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1 土壤 (Soils), 2013, 45(4): 一株根际好氧反硝化菌的筛选及其反硝化条件研究 1,2 1,2 1* (1 ( ) ; ) RWX31 NO 3 -N 140 mg/l 24 h 82% N 2 O RWX31 1% Mg g/l NO 2 -N 0 28 ~ 32 ph 7.0 ~ 7.5 C/N 8 ~ 12 DO 6.5 ~ 7.0 mg/l NO 3 -N 90% RWX31 NO 3 -N X52 [1] [2-4] 1983 Robertson [5] Thiosphaera pantotropha [6-9] ph [10] RWX (EM g/l) 5 KNO 3 2 KH 2 PO 4 1 K 2 HPO Mg 2 SO 4 7 H 2 O ml ph % EM (g/l) EDTA 50.0 ZnSO 4 7H 2 O 2.2 CaCl 2 2H 2 O 5.5 MnCl 2 4H 2 O 5.06 FeSO 4 7H 2 O 5.0 (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 4H 2 O 1.1 CuSO 4 5H 2 O 1.57 CoCl 2 6H 2 O 1.61 ph (DM g/l) 5 KNO 3 ( ) ( ) ( ) * (wmshi@mail.issas.ac.cn) (1985 ) zhouyingru1985@163.com

2 KH 2 PO 4 1 K 2 HPO Mg 2 SO 4 7H 2 O 0.2 ph Luria-Bertani (LB g/l) 10 5 NaCl 5 ph % LB Steinberg NH 4 Cl 12.5 KH 2 PO Mg 2 SO 4 7H 2 O 100 Ca(NO 3 ) 2 4H 2 O 98.9 Na 2 EDTA 2H 2 O 1.5 ZnSO 4 7H 2 O 0.18 MnCl 2 4H 2 O 0.18 H 3 BO NaMoO 4 2H 2 O 0.04 FeCl 3 6H 2 O 0.76 ph g ( 5 cm) 10 ml 250 ml EM 160 r/min 28 1 h 1 ml 9 ml EM ml EM Lemna minor 3 Steinberg 15 mg/l KNO % / 16 h/8 h ml 1 ml 5 mg/l (Na 5 P 3 O 10 ) 150 W 6 5 s EM [11] N 2 O 250 ml 100 ml DM 1 ml RWX31 (OD 600 = 0.5) μm (80% He + 20% O 2 )( 15 min 3 ) r/min h NO 3 -N TN N 2 O 1.3 RWX31 LB ( 12 h) 1% 100 ml r/min OD 600 NO 3 -N NO 2 -N TN LB 1.4 RWX31 1 ml (OD 600 = 0.5) 100 ml r/min 24 h OD 600 NO 3 -N NO 2 -N DM ml Mg 2+ DM Mg g/l NO 2 -N DM TN 140 mg/l NO 2 -N NO 2 -N 1.5 RWX ph ph C/N C/N (DO) DO r/min 1.6 (Bio-Rad 3000 USA) 600 nm NO 3 -N NO 2 -N N-(1- )- TN - DO JPB-607 N 2 O ( Porapak Q 3 m 3 mm) 3 Excel 2003 SPSS 17.0 Duncan (P 0.05

3 mg/l NO 3 -N 24 h 6 NO 3 -N 70% % 4 3 [12] [13] [14] % ~ 70% (34) 50% RWX31 RWX31 16S rrna RWX31 Pseudomonas [15] 表 1 环境样品中分离反硝化菌株 Table 1 Denitrifying bacteria isolated from different samples (%) ( >75%) (%) ~ ~ ~ ~ RWX31 DM 80% He + 20% O 2 24 h DO 3.8 ~ 5.9 mg/l O 2 [16] RWX31 N 2 O NO 3 -N mg/l TN mg/l N 2 O mg/kg 24% NO 3 -N 18% NO 3 -N 58% N 2 O-N 1% N 2 RWX RWX31 RWX31 1% DM OD 600 NO 3 -N TN 4 1 RWX31 9 h 21 h 18 ~ 21 h NO 3 -N RWX31 12 h NO 3 -N 12 h 21 h 24 h NO 3 -N 25 mg/l [17] X31 36 h NO 3 -N N 2 O 24 h NO 3 -N 82% 24 h TN NO X -N TN [18] 1 36 h NO 3 -N 80% TN 76% [19]

4 CW 24 h 108 mg/l NO 3 -N 75% [4] YL-1 24 h 115 mg/l NO 3 -N 50% [20] 2-8 NO 3 -N 140 mg/l 48 h 92% RWX mg/l NO 3 -N 24 h 82% RWX31 图 1 菌株 RWX31 生长与 - NO 3 -N 和 TN 去除曲线 Fig.1 Growth curve and -N and TN remove performance of strain RWX RWX31 2 RWX31 24 h 91.5% P. stutzeri D6 [21] D5 [22] 2 RWX31 NO 3 -N RWX31 RWX31 DM 24 h OD 600 NO 3 -N 表 2 菌株 RWX31 在不同碳源中的反硝化活性 Table 2 Denitrification activity of strain RWX31 in different carbon sources OD 600 NO2 -N (%) % OD % NO 3 -N OD 600 [23] AM-4 2% 图 2 初始接种量对 RWX31 生长和反硝化效率的影响 Fig. 2 Effects of inoculation size on growth and denitrification performance of strain RWX Mg 2+ RWX31 Mg 2+ [24] Mg 2+ 3 Mg 2+ 0 NO 3 -N 6.8% Mg g/l Mg 2+ Mg g/l Mg 2+ NO 2 -N [24] Mg 2+

5 4 687 表 3 Mg 2+ 浓度对 RWX31 反硝化作用的影响 Table 3 Effect of Mg 2+ concentration on denitrification of strain RWX31 Mg 2+ (g/l) OD 600 NO2 -N (%) NO 2 -N RWX31 NO 2 -N 4 NO 2 -N % NO 2 -N NO 2 -N NO 2 -N NO 2 -N 50% RWX31 NO 2 -N NO 2 -N NO 2 -N 20 ~ 30 mg/l NO 2 -N [25] NO X -N NO 2 -N ph NO 2 -N NO 2 -N NO X -N 20 mg/l 140 mg/l NO 2 -N [26] AQ-3 NO 2 -N 20 mg/l RWX31 25 ~ 35 [27] ( 3a) 30 - 表 4 NO2 -N 在初始氮源中所占比例对 RWX31 反硝化作用的影响 Table 4 Effect of nitrite proportion on denitrification of strain RWX31 NO2 -N (%) OD 600 NO2 -N -N (%) h 92.7% NO 3 -N 30 [28] F1 NO 3 -N 30 ~ ph RWX31 ph [29] 3b RWX31 ph % (ph < 6) (ph > 7.5) RWX C/N RWX31 C/N C/N [30] 3c RWX31 C/N C/N 10 NO 3 -N 91.2% C/N RWX31 Chiu [31] C/N Stouthamer [32] C/N DO RWX31 DO DO [4,33-34] 0 50 r/min (DO 3.5 ~ 5.8 mg/l) NO 3 -N 63% 31.2%

6 ~ 250 r/min (DO 6.5 ~ 7.0 mg/l) NO 3 -N 90% Robertson Kuenen [16] 3 O 2 ( ) O 2 ( 1% ~ 2% DO 0.1 ~ 0.2 mg/l) O ~ 250 r/min (DO 6.5 ~ 7.0 mg/l) 100 r/min RWX31 RWX31 Patureau [35] NO X O 2 DO DO RWX31 NO 3 -N DO 100 ~ 250 r/min (DO 6.5 ~ 7.0 mg/l) Fig.3 图 3 培养温度 ph 碳氮比和摇床转速对 RWX31 反硝化作用的影响 Effects of temperature, ph, carbon nitrogen ration and shaking speed on denitrification of strain RWX31 3 RWX mg/l NO 3 -N 24 h NO 3 -N 82% N 2 O RWX31 RWX31 1% Mg g/l NO 2 -N 28 ~ 32 ph 7.0 ~ 7.5 C/N 8 ~ 12, DO 6.5 ~ 7.0 mg/l RWX31 NO 3 -N 140 mg/l 24 h 90% RWX31 [1],,,,,,,,. [J]., 2012, 44(2): [2] Borges MT, Sousa A, De Marco P, Matos A, Honigova P, Castro PML. Aerobic and anoxic growth and nitrate removal capacity of a marine denitrifying bacterium isolated from a recirculation aquaculture system[j]. Microbial Ecology, 2008, 55(1): [3] Kim M, Jeong SY, Yoon SJ, Cho SJ, Kim YH, Kim MJ, Ryu EY, Lee SJ. Aerobic denitrification of Pseudomonas putida AD-21 at different C/N ratios[j]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2008, 106(5): [4],,,,,. [J]., 2010, 16(3):

7 4 689 [5] Robertson LA, Kuenen JG. Anaerobic and aerobic denitrification by sulphide-oxidizing bacteria from waste water[j]. Proceedings of the European Symposium on Anaerobic Waste Water Treatment, 1983: 3-12 [6] Robertson LA, Cornelisse R, Vos P, Hadioetomo R, Kuenen JG. Aerobic denitrification in various heterotrophic nitrifiers[j]. Antonie van Leeuwenhoek, 1989, 56(4): [7] Su JJ, Liu BY, Liu CY. Comparison of aerobic denitrification under high oxygen atmosphere by Thiosphaera pantotropha ATCC and Pseudomonas stutzeri SU2 newly isolated from the activated sludge of a piggery wastewater treatment system[j]. Journal of Applied Microbiology, 2001, 90(3): [8] Yang XP, Wang SM, Zhang DW, Zhou LX. Isolation and nitrogen removal characteristics of an aerobic heterotrophic nitrifying-denitrifying bacterium, Bacillus subtilis A1[J]. Bioresource Technology, 2011, 102(2): [9],. NO X [J]., 2010, 23(3): [10],,,. [J]., 2010, 21(6): [11] Yamaga F, Washio K, Morikawa M. Sustainable biodegradation of phenol by Acinetobacter calcoaceticus P23 isolated from the rhizosphere of duckweed Lemna aoukikusa[j]. Environmental Science & Technology, 2010, 44(16): [12] Kuiper I, Lagendijk EL, Bloemberg GV, Lugtenberg BJJ. Rhizoremediation: a beneficial plant-microbe interaction[j]. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2004, 17(1): 6-15 [13],,,,. [J]., 2010, 42(3): [14],,,. [J]., 1987, 24(2): [15] Zhou YR, Lu YF, Zhang HL, Shi WM. Aerobic denitrifying characteristics of duckweed rhizosphere bacterium RWX31[J]. African Journal of Microbiology Research, 2013, 7(3): [16] Robertson LA, Kuenen JG. Aerobic denitrification: A controversy revived[j]. Archives of Microbiology, 1984, 139(4): [17],,,. X31 [J]. ( ), 2005, 33(7): [18],,. [J]., 2006, 43(3): [19], 婓,,. [J]., 2012, 38(1): [20],,,,. [J]., 2010, 50 (9): [21] Yang XP, Wang SM, Zhou LX. Effect of carbon source, C/N ratio, nitrate and dissolved oxygen concentration on nitrite and ammonium production from denitrification process by Pseudomonas stutzeri D6[J]. Bioresource Technology, 2012, 104: [22],. 1 [J]., 2009, 2(3): [23],,. [J]. ( ), 2012, 36(1): [24]. ( )[D]. :, 2006 [25],,,,,. ph [J]., 2005, 15(8): [26],,,. [J]., 2012, 39(2): [27] Song ZF, An J, Fu G H, Yang XL. Isolation and characterization of an aerobic denitrifying Bacillus sp. YX-6 from shrimp culture ponds[j]. Aquaculture, 2011, 319(1/2): [28],. [J]., 2011(1): [29] Thomas KL, Lloyd D, Boddy L. Effects of oxygen, ph and nitrate concentration on denitrification by Pseudomonas species[j]. FEMS Microbiology Letters, 1994, 118(1/2): [30],,. [J]., 2009, 32(8): 9-12 [31] Chiu YC, Chung MS. Determination of optimal COD/nitrate ratio for biological denitrification[j]. International Biodete rioration & Biodegradation, 2003, 51(1): [32] Stouthamer A. Metabolic pathways in Paracoccus denitrificans and closely related bacteria in relation to the phylogeny of prokaryotes[j]. Antonie van Leeuwenhoek, 1992, 61(1): 1-33 [33] Taylor SM, He Y, Zhao B, Huang J. Heterotrophic ammonium removal characteristics of an aerobic heterotrophic nitrifying- denitrifying bacterium, Providencia rettgeri YL[J]. Journal of Environmental Sciences, 2009, 21(10): [34] Zhang QL, Liu Y, Ai GM, Miao LL, Zheng HY, Liu ZP. The characteristics of a novel heterotrophic nitrification aerobic denitrification bacterium, Bacillus methylotrophicus strain L7[J]. Bioresource Technology, 2012, (108): [35] Patureau D, Bernet N, Delgenès JP, Moletta R. Effect of dissolved oxygen and carbon nitrogen loads on denitrification by an aerobic consortium[j]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2000, 54(4):

8 Isolation and Denitrification Conditions of Rhizosphere Aerobic Denitrifying Bacterium RWX31 ZHOU Ying-ru 1,2, LU Yu-fang 1,2, SHI Wei-ming 1 (1 State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture(Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences), Nanjing ,China; 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing , China) Abstract: The aim of this study was to screen aerobic denitrifying strain from various environmental sites and to investigate the denitrification conditions for the isolated strain. Enrichment culture technique was used in screening and acclimatization of strain, a rhizosphere aerobic denitrifying bacterium RWX31 was isolated and single-factor experiments were used to investigate the denitrification conditions and characteristics. The nitrate remove efficiency of aerobic denitrifying strain RWX31 was 82% when cultivated in 140 mg/l nitrate for 24 hours, N 2 O could be produced aerobically through aerobic denitrification of strain RWX31. The optimum medium was: sodium citrate as carbon source, 1% inoculation volume, 0.05 g/l Mg 2+ concentration and nitrite proportion of 0 in the initial denitrification nitrogen source. The optimum condition was: temperature 28-32, ph , C/N ratio 8-12 and DO concentration mg/l. The highest nitrate removal efficiency was higher than 90% under the above conditions. Rhizosphere bacterium RWX31 was an efficient aerobic denitrifying strain with higher nitrate removal efficiency than reported previously and has application potential. Key words: Rhizosphere, Aerobic denitrifying, Nitrate nitrogen removal efficiency, Condition investigation

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