3 期丁立云, 等 : 饲料磷脂对已交配和未交配雌性三疣梭子蟹卵巢发育 组织学和卵黄蛋白原表达的影响 367 究较少 三疣梭子蟹 (Portunus trituberculatus) 隶属于 甲壳纲 (Crustacea) 梭子蟹科 (Portunidae) 梭子 蟹属 (Portunus), 广泛

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1 第 42 卷第 3 期水产学报 Vol. 42, No 年 3 月 JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA Mar., 2018 文章编号 : (2018) DOI: /jfc 饲料磷脂对已交配和未交配雌性三疣梭子蟹卵巢发育 组织学和卵黄蛋白原表达的影响 丁立云 1,2, 付辉云 2, 侯迎梅 1, 霍雅雯 1, 孙蓬 1, 金敏 1 1*, 周歧存 (1. 宁波大学海洋学院, 鱼类营养研究室, 浙江宁波 ; 2. 江西省水产科学研究所, 江西南昌 ) 摘要 : 为探讨饲料磷脂对已交配和未交配雌性三疣梭子蟹卵巢发育 组织学结构和卵黄蛋白原基因表达的影响, 本研究采用 2 2 双因子随机区组设计 ( 日粮类型 :0% 和 4% 大豆卵磷脂 ; 三疣梭子蟹交配处理 : 已交配和未交配 ), 共 4 个处理组, 以大豆卵磷脂 0% 和 4% 两种人工配合饲料分别投喂交配和未交配两组三疣梭子蟹雌蟹, 进行了为期 12 周的饲养实验 结果显示, 无论三疣梭子蟹是否交配, 饲料中添加 4% 大豆卵磷脂可显著增加三疣梭子蟹的卵巢指数, 提高血清中卵黄蛋白原 孕酮和雌二醇的浓度, 增大卵母细胞直径 ; 同时上调肝胰腺卵黄蛋白原 mrna 相对表达量, 但无显著性差异, 肝胰腺指数呈现出和卵巢指数相反的趋势 ; 交配后的三疣梭子蟹卵巢指数 肝胰腺卵黄蛋白原 mrna 表达量显著高于未交配组 组织学观察显示, 交配使得三疣梭子蟹卵母细胞沉积更丰富的卵黄颗粒, 促进卵母细胞成熟, 交配处理对肝胰腺指数和血清中卵黄蛋白原及孕酮的水平无显著性影响 此外, 饲料磷脂水平和交配处理的交互作用显著影响了三疣梭子蟹血清中类固醇激素孕酮和雌二醇的浓度 本实验结果显示, 饲料中大豆磷脂和交配处理均能促进雌性三疣梭子蟹的卵巢发育, 交配处理对卵母细胞成熟的促进作用更为明显 关键词 : 三疣梭子蟹 ; 大豆磷脂 ; 卵巢发育 ; 组织学 ; 卵黄蛋白原中图分类号 : S 文献标志码 : A 磷脂是细胞膜的重要结构组分, 甲壳动物体内不能合成磷脂或合成量过少, 不能满足其正常生长和发育的需要 [1-2] 甲壳类动物成熟卵母细胞中积累的主要物质是卵黄体和脂肪滴, 卵黄体组成中约 90% 的物质是卵黄磷蛋白, 而卵黄磷蛋白主要由蛋白质 (50%) 脂肪(48%) 和碳水化合物 (2%) 组成, 其中脂肪组成中含量最高的脂类物质是磷脂 [3-4] 在卵巢发育过程中, 磷脂对脂类营养物质从肝胰腺经血淋巴转运到卵巢起着重要作用 已有的研究表明, 饲料中的磷脂 可以显著促进中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis) [5-6] 红螯光壳螯虾 (Cherax quadricarinatus) [7] 和凡纳滨 对虾 (Litopenaeus vannamei) [8] 等甲壳类动物的卵巢 发育, 进而提高幼体体质量和生殖性能 交配 [9] 是甲壳类动物两性生殖的重要生命行为 贾磊 指出, 三疣梭子蟹在自然状态下, 生殖蜕壳 后, 没有交配的雌蟹卵巢发育会停止, 因为交 配是诱导甲壳类动物滤泡细胞向卵母细胞迁移 和卵黄发生的前提 迄今为止, 有关磷脂和交 配处理对甲壳类动物卵巢发育及卵黄发生的研 收稿日期 : 修回日期 : 资助项目 : 国家自然科学基金 ( ); 浙江省重点研发计划项目 (2017C02G ); 浙江省水产动物营养与饲料科技服务团队项目 (ZJANFTST ); 浙江省重中之重一级学科建设项目通信作者 : 周歧存, zhouqicun@nbu.edu.cn

2 3 期丁立云, 等 : 饲料磷脂对已交配和未交配雌性三疣梭子蟹卵巢发育 组织学和卵黄蛋白原表达的影响 367 究较少 三疣梭子蟹 (Portunus trituberculatus) 隶属于 甲壳纲 (Crustacea) 梭子蟹科 (Portunidae) 梭子 蟹属 (Portunus), 广泛分布于中国 日本和韩国 沿海地区, 其肉肥细嫩, 味道鲜美, 营养丰 富, 已成为我国重要海水养殖种类之一 [10-11] 国 内外有关三疣梭子蟹饲料营养素方面的研究, 主要集中在幼蟹对蛋白质 [12] 蛋能比 [13] 脂肪 [14] [15] [16] 氨基酸和脂肪酸的营养需求, 而研究亲蟹较 [17] [18] 少, 仅见高不饱和脂肪酸和花生四烯酸对三 疣梭子蟹卵巢发育影响的公开报道 甲壳类动 物亲体的营养状态极大地影响性腺成熟 繁殖 性能 卵子和幼蟹的质量 [19-20] 因此, 研究饲料 营养素对甲壳类动物亲体卵巢发育的影响具有 重要意义 本实验以大豆卵磷脂 0% 和 4%2 种人 工配合饲料投喂交配和未交配 2 组三疣梭子蟹雌 蟹 12 周, 研究大豆卵磷脂对已交配和未交配三疣 梭子蟹性腺指数 组织学结构和卵黄蛋白原基 因表达的影响, 以期为三疣梭子蟹亲体配合饲 料的生产提供指导, 并为今后深入研究三疣梭 子蟹生殖生理学和营养繁殖学提供基础资料 1 材料与方法 1.1 实验动物 2015 年 9 月在浙江宁波象山选择身体健康 规格相近 未交配的三疣梭子蟹雌蟹作为亲 蟹, 随后放入单体筐中进行养殖和交配, 交配 方法见卢少坤等 [21] 然后随机挑选健康 规格一 致的已交配雌性三疣梭子蟹 (mated crabs) 和未交 配雌性三疣梭子蟹 (unmated crabs) 各 120 只饲养于 240 个塑料饲养筐内 (40 cm 40 cm 40 cm), 待后 续分组实验 1.2 实验饲料 本实验以鱼粉 豆粕和磷虾粉为蛋白源, 鱼油和豆油为脂肪源, 配制成粗蛋白含量约为 42% 粗脂肪含量约为 13% 的 2 种等氮等脂饲料, 分为 A 组 ( 添加 0% 大豆卵磷脂 ) 和 B 组 ( 添加 4% 大豆 卵磷脂 ) 实验饲料配方及营养生化成分见表 1 和 表 2 复合维生素和矿物质为实验室自行配置, 其他饲料原料均购自宁波天邦股份有限公司 所有原料粉碎后过 80 目筛, 按比例添加混匀后, 以双螺杆挤条机挤压并经饲料颗粒机进行制 粒, 饲料直径 0.4 cm, 长度 1.5 cm, 所制饲料 表 1 实验饲料的原料组成及营养成分 ( 干饲料 ) Tab. 1 原料 ingredients 90 C 熟化 30 min, 阴凉处风干, 于 20 C 下密封 保存备用 Ingredients and nutritional ingredient of 1.3 实验设计及饲养管理 experimental diets (dry matter) % 饲料中大豆磷脂水平 dietary soy lecithin levels A (0%) B (4%) 鱼粉 fish meal 豆粕 soybean meal 面粉 wheat flour 磷虾粉 krill meal 鱼油 fish oil 豆油 soybean oil 大豆卵磷脂 soy lecithin 复合矿物质 mineral mix 复合维生素 vitamin mix 氯化胆碱 choline chloride 磷酸二氢钙 Ca (H 2 PO 4 ) 胆固醇 cholesterol 海藻酸钠 sodium alginate 营养成分 nutritional ingredient 粗蛋白 crude protein 粗脂肪 crude lipid 灰分 ash 干物质 dry matter 注 :1. 大豆磷脂油, 符合国标 GB/T , 购于宁波天邦股份有限公司, 丙酮不溶物为 63.3%;2. 复合矿物质和复合维生素配方组 [15] 成参照 Jin 等 Notes: 1.liquid soy lecithin (63.3% acetone insoluble), supplied by Ningbo Tech-Bank Corp., Ningbo, China; 2.Vitamin premix and mineral premix were based on Jin et al [15] 实验采用 2 2 双因子随机区组设计 : 三疣梭 子蟹 ( 已交配和未交配 ), 日粮类型 (0% 和 4% 大豆 卵磷脂 ) 选择规格相近的已交配和未交配的雌 性三疣梭子蟹各 120 只, 分别随机等分为 2 个处理 组, 共 4 个处理组, 每个处理设 3 个重复, 每个重 复 20 只蟹, 共 240 只梭子蟹饲养于 240 个塑料饲养 筐内 (40 cm 40 cm 40 cm), 塑料饲养筐随机放置 于 3 个 4 m 8 m 的水泥池中 实验开始前统一用

3 368 水产学报 42 卷 Tab. 2 脂肪酸 fatty acids 表 2 实验饲料的脂肪酸组成 Fatty acid compositions (total fatty acids) of the experimental diets % 饲料中大豆磷脂水平 dietary soy lecithin levels A (0%) B (4%) C12: C14: C16: C18: C20: C22: C24: SFA C14:1n C16:1n C18:1n C18:1n C20:1n C20:1n C22:1n MUFA C16:2n C18:2n C18:3n C20:2n C20:3n C20:4n C22:5n n C18:3n C18:4n C20:3n C20:4n C20:5n C22:5n C22:6n n PUFA HUFA % 大豆卵磷脂组饲料驯化一周, 实验开始后每 天投喂 1 次, 日投喂量为其体质量的 3%~5% 实 验期间水温 20~26 C, 溶解氧 6.5~7.0 mg/l 氨氮 浓度 0.5 mg/l ph 7.8~8.2, 盐度 26~28,2~3 d 换水 1 次, 每次换水量约为 30%, 实验为期 12 周 1.4 样品采集与分析 饲料常规成分和脂肪酸检测 参照侯迎 [22] 梅等方法, 分别测定饲料中的水分 粗蛋白 粗脂肪 粗灰分和脂肪酸含量 生物学参数的测定 实验结束后擦干体 表水分, 用电子天平称量梭子蟹的总重 ( 精确到 0.01 g), 称重后立即进行活体解剖, 取出卵巢和 肝胰腺称重 ( 精确到 0.01 g) 按以下公式计算卵 巢指数和肝胰腺指数 : 卵巢指数 (gonadosomatic index, GSI, %)=100 卵巢体质量 / 梭子蟹体质量 肝胰腺指数 (hepatopancreas index, HSI, %)= 100 肝胰腺体质量 / 梭子蟹体质量 定 血清中类固醇激素和卵黄蛋白原浓度的测 每个重复随机取 4 只蟹, 从第 3 步足抽取血 液, 分别放入 1.5 ml 离心管中,4 C 静置一夜, 3000 r/min 离心 8 min, 取上清液, 用于孕酮 (PG) 雌二醇 (E 2 ) 和卵黄蛋白原 (VG) 浓度的测 定 PG E 2 和 VG 参照梭子蟹 ELISA 检测试剂盒 说明书 ( 上海源叶生物科技有限公司 ) 进行测定 卵巢组织学结构观察 采用 Bouin 氏液对 卵巢组织进行固定 48 h, 酒精梯度脱水, 二甲苯 透明, 常规石蜡包埋, 切片厚度 5.0~7.0 μm,h. E 染色, 中性数胶封片, 在 OLYMPUS CX-22 显微镜下观察拍照 卵黄蛋白原 (VG)mRNA 表达分析 按照 Trizol 试剂 ( 全式金, 中国 ) 说明书提取三疣梭子蟹 卵巢总 RNA, 分别用核酸定量检测仪 ND-2000 (NanoDrop, 美国 ) 和琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的 浓度和质量 按照 One-Step gdna Removal and cdna Synthesis SuperMix ( 全式金, 中国 ) 试剂盒 说明书进行 RNA 反转录, 合成 cdna 第一链 根据已知的三疣梭子蟹 VG (GenBank 序列 号 :DQ000638) 和 β-actin (GenBank 序列号 : JZ721736) cdna 序列采用 Primer premier 5.0 软件 设计实时荧光定量 PCR 引物, 检测引物特异性及 扩增效率, 筛选后每个基因各得到一对特异性 引物, 引物序列见表 3, 引物由深圳华大基因科 技有限公司合成

4 3 期丁立云, 等 : 饲料磷脂对已交配和未交配雌性三疣梭子蟹卵巢发育 组织学和卵黄蛋白原表达的影响 369 定量仪器为实时荧光定量 PCR 仪 (Light- Cycler*96, Roche, Ltd, Swit), 实时定量 PCR 反应 体系为 20 μl, 上下游模版各 1.0 μl,10 μl 的 2 conc SYBR Green I Master ( 罗氏, 瑞士 ),1 μl of cdna 模板和 7 μl DEPC 水 反应条件 :95 C 2 min, 紧接着 95 C 15 s,58 C 10 s,72 C 10 s 共 45 个循 环 β-actin 作为内参基因, 以投喂 0% 磷脂饲料的 未交配三疣梭子蟹处理组表达量为 1, 采用 2 ΔΔCT 方法运算得到表达量的比值 1.5 数据统计与分析 实验数据以平均值 ± 标准差表示 (mean ± SD), 采用 SPSS17.0 中的多因变量多因素方差分析模型 (GLM) 对数据进行双因子方差分析 模型包括三 疣梭子蟹交配处理 ( 已交配和未交配 ) 日粮类型 (0% 和 4% 大豆卵磷脂 ) 及二者的互作 以 P<0.05 为 差异显著判断标准 2 结果 表 3 实时荧光定量 PCR 引物序列信息 Tab. 3 Primers used in the real-time quantitative 基因引物 primers VG-F VG-R β-actin-f β-actin-r RT-PCR analyses 2.1 饲料磷脂对已交配和未交配三疣梭子蟹 卵巢指数和肝胰腺指数的影响 序列 sequences (5 3 ) CGGTCCTGAGACGCTATT CTTCCTCGCAAACCAACA CCTGACTGCCTACCTCACCAA ATGCCGACAGATTCCATACCC 交配处理显著影响三疣梭子蟹的卵巢指数 (GSI)(P<0.05), 对肝胰腺指数 (HSI) 无显著性影响 (P>0.05); 已交配三疣梭子蟹卵巢指数显著高于 未交配三疣梭子蟹 (P<0.05)( 表 4) 饲料磷脂水平 显著影响已交配三疣梭子蟹的卵巢指数和肝胰腺指数 (P<0.05), 对未交配蟹无显著性影响 (P>0.05); 饲喂 4% 大豆磷脂饲料的已交配蟹的卵巢指数显著高于 0% 大豆磷脂组的已交配蟹 (P<0.05), 肝胰腺指数呈相反趋势 交配处理和饲料大豆磷脂水平对卵巢指数和肝胰腺指数均没有互作关系 2.2 饲料磷脂对已交配和未交配三疣梭子蟹血清卵黄蛋白原 孕酮和雌二醇水平的影响饲料大豆磷脂水平显著影响了血清卵黄蛋白原 孕酮和雌二醇的浓度,4% 大豆磷脂组梭子蟹血清卵黄蛋白原 孕酮和雌二醇的浓度显著高于 0% 大豆磷脂组 (P<0.05); 交配处理并未显著影响梭子蟹血清卵黄蛋白原和孕酮的浓度 (P>0.05), 但对血清雌二醇产生显著性影响, 4% 大豆磷脂已交配蟹显著高于未交配蟹 (P<0.05) ( 表 5) 交配处理和饲料大豆磷脂水平对血清卵黄蛋白原浓度没有互作关系, 但对孕酮和雌二醇浓度的影响有互作关系 2.3 饲料磷脂对已交配和未交配三疣梭子蟹肝胰腺卵黄蛋白原表达的影响交配处理显著影响了三疣梭子蟹肝胰腺卵黄蛋白原 (VG) 的相对表达量 (P<0.05), 已交配三疣梭子蟹肝胰腺 VG mrna 的表达量显著高于未交配三疣梭子蟹 (P<0.05);4% 大豆磷脂组肝胰腺 VG mrna 的表达量相对于 0% 大豆磷脂组有增加的趋势, 但差异不显著 (P>0.05)( 图 1) 交配处理和饲料大豆磷脂水平对肝胰腺 VG mrna 的表达量没有互作关系 2.4 饲料磷脂对已交配和未交配三疣梭子蟹卵巢组织学结构的影响饲料磷脂和交配处理均在不同程度影响着梭子蟹卵巢的组织学结构, 未交配 0% 大豆磷脂 表 4 饲料磷脂对已交配和未交配雌性三疣梭子蟹卵巢指数和肝胰腺指数的影响 Tab. 4 Effect of dietary soy lecithin on the GSI and HSI of mated and unmated female P. trituberculatus for 12 weeks 项目 items 已交配蟹 mated crab 未交配蟹 unmated crab A (0%) B (4%) A (0%) B (4%) 日粮 dietary P-value 交配 mating 互作 interaction 肝胰腺指数 HSI 7.54± ± ± ± 卵巢指数 GSI 1.85±0.37 b 2.64±0.60 c 0.86±0.06 a 1.05±0.15 a 注 : 同一行数据上不同字母表示存在显著差异 (P<0.05), 下同 Notes: Values in the same line with different lowercase superscripts mean significant difference (P<0.05), the same below

5 370 水产学报 42 卷 表 5 饲料磷脂对已交配和未交配雌性三疣梭子蟹血清卵黄蛋白原 孕酮和雌二醇水平的影响 Tab. 5 Effect of dietary soy lecithin on the VG, PG and E 2 levels in serum of mated and unmated female 项目 items P. trituberculatus for 12 weeks 已交配蟹 mated crab 未交配蟹 unmated crab A (0%) B (4%) A (0%) B (4%) 日粮 dietary P-value 交配 mating 互作 interaction 卵黄蛋白原 /(ng/ml) vitellogenin 87.38±30.17 ab ±8.88 b 63.08±29.77 a 91.35±24.66 ab 孕酮 /(pg/ml) progesterone ±22.03 a ±17.24 c ±19.22 ab ±20.88 bc 雌二醇 /(pg/ml) estradiol 35.28±2.29 a 50.04±3.48 b 36.55±1.85 a 40.17±2.47 a hepatopancreas VG relative expression bc 0% 0% mated 处理组以内源性卵黄合成期的卵母细胞 (EN) 为 主, 少部分卵母细胞已经发育到外源性卵黄合 成期 (EX), 滤泡细胞 (FC) 较少, 正向卵母细胞迁 移 ( 图 2-a); 未交配 4% 大豆磷脂处理组区域内的 内源性卵黄合成期的卵母细胞和外源性卵黄合 成期的卵母细胞直径均大于未交配 0% 大豆磷脂 处理组, 可见明显的卵黄颗粒 (Y), 滤泡细胞排 布并贴近在卵母细胞周围 ( 图 2-b); 已交配 0% 大 豆磷脂处理组以近成熟的卵母细胞 (NO) 为主且 有大量的卵黄颗粒, 仍能可见少量的内源性卵 黄合成期的卵母细胞, 滤泡细胞消失 ( 图 2-c); 已交配 4% 大豆磷脂处理组卵母细胞直径大于已 交配 0% 大豆磷脂处理组, 区域内的内源性卵黄 合成期的卵母细胞少于已交配 0% 大豆磷脂处理组 ( 图 2-d) 综合分析显示, 交配处理显著促进了梭 子蟹卵母细胞的成熟, 而添加大豆磷脂可促进 滤泡细胞向卵母细胞迁移, 增大卵母细胞直 径, 同样有促进卵母细胞成熟的趋势 c 4% 4% mated treatment 0% 0% unmated 4% 4% unmated 图 1 饲料磷脂对已交配和未交配雌性三疣梭子蟹肝 胰腺卵黄蛋白原表达的影响 Fig. 1 Effect of dietary soy lecithin on the VG mrna in hepatopancreas of mated and unmated female P. trituberculatus for 12 weeks a ab 3 讨论 本研究采用 0% 和 4% 的大豆磷脂饲喂已交配 和未交配三疣梭子蟹 12 周, 发现磷脂和交配处理 对三疣梭子蟹的卵巢发育具有不同程度的促进 作用 在本实验中, 饲料中添加磷脂显著提高 了梭子蟹的卵巢指数, 而卵巢指数可作为评价 甲壳类动物性腺发育状况优劣的可靠指标, 表 明磷脂可显著促进梭子蟹的卵巢发育, 这与饲 料中高水平的大豆磷脂显著提高了中华绒螯蟹 [6] [7] 红螯光壳螯虾和日本对虾 (Marsupenaeus japonicus) [23] 等甲壳类动物性腺指数的研究结果一 致 交配是一个复杂的生理过程, 研究发现, 与正常交配的绿盲蝽 (Apolygus lucorum) 相比, 未 交配的绿盲蝽卵巢发育相对迟缓, 而且卵量较 少 [24-25] 与本实验类似, 交配后的三疣梭子蟹卵 巢指数显著高于未交配三疣梭子蟹, 其主要原 因可能是雌性三疣梭子蟹一生只交配一次 [26], 交配时, 雄蟹将精荚传递到雌蟹的纳精囊中, 而纳精囊与卵巢发育关系密切 [27], 在不到 2 个月 的时间内, 囊内物质可基本消退, 纳精囊所占 的空间完全被卵巢利用 [26,28-29], 从而促进卵巢的 发育 虾蟹在卵巢发育阶段, 肝胰腺中营养物 质向卵巢持续转运使得肝胰腺指数和卵巢指数 呈负相关 本研究显示, 在已交配蟹中,4% 大 豆磷脂组中的卵巢指数显著高于 0% 大豆磷脂 组, 而肝胰腺指数相对更小, 呈相反趋势 类 似的结果在中华绒螯蟹 [6] [30] 红螯光壳螯虾和凡 [31] 纳滨对虾中也有报道 卵黄蛋白原是卵黄蛋白的前体, 是卵黄发 生期由特定组织形成的一种大分子量的磷酸脂 糖蛋白 [32], 与脊椎动物载脂蛋白 B 及微粒体甘油 三酯转运蛋白同属于古老的脂肪转运蛋白超家 族 [33-34] 研究发现, 高含量的磷脂能够结合更多

6 3期 丁立云 等 饲料磷脂对已交配和未交配雌性三疣梭子蟹卵巢发育 组织学和卵黄蛋白原表达的影响 FC 371 FC Y EN EN 100 μm EX a EX 100 μm EN NO EN Y Y NO 100 μm 图2 b c 100 μm d 饲料磷脂对已交配与未交配雌性三疣梭子蟹卵巢组织学结构的影响 a. 未交配0%大豆磷脂处理组 b. 未交配4%大豆磷脂处理组 c. 已交配0%大豆磷脂处理组; d. 已交配4%大豆磷脂处理组 FC. 滤泡细 胞 EN. 内源性卵黄合成期的卵母细胞 EX. 外源性卵黄合成期的卵母细胞 Y. 卵黄颗粒 NO. 近成熟的卵母细胞 Fig. 2 Effect of dietary soy lecithin on the ovary histological structure of mated and unmated female P. trituberculatus for 12 weeks a, b and c, d represent treatment of diets 0% and 4% soy lecithin fed to unmated crabs (a, b) and mated crabs (c, d) respectively; FC, follicle cells; EN, endogenous vitellogenic oocytes; EX, exogenous vitellogenic oocytes; Y, yolk globules; NO, nearly-mature oocytes 的卵黄蛋白原 从而促进了卵黄物质在卵母细 胞中的积累 VG mrna表达丰度是衡量甲壳动物卵巢发 本实验中 无论梭子蟹是否交 育状态的一个敏感指标 Yang等 [44]研究表明 三 配 4%大豆磷脂组中的卵黄蛋白原浓度均高于 疣梭子蟹卵黄蛋白原主要在卵黄发生期的雌性 [35-37] 0%大豆磷脂组 同本实验一致 张颖等 [38] 发现 肝 胰 腺 中 表 达 所 以 本 研 究 采 用 肝 胰 腺 中 VG 施氏鲟(Acipenser schrenckii)后备亲鱼血清中卵黄 mrna表达来评价饲料磷脂和交配处理对三疣梭 蛋白原浓度随日粮卵磷脂的添加水平和时间增 子蟹卵黄发生的影响 本实验中 已交配三疣 加而升高 甲壳动物可以通过性腺抑制激素和 梭子蟹肝胰腺VG mrna的表达量显著高于未交 性腺刺激激素的相互拮抗作用对卵黄发生及卵 配三疣梭子蟹 表明交配处理对三疣梭子蟹卵 巢发育进行调控 此外 孕酮和雌二醇也是参 巢发育影响显著 对昆虫的研究显示 交配过 与卵黄发生重要的类固醇激素 在卵巢发育过 程中 雄虫会向雌虫体内转移许多具有生理效 程中可以与细胞中雌激素反应元件结合直接调 应的物质 包括精液 营养和激素类物质 从 控肝胰腺和卵巢中卵黄蛋白原mRNA的表达 从 而促进交配雌虫的性腺发育和卵子发生 [45] 三疣 而影响卵黄物质的积累 [40-41] 与卵黄蛋白原浓度 梭子蟹交配时精荚具有的活性物质尚不清楚 表现相同 本研究中 梭子蟹血清中孕酮和雌 有待进一步探究 研究认为 甲壳动物肝胰腺 二醇在4%大豆磷脂组中具有更高的水平 表明 中合成卵黄蛋白原 然后释放至血淋巴 被卵 磷脂可通过影响梭子蟹血清类固醇激素的水 母细胞吸收 [46] 本研究中 已交配梭子蟹肝胰腺 平 从而促进卵黄发生和卵巢发育 在大多数 VG mrna表达水平显著高于未交配蟹 而血清 动物卵黄发生机制研究中发现 外源磷脂经与 中VG浓度在已交配蟹和未交配蟹之间未产生显 卵母细胞中的受体结合后 将作为卵黄物质沉 著差异 产生这一现象是因为mRNA存在贮存 积在卵巢中 继而通过对内分泌激素合成和分 转运 降解 翻译调控和产物的翻译后加工 [47] 泌的调节 影响卵巢的发育和成熟 [ ] 使得基因表达水平难以准确反映蛋白质的质与 [39]

7 372 水产学报 42 卷 [48] 量 龚群等研究力竭运动前后大鼠 (Rattus norvegicus) 脑中海马谷氨酸受体 NR2A 蛋白含量和 基因表达的变化, 发现 NR2A 蛋白含量和其基因 表达的变化趋势不一致, 认为基因表达对蛋白 [49] 质含量的调控可能具有延迟性 张艳研究卵巢 发育期间梭子蟹肝胰腺 VG mrna 和血淋巴 VG 浓 度的变化, 也发现 Ⅳ 期肝胰腺 VG mrna 表达水 平显著高于 Ⅲ2 期, 而血淋巴 VG 浓度在 Ⅳ 期和 Ⅲ2 期之间无显著性差异 综上所述, 饲料中的大豆磷脂和交配处理 均能促进雌性三疣梭子蟹的卵巢发育 组织学 观察显示, 交配处理显著促进了梭子蟹卵母细 胞的成熟, 而添加大豆磷脂可促进滤泡细胞向 卵母细胞迁移, 增大卵母细胞直径, 同样有促 进卵母细胞成熟的趋势 参考文献 : [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] Kanazawa A, Teshima S, Sakamoto, M. Effects of dietary lipids, fatty acids, and phospholipids on the growth and survival of prawn (Penaeus japonicus) larvae[j]. Aquaculture, 1985, 50(1-2): National Research Council (NRC). Nutrient Requirements of Fish and Shrimp[M]. Washington, DC: National Academies Press, Lee R F, Walker A. Lipovitellin and lipid droplet accumulation in oocytes during ovarian maturation in the blue crab, Callinectes sapidus[j]. Journal of Experimental Zoology, 1995, 271(5): 吴旭干, 于智勇, 成永旭, 等. 4 组生物饵料对中华绒螯 蟹 Z 4 到大眼幼体生长发育和脂肪酸组成的影响 [J]. 中 国水产科学, 2007, 14(6): Wu X G, Yu Z Y, Cheng Y X, et al. Effect of four groups of live feeds on larval development, growth (from Z 4 to Megalopa) and fatty acid composition of Eriocheir sinensis[j]. Journal of Fishery Sciences of China, 2007, 14(6): (in Chinese). Wu X G, Cheng Y X, Sui L Y, et al. Effect of dietary supplementation of phospholipids and highly unsaturated fatty acids on reproductive performance and offspring quality of Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis (H. Milne-Edwards), female broodstock[j]. Aquaculture, 2007, 273(4): Sui L Y, Wu X G, Wille M, et al. Effect of dietary soybean lecithin on reproductive performance of Chinese [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] [10] [11] [12] [13] [14] [15] mitten crab Eriocheir sinensis (H. Milne-Edwards) broodstock[j]. Aquaculture International, 2009, 17(1): Wang L M, Zuo D, Lv W W, et al. Effects of dietary soybean lecithin on gonadal development and vitellogenin mrna expression in the female redclaw crayfish Cherax quadricarinatus (von Martens) at first maturation[j]. Aquaculture Research, 2013, 44(8): Cahu C, Guillaume J C, Stéphan G, et al. Influence of phospholipid and highly unsaturated fatty acids on spawning rate and egg and tissue composition in Penaeus vannamei fed semi-purified diets[j]. Aquaculture, 1994, 126(1-2): 贾磊. 三疣梭子蟹 (Portunus trituberculatus) 卵巢发育的初步研究 [D]. 青岛 : 中国海洋大学, Jia L. Preliminary Study on the ovary development of the crab Portunus trituberculatus[d]. Qingdao: Ocean University of China, 2008 (in Chinese). Dan S, Oshiro M, Ashidate M, et al. Starvation of Artemia in larval rearing water affects post-larval survival and morphology of the swimming crab, Portunus trituberculatus (Brachyura, Portunidae)[J]. Aquaculture, 2016, 452: Pan L Q, Hu D X, Liu M Q, et al. Molecular cloning and sequence analysis of two carbonic anhydrase in the swimming crab Portunus trituberculatus and its expression in response to salinity and ph stress[j]. Gene, 2016, 576(1): Jin M, Zhou Q C, Zhang W, et al. Dietary protein requirements of the juvenile swimming crab, Portunus trituberculatus[j]. Aquaculture, 2013, : Huo Y W, Jin M, Zhou P P, et al. Effects of dietary protein and lipid levels on growth, feed utilization and body composition of juvenile swimming crab, Portunus trituberculatus[j]. Aquaculture, 2014, 434: 韩涛, 王骥腾, 胡水鑫, 等. 饲料脂肪水平对三疣梭子蟹 (Portunus trituberculatus) 幼蟹生长及体组成的影响 [J]. 海洋与湖沼, 2013, 44(5): Han T, Wang J T, Hu S X, et al. Effect of dietary lipid level on growth and body composition of juvenile swimming crab Portunnus trituberculatus[j]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2013, 44(5): (in Chinese). Jin M, Wang M Q, Huo Y W, et al. Dietary lysine requirement of juvenile swimming crab, Portunus trituber-

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