茂县土地岭大熊猫走廊带

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中国组织工程研究 Chinese Journal of Tissue Engineering Research mirna-196a-5p 调控 Smad4 表达对胃癌干细胞特性的影响 www.crter.

1 中国组织工程研究 Chinese Journal of Tissue Engineering Research mirna-196a-5p 调控 Smad4 表达对胃癌干细胞特性的影响研究原著郭睿 1, 戴建峰 2, 罗玉明 1, 赵海明 1 1, 唐鹏 ( 1 四川省医学科学院四川省人民医院东院消化内科, 四川省成都市 ; 2 四川广播电视大学农林卫生学院, 四川省成都市 ) DOI: /j.issn ORCID: ( 郭睿 ) 文章快速阅读 : mirna-196a-5p 在胃癌干细胞中的作用机制胃癌 BGC-823 细胞株流式细胞术分选出 CD44 + 细胞, 即胃癌干细胞抑制 CD44 + 胃癌干细胞中 mirna-196a-5p 表达双荧光素酶验证 mirna-196a-5p 对 Smad4 基因的调控 Western blotting 实验检测上皮 - 间质转化相关蛋白和 Smad4 蛋白表达结论 : (1)miRNA-196a-5p 通过调控 Smad4 表达在胃癌干细胞上皮 - 间质转化和侵袭过程中发挥重要作用 ; (2)miRNA-196a-5p 具有作为胃癌治疗靶标的潜能郭睿, 女,1981 年生, 四川省乐山市人, 汉族,2009 年泸州医学院毕业, 硕士, 主治医师, 主要从事胃肠道疾病方面的研究通讯作者 : 戴建峰, 硕士, 讲师, 四川广播电视大学农林卫生学院, 四川省成都市中图分类号 :R394.2 文献标识码 :A 稿件接受 : 文题释义 : 肿瘤干细胞 : 是一类未分化的肿瘤细胞, 能够进行自我更新和多向分化, 具有高度致瘤性, 是促进肿瘤侵袭转移的原动力, 在肿瘤发生发展侵袭转移耐药及复发等过程中, 均发挥重要作用, 提示治愈肿瘤的关键可能在于根除肿瘤干细胞 Smad4:TGF-β/Smads 信号通路在多种细胞生理过程中发挥作用, 近年来, 越来越多的研究关注其在肿瘤中的作用 Smad4 作为 Smads 的重要成员,Smad4 表达缺失与乳腺癌胃癌等多种恶性肿瘤相关, 尤其是在肿瘤细胞的上皮 - 间质转化及侵袭过程中发挥至关重要的调节作用摘要背景 :mirna-196a 是新近发现的与乳腺癌宫颈癌等多种肿瘤相关的 micrornas 生物靶分子研究证实, mirna-196a-5p 在胃癌细胞株和胃癌组织中均表达增加, 然而, 关于 mirna-196a-5p 在胃癌干细胞中的功能和机制研究甚少目的 : 分析 mirna-196a-5p 在胃癌干细胞侵袭中的作用及机制方法 : 流式细胞术分选胃癌 BGC-823 细胞株中的 CD44 + 细胞 ( 即胃癌干细胞 ),qrt-pcr 检测 mirna-196a-5p 表达,Transwell 实验检测细胞侵袭能力 ; 参照 Lipofectamine 2000 转染试剂说明书的操作步骤, 将 mirna-196a-5p inhibitor( 即 mirna-196a-5p INH) 转染至细胞中 ; 双荧光素酶报告基因实验验证 mirna-196a-5p 对 Smad4 基因的调控作用 ;Western blotting 实验检测上皮 - 间质转化相关蛋白 (E-cadherin N-cadherin 和 Vimentin) 和 Smad4 蛋白表达结果与结论 :1miRNA-196a-5p 在胃癌干细胞中表达增加 (P < 0.05);2 抑制 mirna-196a-5p 表达后, 能够降低胃癌干细胞的侵袭能力 (P < 0.05), 增加 E-cadherin 蛋白表达 (P < 0.05), 降低 N-cadherin 和 Vimentin 蛋白表达 (P 均 < 0.05), 增加 Smad4 蛋白表达 (P < 0.05);3 结果表明,miRNA-196a-5p 通过调控 Smad4 表达在胃癌干细胞上皮 - 间质转化和侵袭过程中发挥重要作用,miRNA-196a-5p 具有作为胃癌治疗靶标的潜能关键词 : mirna-196a-5p; 胃癌干细胞 ; 上皮 - 间质转化 ; 侵袭 ;Smad4 主题词 : 胃肿瘤 ; 肿瘤侵润 ; 肿瘤干细胞 ; 微 RNAs;Smad4 蛋白质 ; 组织工程基金资助 : 2017 年四川省卫生和计划生育委员会科研课题普及应用项目 (17PJ041) Regulation of Smad4 by mirna-196a-5p influences gastric cancer stem cell characteristics Guo Rui 1, Dai Jian-feng 2, Luo Yu-ming 1, Zhao Hai-ming 1, Tang Peng 1 ( 1 Department of Gastroenterology, the East Branch of Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People s Hospital, Chengdu , Sichuan Province, China; 2 College of Forestry and Health, Sichuan Radio and TV University, Chengdu , Sichuan Province, China) Guo Rui, Master, Attending physician, Department of Gastroenterology, the East Branch of Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People s Hospital, Chengdu , Sichuan Province, China Corresponding author: Dai Jian-feng, Master, Lecturer, College of Forestry and Health, Sichuan Radio and TV University, Chengdu , Sichuan Province, China 3310 文章编号 : (2018)

2 Guo R, Dai JF, Luo YM, Zhao HM, Tang P. Regulation of Smad4 by mirna-196a-5p influences gastric cancer stem cell characteristics. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2018;22(21): DOI: /j.issn Abstract BACKGROUND: mirna-196a is a recently discovered micrornas biotarget molecule associated with various tumors such as breast cancer and cervical cancer. Studies have confirmed that mirna-196a-5p is upregulated in both gastric cancer cell line and gastric cancer tissues. However, little is known about the function and mechanism of mirna-196a-5p in gastric cancer stem cells. OBJECTIVE: To analyze the function of mirna-196a-5p in the invasion of gastric cancer stem cells and to investigate the possible mechanism. METHODS: CD44 + gastric cancer stem cells were sorted from the gastric cancer BGC-823 cell line using flow cytometry. The expression of mirna-196a-5p was detected by quantitative real-time PCR (qrt-pcr) and the cell invasion was determined by Transwell assay. With reference to the specification of Lipofectamine 2000m kit, mirna-196a-5p inhibitor (mirna-196a-5p INH) was transferred into the sorted cells. Regulation of Smad4 gene by the mirna-196a-5p was validated by dual-luciferase reporter gene assay. Expression of epithelial-mesenchymal transition-associated proteins (E-cadherin, N-cadherin and Vimentin) and Smad4 protein was evaluated by western blot assay. RESULTS AND CONCLUSION: The mirna-196a-5p was up-regulated in the gastric cancer stem cells (P < 0.05). Inhibiting the mirna-196a-5p expression could reduce the invasion ability of gastric cancer stem cells (P < 0.05), increase the E-cadherin protein expression (P < 0.05), decrease the N-cadherin and Vimentin protein expression (P < 0.05), and enhance the Smad4 protein expression (P < 0.05). Therefore, mir-196a-5p has a key role in epithelial-mesenchymal transition and invasion by targeting Smad4 in the gastric cancer stem cells. mir-196a-5p may serve as a potential target for gastric cancer therapy. Subject headings: Stomach Neoplasms; Neoplasm Invasiveness; Neoplastic Stem Cells; MicroRNAs; Smad4 Protein; Tissue Engineering Funding: the Scientific Research Project of Sichuan Provincial Health and Family Planning Committee in 2017, No. 17PJ041 0 引言 Introduction 胃癌是侵袭性最强的恶性肿瘤之一, 其发病率和死亡率呈逐年增加趋势 [1] 在过去的几十年中, 胃癌的综合治疗方案取得了较大改进和完善, 然而胃癌患者的预后仍不乐观 [2-3] 对其他组织器官的侵袭是导致胃癌患者不良预后的主要原因, 大量证据表明, 肿瘤干细胞 (cancer stem cells,cscs) 在肿瘤的侵袭迁移及治疗耐药性中发挥关键性作用 [4] 肿瘤干细胞是一类未分化的肿瘤细胞, 能够进行自我更新和多向分化, 具有高度致瘤性, 是促进肿瘤侵袭转移的原动力 [5] 微小 RNA(microRNAs) 参与肿瘤干细胞的自我更新侵袭和迁移等过程, 是肿瘤干细胞特性的重要调节因子 [6-7] 寻找参与维持肿瘤干细胞特性的相关 micrornas 分子, 对提高肿瘤干细胞相关治疗方案的疗效具有重大意义 mirna-196a 是新近发现的与乳腺癌宫颈癌等多种肿瘤相关的 micrornas 生物靶分子 [8-9] 研究证实, mirna-196a-5p 在胃癌细胞株和胃癌组织中均表达增加 [10-11], 然而, 关于 mirna-196a-5p 在胃癌干细胞中的功能和机制的研究甚少实验旨在分析 mirna-196a-5p 表达与胃癌干细胞侵袭特性之间的关系, 并对其内在机制进行初步探究, 以期为胃癌的临床治疗提供基础理论 1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计细胞学体外实验 1.2 时间及地点于 2015 年 8 月至 2017 年 12 月在四川省人民医院器官移植转化医学四川省重点实验室完成 1.3 材料人胃癌细胞株 BGC-823 HEK-293T 细胞 ( 美国 ATCC 细胞库 ); 细胞培养基及添加试剂 ( 美国 Gibco 公司 ); CD44-FITC 抗体 ( 美国 Abcam 公司 );mirna 提取试剂盒 (mirvana TM, AM1560); mirna qrt-pcr 引物试剂盒 (Bulge Loop TM,MQP-0101); 引物序列 ( 上海生工生物工程技术服务有限公司 );Lipofectamine 2000 转染试剂 ( 美国 Thermo 公司 ); 双荧光素酶检测试剂盒 ( 广州赛哲生物科技股份有限公司 );E-cadherin N-cadherin Vimentin Smad4 和 GAPDH 抗体 ( 美国 Abcam 公司 ) ; 流式细胞仪 (FACSCalibur, 美国 BD 公司 ); 定量 PCR 仪 (7500, 美国 ABI 公司 ); 显微镜 (CKX41, 日本 OLYMPUS 公司 ) 1.4 实验方法细胞培养人胃癌细胞株 BGC-823 培养于 DH 培养基 ( 含体积分数为 10% 胎牛血清 1% L- 谷氨酰胺 100 U/mL 青霉素和 100 mg/l 链霉素 ),HEK-293T 细胞培养于 DMEM 培养基 ( 含体积分数为 10% 胎牛血清 100 U/mL 青霉素和 100 mg/l 链霉素 ), 均置于 37 体积分数为 5% CO 2 饱和湿度的培养箱中流式细胞术分选胃癌干细胞取对数生长期的 BGC-823 细胞,0.25% 胰蛋白酶消化后, 采用无血清培养基 (DMEM/F12 20 mg/l B27 20 μg/l 碱性成纤维细胞生长因子 10 μg/l 表皮细胞生长因子和 10 μg/l 白血病抑制因子 ) 制备细胞悬液, 加入 CD44-FITC 抗体 ( 稀释比例 1 400), 4 孵育 1 h,pbs 洗涤后, 采用流式细胞仪进行分选, CD44 阳性 (CD44 + ) 细胞即为胃癌干细胞流式细胞仪检测分选前后胃癌细胞中 CD44 + 细胞百分比实时定量 PCR(qRT-PCR) 参照 mirna 提取试剂盒说明书的操作步骤, 提取细胞内的总 RNA, 测定浓度和纯度后, 参照 mirna qrt-pcr 引物试剂盒和 qrt-pcr Starter 试剂盒说明书的反应体系和反应条件 (95,20 s; 95,10 s;60,20 s;97,10 s, 共 40 个循环 ), 采用定量 PCR 仪进行实验,miRNA-196a-5p 正向引物序列 : 5 -CTG GAG TAG GTA GTT TCA TGT TG-3, mirna-196a-5p 反向引物序列 :5 -GTG CAG GGT CCG AGG T-3,U6 正向引物序列 :5 -CTG GCT TCG GCA GCA CAT ATA CT-3,U6 反向引物序列 :5 -ACG CTT CAC GAA TTT GCG TGTC-3, 以 U6 为内参, 计算 mirna-196a-5p 相对表达量 (2 - Ct ) 细胞侵袭实验将 Transwell 小室 (8.0 μm 孔径 ) 放 P.O. Box 10002, Shenyang

3 郭睿, 戴建峰, 罗玉明, 赵海明, 唐鹏. mirna-196a-5p 调控 Smad4 表达对胃癌干细胞特性的影响 [J]. 中国组织工程研究,2018,22(21): DOI: /j.issn 置于 24 孔板中, PBS 稀释 Matrigel 胶后, 取 100 μl 至 Transwell 小室的上室, 置于培养箱中,1 h 后用无血清培养基制备细胞悬液, 接种 100 μl 细胞悬液 ( 约细胞 ) 至 Transwell 小室的上室 ( 避免产生气泡 ),24 孔板下室加入 600 μl 含体积分数为 20% 胎牛血清的培养基, 置于培养箱常规培养 24 h, 棉签擦去上室细胞未侵袭细胞, 将 Transwell 小室置于体积分数为 100% 甲醇中固定 15 min, PBS 洗涤 3 次,DAPI 染色, 显微镜下进行观察, 随机选取 5 个视野, 进行细胞计数细胞转染实验取对数生长期的细胞,0.25% 胰蛋白酶消化后, 制备细胞悬液, 接种于 6 孔板中 ( / 孔 ), 置于培养箱中培养 h, 参照 Lipofectamine 2000 转染试剂说明书的操作步骤, 分别将 mirna-196a-5p inhibitor ( 即 mirna-196a-5p INH) 阴性对照转染至细胞中(miRNA 终浓度为 60 nmol/l),4 h 后更换培养液,72 h 后收集细胞, 用于提取细胞 RNA 和蛋白质双荧光素酶报告基因实验将 Smad4 信使 RNA (mrna) 的 3 - 非编码区 (3 -UTR) 克隆至 psicheck-2 载体, 构建 psicheck-smad4-wt 报告基因质粒 ; 将 Smad4 mrna 3 -UTR 突变后克隆至 psicheck-2 载体, 构建 psicheck-smad4-mut 报告基因质粒取对数生长期的 HEK-293T 细胞,0.25% 胰蛋白酶消化后, 制备细胞悬液, 接种于 24 孔板中 ( / 孔 ), 置于培养箱中培养 h, 参照 Lipofectamine 2000 转染试剂说明书的操作步骤, 将 mirna-196a-5p mimics 或阴性对照 psicheck-smad4-wt 或 psicheck-smad4-mut 及内参质粒 SV40 共转染至细胞中, 置于培养箱中 24 h, 参照双荧光素酶检测试剂盒说明书的步骤进行操作, 计算相对荧光强度 Western blotting 实验收集细胞, 预冷 PBS 洗涤 2 次, 参照细胞蛋白提取试剂盒说明书, 抽提细胞全蛋白, BCA 法测定蛋白浓度, 取等量蛋白, 加入适量 SDS 上样缓冲液 (5 ), 沸水煮沸变性 5 min, 置于 -80 保存 SDS-PAGE 胶分离蛋白后, 湿转法将蛋白转移至 PVDF 膜, 5% BSA 溶液 (TBST 溶液进行配制 ) 室温孵育 1 h, 分别加入 E-cadherin N-cadherin Vimentin Smad4 和 GAPDH 一抗工作液 (TBST 溶液进行稀释 ), 室温孵育 1 h,tbst 溶液洗涤 3 次, 每次 3 min, 分别加入 HRP 标记的相应二抗工作液 (TBST 溶液进行稀释 ), 室温孵育 1 h,tbst 溶液洗涤 5 次, 每次 3 min,ecl 化学发光液进行显影, 以目的蛋白与内参 GAPDH 灰度比值表示目的蛋白的相对表达量 1.5 主要观察指标 1qRT-PCR 检测 mirna-196a-5p 表达 ;2Transwell 实验检测细胞侵袭能力 ;3 双荧光素酶报告基因实验验证 mirna-196a-5p 对 Smad4 基因的调控作用 ;4Western blotting 实验检测上皮间质转化相关蛋白 (E-cadherin N-cadherin 和 Vimentin) 和 Smad4 蛋白表达 1.6 统计学分析所有实验均独立重复至少 3 次, 计量资料以 x _ ±s 形式表示, 统计分析采用 SPSS 20.0 软件两组间差异采用 Student s t 检验, 多细胞间差异采用单因素方差分析 (ANOVA),P < 0.05 为差异有显著性意义 2 结果 Results 2.1 胃癌干细胞的分选采用流式细胞术分选胃癌 BGC-823 细胞系中的肿瘤干细胞, 分选前后 CD44 + 细胞百分比分别为 (3.58±0.95)% 和 (94.65±6.47)%, 差异有显著性意义 (t= ,p=0.000), 成功分选得到胃癌干细胞 2.2 胃癌干细胞的侵袭能力增强 Transwell 实验结果显示,CD44 + 细胞的侵袭细胞数为 (169.54±17.24) 个, 显著高于 CD44 - 细胞 (86.49±9.37) 个, 差异有显著性意义 (t=7.331,p=0.001), 见图 mirna-196a-5p 调节胃癌干细胞的侵袭能力 Real-time PCR 结果显示,CD44 + 细胞中 mirna-196a-5p 相对表达量 (4.28±0.59) 显著高于 CD44 - 细胞 (1.13±0.43), 差异有显著性意义 (t=7.473,p=0.001) Transwell 实验结果显示,CD44 + +mirna-196a-5p INH 组的侵袭细胞数 (75.36±9.24) 个, 明显低于 CD44 + +NC 组 (175.64±14.26) 个, 差异有显著性意义 (t=11.385, P=0.000), 而 CD44 + +mirna-196a-5p INH 组与 CD44 - +NC 组 [(71.65±6.85) 个 ] 之间的侵袭细胞数差异无显著性意义 (t=0.559,p=0.303), 见图 2 Western blotting 实验结果显示,CD44 + +mirna- 196a-5p INH 组 E-cadherin 蛋白相对表达量 (0.41±0.05) 高于 CD44 + +NC 细胞 (0.11±0.02), 差异有显著性意义 (t=9.649,p=0.003),cd44 + +mirna-196a-5p INH 组与 CD44 - +NC 组 (0.43±0.07) 之间差异无显著性意义 (t=-0.643,p=0.278), 见图 3;CD44 + +mirna-196a-5p INH 组 N-cadherin 蛋白相对表达量 (0.09±0.02) 低于 CD44 + +NC 组 (0.22±0.04), 差异有显著性意义 (t=-5.422,p=0.003), CD44 + +mirna-196a-5p INH 组与 CD44 - +NC 组 (0.09± 0.03) 之间差异无显著性意义 (t=-0.480,p=0.328), 见图 3; CD44 + +mirna-196a-5p INH 组中 Vimentin 蛋白相对表达量 (0.13±0.04) 低于 CD44 + +NC 组 (0.89±0.19), 差异有显著性意义 (t=-6.780,p=0.001),cd44 + +mirna-196a-5p INH 组与 CD44 - +NC 组 (0.12±0.03) 之间差异无显著性意义 (t=0.346,p=0.373), 见图 Smad4 是 mirna-196a-5p 靶基因生物信息学软件 ( 分析结果显示, mirna-196a-5p 与 Smad4 mrna 3 -UTR 区域具有潜在结合位点, 见图 4 Western blotting 实验结果显示, CD44 + +mirna-196a-5p INH 组 Smad4 蛋白相对表达量 (2.06±0.29) 高于 CD44 + +NC 组 (0.38±0.06), 差异有显著性意义 (t=9.826,p=0.000),cd44 + +mirna-196a-5p INH 组与 CD44 - +NC 组 (1.98±0.34) 之间差异无显著性意义 (t=0.310,p=0.386), 见图 5 双荧光素酶实验结果显示,miRNA-196a-5p mimics ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH

4 Guo R, Dai JF, Luo YM, Zhao HM, Tang P. Regulation of Smad4 by mirna-196a-5p influences gastric cancer stem cell characteristics. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2018;22(21): DOI: /j.issn psicheck-smad4-wt 细胞的相对荧光强度 (0.46±0.12) 显著低于 NC+psicheck-Smad4-wt 细胞 (1.06±0.14) (t=-5.636, P=0.002), 而 mirna-196a-5p mimics+psicheck-smad4- mut 细胞的相对荧光强度 (1.02±0.13) 与 NC+psicheck- Smad4-wt 细胞 (1.01±0.15) 之间差异无显著性意义 (t=0.087,p=0.467) 3 讨论 Discussion 胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一, 具有高发病率早期诊断率低及高死亡率等恶性特征, 其早期诊断率仅约 10%,5 年总生存率仅约 30%, 严重影响人类的生存质量和生命健康 [12] 流行病学调查结果显示, 中国是胃癌高发国家, 胃癌发病率位居所有恶性肿瘤首位 [13-14], 每年新发病例数约占全球新发病例数的 50%, 死亡率也远高于其他国家, 每年约有 17 万死亡病例 [15] 因此, 寻找能够提高胃癌早期诊断率和治疗疗效的方案仍是肿瘤研究领域的热点近年来的研究证实, 肿瘤干细胞在肿瘤恶性进展 ( 如侵袭复发和化疗耐药等 ) 过程中占有重要地位 [16], 目前, 已成功从乳腺癌结肠癌以及胃癌等肿瘤细胞织中分离鉴定出肿瘤干细胞 [17-19], 同时, 多种靶向肿瘤干细胞的治疗方案也应运而生, 其中以肿瘤干细胞表面过表达的靶分子为 [20] 靶标的靶向治疗是较为有效的治疗策略 Takaishi 等首次分离出胃癌干细胞, 并对其病理学意义进行了初步探究 CD44 是一种跨膜糖蛋白, 是多种肿瘤干细胞的表面标志物 [21-22] [23],Zhang 等研究结果表明,CD44 阳性表达的胃癌细胞具有干细胞特性, 如自我更新多向分化和高致瘤性 [24] 等,Song 等也证实, 胃癌细胞中 CD44 阳性表达的细胞具有干细胞特性, 故 CD44 可用于分离胃癌等肿瘤组织或细胞中的肿瘤干细胞 [25] 实验采用流式细胞术, 成功从胃癌 BGC-823 细胞系中分选出 CD44 阳性表达的胃癌干细胞上皮 - 间质转化不仅在肿瘤侵袭中发挥关键性作用, 在肿瘤复发中也扮演重要角色 [26] 上皮 - 间质细胞转化过程中, 上皮分子 E-cadherin 表达降低, 而间质分子 N-cadherin 和 Vimentin 表达增加 [27-28] 研究证实,microRNAs 可参与调节肿瘤上皮 - 间质细胞转化过程 [29-31],microRNAs 属于非编码 RNA, 通过调控靶基因表达, 参与多种生理病理过程 [32-33], 如 mir-200c 过表达可抑制胰腺癌干细胞侵袭 [34], 而 mir-106b 参与调节胃癌干细胞特性, 尤其可通过转化生长因子 β 信号通路调控肿瘤上皮 - 间质细胞转化过程 [35] 研究发现,miRNA-196a-5p 在胶质母细胞瘤组织早期舌鳞状细胞癌组织中表达均增加 [36-37], 且与患者病情恶性进展关系紧密研究结果显示, 胃癌干细胞的侵袭能力显著高于胃癌非干细胞, 且 mirna-196a-5p 在胃癌干细胞中的相对表达量增加, 提示 mirna-196a-5p 高表达可能参与并促进了胃癌干细胞的侵袭过程实验采用细胞转染方法, 抑制胃癌干细胞中 mirna- 196a-5p 表达后, 发现细胞侵袭能力被明显抑制, 且上皮 - 间质细胞转化相关蛋白表达水平也发生变化, 如上皮分子 E-cadherin 表达增加, 间质分子 N-cadherin 和 Vimentin 表达降低, 提示降低 mirna-196a-5p 表达后, 能显著阻碍胃癌干细胞上皮 - 间质细胞转化过程, 进而抑制侵袭发生紧接着, 双荧光素酶实验结果初步揭示了 mirna-196a-5p 促进胃癌干细胞侵袭的作用机制,miRNA-196a-5p 可特异性与 Smad4 mrna 3 -UTR 结合, 抑制 Smad4 基因表达, Western blotting 实验结果也证实, 抑制 mirna-196a-5p 表达能显著增加 Smad4 蛋白表达水平 Smad4 是转化生长因子 β/smad 信号通路的关键作用分子, 转化生长因子 β1 与受体结合后, 诱导 Smad2/3 蛋白磷酸化后, 进而与 Smad4 结合形成多聚体, 并转移至细胞核中, 调控多种靶基因的表达 [38-39] 大量研究证实, 转化生长因子 β 信号通路参与调控肿瘤上皮 - 间质转化过程 [40-41], 在肿瘤侵袭和复发中发挥关键性作用 [42] 实验并未对 Smad4 调控胃癌干细胞上皮 - 间质转化过程的作用机制进行探究, 后续研究中将进行探讨综上所述, 实验成功分选出胃癌干细胞, 并发现胃癌干细胞的高侵袭性可能与 mirna-196a-5p 高表达相关, 抑制 mirna-196a-5p 表达则可降低胃癌干细胞的侵袭能力, 且细胞中上皮 - 间质转化相关蛋白也发生了相应变化, 双荧光素酶实验结果进一步证实, mirna-196a-5p 可调控 Smad4 基因表达, 这可能是 mirna-196a-5p 促进胃癌干细胞侵袭的作用机制之一,miRNA-196a-5p 具有作为胃癌治疗靶标的潜能作者贡献 : 实验设计实施为郭睿, 实验评估为罗玉明戴建峰, 资料收集为郭睿赵海明唐鹏经费支持 : 该文章接受了 2017 年四川省卫生和计划生育委员会科研课题普及应用项目 (17PJ041) 的资助所有作者声明, 经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道利益冲突 : 文章的全部作者声明, 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突伦理问题 : 研究用细胞的实验方案符合相关伦理学要求, 文章的撰写与编辑修改后文章遵守了国际医学期刊编辑委员会学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范写作指南 : 该研究遵守国际医学期刊编辑委员会学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范文章查重 : 文章出版前已经过 CNKI 反剽窃文献检测系统进行 3 次查重文章外审 : 文章经国内小同行外审专家双盲外审, 符合本刊发稿宗旨生物统计学声明 : 文章统计学方法已经戴建峰专家审核文章版权 : 文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议开放获取声明 : 这是一篇开放获取文章, 根据知识共享许可协议署名 - 非商业性使用 - 相同方式共享 3.0 条款, 在合理引用的情况下, 允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑调整和扩展, 同时允许任何用户阅读下载拷贝传递打印检索超级链接该文献, 并为之建立索引, 用作软件的输入数据或其它任何合法用途 4 参考文献 References [1] Chen W, Zheng R, Zhang S, et al. Report of incidence and mortality in China cancer registries, Chin J Cancer Res. 2013;25(1): P.O. Box 10002, Shenyang

郭睿, 戴建峰, 罗玉明, 赵海明, 唐鹏. mirna-196a-5p 调控 Smad4 表达对胃癌干细胞特性的影响 [J]. 中国组织工程研究,2018,22(21):3310-3315. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.

40) 图注 :CD44 + 胃癌干细胞的侵袭细胞数多于 CD44 - 胃癌细胞 CD44 + +NC 组 CD44 - +NC 组 CD44 + +mirna-196a-5p INH 组图 3 Western blotting 实验检测上皮 - 间质转化相关蛋白表达 Figure 3 Epithelial-mesenchymal transition-associated proteins

CD44 + +NC 组 CD44 - +NC 组 CD44 + +mirna-196a-5p INH 组图 4 Smad4 3 -UTR( 野生与突变 ) 与 mirna-196a-5p 序列配对示意图 Figure 4 The schematic diagram of Smad4 3 -UTR (wild and mutant) matching with the

Stomach development, stem cells and disease. Development. 2016;143(4):554-565. [3] Miller KD, Siegel RL, Lin CC, et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA Cancer J Clin.

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Microsoft Word - 7469-7474张斌6.0最终版.DOC 中国组织工程研究第 17 卷第 42 期 2013 10 15 出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research October 15, 2013 Vol.17, No.42 doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.42.020 [http://www.crter.org] 张斌, 王兵济, 李