋势, 但差异无统计学意义 (P>0.05) 但与模型组比较, 冠心康治疗 8~12 周后 Ldlr 基因表达显著上调 (P< 0.05) 表明冠心康可通过调节 Ldlr 基因, 调节血清胆固醇及 LDL 水平, 且与用药时间相关 对于 SREBPs 相关通路的研究表明, 与模型组比较, 冠心康治疗 4~8 周和 8~12 周后 Srebp2 基因及蛋白表达显著上调 (P<0.05) 但与模型组比较, 冠心康治疗后对 Hmgcr 基因表达无显著影响 (P>0.05) 表明冠心康可能通过对 Srebp2 基因及蛋白的调节, 平衡胆固醇稳态, 且其调节功能与用药时间及造模周期密切相关 综上所述, 冠心康可调节高脂血症大鼠肝脏 Ldlr 基因及蛋白表达, 且可通过调节 Srebp2 基因及蛋白水平, 调节胆固醇稳态, 其作用与造模及用药时间密切相关, 但其进一步机制仍需探讨 参考文献 : [1]StancuCS,CarnutaMG,SandaGM,etal.Hyperlipidemia induced hepaticandsmalintestineer stresanddecreasedparaoxonase1 expresionandactivityisasociatedwithhdldysfunctioninsyrian hamsters[j].molnutrfoodres,2015,59(11): [2] 刘萍, 张静生. 冠心康对高脂血症大鼠血脂影响的研究 [J]. 中成药,2003,25(9): [3] 章怡, 刘萍, 高虹, 等. 冠心康对脂质损伤的人血管内皮细胞保护机制的研究 [J]. 中医药学刊,2005,23(8): [4] 毛美娇, 胡俊萍, 陈富荣, 等. 冠心康对载脂蛋白 E 基因敲除动脉粥样硬化小鼠血脂及炎性标志物的影响 [J]. 中西医结合学报, 2011,9(3): [5] 章怡, 刘萍. 冠心康对动脉粥样硬化大鼠主动脉 LXRα ABCA1 基因表达的影响 [J]. 中国动脉硬化杂志,2010,18(8): [6] LeeSD,TontonozP.LiverX receptorsattheintersectionoflipid metabolismandatherogenesis[j].atherosclerosis,2015,242(1): [7] SchererDZ,ZagoVH,ParaES,etal.Asymptomaticindividuals withhighhdl ClevelsoverexpresABCA1andABCG1andpresent mir 33adysregulationinperipheralbloodmononuclearcels[J]. Gene,2015,570(1): [8] Lahrach H, Esiarab F, TiminouniM, et al. Asociation of apolipoproteinegenepolymorphism withend stagerenaldiseaseand hyperlipidemiainpatientsonlong term hemodialysis[j].renfail, 2014,36(10): [9] YangF,VoughtBW,SaterleeJS,etal.AnARC/Mediatorsubunit requiredforsrebpcontrolofcholesterolandlipidhomeostasis[j]. Nature,2006,442(7103): [10] ZelcerN,HongC,BoyadjianR,etal.LXR regulatescholesterol uptakethroughidol dependentubiquitinationoftheldlreceptor[j]. Science,2009,325(5936): [11] VarinA,ThomasC,IshibashiM,etal.LiverXreceptoractivation promotes polyunsaturated faty acid synthesis in macrophages: relevanceinthecontextofatherosclerosis[j].arteriosclerthrombvasc Biol,2015,35(6): [12] MarquartTJ,AlenRM,OryDS,etal.MiR 33linksSREBP 2 inductiontorepresionofsteroltransporters[j].procnatlacadsci USA,2010,107(27): [13] BrownMS,YeJ,GoldsteinJL.Medicine.HDLmiR eddownby SREBPintrons[J].Science,2010,328(5985): [14]RaynerKJ,SuárezY,DávalosA,etal.MiR 33contributestothe regulationofcholesterolhomeostasis[j].science,2010,328(5985): [15]Najafi ShoushtariSH,KristoF,LiY,etal.MicroRNA 33andthe SREBPhostgenescooperatetocontrolcholesterolhomeostasis[J]. Science,2010,328(5985): 编辑 : 季春来收稿日期 :

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