中国组织工程研究第 18 卷第 23 期 2014 06 04 出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research June 4, 2014 Vol.18, No.23 小鼠精原干细胞体外培养诱导成骨的能力 胡红梅 1, 李伟 2, 孙新明 1, 蒋芬 1 1, 杨赣军 ( 1 井冈山大学医学院组织胚胎学教研室, 江西省吉安市 343000; 2 井冈山大学临床医学院口腔系, 江西省吉安市 343000) 文章亮点 : 1 文章创新性的在体外分离 培养 纯化精原干细胞, 并观察其在成骨细胞培养条件下的生物学特征变化, 以期为治疗牙槽骨吸收 研制骨组织工程材料的种子细胞选择奠定实验基础 2 实验结果提示精原干细胞在该诱导培养条件下具有成骨能力的趋势, 这将为进一步研究成体干细胞的多向分化理论提供参考, 同时也为深入研究精原干细胞向其他细胞转化提供了实验依据 关键词 : 干细胞 ; 培养 ; 精原干细胞 ; 成骨能力 ; 诱导 ; 生物学特性 ; 种子细胞主题词 : 干细胞 ; 成骨细胞 ; 显微镜检查, 荧光 ; 培养基, 条件性基金资助 : 江西省吉安市 2013 年度科技计划项目 ([2013]18), 课题名称 : 小鼠精原干细胞体外培养及分化的研究 摘要背景 : 精原干细胞具有自我更新及多向分化潜能, 并可将其体外定向诱导为特异性细胞, 提示精原干细胞亦可能具有向成骨细胞转化的可能性, 但有关这方面的研究尚未见报道 目的 : 观察小鼠精原干细胞在体外成骨细胞培养条件下的生物学特征变化 方法 : 取生后 15-20 d 小鼠胫骨骨髓, 分离 培养骨髓基质细胞,5 d 后丝裂霉素 C 处理制备成饲养层 ; 取生后七至八天小鼠睾丸, 经酶消化后制成单细胞悬液并接种于饲养层上 3 d 后实验组和对照组分别用条件培养液和基本培养液进行诱导培养, 通过倒置相差显微镜观察培养细胞生长状况及形态变化, 并结合碱性磷酸酶染色 Ⅰ 型胶原免疫荧光染色等方法进行结果检测 结果与结论 : 实验组精原干细胞在条件培养液中较对照组细胞贴壁生长快, 条件培养 3-6 d 后见细胞生长迅速, 呈集落样增长, 细胞立体感增强, 细胞团 簇的大小继续增加, 细胞外基质增多, 但未见明显细胞间桥 培养 15 d 后, 对两组细胞进行碱性磷酸酶染色可见胞质 胞膜染为黑色, 呈阳性 在荧光显微镜下可见实验组细胞浆内出现绿色荧光, 呈阳性荧光反应 ; 对照组细胞呈阴性反应, 说明实验组细胞 Ⅰ 型胶原染色阳性, 这与成骨细胞的生物学特性相似 提示精原干细胞在一定的诱导条件下具有成骨能力, 有望为骨组织工程学研究提供种子细胞 胡红梅, 女,1976 年生, 江西省抚州市人, 汉族, 2007 年泸州医学院毕业, 硕士, 讲师, 主要从事精原干细胞的分化研究 通讯作者 : 李伟, 硕士, 副教授, 井冈山大学临床医学院口腔系, 江西省吉安市 343000 doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.23.016 [http://www.crter.org] 中图分类号 :R394.2 文献标识码 :B 文章编号 :2095-4344 (2014)23-03702-05 稿件接受 :2014-04-04 胡红梅, 李伟, 孙新明, 蒋芬, 杨赣军. 小鼠精原干细胞体外培养诱导成骨的能力 [J]. 中国组织工程研究,2014, 18(23):3702-3706. Osteogenetic ability of mouse spermatogonial stem cells cultured in vitro Hu Hong-mei 1, Li Wei 2, Sun Xin-ming 1, Jiang Fen 1, Yang Gan-jun 1 ( 1 Department of Histology and Embryology, School of Medicine, Jing Gang Shan University, Ji an 343000, Jiangxi Province, China; 2 Oral Department of Clinical Medical School, Jing Gang Shan University, Ji an 343000, Jiangxi Province, China) Abstract BACKGROUND: Spermatogonial stem cells are a kind of adult stem cells, which have self-renewal and differentiation potential, and can be differentiated into specific cells in vitro, suggesting that the spermatogonial stem cells may be possibly differentiated into osteoblasts. But the related research has not been reported. OBJECTIVE: To observe the biological characterization and osteogenic process of mouse spermatogonial stem cells cultured in vitro. METHODS: Spermatogonial stem cells were obtained from the testicle of mice aged 15-20 days, and were cultured on the feeder layer from bone marrow stroma cells in vitro. When cultured for 3 days, the cells were cultured in the conditioned medium (experimental group) and basic medium (control group). The cells proliferation capability and osteogenic property were examined by phase-contrast microscope, alkaline phosphatase activity and type I collagen immunofluorescence staining. RESULTS AND CONCLUSION: Spermatogonial stem cells proliferated faster in the experiment group than in the control group. Cells grew rapidly in colony-like shape in the conditioned medium at 3-6 days, the three-dimensional feeling enhanced, cell mass and clusters continued to increase in size, the extracellular matrix was increased in number and the cytoplasmic bridge was not obvious. After culture for 15 days, cells in the two groups were positive for alkaline phosphatase staining that the cytoplasmic membrane was dyed Hu Hong-mei, Master, Lecturer, Department of Histology and Embryology, School of Medicine, Jing Gang Shan University, Ji an 343000, Jiangxi Province, China Corresponding author: Li Wei, Master, Associate professor, Oral Department of Clinical Medical School, Jing Gang Shan University, Ji an 343000, Jiangxi Province, China Accepted: 2014-04-04 3702 P.O. Box 10002, Shenyang 110180
black. Under the fluorescent microscope, green fluorescence was visible in the experimental group, suggesting the cells in the experimental group was positive for type I collagen, but negative in the control group, which is similar with the biological characteristics of osteoblasts. These findings indicate that spermatogonial stem cells possess the osteogenic capability under induction conditions, which are expected to provide seed cells for bone tissue engineering. Subject headings: stem cells; osteoblasts; microscopy, fluorescence; culture media, conditioned Funding: the Science and Technology Plan of Ji an City in 2013, No. [2013]18 Hu HM, Li W, Sun XM, Jiang F, Yang GJ. Osteogenetic ability of mouse spermatogonial stem cells cultured in vitro. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2014;18(23):3702-3706. 0 引言 Introduction 干细胞是体内具有多向分化潜能 自我更新能力和分裂增殖能力的细胞, 是研究发育生物学机制的理想模型, 同时也是临床上创伤修复 组织或器官功能重建 基因治疗等的理想的细胞移植物, 因此干细胞的研究及利用干细胞治疗疾病的细胞组织工程, 成为继人类基因大规模测试完成后生命科学中最活跃的研究领域之一 精原干细胞作为干细胞家族成员之一, 不仅具有干细胞最根本的特征, 同时有正常的二倍体核型, 可以冷冻保存 体外培养 基因操作等特征, 对医学 生物学等领域研究具有潜在的应用价值 ; 其次, 精原干细胞还是体内惟一的一种可以从细胞水平上来认识其增殖 分化及这些活动调节的干细胞, 加之在青春期以前精原干细胞在睾丸中的数目较多 易于获得 取材方便等优点, 成为近年来研究成体干细胞生物学特性及生物学技术应用研究的理想模型 [1] 精原干细胞是一种成体干细胞, 具有自我更新及多向分化潜能, 并具有一定的可塑性, 能 转分化 为与它原存部位不同的其他特化组织细胞 [2-4] 已有研究表明, 精原干细胞具有向造血细胞 多巴胺能神经元 肌细胞 血管内皮细胞 神经胶质细胞 心肌细胞等分化的能力 [5-7], 将其体外扩增, 可为细胞移植提供足够的来源, 将其体外定向诱导为特异性细胞, 再植入受者体内, 可达到修复损伤 治疗疾病的目的 [8-11] 牙周病是牙周组织的慢性进行性破坏性疾病, 牙周膜 牙槽骨和牙骨质都受到损害时, 最终因支持组织破坏, 尤其是牙槽骨丧失而导致牙齿脱落, 严重影响人们的生活质量, 如何促进牙槽骨的新生, 重建牙周组织生理连接是当今牙周炎的研究热点 [12-13] 由于精原干细胞的易于获得 取材方便以及可以多向分化的特点, 提示精原干细胞亦可能具有向成骨细胞转化的可能性, 利用精原干细胞分化为成骨细胞的潜能, 并运用到牙槽骨吸收导致的牙周疾病治疗中, 将是一个极具探索性的研究, 目前有关这方面的研究尚未见报道 文章尝试在体外分离 培养 纯化精原干细胞, 并观察其在成骨细胞培养条件下的生物学特征变化, 为治疗牙槽骨吸收而研制骨组织工程材料的种子细胞选择奠定实验基础 1 材料和方法 Materials and methods 设计 : 细胞学水平, 观察性实验 时间及地点 : 于 2013 年 4 月在井冈山大学医学院中心实验室完成 材料 : 实验动物 : 取 15-20 d 的小鼠 2 只, 雌雄不拘 ; 出生七至八天雄性小鼠 1 只, 均为清洁级 BABL/c, 购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司, 井冈山大学实验动物中心机构许可证号 :SYXK( 赣 )2012-0001 实验过程中对动物的处置符合 2009 年 Ethical issues in animal experimentation 相关动物伦理学标准的条例 小鼠精原干细胞体外培养诱导成骨能力实验的主要试剂及仪器 : 试剂及仪器 来源 IMDM 培养基 美国 GIBCO 公司 小牛血清 成都哈里生物公司 胰蛋白酶 Ⅳ 型胶原酶 β- 甘油磷酸钠 美国 Sigma 公司 地塞米松 维生素 C 丝裂霉素 C 磷酸 浙江海正药业有限公司 胰岛素 兔抗鼠 c-kit 受体试剂盒 即用型 武汉博士德有限公司 SABC 试剂盒 SABC-FITC DAB 显色试 剂盒 Ⅰ 型胶原蛋白检测试剂盒 碱性磷酸酶试剂盒 南京建成生物工程研究所 CO 2 培养箱 美国 Shellab 公司 超净台 上海净化设备厂 倒置相差显微镜 低速离心机 DP12 数码相机 日本 Olympus 公司 实验方法 : 骨髓基质细胞分离 培养及饲养层的制备 : 取出生 15-20 d 小鼠 2 只, 颈椎脱臼处死后, 无菌条件下取其双侧股骨和胫骨 用 1 ml 含体积分数 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液冲洗骨髓, 离心去上清, 然后加入适量的 IMEM( 含体积分数 10% 胎牛血清 ), 置 37 5%CO 2 培养箱中培养 4 h 后换液, 以去除未贴壁的血细胞, 以后每隔 3 d 换液 1 次 在倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况, 当细胞分裂增殖达瓶壁面积的 80% 时, 用丝裂霉素 C 处理制成饲养层 [14-16] 精原干细胞的分离 培养 : 取出生七至八天雄性小 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 3703
鼠, 颈椎脱臼处死后, 取其双侧睾丸, 去其表面白膜 血管及附睾, 加入适量 D-Hank s 液, 用吸管吹打将生精小管吹散 再加入 10 倍体积的 0.1% Ⅳ 型胶原酶, 于 37 体积分数 5%CO 2 条件下作用 10 min, 移入 10 ml 离心管, 静置待生精小管沉降后, 弃上清 重复上述操作 1 次后, 加入 0.25% 胰蛋白酶, 在显微镜下控制消化时间, 见消化成单细胞或小细胞团时, 用含体积分数 10% 胎牛血清的 IMDM 培养基终止消化, 离心, 去上清, 重新加入 2 ml 上述培养基, 吹打数次, 制成单细胞悬液接种于上述饲养层中 [17-19] 精原干细胞生长状况的观察 : 在倒置相差显微镜下观察精原干细胞生长部位与基质细胞的关系, 并观察增殖干细胞的形态大小, 细胞核大小, 克隆形成时间, 细胞增殖状况, 增殖时间, 细胞的结构 精原干细胞的 C-KIT 受体鉴定 (ABC 法 ): 选取培养 20 d 的生长有精原干细胞的载玻片, 甲醇 冰醋酸 (3 1) 固定液固定 30 min, 滴加含体积分数 3%H 2 O 2 的 PBS 中 20-30 min, 以阻断内源性的过氧化物酶, 滴加 1 200 稀释的一抗 ( 兔抗鼠 C-kit), 对照组滴加生理盐水, 湿盒内 37 保湿 1 h, 滴加生物素标记的二抗 ( 羊抗兔 IgG ), 置于 37 湿盒内 30 min, SABC 工作液,DAB 显色, 干燥后甘油明胶封固 [20-21] 精原干细胞的传代纯化及诱导培养 : 精原细胞培养 3 d 后, 用 0.125% 胰蛋白酶 +0.01% 乙二胺四乙酸消化 2 min, 待圆形的精原细胞脱离后,Hank s 液终止消化, 将传代纯化的精原干细胞悬液吸出, 离心弃上清, 取 6 孔板, 孔内放置事先制备好的盖玻片, 将精原细胞接种在该盖玻片上, 分组进行培养诱导分化 对照组 : 用基本培养液 (DMEM+100 U/mL 青霉素 +100 U/mL 链霉素 + 体积分数 10% 胎牛血清培养精原细胞, 四至五天换液 1 次, 共培养 15 d 实验组: 基本培养液中添加 50 mmol/l β- 甘油磷酸钠 10-6 mol/l 地塞米松 50 mg/l 维生素 C 50 nmol/l 胰岛素 20 nmol/l 碱性成纤维细胞生长因子, 称为条件培养液, 用条件培养液诱导培养精原干细胞, 四至五天换液 1 次, 共培养 15 d 钙 - 钴法碱性磷酸酶染色 : 培养 2 周后, 取出 2 组细胞爬片, 用 PBS 漂洗后, 以 40 g/l 的多聚甲醛固定 30 min, 钙 - 钴法碱性磷酸酶染色 [22] Ⅰ 型胶原免疫荧光检测 : 培养 2 周后, 对 2 组细胞进行 Ⅰ 型胶原检测 采用间接免疫荧光法测定, 取出细胞爬片, 用 PBS 漂洗后, 以 40 g/l 的多聚甲醛固定 30 min, 常规处理后滴加山羊血清封闭液, 加一抗 Ⅰ 型胶原抗体,4 冰箱过夜, 再加二抗生物素化羊抗兔 IgG, 于 37 湿盒中保存 30 min 后, 滴加素生物素过氧化物酶复合物 - 荧光素异硫氰酸盐于 37 湿盒中保存 30 min,90% 甘油封固, 荧光显微镜下观察 主要观察指标 : 两组精原干细胞在不同时间段培养时的形态学观察, 钙 - 钴法碱性磷酸酶染色和 Ⅰ 型胶原免疫荧光检测 [23] 3704 2 结果 Results 2.1 原代骨髓基质细胞培养及饲养层的制备原代培养骨髓基质细胞 4-6 h 贴壁, 细胞增殖快,5-7 d 可达 80% 的汇合, 铺成单层 此时细胞形态不均, 为多角形或梭形, 呈平行或漩涡状生长, 细胞突起间可相互交织成网, 经丝裂酶素 C 处理后, 细胞不再增殖分裂, 但可继续分泌基质 2.2 精原干细胞培养刚接种在饲养层上的睾丸细胞呈单个或成群悬浮于基质细胞上, 接种 24 h 之后即可见链状细胞 ( 图 1A);48 h 可见处于增殖期的细胞呈立体球形, 细胞堆叠紧密, 形态大小一致, 呈 4 个 8 个或数十个成串 成链状生长 ;72 h 细胞团 簇的大小继续增加, 可达 32 个以上的细胞, 细胞核大而圆 核质比高, 符合干细胞特征 ( 图 1B) 2.3 精原干细胞的传代纯化及诱导培养形态学特征 : 实验组精原干细胞在条件培养液中较对照组细胞贴壁生长快, 条件培养 3-6 d 后见细胞生长迅速, 呈集落样增长, 细胞立体感增强, 细胞团 簇的大小继续增加, 细胞外基质增多, 但未见明显细胞间桥 ( 图 1C,D) 钙 - 钴法碱性磷酸酶染色 : 培养 15 d 后, 对 2 组细胞进行碱性磷酸酶染色可见胞质 胞膜染为黑色, 呈阳性 ( 图 1E) Ⅰ 型胶原免疫荧光检测结果 : 在荧光显微镜下可见实验组的细胞浆内出现绿色荧光, 呈阳性荧光反应 ( 图 1F), 对照组细胞呈阴性反应 提示实验组的细胞可以表达 Ⅰ 型胶原蛋白, 且主要集中胞浆中 3 讨论 Discussion 精原干细胞属于不均一的细胞体系, 包括多种类型 在实验中发现, 动物日龄的选择 适当的组织消化步骤及合理的饲养层的选择, 是获得高产量高纯度有活力的精原干细胞的重要影响因素 [24] 本实验选用七至八天雄性小鼠, 是因为此时期的小鼠生精上皮内基本只有 A 型精原细胞和支持细胞, 其他各级生精细胞尚未发育成熟, 理论上可获得最大量的精原干细胞 作者采用两步酶消化法结合差速贴壁法, 能制备出大量纯度较高的精原干细胞 在干细胞研究应用中, 首先要解决的关键性问题就是干细胞在体外的非分化扩增, 即如何在保持干细胞数目扩增的同时又抑制其分化 目前主要有两种方法 : 一是用饲养层细胞来支持干细胞的培养, 二是用条件培养基 饲养层的主要作用是提供干细胞培养时的附着支持物, 分泌干细胞体外存活和增殖必须的生长因子, 还兼有同化营养液, 除去培养环境中代谢毒素的作用 以骨髓基质细胞作为饲养层培养精原干细胞, 在未加任何外源性因子的条件下可观察到精原干细胞呈现大量未分化增殖现象, 和传统的饲养层相比, 其具有简单 经济 可操作性强等优点 前期的研究已报道了用原代骨髓基质细胞作饲养层来培养精原干细胞的可能机制并做了相关鉴定 [25] P.O. Box 10002, Shenyang 110180
A B C D E F 图 1 精原干细胞的培养 传代纯化及诱导分化 Figure 1 Culture, passage, purification, and differentiation of spermatogonial stem cells 图注 : 图中 A 为在饲养层上培养 24 h 的精原干细胞, 细胞增殖明显, 可呈链状 ( 相差显微镜, 100);B 为在饲养层上培养 3 d 的精原干细胞, 细胞团 簇的大小继续增加, 细胞核大而圆 核质比高, 可见细胞间桥 ( 相差显微镜, 200);C 为传代诱导培养 2 h 的精原干细胞, 细胞生长迅速, 立体感较强 ( 100);D 为传代诱导培养 3 d 的精原干细胞, 细胞呈集落样增长, 细胞立体感增强, 但细胞间桥不明显 ( 200);E 为精原干细胞传代诱导培养 15 d 后碱性磷酸酶染色, 胞质 胞膜染为黑色, 呈阳性 ( 400);F 为精原干细胞传代诱导 15 d 后 Ⅰ 型胶原免疫荧光染色, 细胞浆内出现绿色荧光, 呈阳性荧光反应 ( 200) 本实验选用条件培养基即在基础培养液中添加了一定诱导物质以观察精原干细胞的生物学特征的变化, 结果显示, 细胞贴壁及增殖速度快于对照组, 但增殖的细胞之间不表现出精原干细胞的特征性结构 - 胞质间桥, 这提示细胞形态结构发生了一定的变化 ; 其次免疫荧光阳性显示出实验组细胞内 Ⅰ 型胶原的表达, 这进一步提示细胞在功能上具有向成骨细胞转化的可能性, 现对其可能的机制作如下讨论 : 维生素 C 是胶原中脯氨酸和赖氨酸末端羟基化的共同影响因子, 是细胞合成 Ⅰ 型胶原所必需的成分, 它可诱导成骨细胞表达特异性分化蛋白基因, 从而促使细胞碱性磷酸酶活性的增加和蛋白质合成, 同时刺激钙盐的沉积, 促进钙化结节的形成 地塞米松是人工合成的糖皮质激素, 骨细胞是糖皮质激素的靶细胞, 故地塞米松可有效地 [26-27] 调节骨细胞的生长和分化,Chaudhary 等将其作为阳性对照来研究其他生长因子或激素等对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响 ; 其次, 地塞米松还具有促进胰岛素样生长因子和 Ⅰ 型胶原合成的作用, 目前是广泛用于骨髓基质干细胞 牙髓细胞 牙囊细胞等向成骨样细胞分化的诱导剂 碱性成纤维细胞生长因子是一种广谱的有丝分裂源, 对来源于中胚层和神经外胚层的细胞具有明显的促增殖作用, 能够促进软骨及骨组织的形成 本实验用碱性成纤维细胞生长因子并联合应用了高浓度 (10-6 mol/l) 地塞米松, 发现它们在促进细胞增殖的同时, 还能促进细 胞的分化 胰岛素通过促进成骨细胞增殖和 Ⅰ 型胶原的合成发挥作用, 研究显示, 胰岛素可促进人牙髓细胞分化成具有矿化能力的细胞, 联合应用碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素促进作用更明显 [28-30] β- 甘油磷酸钠能为细胞提供磷酸根, 磷酸根作为碱性磷酸酶作用底物, 能加速生理性钙盐沉积 ; 同时磷是机体的一种重要元素, 参与骨质的形成及细胞膜的组成, 并与许多代谢中的酶活性有关, 从而促进向成骨细胞分化的转变 碱性磷酸酶是成熟成骨细胞的标志性酶之一, 是参与骨形成 代谢及再生的重要物质 + 它能够水解有机磷酸酶, 使局部 PO 4 浓度增高, 并可破坏钙化抑制剂, 从而启动钙化, 因此碱性磷酸酶在体外钙化中起着关键性作用 Ⅰ 型胶原蛋白是成骨细胞分泌的一种蛋白, 是骨胶原的重要组成部分, 经矿化后为骨骼提供支架 这些说明精原干细胞在成骨细胞培养条件下物学特征发生了变化, 可诱导分化为具有某些成骨细胞特征的细胞 本实验初步探讨了精原干细胞在成骨细胞培养条件的生物学特征变化, 结果提示了精原干细胞在该诱导培养条件下具有成骨能力的趋势, 这将为进一步研究成体干细胞的多向分化理论提供实验参考, 同时也为深入研究精原干细胞向其他细胞转化提供实验基础 致谢 : 感谢井冈山大学医学院中心动物实验室提供的动物 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 3705
作者贡献 : 第一作者负责实验实施, 第三作者负责实验设计, 第二作者负责实验评估, 资料收集为第一 三作者, 第一作者成文, 第二 三作者审校, 第一 二作者对文章负责 利益冲突 : 文章及内容不涉及相关利益冲突 伦理要求 : 实验过程中对动物的处置符合 2009 年 Ethical issues in animal experimentation 相关动物伦理学标准的条例 学术术语 : 精原干细胞 - 是一种成体干细胞, 具有自我更新及多向分化潜能, 已有研究表明, 精原干细胞具有多向细胞分化的能力, 将其体外扩增, 可为细胞移植提供足够的来源, 并可将其体外定向诱导为特异性细胞 作者声明 : 文章为原创作品, 无抄袭剽窃, 无泄密及署名和专利争议, 内容及数据真实, 文责自负 4 参考文献 References [1] Thomson JA,Itskovitz- Eldor J,Shapiro SS,et al.embryonic stem cell lines deribed from human blastocyts.science. 1998;282(5391):1145-1147. [2] Sumner JP, Shapiro EM, Maric D,et al.in vivo labeling of adult neural progenitors for MRI with micron sized particles of iron oxide: quantification of labeled cell phenotype.neuroimage. 2009;44(3):671-678. [3] Vande Velde G, Raman Rangarajan J, Vreys R, et al. Quantitative evaluation of MRI-based tracking of ferritin-labeled endogenous neur cell progeny in rodent brain.neuroimage. 2012; 62(1):367-380. 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