孕婦乙型鏈球菌篩檢檢體採集標準作業 保存與運輸作業等須知 101 年 12 月 31 日修訂版 1. 目的 : 乙型鏈球菌 (Group B Streptococcus; 以下簡稱 GBS) 是新生兒細菌感染疾病中最常見細菌之一, 可引起新生兒敗血症 腦膜炎 肺炎等嚴重感染, 造成新生兒死亡或留下神經系統後遺症 執行孕婦產前陰道和肛門口 ( 或直腸 ) 乙型鏈球菌篩檢, 可有效預防及降低新生兒乙型鏈球菌感染 2. 適用範圍 : 懷孕達 35~37 週之孕婦 3. 材料 : 細菌培養用採檢拭子, 內含非營養之傳送培養基, 如 Stuart, s 或 Amies 4. 採檢步驟 : 4.1 取一細菌培養用採檢拭子, 清楚標示病患姓名 病歷號 ; 檢驗單應註明 GBS 篩檢培養 4.2 將其放入陰道口約 2 公分處, 採集黏膜分泌物 4.3 使用同一採檢拭子, 放於肛門口內約 2.5 公分處, 以旋轉之方式採集檢體 4.4 將採檢拭子放回採集容器中 4.5 請儘速送檢 5. 檢體保存條件 : 於 4 下可保存 24 小時
孕婦乙型鏈球菌 (Group B Streptococcus) 檢驗標準作業手冊 101 年 12 月 31 日修訂版 1. 目的 : 乙型鏈球菌 (Group B Streptococcus; GBS; 學名 Streptococcus agalactiae) 被認為是嬰兒出生前後感染及死亡的重要原因 經乙型鏈球菌感染的嬰兒往往會導致嚴重的併發症, 包括敗血症 肺炎及腦膜炎等, 嚴重則會造成死亡及永久性的神經性後遺症 乙型鏈球菌感染新生兒的途徑, 通常是在分娩的時候, 經由母體感染, 所以若能在孕婦懷孕時期早期診斷出是否感染乙型鏈球菌, 就可以有效預防新生兒感染的危險 因此, 美國疾病管制局建議懷孕 35-37 週的婦女應做全面性的篩檢, 採檢的部位為陰道及直腸末端, 可以增加乙型鏈球菌的診斷機率約 50 %以上, 若在確定診斷後給予孕婦抗生素的治療, 新生兒感染乙型鏈球菌的機率, 則可以降低 75 %以上 2. 範圍 : 懷孕 35-37 週的婦女 ( 包括計畫性剖腹產孕婦 ) 3. 材料及試劑 : 3.1 Stuart s 或 Amies 的運送培養基 3.2 增菌培養基 : 可選擇使用, 步驟中以 LIM broth 為例說明之 3.2.1 LIM broth ( 含 10 μg/ml 的 colistin 及 15 μg/ml 的 nalidixic acid 之 Todd-Hewitt 培養液 ) 3.2.2 含 5% 綿羊血的 Trans-Vag broth ( 含 8 μg/ml 的 gentamicin 及 15 μg/ml 的 nalidixic acid 之 Todd-Hewitt 培養液 ) 3.2.3 StrepB carrot broth( 含 Granada medium 可偵測溶血型的 GBS 菌株 ) 3.3 建議培養基 3.3.1 Blood agar plate (BAP) 3.3.2 Columbia colistin-nalidixic acid agar (CNA) 3.3.3 乙型鏈球菌產色培養基 (CHROMagar GBS): 依產品說明使用 - 1 -
3.4 二氧化碳 (5%) 培養箱 3.5 觸媒 (3% catalase): 10 ml, 30% H 2 O 2 + 90 ml 無菌水,2-8 保存 3.6 革蘭氏染色套組 (Gram stain kit) 3.7 標準菌株 3.7.1 Staphylococcus aureus ATCC 25923 3.7.2 Streptococcus agalactiae ATCC 12386 3.7.3 S. pyogenes ATCC 19615 3.8 Hippurate (1%) 試劑 :1 g sodium hippurate + 100 ml 無菌水, 分裝 0.4 ml 備用, 保存於 -20, 直到品管異常後丟棄 3.9 Ninhydatre (3.5%) 試劑 :50 ml acetone + 50 ml 1-butanol + 3.5 g ninhydrin; 存放於棕色瓶內, 室溫下可保存 6 個月 3.10 自動化鑑定儀器或其他商業試劑套組 4. 培養步驟 : 4.1 LIM broth 4.1.1 將陰道 - 肛門拭子接種到 LIM broth 中 4.1.2 將接種後之 LIM broth 於 35-37, 二氧化碳 (5%) 培養箱中, 培養 18-24 小時 4.1.3 無論是否混濁, 將 LIM broth 次培養於 BAP( 或其他建議培養基 ) 上 4.1.4 將次培養之 BAP( 或其他建議培養基 ) 於 35-37, 二氧化碳 (5%) 培養箱中培養 18-24 小時 4.1.5 若無懷疑菌落, 則延長培養 18-24 小時後再行觀察 4.2 StrepB carrot broth 4.2.1 將陰道 - 肛門拭子接種到 StrepB carrot broth 中 4.2.2 將接種後之 StrepB carrot broth 於 35-37 培養箱中, 培養 18-24 小時 4.2.3 若 broth 產生橘色至紅色的變化, 則判定為 GBS 陽性 (1) 將 broth 次培養於 BAP( 或 CNA) 上 (2) 將次培養之培養基, 於 35-37, 二氧化碳 (5%) 培養箱中培養 18-24 - 2 -
小時 (3) 挑取 GBS 菌落進行藥物感受性試驗 4.2.4 若 broth 無顏色變化 (1) 將 broth 次培養於 BAP( 或 CNA) 上 (2) 將次培養之培養基於 35-37, 二氧化碳 (5%) 培養箱中培養 18-24 小時 (3) 選取懷疑的菌落進行 5.2~5.4 之鑑定流程 5. 鑑定流程 ( 圖二 ): 5.1 觀察 BAP 培養基上灰色半透明菌落 ( 窄型之 Beta 溶血或無溶血 ) 5.2 做觸媒 (3% catalase) 試驗 5.3 若觸媒試驗陰性, 進一步做革蘭氏染色 5.4 若染色呈現革蘭氏陽性鏈球菌 (Gram positve coccus in chains), 則進行下列任一個確定試驗來鑑定 5.4.1 CAMP test (Christie, Atkins, Munch-Peterson test)( 圖一 ) (1) 以直線劃法將標準菌株 Staphylococcus aureus ATCC 25923 劃於 BAP 中間的位置 (2) 同樣以直線劃法, 將測試菌株垂直步驟 (1) 之菌線劃於 BAP 上, 切勿碰觸步驟 (1) 之菌線 (3) 將 BAP 於 35-37, 二氧化碳 (5%) 培養箱中培養 18-24 小時 (4) 觀察在 Staphylococcus aureus 與測試菌株之交界處是否產生箭頭狀 (arrowhead) 的加強溶血現象, 有的話則為陽性反應, 確認為乙型鏈球菌 (5) 陰性則不會產生箭頭狀 (arrowhead) 的加強溶血現象 5.4.2 Hippurate hydrolysis test (1) 取出三管已分裝好的 Hippurate 試劑 ( 每管 0.4 ml) (2) 分別加入培養 18-24 小時的測試菌株 陽性對照菌株 (S. agalactiae ATCC 12386) 與陰性對照菌株 (S. pyogenes ATCC 19615), 濃度約需達 McFarland No.3. ( 注意勿將培養基挑起, 以免內含之蛋白質影響 - 3 -
試驗結果 ) (3) 於 35-37 培養 2 小時 (4) 加入 4 滴的 ninhydrin 試劑 (5) 於 35-37 培養 30 分鐘 (6) 每隔 10 分鐘觀察一次顏色, 陽性反應會於 30 分鐘內出現深藍色變化, 陰性則呈現淡淡的紫色或不變色 5.4.3 鏈球菌血清分型乳膠凝集試驗 (Latex serologic test for streptococcal grouping): 依試劑操作說明執行 5.4.4 自動化鑑定儀器或商業化套組 (Vitek 2, Phoenix, 或 API 等 ): 依儀器或套組操作說明執行 6. 報告 : 6.1 陰性報告 : 乙型鏈球菌培養陰性 6.2 陽性報告 : 乙型鏈球菌培養陽性 7. 品管 : 7.1 CLSI M22-A3 規範之排除品管項目 :LIM broth, BAP, CNA; 若自行配製者, 依下列規範操作 7.1.1 LIM broth (1) 陽性對照 :S. agalactiae ATCC 12386, 生長 ( 混濁 ) (2) 陰性對照 :Escherichia coli ATCC 25922 抑制 ( 部份至全部 ) (3) 頻率 : 每批 7.1.2 BAP (1) 陽性對照 :S. aureus ATCC 25923, 生長良好,β 溶血 (2) 陰性對照 : 無 (3) 頻率 : 每批 7.1.3 CNA (1) 陽性對照 :S. aureus ATCC 25923, 生長良好,β 溶血 (2) 陰性對照 :Proteus mirabilis ATCC 12453 抑制 ( 部份至全部 ) - 4 -
(3) 頻率 : 每批 7.2 觸媒 (3% catalase) 7.2.1 陽性對照 :S. aureus ATCC 25923, 產生氣泡 7.2.2 陰性對照 :S. pyogenes ATCC 19615, 無氣泡產生 7.2.3 頻率 : 每批 7.3 CAMP test 7.3.1 陽性對照 :S. agalactiae ATCC 12386, 產生箭頭狀加強溶血 7.3.2 陰性對照 :S. pyogenes ATCC 19615, 無加強溶血的現象 7.3.3 頻率 : 每批 (BAP) 7.4 Hippurate test (hippurate and ninhydin reagent) 7.4.1 陽性對照 :S. agalactiae ATCC 12386, 30 分鐘內出現深藍色反應 7.4.2 陰性對照 :S. pyogenes ATCC 19615, 淡紫色或不變色 7.4.3 頻率 : 每批 7.5 StrepB carrot broth 7.5.1 陽性對照 :S. agalactiae ATCC 12386, 產生橘色至紅色 7.5.2 陰性對照 :S. pyogenes ATCC 19615, 無顏色變化 7.5.3 頻率 : 每批 8. 參考文獻 : 8.1 Clinical microbiology procedure handbook, 3 rd ed., Section 3.9.2, Group B Streptococcus Culture. 8.2 CDC website: www.cdc.gov/groupbstrep/lab 8.3 Clinical Laboratory Standard Institute M22-A3 8.4 CDC. Morbidity and Mortality Weekly Report, No. RR-10, Vol. 59, 2010. 9. 附圖 : 9.1 圖一,CAMP test 操作結果示意圖 - 5 -
附圖一 CAMP test 圖二, 乙型鏈球菌檢驗鑑定流程圖 BAP 中間直立菌線 :Staphylococcus aureus ATCC 25923; 左側水平菌線 :Group B streptococcus, 與 Staphylococcus aureus ATCC 25923 交界處可見箭頭狀加強溶血區 ; 右側水平菌線 :Group A streptococcus, 與 Staphylococcus aureus ATCC 25923 交界處可見無加強溶血的現象 CAMP test positive control: Group B streptococcus Staphylococcus aureus ATCC 25923 CAMP test negative control: Group A streptococcus 附圖二 乙型鏈球菌檢驗鑑定流程圖 - 6 -
孕婦乙型鏈球菌抗微生物製劑敏感性試驗作業指引 101 年 12 月 31 日修訂版 1. 前言產前分離之乙型鏈球菌 (Group B Streptococcus;GBS) 基本上是不需例行性操作抗微生物製劑敏感性試驗 (antimicrobial susceptibility testing; AST), 但產婦若對於盤尼西林產生過敏者, 實驗室則接受臨床醫師之醫囑進行敏感性試驗 我們建議實驗室例行性對於產前分離的乙型鏈球菌進行敏感性試驗, 以利臨床醫師使用抗生素之參考 臨床與實驗室標準協會 (Clinical and Laboratory Standards Institute ; CLSI) 建議 GBS 的敏感性試驗可採用紙錠擴散法 (disk diffusion method) 或肉湯微量稀釋法 (broth microdilution method), 經認可的商品化系統依製造商的操作建議也可接受 本文則以紙錠擴散法, 提供實驗室操作 GBS 的敏感性試驗時之參考 2. 材料 2.1 Tryptic soy broth(tsb) 或無菌生理食鹽水 2.2 5% 綿羊血的 Mueller-Hinton 培養基 2.3 0.5 McFarland turbidity standard 2.4 鑷子 2.5 無菌棉棒 2.6 紙錠 :penicillin(10 units) erythromycin(15 μg) clindamycin(2 μg) vancomycin(30 μg) 本文建議至少操作上述 4 種抗微生物製劑, 其他藥物可參考 CLSI M100 相關之規範, 下列所述之方法步驟也僅以此四種藥物為例 3. 步驟 3.1 使用無菌棉棒挑取經培養 18-24 小時的菌落, 於 TSB 或無菌生理食鹽水調
成 0.5 McFarland 濃度之懸浮液 3.2 將無菌粗棉棒浸潤於已調好的菌液中, 沿管壁輕輕將多餘菌液壓除, 塗抹在含 5% 綿羊血的 Mueller-Hinton 培養基表面上 ( 以三個不同的方向進行塗抹, 每次轉 60 度, 使接種原平均分布 ) 3.3 待菌液吸收後 ( 約 3-5 分鐘, 勿超過 15 分鐘 ), 以無菌鑷子將適當的抗生素紙錠貼於瓊脂表面 3.4 紙錠間的距離應超過 24 mm, 與培養基的邊緣應距 15 mm; 但對於操作 D-zone test 時, 應注意將 erythromycin 與 clindamycin 的紙錠貼於相隔 12 mm 之距離 3.5 將培養基反轉 ( 培養基蓋朝下 ) 置於 35 ± 2,5% 二氧化碳培養箱中, 培養 20-24 小時 3.6 測量抑制環的直徑 ( 量測時為菌落生長處非溶血處 ) 3.7 當 clindamycin 呈現有效而 erythromycin 無效時, 此時應操作 D-zone test, 操作方式如步驟 3.4 所述 4 品管 4.1 使用 Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 為品管菌株, 可接受的範圍分別為 penicillin(10 units): 24-30 mm erythromycin(15 μg): 25-30 mm clindamycin(2 μg): 19-25 mm vancomycin(30 μg): 20-27 mm 4.2 品管頻率依據 CLSI 規範採用日品管或週品管 4.2.1 日品管 : 實施每日品管, 若連續 20 個結果小於 ( 等於 )1 個或 30 個結果小於 ( 等於 )3 個超過可接受範圍時, 可轉換為週品管 4.2.2 週品管 : 每週至少執行一次 當培養基或紙錠為新批號時, 也應實施品管試驗 5 結果報告 5.1 依據 CLSI M100-S21 針對 Streptococcus spp. β-hemolytic group 的紙錠抑制環判讀與結果解釋 : - 2 -
抗微生物製劑紙錠劑量 抑制環判讀 (mm) S I R Penicillin 10 units 24 - - Erythromycin 15 μg 21 16-20 15 Clindamycin 2 μg 19 16-18 15 Vancomycin 30 μg 17 - - 5.2 結果報告中可備註 : 當 pencillin 有效時, 同時也表示對 ampicillin, amoxicillin, amoxicillin-clavulanic acid, ampicillin-sulbactam, cefazolin, cefepime, cephradine, cephalothin, cefotaxime, ceftriaxone, ceftizoxime, imipenem, ertapenem, and meropenem. 等藥物有效 5.3 D-zone test 的判讀 : 當 clindamycin 紙錠的抑制環與相鄰的 erythromycin 紙 錠呈現鈍形 ( 或 D 型 ) 抑制環時, 為 D-zone test 陽性時, 應考慮為誘導性 clindamycin 抗性,clindamycin 應被報告為抗藥性 無誘導,D-zone test 陰性 有誘導,D-zone test 陽性 6 注意事項 6.1 調整菌液濃度的棉棒與塗抹培養基的棉棒不可使用同一支, 以免造成菌液濃度不正確 6.2 每次操作皆應檢查培養基效期 顏色 厚度與平整度及紙錠之效期 6.3 操作 D-zone test 時 erythromycin 與 clindamycin 的紙錠是相隔 12 mm 的距離, 與葡萄球菌貼的距離不同 6.4 若是 D-zone test 陰性,clindamycin 抑制環中有微薄菌落生長, 仍應判讀 clindamycin 為抗藥性 - 3 -
孕婦乙型鏈球菌檢驗結果書寫報告格式 1. 陰性報告 : 乙型鏈球菌培養陰性 2. 陽性報告 : 乙型鏈球菌培養陽性, 以及 penicillin ampicillin erythromycin clindamycin vancomycin 等 5 種藥敏試驗結果