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买宫王
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1 生态学杂志 Chinese Journal of Ecology 2015,34(6): 一株快速产脂肽解淀粉芽孢杆菌的筛选及其产物特性 1,2 班允赫 1,2 张潆月 2 史荣久 3 赵峰 2 梁小龙 2 韩斯琴 1 张阳 2 张颖 ( 1 沈阳师范大学, 沈阳 ; 2 中国科学院沈阳应用生态研究所污染生态与环境工程重点实验室, 沈阳 ; 3 哈尔滨工业大学市政环境工程学院城市水资源与水环境国家重点实验室, 哈尔滨 ) 摘要从新疆油田采出水中筛选获得 1 株快速产生物表面活性剂的芽孢杆菌菌株 BQ 2 16S rrna 基因序列分析显示, 该菌株与解淀粉芽孢杆菌 ( Bacillus amyloliquefaciens) 的序列相似性为 99% 以 20 g L -1 的葡萄糖为碳源,5 g L -1 的 NaNO 3 为氮源,BQ 2 在好氧条件下培养 8 h 即可将发酵液的表面张力由 69.7 mn m -1 降至 25.9 mn m -1 ; 第 20 ~ 24 h, 表面活性剂产量迅速增加, 在第 40 h 达到最高产量 mg L -1 薄层层析和红外光谱分析结果显示,BQ 2 的发酵产物为脂肽类生物表面活性剂该表面活性剂的临界胶束浓度 (CMC) 为 30 mg L -1, 且对新疆原油等供试有机化合物具有较好的乳化活性 BQ 2 发酵液在广泛的温度 (20 ~ 121 ) 盐度(NaCl 浓度为 30 ~ 250 g L -1 ) 和 ph(4 ~ 12) 条件下保持稳定活性 BQ 2 产生表面活性剂迅速, 产量较高, 且产物环境稳定性好, 在微生物采油和污染环境修复领域具有较大的应用潜力关键词国家 863 计划项目 (2013AA ) 和大庆油田合作项目资助通讯作者 E mail: yzhang@ iae.ac.cn 收稿日期 : 接受日期 : 生物表面活性剂 ; 解淀粉芽孢杆菌 ; 脂肽 ; 快速发酵 ; 微生物采油中图分类号 Q 文献标识码 A 文章编号 (2015) Isolation of Bacillus amyloliquefaciens for rapid production of lipopeptides and its product characteristics. BAN Yun he 1,2, ZHANG Ying yue 1,2, SHI Rong jiu 2, ZHAO Feng 3, HAN Si qin 2, ZHANG Yang 1, ZHANG Ying 2 ( 1 Shenyang Normal University, Shenyang , China; 2 Key La boratory of Pollution Ecology and Environmental Engineering, Institute of Applied Ecology, Chinese A cademy of Sciences, Shenyang , China; 3 State Key Laboratory of Urban Water Resource and En vironment, School of Municipal and Environmental Engineering, Harbin Institute of Technology, Har bin , China). Chinese Journal of Ecology, 2015, 34(6): Abstract: A bacterial strain BQ 2 that could rapidly produce lipopeptides was isolated from the production water from Xinjiang Oilfield. Phylogenetic analysis of the homoeologous 16S rrna gene sequences showed that BQ 2 shared a 99% sequence similarity with Bacillus amyloliquefa ciens. When cultured with 20 g L -1 of glucose and 5 g L -1 of sodium nitrate as carbon and ni trogen sources, BQ 2 decreased the surface tension of culture medium from 69.7 mn m -1 to 25.9 mn m -1 within 8 h. The rapid increase in the production of biosurfactant occurred within h, and the highest yield of mg L -1 was detected at 40 h. Analyses from thin layer chromatography ( TLC) and infrared spectroscopy ( IF TR) revealed that the biosurfactant pro duced by BQ 2 is lipopeptide with cyclic structure. This biosurfactant had a critical micelle con centration (CMC) of 30 mg L -1, and showed good emulsifying activity (EI 24 ) against various organic compounds such as crude oil from Xinjiang Oilfield. The surface activity of the fermenta tion broth of BQ 2 remained stable under a wide range of temperature ( ), salinity ( g L -1 of sodium chloride), and ph (4-12), respectively. Strain BQ 2 could rapidly produce high yield biosurfactant, with a good environmental stability and this presents a possible great potential in microbial enhanced oil recovery or environmental remediation processes. Key words: biosurfactant; Bacillus amyloliquefaciens; lipopeptide; fast fermentation; microbial enhanced oil recovery ( MEOR).

2 班允赫等 : 一株快速产脂肽解淀粉芽孢杆菌的筛选及其产物特性 1683 生物表面活性剂 ( biosurfactant) 一般是指由微生物产生的兼具亲水和疏水基团具有表面活性的化合物 (Gudiña et al.,2012) 常见的生物表面活性剂主要包括脂肽糖脂磷脂多糖脂类混合物以及一些脂类衍生物等同化学合成的表面活性剂相比, 生物表面活性剂具有低毒可生物降解高表面活性和环境友好等特性, 因而在农业化妆品食品药物环境污染修复和微生物采油等领域具有重大应用潜力 ( Khire et al., 1994; Desai et al., 1997; Makkar et al.,2002) 脂肽类生物表面活性剂能显著降低有机相和水相之间的表 / 界面张力, 有效地乳化原油, 且对温度 ph 和盐度有较好的适应性 (Gudiña et al.,2012), 因此脂肽类表面活性剂产生菌在微生物提高原油采收率领域具有很好的应用潜力芽孢杆菌是工业生产脂肽类表面活性剂的优良菌种 ( Al Bahry et al., 2013), 其中枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌是目前微生物采油领域中报道最多的菌种本研究从新疆油田采出液中筛选到一株解淀粉芽孢杆菌, 具有快速产脂肽类表面活性剂的特性, 并对其发酵产物的特性进行了初步研究, 为利用微生物提高原油采收率提供了新的菌种资源 1 材料与方法 1 1 材料油田采出液油田采出液样品取自新疆克拉玛依油田, 其油藏深度约为 1088 m, 油藏温度为 39, 采出水的矿化度约为 mg L 培养基种子液培养基 ( g L -1 ): 蛋白胨 10, 酵母膏 5,NaCl 5, 调节 ph 至 7.0 ~ 7 2 斜面培养基 (g L -1 ): 蛋白胨 10, 酵母膏 5,NaCl 5,1.8% 琼脂, 调节 ph 至 7.0 ~ 7.2 发酵培养基 ( g L -1 ):NaNO 3 5,NaCl 0 6,KCl 0 6, 微量元素液 5 ml, 葡萄糖 20, KH 2 PO 4 3 4, K 2 HPO 4 4.4,MgSO 4 0.5, 酵母膏 0.5, 调节 ph 至 7.0 ~ 7.2 微量元素液 (g L -1 ):ZnSO 4 7H 2 O 0.29,CaCl 2 4H 2 O 0 24,CuSO 4 5H 2 O 0.25,MnSO 4 H 2 O 0 17 血平板培养基 : 在发酵培养基的基础上补加 1 8% 琼脂, 并加入终浓度为 5% 的无菌脱脂羊血 1 2 表面活性剂产生菌菌株的筛选将新鲜采集的采出水样品 10 倍梯度稀释, 取 0 1 ml 涂布于血平板培养基,37 恒温培养 ; 待长出单菌落后, 挑取周围出现溶血圈的菌落, 转接至新的血平板培养基上, 划线分纯至少 3 次挑取菌龄为 24 h 的纯菌接种至种子液培养基中, 在 r min -1 条件下振荡培养取 24 h 的上述种子液, 以 5% 的接种量转接至发酵培养基中, 并在 r min -1 条件下振荡培养 48 h 取上述发酵液 20 ml, 在 5000 r min -1 条件下离心 10 min 后, 测定其上清液的表面张力将表面张力值低于 35 mn m -1 所对应的菌株保存并用于进一步评价 1 3 菌株的初步鉴定采用细菌基因组 DNA 提取试剂盒 ( TIANamp Bacteria DNA Kit,DP302) 提取特定菌株的基因组 DNA 采用细菌通用引物 27F ( 5 AGAGTTTGATC CTGGCTCAG 3) 和 1492R ( 5 AGAGTTTGATCCTG GCTCAG 3) 扩增目的菌株的 16S rrna 基因 PCR 扩增条件为 :95 预变性 5 min;94 变性 1 min,60 退火 1 min,72 延伸 2 min,30 个循环 ;72 延伸 10 min PCR 扩增产物经 DNA 凝胶回收试剂盒 ( TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.3.0) 纯化后, 送至北京六合华大基因科技股份有限公司测序采用 NCBI 数据库中 BLAST 程序 (http: / / blast. ncbi. nlm. nih. gov / Blast. cgi) 对获得的 16S rrna 基因序列与数据库中已有序列进行序列同源性比对分析 1 4 表面活性剂提取及其特性分析表面活性剂提取将培养菌株的 48 h 发酵液在 g 条件下离心 15 min, 收集上清液用 6 mol L -1 的盐酸调节上清液 ph 至 2.0, 用纱布封口后, 静置于 4 冰箱中过夜将过夜后的悬液在 g 条件下离心 15 min, 收集沉淀, 再用盐酸溶液 (ph = 2) 反复洗涤沉淀 3 次以上, 然后用 NaOH 溶液调节 ph 至中性 ( Yao et al.,2012) 最后用氯仿甲醇 (2 1,V V) 的有机相萃取, 将下层萃取液转移至旋转蒸发仪中, 在 50 下旋转蒸干后, 冷冻干燥, 即得到表面活性剂产物粗品 ( Zhang et al., 1994) 表面活性剂结构的定性分析采用薄层层析分析法取提取的生物表面活性剂粗品溶于二氯甲烷中, 将样品点在硅胶板上, 在氯仿乙酸 (8 2, V V) 中展开 10 min 用茚三酮原位水解显色 ( 吕应年等,2005) 检测取提取的生物表面活性剂粗品溶于二氯甲烷中, 采用傅里叶变换红外光谱仪 ( NICOLET380, USA) 在 100 ~ 4000 cm -1 区域对表面活性剂的粗品

1684 生态学杂志第 34 卷第 6 期进行红外吸收光谱的扫描分析 1 5 产物定量分析采用排油圈法对表面活性剂定量 ( Morikawa et al.,2000) 具体为 : 精确称取 1.4.1 中提取所得的产物粗品溶于蒸馏水中, 配制成不同浓度的产物溶液 (100 200 400 600 800 1000 mg L -1 ); 另在直径为 90 mm 的培养皿中加入 30 ml

表面张力和表面活性剂浓度, 并绘制菌株生长动力学曲线 1 7 表面活性剂临界胶束浓度 (CMC) 的测定精确称取 1.4.

3 1684 生态学杂志第 34 卷第 6 期进行红外吸收光谱的扫描分析 1 5 产物定量分析采用排油圈法对表面活性剂定量 ( Morikawa et al.,2000) 具体为 : 精确称取中提取所得的产物粗品溶于蒸馏水中, 配制成不同浓度的产物溶液 ( mg L -1 ); 另在直径为 90 mm 的培养皿中加入 30 ml 去离子水, 然后缓慢滴入新疆油田原油 20 μl, 待油膜稳定后, 向其中心滴入 10 μl 产物溶液, 测定其排油圈直径根据表面活性剂浓度与排油圈直径之间关系制作标曲线, 测定发酵液中表面活性剂产物浓度 1 6 表面活性剂产生菌菌株生长动力学评价在 r min -1 条件下, 以发酵培养基进行分离菌株纯培养, 在不同培养时间取样, 测定发酵液的 OD 600 表面张力和表面活性剂浓度, 并绘制菌株生长动力学曲线 1 7 表面活性剂临界胶束浓度 (CMC) 的测定精确称取中提取所得的产物粗品溶于蒸馏水中, 配制成不同浓度梯度 (0 ~ 100 mg L -1 ) 的产物溶液, 测定溶液的表面张力, 并依据表面活性剂浓度表面张力曲线求得临界胶束浓度值 1 8 生物表面活性剂的乳化活性取适时的菌株发酵液在 g 条件下离心 15 min, 取其上清液 5 ml, 加入等体积的有机相 ( 液体石蜡石油醚异辛烷环己烷正庚烷苯原油橄榄油等 ) 充分振荡 2 min, 静置 24 h, 测其乳化活性乳化指数公式 : EI 24 = ( 有机相高度 / 总相高度 ) 100% 1 9 表面活性剂的环境适应性分析取适时的菌株发酵液在 g 条件下离心 15 min, 取上清并分别在不同温度 ( ) 下处理 2 h, 在不同 ph ( ) 条件下处理 12 h 在不同盐度 ( g L -1 ) 条件下处理 12 h, 测定上清液的表面张力以评价温度 ph 和盐度对表面活性剂稳定性的影响均能由 mn m -1 降至 30 mn m -1 以下而 BQ 2 菌株 8 h 发酵液的表面张力可降至 25.9 mn m -1, 为 5 株菌中最快且最低的因此, 本文选取该菌株进行后续研究 2 2 BQ 2 菌株的初步鉴定 BQ 2 在 37 下培养 48 h, 菌落呈白色, 不规则, 中央凹陷, 边缘不整齐 ( 图 1); 革兰氏染色为阳性, 产芽孢, 细胞为杆状, 大小约 1.2 ~ 2.1 μm 0.6 ~ 0.75 μm,( 图 2) 16S rrna 基因序列比对结果显图 1 菌株 BQ 2 在 LB 固体培养基上的菌落形态 Fig.1 Colony morphology of BQ 2 strain on solid LB me dium 图 2 菌株 BQ 2 的环境扫描电镜照片 ( 24000) Fig.2 Photomicrograph ( 24000) of strain BQ 2 taken by environmental scanning electron microscope 2 结果与分析 2 1 生物表面活性剂产生菌株的分离筛选采用血平板初筛表面张力复筛的筛选方法, 从新疆油田采出水样品中分离筛选出 5 株表面活性剂产生菌株, 经过 48 h 好氧发酵, 发酵液表面张力图 3 Fig.3 菌株 BQ 2 的 16S rrna 基因系统发育树 Phylogenetic tree of 16S rrna gene of BQ 2 strain

4 班允赫等 : 一株快速产脂肽解淀粉芽孢杆菌的筛选及其产物特性 1685 图 4 Fig.4 BQ 2 菌株好氧发酵产物红外光谱 Infrared spectrum graph of product of strain BQ 2 示, 菌株 BQ 2 与 Bacillus amyloliquefaciens ( UC MB5113,GenBank 登录号 :HG ) 的同源性最高 ( 图 3), 其序列相似性为 99% 2 3 BQ 2 菌株产物定性分析 BQ 2 菌株的发酵产物粗提后的薄层层析显示茚三酮染色呈粉红色, 因此, 初步判断该表面活性剂为脂肽类化合物 BQ 2 粗体产物的红外光谱谱图如图 4 所示, 在和 cm -1 处是脂肪酸链 CH 的伸缩振动 ; cm -1 处是分子链间氢键引起的 NH 收缩振动, 和 cm -1 处是酰胺谱带 Ⅰ 和 Ⅱ, 说明 BQ 2 产物分子中存在肽链结构 ; 和 cm -1 两处是内脂的吸收峰, 推测 BQ 2 产物分子中可能含有环肽结构综合薄层层析和红外光谱的分析结果, 推断 BQ 2 的表面活性产物为一种脂肽类表面活性剂 2 4 BQ 2 菌株的发酵动力学由图 5 可见,BQ 2 在 0 ~ 24 h 处于对数期, 菌体快速生长,OD 600 持续增大生长曲线中没有明显的稳定期, 在 24 h 后进入衰亡期, 在 56 h 出现二次增长现象, 可能是由于此时菌体细胞破裂, 营养物质外放, 而出现芽孢萌发现象 0 ~ 4 h, 表面张力随着菌体生长由 69.7 mn m -1 迅速下降, 并在 8 h 降至最低 (25.9 mn m -1 ) 20 ~ 24 h 产物的量迅速增加, 在 40 h 达到最大值 mg L BQ 2 菌株产物临界胶束浓度 (CMC) 如图 6 所示, 在 0 ~ 30 mg L -1 范围内, 表面张力随着质量浓度的增大逐渐下降, 由 mn m -1 降至 mn m -1, 之后基本保持不变此时图 5 BQ 2 菌株的生长动力学曲线 Fig.5 Kinetic curve of stain BQ 2 图 6 BQ 2 菌株产物浓度与表面张力关系 Fig. 6 Relationship between solution surface tension and product concentration of strain BQ 2

5 1686 生态学杂志第 34 卷第 6 期的质量浓度为 30 mg L -1, 此浓度即为该表面活性产物的临界胶束浓度 2 6 BQ 2 菌株产物乳化活性 BQ 2 菌株发酵产物对原油液体石蜡异辛烷和橄榄油等的乳化活性在 53.03% ~ 84.73%( 图 7), 其中对新疆原油的乳化活性最好 (84.73%) 2 7 BQ 2 菌株产物的环境稳定性在 20 ~ 121 温度范围内,BQ 2 菌株的发酵液的表面活性几乎没有变化 ( 图 8a) 在 ph 5 ~ 12, 发图 7 BQ 2 菌株发酵液对多种有机相的乳化活性 Fig.7 Emulsifying ability of fermentation solution of stain BQ 2 to various organic phases 图 8 温度 (a) ph(b) 及盐度 (c) 对 BQ 2 菌株发酵产物的影响 Fig.8 Effect of temperature (a), ph (b) and salinity (c) on the biosurfactant produced by strain BQ 2 酵液的表面张力均在 30 mn m -1 左右, 影响并不显著, 而由于脂肽类表面活性剂在 ph 为 2 ~ 4 的条件下会析出, 导致发酵液的表面张力上升 ( 图 8b) 从发酵产物对盐的耐受性看 ( 图 8c), 在 30 ~ 150 g L -1 盐度 (NaCl 浓度 ) 范围内, 发酵液的表面张力几乎没有变化, 均在 26 mn m -1 以下但随着盐度的进一步增大, 发酵液的表面张力提高 3 讨论目前, 在微生物采油领域报道的产脂肽类表面活性剂菌种大都是地衣芽孢杆菌 (Bacillus lichenifor mis) ( 肖兵等, 2013) 枯草芽孢杆菌 ( B. subtilis) (Suthar et al.,2008; Gudiña et al.,2013), 也有假单胞菌 (Pseudomonas XD 1)( 尹华等,2005) 克雷伯氏菌 (Klebsiella oxitoca)(kim et al.,2005) 和柴油食烷菌 (Alcanivorax dieselolei B 5) (Qiao et al.,2010) 等而仅有的解淀粉芽孢杆菌在微生物采油中的报道是从胜利油田含油污泥和石油污染土壤中筛选出的解淀粉芽孢杆菌 BZ 6, 能产生脂肽类表面活性剂 (fengycin A), 提高原油的采收率 (Liu et al.,2012) 在细菌系统分类学上, 根据 16S rrna 基因的相似性, 一般认为相似性低于 97% 的 2 个菌株不同种 (Tindall et al.,2010) 本文通过 16S rrna 比对基因的相似性, 并结合形态学观察, 将 BQ 2 菌株鉴定为 Bacillus amyloliquefaciens, 而没有对其进行严格的分类鉴定最终的分类鉴定还需要结合形态学生理生化进化和分子杂交等多项分析才能最终确定该菌的分类地位 BQ 2 的发酵液对几种不同的疏水性有机物均有较好的乳化活性, 这对乳化原油提高采收率和增溶烃类物质进行生物降解都是非常有利的在国内, 油藏温度大多在 20 ~ 60,pH 一般偏碱性, 而由于不同地质条件, 不同地理位置的油藏水型不甚相同, 但最高矿化度一般都在 50 ~ 260 g L -1, 如新疆克拉玛依油区为 150 g L -1 ( Wang et al.,1988) 塔里木油田为 260 g L -1 ( 周明等,2010) 乌尔逊油田最高为 230 g L -1 ( 顾永光,2013) 塔河油田为 180 g L -1 ( 陈国玲等,2013) 胜利油田为 55 g L -1 ( 陈文婷,2011) 等 BQ 2 发酵液在广泛温度 ph 和盐度条件下均具有较高的表面活性, 这就为 BQ 2 表面活性产物在不同地质条件油藏的应用提供了保障 BQ 2 菌株可以在 8 h 内将发酵液的表面张力

6 班允赫等 : 一株快速产脂肽解淀粉芽孢杆菌的筛选及其产物特性 1687 由 69.7 mn m -1 降至 25.9 mn m -1, 而国内外已报道的产表面活性剂菌株一般都需要 24 ~ 48 h 才能将发酵液的表面张力降至最低 ( 吴作军等,2007; So brinho et al., 2008; 罗建波等, 2010; 李娜娜等, 2010; 王健等,2011;Ghojavand et al.,2011; 肖兵等, 2013), 只有少数菌株仅需要 12 h 以内 ( Nitschke et al.,2006;al Bahry et al.,2013) BQ 2 菌产表面活性物质速度较快的特性对于微生物驱油的实际应用具有重要意义常规的微生物驱油分为地面发酵法和地下发酵法 2 种地面发酵法主要是利用地面发酵设备培养表面活性剂产生菌, 而后将产物注入地下油藏中, 以达到微生物驱油的目的地下发酵法主要是通过向油藏中注入筛选到的功能菌和 / 或营养激活剂, 使功能菌在油藏原位进行生长代谢, 产生表面活性剂以达到微生物驱油的目的但是, 地下油藏的缺氧环境, 导致地下发酵法的应用实施需要在注入激活剂的同时向油井中注入空气然而, 无论是激活剂, 还是空气, 一旦注入油藏这一复杂环境, 都会在一定时间内迅速流失 BQ 2 菌株具有快速发酵产表面活性剂的特性, 能够在油藏注入空气和激活剂的初期, 快速地利用空气和激活剂, 产生表面活性剂, 降低发酵液的表面张力, 缩短发酵周期, 提高发酵效率, 因此具有既适应于地面法发酵又适应于地下法发酵的应用潜力在微生物发酵过程中, 表面活性剂的产量与发酵条件有着密切的关系, 不同培养基成分和培养条件对表面活性剂的产量有一定影响解淀粉芽孢杆菌可广泛利用各种常见种类的碳源及混合碳源, 在实际应用中, 还应针对廉价的碳源和氮源进行配方优化, 以及发酵条件的优化, 在保证一定表活剂产量的同时, 简化激活剂配方, 降低成本参考文献陈国玲, 郭秀东高矿化度油田污水微生物水处理室内研究. 化学工程与装备, (5): 陈文婷油田采出水处理技术综合评价 ( 硕士学位论文 ). 青岛 : 中国石油大学 ( 华东 ). 顾永光乌尔逊油田矿化度规律研究. 内蒙古石油化工, (22): 李娜娜, 史荣久, 郝金生, 等表面活性剂产生菌 SQ6: 筛选及其发酵液表面活性. 生态学杂志, 9( 8): 吕应年, 杨世忠, 牟伯中一株脂肽类生物表面活性剂产生菌的筛选. 微生物杂志, 25(2): 4-8. 罗建波, 吴卫霞, 张凡一株产脂肽类生物表面活性剂菌株的分离及代谢产物分析. 化学与生物工程, 27 (2): 王健, 孙玉梅, 王培忠, 等生物表面活性剂产生菌的筛选及特性研究. 大连工业大学学报, 30( 1): 吴作军, 李宝珍, 袁红莉 Bacillus sp. W112 产生表面活性剂条件优化及其特性. 过程工程学报, 7(6): 肖兵, 杨德玉, 史荣久, 等一株高效表面活性剂产生菌的筛选及其活性产物的结构与性质. 生态学杂志, 32(3): 尹华, 谢丹平, 彭辉, 等假单胞菌 XD 1 (Pseuomonas XD 1) 的产表面活性剂性能研究. 环境科学学报, 25(2): 周明, 冯积累, 江同文, 等塔里木油田高温高矿化度油藏三次采油初步研究. 新疆石油地质, 31(2): Al Bahry SN, Al Wahaibi YM, Elshafie AE, et al Bio surfactant production by Bacillus subtilis B20 using date molasses and its possible application in enhanced oil recov ery. International Biodeterioration & Biodegradation, 81: Desai JD, Banet IM Microbial production of surfactants and their commercial potential. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 61: Ghojavand H, Vahabzadeh F, Azizmohseni F A halotol erant, thermotolerant, and facultative biosurfactant produc er identification and molecular characterization of a bacteri um and evolution of emulsifier stability of a lipopeptide bio surfactant. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 16: Gudiña EJ, Pereira JFB, Costa R, et al Biosurfactant producing and oil degrading Bacillus subtilis strains en hanced oil recovery in laboratory sand pack columns. Jour nal of Hazardous Materials, 261: Gudiña EJ, Pereira JFB, Rodrigues LR, et al Isolation and study of microorganisms from oil samples for applica tion in microbial enhanced oil recovery. International Biode terioration & Biodegradation, 68: Khire JM, Khan MI Microbially enhanced oil recovery ( MEOR). Part 2. Microbes and subsurface environment for MEOR. Enzyme and Microbial Technology, 16: Kim P, Kim JH Characterization of a novel lipopolysac charide biosurfactant from klebsiella oxitoca. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 10: Liu WX, Wang XB, Wu LH, et al Isolation, identifica tion and characterization of Bacillus amyloliquefaciens BZ

7 1688 生态学杂志第 34 卷第 6 期 6, a bacterial isolated for enhanced oil recovery from oily sludge. Chemosphere, 87: Makkar RS, Cameotra SS An update on the use of uncon ventional substrates for biosurfactant production and their new applications. Applied Microbiology and Biotechnology, 58: Morikawa M, Hirata Y, Imanaka T A study on the struc ture function relationship of lipopeptide biosurfactant. Bio chimica et Biophysica Acta, 1488: Nitschke M, Pastore GM Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology, 97: Qiao N, Shao ZZ Isolation and characterization of a novel biosurfactant produced by hydrocarbon degrading bacterium Alcanivorax dieselolei B 5. Journal of Applied Microbiology, 108: Sobrinho H, Rufino R, Luna J, et al Utilization of two agroindustrial by products for the production of a surfactant by Candida sphaerica UCP0995. Process Biochemistry, 43: Suthar H, Hingurao K, Desai A, et al Evaluation of bio emulsifier mediated microbial enhanced oil recovery using sand pack column. Journal of Microbiological Methods, 75: Tindall BJ, Rossello Mo ra R, Busse HJ, et al Notes on the characterization of prokaryote strains for taxonomic pur poses. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 60: Wang ZH, Zhang SJ Discovery and characteristics of high mineralized soda dicarbonate typed water in karamay oil region. Experimental Petroleum Geology, 20: Yao DH, Ji ZX, Wang CJ, et al Co producing iturin A and poly γ glutamic acid from rapeseed meal under solid state fermentation by the newly isolated Bacillus subtilis strain World Journal of Microbiology and Biotechnolo gy, 28: Zhang YM, Miller RM Enhanced octadecane dispersion and biodegradation by a Pseudomonas rhamnolipid surfac tant ( biosurfactant). Applied and Environmental Microbiolo gy, 58: 作者简介班允赫, 男,1988 年生, 硕士研究生主要从事环境微生物学方面研究 E mail: @ 163.com 责任编辑张敏

L 8 0 g L ~0 700 g L % 6 00% 1 50% 1 3 NaCl 0 50% NH 4 2 SO % KH 2 PO % CaCO % 0 03% ~ 0 04% 2 24 h 0 02

L 8 0 g L ~0 700 g L % 6 00% 1 50% 1 3 NaCl 0 50% NH 4 2 SO % KH 2 PO % CaCO % 0 03% ~ 0 04% 2 24 h 0 02 38 5 Vol 38 No 5 2014 9 Journal of Jiangxi Normal UniversityNatural Science Sep 2014 1000-5862201405-0501-05 1 1* 2 2 1 3300222 330052 Streptomyces lincolnensis 13 8 6% 12 4% Q 93 A 0 1 2 Streptomyces