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0;() 南方医科大学学报 J South Med Univ 7 临床研究 基础研究 p8 丝裂原激活蛋白激酶基因重组慢病毒载体的构建及其在建 立人前列腺癌稳定细胞株中的应用 荆玉明 罗 杰 张艳玲 陈三三 万 沛 颜仁和 王宏昌 陈白虹 谭万龙 李红卫 南方医科大学 南方医院泌尿外科 生物技术学院 广东 广州 5055 摘要 目的 构建 p8 丝裂原激活蛋白激酶基因 MPK 重组慢病毒载体并建立表达外源性 p8 基因的人前列腺癌稳定细胞 株 方 法 采 用 限 制 性 内 切 酶 酶 切 T4 DN 连 接 酶 连 接 等 方 法 将 EGFP/p8 融 合 基 因 插 入 慢 病 毒 载 体 ptyfefα-ires-egfp中 构建启动子EFα调控的EGFP/p8共表达慢病毒载体pTYF-EFα-EGFP/p8 经酶切鉴定后 利用慢病毒 三质粒系统 通过脂质体法转染包装细胞 HEK 9T 细胞 收集病毒上清后转导人前列腺癌 DU45 细胞株 经有限稀释法筛选 重组 EGFP/p8 稳定细胞株 用 Western blotting 检测细胞总 p8 的表达 用计数法绘制细胞的生长曲线 结果 经酶切鉴定 成 功构建EGFP/p8重组慢病毒载体 并包装慢病毒 检测病毒悬液的滴度为4.7 06 TU/ml 利用此病毒悬液感染DU45细胞 成 功筛选到 EGFP/p8 稳定表达细胞株 Western blotting 显示该细胞株能稳定表达外源性 EGFP/p8 融合蛋白 这种过表达 p8 的 细胞株的生长速度明显低于对照组 结论 成功构建p8 MPK重组慢病毒载体并建立了表达外源性p8 MPK基因的稳定 细胞株EGFP/p8-DU45 细胞内p8过表达能够抑制DU45细胞的增殖 关键词 p8丝裂原激活蛋白激酶 稳定细胞株 前列腺癌 慢病毒 中图分类号 R77.5; R7 文献标志码 文章编号 67-454 0 0-07-05 DOI: CNKI:44-67/R.0007.59.00 http://www.cnki.net/kcms/detail/44.67.r.0007.59.00.html Construction of a recombinant lentiviral vector of p8 MPK and establishment of a human prostatic carcinoma cell line stably expressing p8 MPK JING Yuming, LUO Jie, ZHNG Yanling, CHEN Sansan, WN Pei, YN Renhe, WNG Hongchang, CHEN aihong, TN Wanlong, LI Hongwei Department of Urology, Nanfang Hospital, School of iotechnology, Southern Medical University, Guangzhou 5055, China bstract: Objective To construct a recombinant lentiviral vector for p8 MPK and establish a human prostatic carcinoma cell line that stably expresses p8 MPK. Methods EGFP/p8 fusion gene was subcloned into the lentiviral vector ptyfefα-ires-egfp. The recombinant lentiviral vector ptyf-efα-egfp/p8 was indentified by restriction enzyme digestion, and packaged in HEK 9T cells using lipofectamintm000 with the packaging plasmid pspx and envelope plasmid pmd.g. The viral titer was tested according to the expression level of GFP. The resulting recombinant lentiviral vector was transduced into human prostatic carcinoma DU45 cells, and stably transduced cells were selected by limiting dilution analysis. The intracellular expression level of total p8 was detected by Western blotting and the cell growth curve was drawn. Results DN restriction enzyme digestion demonstrated that the recombinant lentiviral vector of the fusion gene EGFP/p8 (ptyf-efα-egfp/p8) was constructed successfully. The recombinant lentiviral vector was packaged in 9T with a viral titer of 4.7 06 TU/ml. stable cell line, EGFP/p8-DU45, was established, which stably expressed exogenous EGFP/p8 MPK fusion protein as detected by Western blotting and showed a lowered growth rate compared to the control cells. Conclusion We have successfully constructed a recombinant lentiviral vector of the fusion gene EGFP/p8 and established a stable cell line EGFP/p8-DU45. Overexpression of p8 has a significant inhibitory effect on the proliferation of DU45 cells in vitro. Key words: p8 MPK; stable cell line; prostatic carcinoma; lentivirus 癌症极大的威胁着人类的健康 前列腺癌是成年男 性最常见的恶性肿瘤之一 在美国 其发病率居男性恶 性肿瘤首位 在我国 其发病率也逐年上升 近些年来 收稿日期 0--06 基金项目 国家自然科学基金 807 Supported by National Natural Science Foundation of China (807). 作者简介 荆玉明 硕士 E-mail: jingyumingdoc@6.com 通讯作者 谭万龙 主任医师 教授 博士生导师 电话 00-66476 E-mail: twl@fimmu.com 李 红 卫 教 授 博 士 生 导 师 电 话 006648555 E-mail: hongwei@yahoo.com 对于前列腺癌的各种治疗方法的研究成为一个活跃的 领域 其中肿瘤的基因治疗是通过转入外源基因激活 凋亡通路诱导肿瘤细胞的凋亡 但是细胞内凋亡信号通 路交织成网 单一信号的信号强度相对较弱 凋亡程序 往往难以高效 持续的激活 丝裂原活化蛋白激酶 MPK 是真核细胞信号传导的重要通路 p8 作为该 家族的亚族之一 参与了细胞内如应激反应 增殖 凋亡 -4 等多种生物学过程 在前列腺癌发生 发展的过程 中 p8 MPK通路广泛参与和调节肿瘤细胞的增殖和 凋亡 目前研究发现多种治疗基因通过p8 MPK通路

8 南方医科大学学报 (J South Med Univ) 第 卷 [5-6] 诱导细胞凋亡 利用慢病毒法可以稳定地将外源性 p8 MPK 转入细胞内, 使细胞总 p8 过表达, 增加该通路的信号强度, 从而提高这些通过 p8 MPK 通路诱 [7-0] 导凋亡的基因的疗效 本研究将构建 p8 MPK 基因重组慢病毒载体并建立稳定表达外源性 EGFP/p8 融合蛋白的人前列腺癌 DU45 单克隆细胞株 EGFP/ p8-du45, 从而为 p8 MPK 的功能及通过 p8 MPK 通路作用的相关基因的进一步研究提供工具 材料与方法. 材料.. 细胞株 质粒 HEK 9T 细胞株 DU45 细胞株 pspx 质粒 pmd.g 质粒 ptyf-efα-ires-egfp 质粒 pegfp/p8 质粒及 ptyf-efα-ires-egfp 质粒由南方医科大学生物技术学院保存.. 试剂 仪器限制性内切酶购于 New England iolab,rapid DN Ligation Kit 购于 Fermentas, DMEM 高糖购于 HYCLONE, 胎牛血清 (FS) 及 Lipofectamin TM 000 购于 Invitrogen,Polybrene 购于 Santa Cruz iotechology, 细胞培养瓶 细胞培养平板购于 Corning,nti-total p8 MPK 抗体购于 Cell Signaling Technology,nti β-actin 抗体和 nti-rabbit HRG 酶标 IgG 抗体购于 Sigma-ldrich,RIP 裂解液购于北京鼎国昌盛生物技术公司. 方法.. 慢病毒载体 ptyf-efα-egfp/p8 构建及鉴定使用 am HI 对 pegfp/p8 载体进行单酶切并进行平端化处理, 再使用 Nhe I 对酶切产物进行单酶切并进行琼脂糖凝胶电泳, 切胶回收含 EGFP/p8 融合基因的小片断 ; 慢病毒载体 ptyf-efα-ires-egfp 经 EcoR V 和 Nhe I 双酶切后回收含 EFα 启动子的 ptyf-efα 大片段, 并与 EGFP/p8 小片段按 Rapid DN Ligation Kit 操作说明进行连接 将连接反应混合物转化大肠杆菌 DH5α, 挑取若干单克隆接种于含氨苄青霉素的 L 培养基中,7 振摇过夜 取 5 ml 菌液用 QIGEN Plasmid Kit 小量提取重组载体质粒, 同时以 pegfp/p8 质粒作为对照, 使用 Sal I 和 Nhe I 进行双酶切后, 琼脂糖凝胶电泳鉴定重组载体.. 慢病毒包装 HEK 9T 细胞常规培养于含 0% FS 的 DMEM 高糖培养基 转染前 d, 取对数期状态良好的细胞, 胰酶消化后调整细胞浓度 5 0 5 /ml,6 孔板每孔接种 ml 细胞悬液 转染时观察细胞 80%~90% 融合, 按 Lipofectamin TM 000 说明书 pspx pmd.g 及慢病毒载体 ( 以 ptyf -EFα-EGFP 载体作为对照 ) 三质粒共转染 9T 细胞, 转染 48 h 后收集细胞上清, 000 r/min 4 离心 5 min 后于 -80 中保存病毒液.. 慢病毒滴度测定采用终点稀释法测病毒滴度 (TU/ml): 转导前 d,9t 细胞按 0 5 /ml, ml 每孔接种于 6 孔板中, 取出收集的慢病毒液于 4 冰箱中过夜融化 转导当天, 分别配制终体积为 ml, 病毒做 0 ~0 6 倍稀释的的全培,4 h 后更换为不含病毒上清的 ml 普通全培,7 h 后荧光显微镜下显微镜下观察转导情况, 计数接近稀释终点的两孔的阳性细胞数, 取平均值计算病毒滴度 病毒滴度的计算公式为病毒滴度 (TU/ml)= 阳性细胞数 稀释倍数..4 慢病毒转导 DU45 细胞转导前 d 取对数生长期状态良好的 DU45 细胞按每孔 5 0 4 个细胞接种于 4 孔板中, 转导时加入总体积 00 μl, 含 00 μl 病毒液 (MOI=0) 及 polybrene(8 μg/ml) 的全培,4 h 后更换为 500 μl 不含病毒液的全培,7 h 后观察细胞荧光发光..5 单克隆细胞株的建立采用有限稀释法建立单克隆细胞株 将转导后的 DU45 细胞消化计数并调整浓度为 0 ml, 吸管反复吹吸细胞悬液使其均匀, 然后向 96 孔板中每孔加 00 μl 细胞悬液 常规培养 0 d 后, 在荧光显微镜下观察单克隆形成的情况, 标记生长状态良好 细胞形态无明显改变 荧光强度较高的阳性克隆孔, 然后逐级扩大培养..6 Western blotting 检测重组细胞株总 p8 的表达取对数生长期状态良好的 EGFP/p8-DU45 细胞 EGFP-DU45 细胞 正常 DU45 细胞以 4 0 5 每孔接种于 6 孔板中,4 h 后去除培养基,PS 洗 遍,RIP 裂解液裂解细胞后, 000 g 4 离心 5 min, 收集上清于 -0 保存 取 6 μl 上述收集的蛋白上清, 加入 4 μl SDS- 上样缓冲液, 于沸水中变性处理 5 min 后, 等量上样于分离胶浓度 % 浓缩胶浓度 5% 的聚丙烯酰胺凝胶中电泳 (SDS-PGE 电泳 ), 电泳完毕后, 采用湿转法将蛋白转膜至 PVDF 膜上, 于常温下在 S 浓度 5% 的 TST 中封闭 h, 然后分别加入 nti total p8 抗体 ( 000) 及 ntiβ- actin 抗体 ( 000)4 过夜, 用 TST 洗膜 遍后加入 抗 anti-rabbit IgG( 0 000) 室温孵育 h,tst 洗膜后加入发光液 ml, 暗室中用感光胶片记录蛋白条带结果..7 细胞生长观察分别消化 EGFP/p8-DU45 细胞 EGFP-DU45 细胞及正常 DU45 细胞, 细胞计数后于 4 孔板内每孔接种 0 4 细胞, 每种细胞接种 4 块板, 每板接种 4 个孔 之后每隔 4 h 分别于各板内随机取 孔的细胞进行单盲计数并计算每板细胞数的平均值, 连续计数 8 d 后进行数据统计 ; 利用 种细胞每天测量的细胞数的平均值绘制生长曲线. 统计学处理采用 SPSS.0 统计软件, 运用重复测量分析方法分别比较 EGFP/p8-DU45 细胞与正常 DU45 细胞以及 EGFP-DU45 细胞与正常 DU45 细胞之间的生长速

荆玉明,等.p8 丝裂原激活蛋白激酶基因重组慢病毒载体的构建及其 在建立人前列腺癌稳定细胞株中的应用 第期 9 度是否具有统计学差异 P<0.05为差异有显著性 结果. 慢病毒载体pTYF -EFα-EGFP/p8酶切鉴定 慢 病 毒 载 体 ptyf -EFα-EGFP/p8 经 Sal I 和 Nhe I双酶切后在%琼脂糖凝胶电泳中条带 其中可见 大小约为.7 kb和5.5 kb的条带 对照载体pEGFP/p8 经双酶切后可见约.7 kb和.0 kb的条带 均与预计结 果符合 证实载体构建成功 图 bp 5000 4000 000 000 000 图 慢病毒包装及病毒滴度测定中荧光显 微镜下观察9T细胞 病毒包装三质粒共转染9T细胞4 h后; 包装好的慢病毒上清转导9T细胞7 h后 Fig. Fluorescent 9T cells during the production and titering of the lentiviral stock (Original magnification: 00). 图 慢病毒载体 ptyf -EFα- EGFP/p8 酶切鉴定 : DN MKER; : 对照的 pegfp/p8 质粒; : ptyf -EFα- EGFP/p8质粒 Fig. Identification of the lentiviral vector ptyf -EFα- EGFP/p8 by agarose gel electrophoresis.. 慢病毒包装及滴度测定 9T 细胞经三质粒共转染后 细胞逐渐出现融合 现象 转染后 4 h 在荧光显微镜下观察细胞的转染效 率 几乎所有9T细胞均发出亮度较高的绿色荧光 说 明转染效率较高 病毒包装成功 图 利用终点稀 释法验证慢病毒包装成功与否以及检测病毒的感染性 滴度 图 为测定慢病毒滴度时 转导 9T 细胞 7 h 后稀释 0 倍的孔内细胞荧光发光情况 稀释终点为 05 孔和 06 孔 计数两孔内分别共 8 和 5 个阳性细胞 故计算慢病毒滴度为 44 05+5 06 /=4.7 06 TU/ml. 慢病毒转导DU45细胞 图 示 慢病毒转导 DU45 细胞 7 h 后荧光显微 镜白光下下观察成上皮细胞形态 生长状态良好 在激 发光下 部分整合了EGFP/p8融合基因的DU45细胞 能发出绿色荧光 荧光较均匀的分布于整个细胞 慢病 毒的转导效率较高.4 单克隆稳定细胞株建立 图 4 所示为有限稀释法铺板后第 0 天 在 96 板中 的挑选出的一株单克隆细胞群落 该株细胞成上皮细胞 图 荧光显微镜观察慢病毒转导后4 h的 DU45细胞 : 激发光下; : 同视野白光下 Fig. Fluorescence and bright-field images of DU45 cells after lentiviral transduction (Original magnification: 00). 形态与正常的未经处理的DU45细胞在形态学上没有 明显差异 其生长状态良好 所有细胞均发出绿色荧光 荧光较均匀地分布于整个胞浆 将其扩大培养后保存 命名为EGFP/p8-DU45

0 南方医科大学学报 J South Med Univ Mr 第 卷 N GFP p8 70 000 ECFP/p8 融合蛋白 55 000 40 000 内源性 p8 蛋白 内参 eta-actin 蛋白 图5 Western blotting检测细胞总p8的表达 N: 正常 DU45 细胞株; GFP: EGFP-DU45 细胞株; p8: EGFP/p8-DU45细胞株 Fig.5 Expression levels of p8 in cell lines detected by Western blotting. 图 4 荧光显微镜观察 EGFP/p8-DU45 单克隆细胞.5 Western blotting 检测 EGFP/p8-DU45 细胞株总 p8的表达 为检测p8蛋白表达情况 共纳入组细胞进行检 测 除上述的 EGFP/p8-DU45 外 还加入常规培养未 经特殊处理的DU45细胞株和同样用慢病毒法构建的 稳定表达 EGFP 的细胞株 EGFP-DU45 作为对照 结 果如图5所示 株细胞的内参表达量基本一致 在相对 分子质量9 000附近 株细胞均出现深浅程度相近的 条带 说明组细胞均表达内源性的p8蛋白 表达量没 有明显差异 同时EGFP/p8 DU45细胞株还出现了相 对分子质量为 60 000 左右的条带 为外源性的 EGFP/ p8融合蛋白 其表达量较高.6 细胞生长观察 种细胞经持续培养 8 d 后 通过在显微镜下计数 而绘制的细胞生长曲线图 图6 可见 较普通的未经特 殊处理的 DU45 细胞株 表达外源性 p8 的 EGFP/ p8-du45细胞株生长速度明显减慢 P<0.05 而用同 样方法转入外源 EGFP 基因的 EGFP-DU45 细胞株的 生长速度与正常DU45细胞之间相比没有显著的统计 学差异 P>0. 说明过表达p8 MPK对于DU45细 胞的增殖能力具有抑制作用 讨论 目前 对于早期前列腺癌 主要的治疗方法包括手 术治疗 放疗 内分泌治疗等 但是上述方法均伴有不同 程度并发症的发生率 对于晚期激素难治性前列腺的治 normal EGFP p8 8 7 细胞数 ( 04) : 激发光下; : 同视野白光下 Fig.4 Fluorescence and bright-field images of EGFP/p8-DU45 colony (Original magnification: 00). 9 6 5 4 4 t/d 5 6 7 8 图6 各株细胞的生长曲线 normal:正常 DU45 细胞株; EGFP: EGFP-DU45 细胞株; p8: EGFP/p8-DU45细胞株 Fig.6 Growth curve of the cells. 疗尚缺乏有效的方法 基因治疗具有高选择性 低损伤 性的特点 发现和研究高效的凋亡诱导基因并运用各种 方法导入肿瘤细胞的策略目前已成为各器官肿瘤研究 的热点 但是相对传统治疗方法 基因治疗的疗效较 低 这是由于胞内凋亡通路具有复杂性 网络型 相对微 量的特点 p8 MPK属于丝裂原活化蛋白激酶家族 之一 它参与了胞内多种信号转导通路 具有多种细胞 调节功能 其中包括调节细胞的增殖和凋亡 在前列 腺癌基因治疗的研究中发现 许多促凋亡基因通过p8 - MPK通路发挥其治疗作用 在本实验中 我们发 现过表达 p8 的 DU45 细胞尽管在细胞形态上没有发 生显著改变 但其生长受到明显抑制 这种抑制作用因 为 p8 蛋白的稳定过表达而长期存在 但对于细胞内 相关信号通路的具体变化还需要做进一步的研究 我们 构建的过表达p8的前列腺癌DU45细胞 为后续的研 究工作提供了工具 哺乳动物细胞内转入外源基因的方法有很多种 目 前常用的有脂质体法 磷酸钙法等瞬时转染系统以及利

第 期 荆玉明, 等.p8 丝裂原激活蛋白激酶基因重组慢病毒载体的构建及其在建立人前列腺癌稳定细胞株中的应用 用病毒载体转导的方法 瞬时转染系统因其直接转入外源基因的 DN 模板, 外源基因的表达快速 高效, 但是瞬时转染系统对某些细胞的转染效率较低, 而且外源基因在转染细胞的基因组整合效率极低, 经过多次传代 [5] 后, 外源基因容易丢失或出现基因表达静默现象 病毒载体方面, 腺病毒载体的表达特性与瞬时转染类似 ; 腺相关病毒能结合在特定的染色体上从而实现稳定传 [6-7] 代, 但结合的几率较低 慢病毒系统改造自逆转录病毒, 具有逆转录酶的活性, 有比较高的概率使外源基因整合于细胞基因组内, 从而稳定地传代给子代细 [8] 胞, 因此利用慢病毒载体构建外源基因重组稳定细胞株具有明显的优势 本实验中, 在利用慢病毒法转导基因的策略上, 我们在构建慢病毒载体时加入 GFP 报告基因, 在病毒转导过程中利用报告基因能够方便评价病毒包装和转导的效果 目前用于筛选稳定细胞株的方法主要有流式细胞分选法 抗性筛选法等, 但由于慢病毒转导时, 外源基因插入的位点是随机的, 因此单独应用上述两种方法筛选出的稳定细胞株的每个细胞之间具有基因结构的差异, 导致最终外源基因的表达以及细胞生长速度也具有差异, 增加了系统误差 ; 同时在抗性筛选及进行流式分选 [9] 的过程中, 细胞的生长状态容易受到影响 本实验通过有限稀释法使细胞单克隆化, 进而在荧光显微镜下选择荧光强度较高的单克隆株并通过 Western blotting 进行表达鉴定, 得到了稳定 高效 均一地表达外源性 p8 的前列腺癌细胞株 参考文献 : [] Pfeifer, Verma IM. Gene therapy: promises and problems[j]. nnu Rev Genom Hum Genet, 00, : 77-. [] Johnson GL, Lapadat R. Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK, JNK and p8 protein kinases[j]. Science, 00, 98(5600): 9-. [] Kyriakis JM, vruch J. Mammalian mitogen-activated protein kinase signal transduction pathways activated by stess and inflammation[j]. Physiol Rev, 00, 8(): 807-69. [4] Davis RJ. Signal transduction by the JNK group of MP kinases [J]. Cell, 000, 0: 9-5. [5] Shen KH, Hung SH, Yin LT, et al. cacetin, a flavonoid, inhibits the invasion and migration of human prostate cancer DU45 cells via inactivation of the p8 MPK signaling pathway[j]. Mol Cell iochem, 00, (-): 79-9. [6] Li HW, Qi YF, Li CY, et al. ngiotensin type receptor mediated apoptosis of human prostate cancer cells[j]. Mol Cancer Ther, 009, 8: 55-65. [7] Seo HS, Choi HS, Choi HS, et al. Phytoestrogens induce apoptosis via extrinsic pathway, inhibiting nuclear factor-kappa signaling in HER-overexpressing breast cancer cells[j]. nticancer Res, 0, (0): 0-. [8] ogazzi F, Russo D, Raggi F, et al. Transgenic mice overexpressing growth hormone (GH) have reduced or increased cardiac apoptosis through activation of multiple GH-dependent or -independent cell death pathways[j]. Endocrinology, 008, 49(): 5758-69. [9] Pfeifer. Lentiviral transgenesis[j]. Transgenic Res, 004, : 5-. [0]Fassler R. Lentiviral transgene vectors[j]. EMO Rep, 004, 5: 8-9. []Dash R, zab, Shen XN, et al. Developing an effective gene therapy for prostate cancer: New technologies with potential to translate from the laboratory into the clinic[j]. Discov Med, 0, (56): 46-56. []Strittmatter F, Gratzke C, Walther S, et al. lpha-adrenoceptor signaling in the human prostate involves regulation of p8 mitogen-activated protein kinase[j]. Urology, 0, 78(4): e7-. []Khandrika L, Lieberman R, Koul S, et al. Hypoxia-associated p8 mitogen-activated protein kinase-mediated androgen receptor activation and increased HIF-alpha levels contribute to emergence of an aggressive phenotype in prostate cancer[j]. Oncogene, 009, 8(9): 48-60. [4]Whitelaw C. Transgenic livestock made easy[j]. Trends iotechnol, 004, : 57-9. [5]Liu J, Jones KL, Sumer H, et al. Stable transgene expression in human embryonic stem cells after simple chemical transfection[j]. Mol Rep Dev, 009, 76(6): 580-6. [6]Wang H, Shayakhmetov DM, Leege T, et al. capsid-modified helper-dependent adenovirus vector containing the beta-globin locus control region displays a nonrandom integration pattern and allows stable, erythroid-specific gene expression[j]. J Virol, 005, 79(7): 0999-0. [7]Soifer HS, Kasahara N. Retrotransposon-adenovirus hybrid vectors: efficient delivery and stable integration of transgenes via a two-stage mechanism[j]. Curr Gene Ther, 004, 4(4): 7-84. [8]McGrew MJ. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors[j]. EMO Rep, 004, 5: 78-. ( 编辑 : 黄开颜 )