724 水产学报 41 卷 草鱼 (Ctenopharyngodon idella) [10] 鲤(Cyprinus carpio) [11] 异育银鲫(Carassius auratus gibelio) [12] 吉富罗非鱼 (GIFT Oreochromis niloticus) [13] 暗

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1 第 41 卷第 5 期水产学报 Vol. 41, No 年 5 月 JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA May, 2017 文章编号 : (2017) DOI: /jfc 腹腔注射葡萄糖对大黄鱼血液生化指标及糖代谢关键酶表达量的影响 李弋 1, 邱红 1, 侯迎梅 1, 陆游 1, 申屠基康 2 1*, 周歧存 (1. 宁波大学海洋学院, 鱼类营养研究室, 浙江宁波 ; 2. 宁波市海洋与渔业研究院, 浙江宁波 ) 摘要 : 为研究大黄鱼对葡萄糖的耐受能力和相关糖代谢关键酶的表达量, 选取体质量约为 100 g 的大黄鱼禁食 24 h, 随机分为 3 个实验组, 分别为 (0.9% 的无菌生理盐水, CG 组 ), 低剂量葡萄糖组 (300 mg/kg 体质量,LG 组 ) 和高剂量葡萄糖组 (1500 mg/kg 体质量,HG 组 ) 结果显示, 大黄鱼在注射高剂量和低剂量葡萄糖后, 血糖均在 3 h 达到最高水平, 且 HG 组的峰值显著高于 LG 组,LG 组在 24 h 恢复至正常水平,HG 组在 24 h 仍然高于正常水平 HG 组 LG 组注射葡萄糖后,HK GK 基因相对表达量均显著上升, 其峰值出现在注射后 9 h HG 组 PFK 基因相对表达量在注射后 6 h 达到峰值 HG 组 PEPCK 基因相对表达量在注射葡萄糖后显著下降, 其中最低时间点为 2 h HG 组 G6PD 基因相对表达量在注射后 6 h 显著高于其他各个时间点 研究表明, 注射高 低浓度葡萄糖后, 均会提高大黄鱼血糖水平, 且能维持较长时间 注射葡萄糖后糖酵解途径关键酶如 HK GK PFK 及糖异生途径关键酶 PEPCK 基因相对表达量受血糖调节, 但 G6Pase FBPase 表达量并不因血糖升高而下降 导致注射葡萄糖后, 大黄鱼不断产生内源性葡萄糖, 这是大黄鱼表现为对高血糖不耐受的原因之一 关键词 : 大黄鱼 ; 腹腔注射 ; 糖耐量 ; 糖代谢关键酶 ; 基因表达中图分类号 : S 文献标志码 : A 糖类是一类重要的营养物质, 不仅为水产动物的生理活动供能, 还参与体脂和非必需氨基酸的合成 [1], 在水产饲料中添加适量的可消化糖类对于减少蛋白质和脂肪作为能量消耗非常重要 [2], 并且饲料中适宜的碳水化合物水平有助于增强鱼类的抗病力 [3] 但鱼类对糖的利用能力较低, 是先天性的 糖尿病患者 [4] 为探求鱼类对糖类的利用能力,Phillips [5] 将诊断人类糖尿病的糖耐量实验运用在鱼类营养研究中, 此后很多研究运用糖耐量指标探讨鱼类对糖类的代谢能力 在经典的糖耐量实验中, 一般采用注射和口服法, 其中注射法敏感性高, 重复性好, 结果更加精确 ; 注射剂量目前并没有相应的规 范, 一般选择为 200~2000 mg/kg, 一般给糖量显 著影响糖耐量实验中血糖浓度和高血糖持续时 间, 剂量越高血糖越高, 高血糖持续时间越 长 [6] 研究表明, 鱼类特别是肉食性鱼类对糖的 耐受能力较差 [7] 与杂食性 草食性鱼类相比, 肉食性鱼类对葡萄糖的耐受能力较低, 血糖水 平持续偏高 鱼类对糖类的耐受能力差异有很 多假设 : 肌肉中葡萄糖转运蛋白数目少 [8] ; 糖酵 解 糖异生途径对体内葡萄糖调控不能相互呼 [9] 应等 目前关于青鱼 (Mylopharyngodon piceus) [10] 收稿日期 : 修回日期 : 资助项目 : 国家自然科学基金 ( ); 宁波市农业科技攻关重大项目 (2012C10025); 浙江省 2011 协同创新项目 ( ); 浙江省重中之重一级学科建设项目 ( ); 岱衢洋大黄鱼专用饲料集成应用与示范 (2014GA701001) 通信作者 : 周歧存, zhouqicun@nbu.edu.cn

2 724 水产学报 41 卷 草鱼 (Ctenopharyngodon idella) [10] 鲤(Cyprinus carpio) [11] 异育银鲫(Carassius auratus gibelio) [12] 吉富罗非鱼 (GIFT Oreochromis niloticus) [13] 暗纹东方鲀 (Takifugu obscurus) [14] 等的糖耐量研究已见报道, 但有关大黄鱼 (Larimichthys crocea) 糖耐量的研究还未见报道 在糖代谢过程中, 鱼体内糖代谢酶起了重要的作用 [15-16], 众多研究从糖代谢关键酶活性探讨鱼类对糖耐受能力差异的原因, 鲜有研究从糖代谢关键酶表达量的角度具体阐释鱼类对糖的利用能力 大黄鱼隶属鲈形目 (Perciformes), 石首鱼科 (Sciaenidae), 属肉食性鱼类 [17], 是我国四大海洋经济鱼类之一, 也是我国最具地方特色的海洋经济鱼类 本研究以大黄鱼为实验对象, 分别用低剂量 高剂量葡萄糖对大黄鱼进行腹腔注射, 并在注射后不同时间进行取样, 研究大黄鱼对高 低浓度葡萄糖的耐受能力, 并从糖代谢关键酶表达量的角度具体阐释大黄鱼对糖的利用能力 1 材料与方法 1.1 实验材料与试剂实验所用大黄鱼采购于浙江象山港湾水产苗种有限公司, 在宁波市海洋与渔业科技创新基地暂养 1 周后, 挑选健康 体质强壮 体质量约为 100 g 的大黄鱼作为实验用鱼 实验所用针剂分别为 0.9% 生理盐水, 以及浓度为 30 和 150 mg/ml 葡萄糖注射液 生理盐水由上海市国药集团生产的无水氯化钠粉末溶于无菌蒸馏水配制而成, 葡萄糖注射液由 Sigma 公司提供的无水葡萄糖粉末溶于无菌蒸馏水配制而成 以上注射液配置完均经过高压蒸汽灭菌后,4 C 冷藏于冰箱中备用 1.2 实验设计将 270 尾大黄鱼随机分至 6 个玻璃钢桶中, 每桶 45 尾 设 3 个处理组, 分别为 (CG 组 ) 低剂量葡萄糖处理组 (LG 组 ) 高剂量葡萄糖处理组 (HG 组 ) 每个处理组设 2 个重复, 每个玻璃钢桶为 1 个重复 其中注射 0.9% 生理盐水, 低剂量葡萄糖组依照 300 mg/kg 体质量的剂量进行腹腔注射, 高剂量葡萄糖组依照 1500 mg/kg 体质量的剂量进行腹腔注射 实验进行前, 所有的大黄鱼统一投喂商业 饲料后饥饿 24 h 将玻璃钢桶中的鱼用 MS-222 进 行麻醉后, 进行腹腔注射, 在注射后 和 24 h 分别进行取样 每个玻璃钢 桶中每个时间点捞出 5 尾进行取样 首先用 MS- 222 对大黄鱼进行麻醉, 尾静脉取血注入离心管 中,4 C 静置 24 h 后,3000 r/min 离心取上清液作 为血清样品 取完血的大黄鱼, 立即解剖取肝 脏, 速冻于液氮中, 作为肝脏样品待测 1.3 引物设计 参照美国国立生物技术信息中心 (NCBI) 网 站上的大黄鱼己糖激酶 (HK)(XM_ ) 葡萄糖激酶 (GK)(XM_ ) 6- 磷酸果糖 激酶 (PFK)(XM_ ) 葡萄糖 -6- 磷酸酶 (G6Pase)(XM_ ) 果糖 -1,6- 二磷酸酶 (FBPase)(XM_ ) 磷酸烯醇式丙酮酸 羧激酶 (PEPCK)(XM_ ) 6- 磷酸脱氢 酶 (G6PD)(XM_ )cDNA 序列, 以 Primer Premier 5.0 软件设计荧光定量 PCR(real-time PCR, RT-PCR) 扩增特异性引物, 同时设计 β- 肌动蛋白 (β-actin) 引物作为内参, 所有引物均由华大基因 生物技术有限公司合成 ( 表 1) HK GK PFK 基因 genes PEPCK FBPase G6Pase G6PD β-actin 1.4 血清指标测定 表 1 RT-PCR 引物序列 Tab. 1 Primer sequences for RT-PCR 血清生化指标及酶活使用日立 型全 自动生化分析仪进行检测 序列 sequences (5 3 ) 上游 :GTTCATTGACTGTCTGGTGC 下游 :GCCGTGGTTGATAAGATTAG 上游 :AATCTGAGGATGCTGGTG 下游 :GTTGTTTGCTGCTTTCTTT 上游 :CCATCAACATCCACGACC 下游 :ATCAAAGGGAGAAGGTGC 上游 :GGCACCTCGGATAAGACCAA 下游 :AAGGCCCTCCCACCATACTC 上游 : ATCGCTCACCTTTATGGC 下游 :CACTGGGCTCATCATCTGT 上游 :GCAGGCGTCTACTACACCCT 下游 :GCTTCAGCCACAATCATACC 上游 :GAGCTGCGTAACATTGACT 下游 :GTACATACCGCTGACCATC 上游 :CTACGAGGGTTATGCCCTGCC 下游 :TGAAGGAGTAACCGCGCTCTGT 1.5 总 RNA 提取及实时定量 PCR 取出 50 mg 左右大黄鱼肝脏样品, 采用 TRIzol

3 5 期李弋, 等 : 腹腔注射葡萄糖对大黄鱼血液生化指标及糖代谢关键酶表达量的影响 725 Reagent ( 全式金, 中国 ) 提取 RNA, 提取的 RNA 质量及浓度分别使用 1.2% 琼脂糖凝胶电泳及超微量分光光度计检测 使用全式金公司提供的 cdna 反转试剂盒, 按照说明书采用一步法将 RNA 反转为 cdna 定量前使用 DNase-free 水将 cdna 稀释 3 倍, 定量仪器为实时定量 PCR 仪 (LightCycler*96, F. Hoffmann-La Roche, Ltd., Swit), 实时定量 PCR 体系为 20 μl, 上下游模板各 1.0 μl,10 μl 的 2 conc SYBR Green I Master ( 全式金, 中国 ),2 μl cdna 和 6 μl DEPC 水 实时定量 PCR 设定的程序 : 95 C 2 min,95 C 持续 10 s, 58 C 持续 10 s, 最后 72 C 维持 20 s 所有基因的扩增效率大致相等, 范围从 95% 到 102% 对每一个扩增的熔解曲线进行分析, 以确认只有 1 个 PCR 产物的存在 β-actin 作为内参基因, 采用 2 C T 方法, 每组注射后 0 h 作为标准, 设该时 间点基因表达量为 数据统计分析所有数据采用 SPSS version17.0 软件进行统计分析, 实验结果以平均值 ± 标准差表示, 先对数据作单因素方差分析 (One-Way ANOVA); 若统计结果有显著差异, 再作 Tukey 进行多重比较,P<0.05 表示差异显著 2 结果 2.1 注射葡萄糖对大黄鱼血清生化指标的影响随着时间的增加,3 个处理组的血糖均先上升后下降 ( 表 2) 其中 CG 组血清的血糖变化并不显著 (P>0.05);LG 组注射后, 血糖立即升高, 3~4 h 血糖出现峰值, 为 14~15 mmol/l,6 h 后血糖开始下降,24 h 时恢复到 0 h 的血糖水平 ;HG 组变化与 LG 组相似, 其峰值出现在 2~4 h, 为 19 mmol/l 左右,6~24 h 血糖开始下降, 但 24 h 血糖仍然高于 0 h 注射葡萄糖后,3 个组各个时间点大黄鱼血清中的总蛋白 白蛋白 总胆固醇 碱性磷酸酶 谷草转氨酶 甘油三酯均没有显著变化 (P>0.05) 注射生理盐水及低剂量葡萄糖后, 球蛋白没有显著性差异 (P>0.05); 注射高剂量葡萄糖后, 球蛋白随注射后时间延长先上升后下降, 其中 1 h 时含量显著高于其他时间点 (P<0.05) 2.2 注射葡萄糖对大黄鱼糖代谢关键酶基因注射葡萄糖对大黄鱼糖酵解途径关键酶基因 CG 组的 HK 基因相对表达量表现为先上升后下降, 但是变化不显著 (P>0.05) ( 图 1);LG 组 HK 基因相对表达量随时间变化显著 (P<0.05),HK 基因相对表达量在注射后 1 h 升高, 1~6 h 各个时间点之间 HK 基因相对表达量没有差异,9 h 的 HK 基因相对表达量最高,12 h 的 HK 基因相对表达量较 9 h 下降,24 h 的 HK 基因相对表达量又有所升高 ;HG 组 HK 基因相对表达量随时间变化显著 (P<0.05), 在注射后 1 h 升高,1~6 h 各个时间点之间 HK 基因相对表达量没有差异,9 h 的 HK 基因相对表达量最高,12~24 h 各时间点之间没有差异 CG 组各个时间点的 GK 基因相对表达量没有显著性差异 (P>0.05)( 图 2);LG 组 GK 基因相对表达量随时间变化差异显著 (P<0.05), 注射后 1 h 的 GK 基因相对表达量显著上升 (P<0.05), 之后保持不变,24 h 的 GK 基因相对表达量开始下降, 但高于 0 h;hg 组 GK 基因相对表达量随时间变化差异显著 (P<0.05), 注射后 1 h 的 GK 基因相对表达量显著上升 (P<0.05),4 h 出现下降,6 h 又开始升高,9 h 的 GK 基因相对表达量最高,12 h 开始下降,24 h 的 GK 基因相对表达量与 0 h 无显著性差异 (P>0.05) CG 组 LG 组各个时间点的 PFK 基因相对表达量没有显著性差异 (P>0.05)( 图 3),HG 组 PFK 基因相对表达量随时间变化差异显著 (P<0.05), 随着注射后时间的延长先升高后下降 PFK 基因相对表达量在注射后 1 h 升高,1~4 h 各个时间点 PFK 基因相对表达量保持不变,6 h 的 PFK 基因相对表达量升高,6 h 后 HK 基因相对表达量下降, 但 6 h 后各个时间点之间 PFK 基因相对表达量与 1~4 h 相比均没有显著差异 注射葡萄糖对大黄鱼糖异生途径关键酶基因 CG 组与 LG 组 PEPCK 基因相对表达量随着注射后时间的延长没有显著差异 (P>0.05)( 图 4) LG 组 PEPCK 基因相对表达量随时间的延长先上升后下降 ;HG 组在注射葡萄糖后 1 h 下降,2 h 时 PEPCK 基因相对表达量最低,3 h 后开始上升, 但在 12 h 小幅下降 3 个组的 G6Pase 基因相对表达量随着注射后时间的延长均没有显著变化 (P>0.05)( 图 5) 3 个组的 FBPase 基因相对表达量随着注射后时间的延长均没有显著变化 (P>0.05)( 图 6)

4 726 水产学报 41 卷 表 2 注射葡萄糖对大黄鱼血清生化指标的影响 Tab. 2 Effect of glucose injection on hematological characteristics of L. crocea 指标 index 注射后时间 /h time after injection 血糖 /(mmol/l) Glu 总蛋白 /(g/l) TP 白蛋白 /(g/l) ALB 球蛋白 /(g/l) GLOB 白球比例 A/G 谷草转氨酶 / (U/L) ALT 碱性磷酸酶 / (U/L) ALP 总胆固醇 / (mmol/l) CHOL 甘油三脂 / (mmol/l) TG 9.96± ± ± ± ± ± ± ± ±2.05 低剂量葡萄糖组 9.97±1.73 a 12.59±2.03 ab 14.35±2.16 ab 15.09±2.89 b 14.82±3.36 b 13.14±2.04 ab 12.51±2.97 ab 11.94±1.59 ab 10.04±1.62 a 高剂量葡萄糖组 10.42±3.05 a 17.76±2.29 bc 19.13±2.91 c 19.49±3.25 c 19.15±2.90 c 16.86±2.31 abc 15.65±1.38 abc 14.84±2.22 abc 13.09±1.71 ab 26.48± ± ± ± ± ± ± ± ±2.99 低剂量葡萄糖组 24.67± ± ± ± ± ± ± ± ±3.77 高剂量葡萄糖组 27.48± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.66 低剂量葡萄糖组 6.28± ± ± ± ± ± ± ± ±0.67 高剂量葡萄糖组 6.92± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±2.40 低剂量葡萄糖组 18.38± ± ± ± ± ± ± ± ±3.17 高剂量葡萄糖组 20.57±2.39 ab 22.56±1.75 b 20.00±2.03 ab 19.37±2.28 ab 19.36±2.49 ab 17.15±1.98 a 18.62±1.77 a 18.46±1.67 a 17.45±1.31 a 0.33± ± ± ± ± ± ± ± ±0.03 低剂量葡萄糖组 0.35± ± ± ± ± ± ± ± ±0.03 高剂量葡萄糖组 0.34± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±11.61 低剂量葡萄糖组 67.50± ± ± ± ± ± ± ± ±18.05 高剂量葡萄糖组 77.33± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±2.53 低剂量葡萄糖组 13.00± ± ± ± ± ± ± ± ±2.34 高剂量葡萄糖组 14.33± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±1.32 低剂量葡萄糖组 9.43± ± ± ± ± ± ± ± ±2.72 高剂量葡萄糖组 9.57± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±3.38 低剂量葡萄糖组 17.57± ± ± ± ± ± ± ± ±4.15 高剂量葡萄糖组 17.08± ± ± ± ± ± ± ± ±3.72 注 : 同行肩注不同英文字母表示有显著差异 (P<0.05) Notes: values in same row with different superscripts are statistically different at P<0.05

5 5期 李 图1 弋 等 腹腔注射葡萄糖对大黄鱼血液生化指标及糖代谢关键酶表达量的影响 图4 注射葡萄糖对大黄鱼 HK基因 Fig. 1 注射葡萄糖对大黄鱼 PEPCK基因 图中标注不同英文字母 表示为同一组内的不同处理时间有显 Fig. 4 著差异(P<0.05) 下同 727 PEPCK in L. crocea HK in L. crocea Values in same color bar with different superscripts are statistically different at P<0.05 the same below 图5 注射葡萄糖对大黄鱼 G6Pase基因 图2 注射葡萄糖对大黄鱼 GK基因 Fig. 2 Fig. 5 G6Pase in L. crocea GK in L. crocea 图6 注射葡萄糖对大黄鱼 FBPase基因 图3 注射葡萄糖对大黄鱼PFK基因 Fig. 3 PFK in L. crocea 注射葡萄糖对大黄鱼磷酸戊糖途径关键酶基 因 CG组与LG组G6PD基因 相对表达量随着注射后时间的延长没有显著差 异(P>0.05)(图7) HG组G6PD基因相对表达量在 注射葡萄糖后4 h内没有变化 6 h的g6pd基因相 Fig. 6 FBPase in L. crocea 对表达量显著高于其他各个时间段(P<0.05) 讨论 注射葡萄糖对大黄鱼血清生化指标的影响 本研究表明 大黄鱼注射300 mg/kg葡萄糖

6 728 水产学报 41 卷 [13] 不同给糖类方式与剂量有关 刘含亮等研究表 明, 给吉富罗非鱼注射 30 mg/kg 葡萄糖后,1 h 血 糖即达到峰值,3 h 已经恢复至正常水平 血糖 达到峰值的时间及高血糖持续时间均低于本研 究结果, 这是由于杂食性鱼类对血糖的清除能 力比肉食性鱼类强 由此可知, 与其他鱼相 比, 大黄鱼与大多数肉食性鱼类一样, 对血液 中葡萄糖的清除能力较差, 表现为持续的高 血糖 图 7 注射葡萄糖对大黄鱼 G6PD 基因 Fig. 7 G6PD in L. crocea 后, 高血糖持续 24 h; 注射 1500 mg/kg 葡萄糖 后, 高血糖持续 24 h 以上 银锯眶鴤 (Bidyanus bidyanus) 在腹腔注射 1000 及 2000 mg/kg 葡萄糖 后, 高血糖分别持续 12 及 24 h; 罗非鱼在腹腔注 射 2000 mg/kg 葡萄糖后, 高血糖持续 6 h 以上 [8] ; 虹鳟 (Oncorhynchus mykiss) 在腹腔注射 1000 及 300 mg/kg 葡萄糖后, 高血糖分别持续 24 及 18 h [18-19] ; 大菱鲆 (Scophthalmus maximus) 在腹腔注射 1000 mg/kg 葡萄糖后, 高血糖持续 24 h [20] ; 暗纹东方鲀在腹 腔注射 1000 mg/kg 葡萄糖后, 高血糖持续 9 h [14] ; 沙重牙鲷 (Diplodus sargus) 在腹腔注射 1000 mg/kg 葡萄糖后, 高血糖持续 9 h [21] ; 以上研究表明, 鱼类, 特别是肉食性鱼类, 高血糖持续时间较 长, 与本实验结果相近 本实验低剂量葡萄糖 组血糖峰值为 14~15 mmol/l, 高剂量葡萄糖组血 糖峰值在 19 mmol/l 左右 这与一些研究中血糖 峰值为 14~25 mmol/l [8,18,20] 的结果相近 本研究 表明, 大黄鱼注射高 低剂量葡萄糖后,2~4 h 血糖达到峰值 沙重牙鲷在腹腔注射 1000 mg/kg 葡萄糖后 2 h 血糖达到峰值 [21] ; 大西洋鲑 (Salmo salar) 在腹腔注射 1 g/kg 葡萄糖后 3 h 血糖达到峰 值 [22] ; 金赤鲷 (Pagrus auratus) 在腹腔注射 1 g/kg 葡萄糖后 3 h 血糖达到峰值 [23] ; 大菱鲆在腹腔注 射 0.1 g/kg 葡萄糖后 3 h 血糖达到峰值 [20], 以上研 究表明这些鱼类在注射葡萄糖后 3 h 左右达到血 糖峰值, 与本实验的结果相近, 但舌齿鲈 (Dicentrarchus labrax) 尖吻鲈 (Lates calcarifer) 在腹腔注 射 1 g/kg 葡萄糖后分别在 6 和 8 h 血糖才达到峰值 [24], 时间高于本研究结果 ; 高首鲟 (Acipenser transmontanus) 经口摄食 0.1 g/kg 葡萄糖后 6 h 才达到峰值 [25], 血糖达到最高值的时间高于本实验结果, 这与 3.2 注射葡萄糖对大黄鱼糖酵解关键酶基因 和其他动物一样, 糖酵解也是鱼类最主要 的葡萄糖代谢途径 注射 14 C 葡萄糖实验表明, 鱼类摄食的葡萄糖多数被分解 [20,26], 但实验期 间鱼体的葡萄糖氧化速率很慢, 这可能是由于 鱼类代谢率较低所致 [16] [27] Kamalam 等认为, 缺 乏相关关键酶调控和糖分解速率慢是一些鱼类 不能更好地利用葡萄糖的原因 GK 是重点研究的糖代谢酶类, 因为它在肝 脏代谢 葡萄糖平衡中发挥了重要的角色 以往 的研究认为鱼类体内缺少 GK 或活性很低是导致 鱼类不能有效利用糖类的原因 [15], 但是之后大量 研究表明 GK 在鱼体内是存在的 本实验中,2 个 葡萄糖处理组 GK 基因在注射完葡萄糖后均呈现 先上升后下降, 与血糖的变化趋势一致 Kamalam [27] 等研究表明, 肉食性鱼类不能很好利用碳水化 [28] 合物并不是由于 GK 基因表达量少 Viegas 等研 究表明虽不能确定 GK 有维持血糖平衡的能力, 但可以证实在肉食性鱼类中 GK 基因表达对高碳 [29] [30] 水化合物有适应性反应 蔡春芳和林小植等 的研究都得出随着碳水化合物的增加, 鱼类的 GK 活性提高的结论 在虹鳟的实验中, 无论长 期还是短期投喂含糖类的饲料都会增加肝脏中 GK 基因的表达 [31] [32] ; 刘波等在对翘嘴红鲌 (Erythroculter ilishaeformis) 研究中发现, 高 CHO 组投料 6 h [33] 后显著增加了 GK mrna 水平 ;Panserat 等研究 表明银大麻哈鱼 (O. kisutch) 在注射 250 mg/kg 葡萄 糖后, 其肝脏 GK 基因在 6 h 时升高 ; 以上结果表 明, 碳水化合物可以诱导 GK 基因的表达, 并且 GK 的活性及表达量与血糖变化趋势有相关性 本实验结果与上述结果一致, 说明在大黄鱼肝 脏内 GK 基因的表达会随血糖的增加而上升, 可 见 GK 并不是限制大黄鱼有效利用葡萄糖的因素

7 5 期李弋, 等 : 腹腔注射葡萄糖对大黄鱼血液生化指标及糖代谢关键酶表达量的影响 729 PFK 是限制大黄鱼糖酵解又一个关键酶, 本 实验中 LG 组随着注射后时间的延长,PFK 基因 的相对表达量没有显著变化, 但 HG 组随着注射 时间的延长变化显著, 先上升后下降, 其峰时与血 [30] 糖的峰时几乎一致 林小植等发现投喂含中 高水平糖类饲料, 南方鲇 (Silurus meridionalis) 幼 [34] 鱼的 PFK 活性不随血糖变化 ; 但 Shiau 等研究表 明随着罗非鱼血糖升高, 鱼体内的 PFK 活性增 [33] 强 Panserat 等研究表明银大麻哈鱼在注射 250 mg/kg 葡萄糖后, 其肝脏 PFK 基因没有显著性 变化 可以得出,PFK 也不是限制大黄鱼有效利 用葡萄糖的因素 另外 PFK 基因表达量的差异与 注射葡萄糖的浓度有关, 其具体机理需要进一 步研究 综上, 大黄鱼相关糖酵解关键酶的表达量 随血糖的升高而相应升高, 因此可以排除大黄 鱼持续高血糖是由于糖酵解关键酶不受血糖浓 度调节的假设, 但是否由于糖酵解代谢速率慢 导致大黄鱼不能更好地利用糖类则需要进一步 研究证实 3.3 注射葡萄糖对大黄鱼糖异生关键酶基因 研究证实鱼类有非常有效的糖异生途径 [35], 通过此途径, 鱼类可以利用 α- 酮酸 乳酸 甘油 等合成葡萄糖, 鱼类糖异生途径主要集中在肝 脏 肾脏及肠中 而肝脏是葡萄糖代谢的主要 部位, 因此, 糖代谢途径的酶表达及活性的研 究都集中于肝胰脏 [36] 杂食性鱼类糖异生途径酶 类的表达和高等脊椎动物近似, 而肉食性鱼类 的糖异生途径似乎不受碳水化合物的调节 [27] PEPCK 催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮 酸, 是糖异生途径的第一个限速酶 [37] Panserat [38] 等发现鲤在摄食含糖饲料后 PEPCK 表达没有差 [39] 异 ; 俞菊华等发现在脂肪水平一致时, 高糖和 中糖饲料组翘嘴红鲌 PEPCK 的表达除了在 0 3 h 时高糖组显著较高外, 在 h 无显著性 差异, 但 h 高糖组 PEPCK 表达量相对较 低 本实验中大黄鱼注射高剂量葡萄糖后, 肝 脏的 PEPCK 基因的相对表达量显著下降 可以 得出, 糖异生途径的第一个限速酶 PEPCK 表达 会被高糖抑制 [40] Enes 等给舌齿鲈投喂高碳水化合物组饲 [41] 料, 发现其 FBPase 活性并不受影响 ; 聂琴等发 现大菱鲆 FBPase 不随糖的种类变化而变化 ; [38] Panserat 等发现鲤的 FBPase 基因表达量无论投 喂饲料中有无糖类都没有变化 ;Enes [42] 关于金赤 鲷的研究发现 FBPase 活性不受饲料中糖的影 响 本研究表明,FBPase 基因的相对表达量随着 注射后时间延长均没有显著变化 可以得出, 糖 异生途径的限速酶 FBPase 不受葡萄糖的调节 G6Pase 通过催化使葡萄糖 -6- 磷酸去磷酸化 变为葡萄糖, 在维持血糖稳定中扮演重要角色 [43] [44] Panserat 等研究表明葡萄糖并不能抑制虹鳟 G6Pase 的表达, 并且认为虹鳟对糖类利用率低 与其肝脏糖异生调控较差有关 本研究表明, G6Pase 基因的相对表达量随着注射后时间延长 均没有显著变化 可以得出, 糖异生途径的限 速酶 G6Pase 不受葡萄糖的调节 其他研究表明, 鱼类不能抑制 G6Pase 活性 和表达量以及餐后 GK 活性和表达量的增加导致 了鱼类在食用碳水化合物后持续的高血糖 [31,45] [27] Kamalam 等认为肉食性鱼类肝脏中通过糖异生 产生内源性葡萄糖不受控制, 最终导致了糖类 利用率的低下 结合本研究可以得出, 糖异生 途径的关键酶 FBPase G6Pase 表达不会随着血 糖升高而受到抑制, 这有可能导致内源性葡萄 糖不断被合成, 而使大黄鱼血糖持续偏高 但 FBPase G6Pase 不被抑制的具体机理以及与 PEPCK 之间的相互联系需要进一步研究 3.4 注射葡萄糖对大黄鱼磷酸戊糖途径关键 酶基因 磷酸戊糖途径有非常重要的生物学意义, 它是细胞产生还原力 (NADPH) 的主要途径, 并且 是细胞内不同结构糖分子的重要来源, 为各种 单糖的相互转换提供条件 [46] [47] Hemre 等认为在 脂肪合成中, 可消化糖的作用主要是胞质还原 性糖, 而并非提供了碳原子骨架 磷酸戊糖途 径曾被认为在糖代谢中作用较小, 但最近的研 究表明, 磷酸戊糖途径可能是鱼类降解葡萄糖 的主要途径 [48] [49] 任鸣春研究表明虹鳟摄食含碳水化合物 饲料后 5 h 的 G6PD 表达量显著高于 24 h, 并且发 现 G6PD 表达量与 GK 表达量呈很好的正相关性, 这暗示着经由 GK 催化形成的葡萄糖 -6- 磷酸, 大 部分可能经由磷酸戊糖途径代谢或者形成了糖 原储存, 而不是继续进行糖酵解 本研究中, 注

8 730 水产学报 41 卷 射高剂量葡萄糖组后 6 h,g6pd 表达量显著高于其他各时间点, 可见磷酸戊糖途径也受血糖调节 4 结论大黄鱼对葡萄糖的耐受能力差, 与大多数肉食性鱼类相似, 注射葡萄糖后血糖 3 h 达到峰值, 高血糖状态持续 24 h 以上 根据对大黄鱼糖酵解 糖异生途径关键酶表达量的分析可得, 糖酵解途径关键酶表达量会随葡萄糖的注射而升高, 糖异生途径的关键酶 PEPCK 表达被高浓度葡萄糖抑制, 但是糖异生途径关键酶 G6Pase FBPase 却没有被抑制, 这导致内源性葡萄糖不断被合成而使大黄鱼血糖持续偏高 参考文献 : [ 1 ] 邢淑娟, 张文兵. 鱼类糖营养生理的研究进展 [J]. 河北渔业, 2015(8): Xing S J, Zhang W B. Progress in carbohydrate nutrition physiology studies in fish[j]. Hebei Fisheries, 2015(8): 63-71(in Chinese). [ 2 ] 蔡春芳, 陈立侨. 鱼类对糖的利用评述 [J]. 水生生物学报, 2006, 30(5): Cai C F, Chen L Q. Comment on the utilization of dietary carbohydrates in fish[j]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2006, 30(5): (in Chinese). [ 3 ] 艾庆辉, 麦康森. 鱼类营养免疫研究进展 [J]. 水生生物学报, 2007, 31(3): Ai Q H, Mai K S. Advance on nutritional immunity of fish[j]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2007, 31(3): (in Chinese). [ 4 ] Wilson R P, Poe W E. Apparent inability of channel catfish to utilize dietary mono- and disaccharides as energy sources[j]. The Journal of Nutrition, 1987, 117(2): [ 5 ] Phillips A M. The Utilization of Carbohydrates by Trout: Fisheries research bulletin[m]. New York: New York State Conservation Department, Bureau of Fish Culture, [ 6 ] 牛思佳, 郭金龙, 杨振才, 等. 鱼类葡萄糖耐量研究进展 [J]. 水产科学, 2015, 34(7): Niu S J, Guo J L, Yang Z C, et al. A review: research advances in glucose tolerance in fish[j]. Fisheries Science, 2015, 34(7): (in Chinese). [ 7 ] Furuichi M, Yone Y. Availability of carbohydrate in nutrition of carp and red sea bream[j]. Bulletin of the [ 8 ] [ 9 ] [10] [11] [12] [13] [14] Japanese Society of Scientific Fisheries, 1982, 48(7): Wright J R Jr, O Hali W, Yang H, et al. GLUT-4 deficiency and severe peripheral resistance to insulin in the teleost fish tilapia[j]. General and Comparative Endocrinology, 1998, 111(1): Panserat S, Capilla E, Gutierrez J, et al. Glucokinase is highly induced and glucose-6-phosphatase poorly repressed in liver of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) by a single meal with glucose[j]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 2001, 128(2): 黄鹤忠, 丁磊, 宋学宏, 等. 青鱼和草鱼葡萄糖耐量的比较研究 [J]. 中国水产科学, 2005, 12(4): Huang H Z, Ding L, Song X H, et al. Comparative research on glucose tolerance betweem black carp Mylopharyngodon piceus and grass carp Ctenopharyngodon idellus[j]. Journal of Fishery Sciences of China, 2005, 12(4): (in Chinese). 吕春双, 范泽, 程镇燕, 等. 鲤鱼经葡萄糖注射后的糖代谢反应 [C]// 中国水产学会 年中国水产学会学术年会论文摘要集. 杭州 : 中国水产学会, Lü C S, Fan Z, Cheng Z Y, et al. Glucose tolerance in common carp (Cyprinus carpio)[c]// China Fisheries Association. Academic annual Conference of China Fisheries Association. Beijing: China Fisheries Association, 2015(in Chinese). 蔡春芳, 刘影, 陈立侨, 等. 异育银鲫口服不同剂量葡萄糖后的代谢反应 [J]. 水生生物学报, 2003, 27(6): Cai C F, Liu Y, Chen L Q, et al. Metabolic responses of allogynogenetic gbelcarp after oral administration of different doses of glucose[j]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2003, 27(6): (in Chinese). 刘含亮, 孙敏敏, 王红卫, 等. 注射葡萄糖对吉富罗非鱼血浆生化指标 胰岛素和糖酵解关键酶的影响 [J]. 中国水产科学, 2012, 19(5): Liu H L, Sun M M, Wang H W, et al. Effects of glucose injection on biochemical parameters, insulin, and glycolytic enzymes in GIFT (Oreochromis niloticus)[j]. Journal of Fishery Sciences of China, 2012, 19(5): (in Chinese). 刘襄河, 王安利, 叶超霞, 等. 腹腔注射葡萄糖对暗纹东方鲀血浆生化指标 胰岛素和糖酵解关键酶的影响 [C]// 中国水产学会. 第九届世界华人鱼虾营养学术研讨会论文集. 厦门 : 中国水产学会, 2013.

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