第 12 期 孙 凯,% 等.% 缺 血 后 处 理 对 肝 脏 缺 血 再 灌 注 损 伤 的 保 护 效 应 2481 盒 由 南 京 建 成 生 物 工 程 公 司 提 供 ; 抗 大 鼠 Bcl-2 蛋 白 单 克 隆 抗 体 及 链 霉 菌 抗 生 物 素 蛋 白 - 过 氧 化 物 酶

2480 %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 南 方 医 科 大 学 学 报 (J%South%Med%Univ)%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%2009;29(12) 缺 血 后 处 理 对 肝 脏 缺 血 再 灌 注 损 伤 的 保 护 效 应 孙 凯 1, 刘 志 苏 2, 孙 权 2 ( 1 南 方 医 科 大 学 南 方 医 院 普 通 外 科, 广 东 广 州 510515; 2 武 汉 大 学 中 南 医 院 普 通 外 科, 湖 北 武 汉 430071) 摘 要 : 目 的 探 讨 缺 血 后 处 理 对 肝 脏 缺 血 再 灌 注 损 伤 (IRI) 的 保 护 效 应 方 法 建 立 大 鼠 局 部 肝 脏 IRI 模 型, 将 24 只 健 康 雄 性 Wistar 大 鼠 随 机 分 为 假 手 术 缺 血 再 灌 注 缺 血 后 处 理 3 组, 以 缺 血 再 灌 前 反 复 多 次 的 短 暂 预 再 灌 停 灌 作 后 处 理 ; 观 察 肝 组 织 中 丙 二 醛 (MDA) 超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD) 过 氧 化 氢 酶 (CAT) 及 谷 胱 甘 肽 过 氧 化 物 酶 (GSH-PX) 水 平 变 化, 采 用 免 疫 组 化 法 检 测 肝 组 织 中 Bcl-2 蛋 白 含 量, TUNEL 法 检 测 肝 细 胞 凋 亡 状 态, 透 射 电 镜 观 察 肝 组 织 超 微 结 构 的 病 理 形 态 学 变 化, 并 以 图 象 分 析 仪 对 线 粒 体 立 体 形 态 进 行 定 量 分 析 结 果 与 缺 血 再 灌 注 组 相 比, 缺 血 后 处 理 组 肝 组 织 中 MDA 含 量 及 肝 细 胞 凋 亡 指 数 明 显 下 降 (P<0.05), 而 SOD CAT GSH-PX 水 平 和 Bcl-2 蛋 白 表 达 的 光 密 度 值 则 显 著 升 高 (P<0.05), 线 粒 体 超 微 结 构 损 伤 亦 明 显 减 轻 结 论 缺 血 后 处 理 可 通 过 抑 制 再 灌 注 后 肝 实 质 细 胞 凋 亡, 减 轻 肝 脏 IRI 关 键 词 : 肝 脏 ; 缺 血 再 灌 注 损 伤 ; 缺 血 后 处 理 ; 凋 亡 ; 线 粒 体 ;Bcl-2 中 图 分 类 号 :R657.3 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 :1673-4254(2009)12-2480-05 Protective effect of ischemic postconditioning on hepatic ischemia-reperfusion injury SUN%Kai 1,%LIU%Zhi-su 2,%SUN%Quan 2 1 Department%of%General%Surgery,%Nanfang%Hospital,%Southern%Medical%University,%Guangzhou%510515,%China;% 2 Department%of%General% Surgery,%Zhongnan%Hospital,%Wuhan%University,%Wuhan%430071,%China Abstract: Objective To% investigate% the% protective% effect% of% ischemic% postconditioning% (IPC) % against% hepatic% ischemia-reperfusion%injury.%methods Twenty-four%normal%male%Wistar%rats%were%randomly%divided%into%sham-operated%group,% ischemia-reperfusion% group% (IR) % and% IPC% group, % and% in% the% latter% two% groups, % the% rats% were% subjected% to% acute% hepatic% ischemia-reperfusion. %IPC%was%achieved%by%several%brief%pre-reperfusion%and%withdrawn%before%persistent%reperfusion. %The% concentration%of%malondialdehyde% (MDA) %and%activity%of%several%antioxidant%enzymes%in%the%hepatic%tissue%were%measured.% The%cell%apoptosis%was%detected%by%TdT-mediated%dUTP-biotin%nick%end%labeling%(TUNEL)%and%the%expression%of%Bcl-2%protein% measured%by%immunohistochemistry. %The%mitochondrial%ultrastructural%and%morphological%changes%of%the%hepatic%cells%were% observed%by%electron%microscopy.%results Compared%with%IR%group,%IPC%group%showed%significantly%reduced%concentration%of% MDA%and%the%hepatocellular%apoptotic%index%(P<0.05)%with%markedly%enhanced%activity%of%the%antioxidant%enzymes%and%Bcl-2% protein%expression%(p<0.05).the%mitochondrial%ultrastructural%damage%was%also%relieved%obviously%in%ipc%group.%conclusions IPC%can%reduce%the%hepatocellular%apoptosis%after%reperfusion%and%offers%protection%against%hepatic%IR%injury. Key words: liver;%ischemia-reperfusion%injury;%ischemic%postconditioning;%apoptosis;%mitochondria;%bcl-2 肝 脏 缺 血 再 灌 注 损 伤 (ischemia-reperfusion% injury,iri) 是 临 床 广 泛 关 注 的 问 题, 常 见 于 许 多 临 床 病 理 过 程 和 肝 脏 手 术 过 程, 如 出 血 性 休 克 肝 切 除 和 肝 移 植 等 业 已 证 实, 凋 亡 作 为 细 胞 死 亡 的 一 种 基 本 方 式, 对 于 维 持 细 胞 正 常 发 育 和 稳 定 具 有 重 要 意 义, 与 临 床 上 许 多 疾 病 的 发 生 发 展 密 切 相 关, 亦 参 与 组 织 器 官 的 IRI [1] 线 粒 体 作 为 细 胞 关 键 的 细 胞 器 之 一, 其 在 供 能 调 节 渗 透 压 钙 稳 态 PH 值 以 及 细 胞 信 号 传 %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 收 稿 日 期 :2009-06-16 基 金 项 目 : 广 东 省 自 然 科 学 基 金 博 士 启 动 项 目 ( 编 号 : 8451051501000390) 作 者 简 介 : 孙 凯 (1978-), 男, 博 士, 电 话 :020-62787170,E-mail:% sunkai9602@sina.com 通 讯 作 者 : 刘 志 苏, 武 汉 大 学 中 南 医 院 普 通 外 科 导 中 起 重 要 作 用, 而 线 粒 体 / 细 胞 色 素 C 凋 亡 途 径 亦 日 益 受 到 学 者 关 注 本 实 验 通 过 建 立 在 体 大 鼠 局 部 肝 脏 IRI 模 型, 观 察 缺 血 后 处 理 (ischemic% postconditioning,ipc) 对 肝 脏 IRI 中 细 胞 凋 亡 的 影 响 及 线 粒 体 在 其 中 的 调 控 作 用, 为 临 床 上 入 肝 血 流 阻 断, 采 取 更 合 理 的 复 流 方 式 提 供 理 论 依 据 1%% 材 料 与 方 法 1.1%% 实 验 动 物 本 实 验 选 用 健 康 雄 性 Wistar 大 鼠 24 只, 体 质 量 200~250%g, 由 武 汉 大 学 医 学 院 动 物 实 验 中 心 提 供 1.2%% 主 要 试 剂 丙 二 醛 (MDA) 超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD) 过 氧 化 氢 酶 (CAT) 及 谷 胱 甘 肽 过 氧 化 物 酶 (GSH-PX) 试 剂

第 12 期 孙 凯,% 等.% 缺 血 后 处 理 对 肝 脏 缺 血 再 灌 注 损 伤 的 保 护 效 应 2481 盒 由 南 京 建 成 生 物 工 程 公 司 提 供 ; 抗 大 鼠 Bcl-2 蛋 白 单 克 隆 抗 体 及 链 霉 菌 抗 生 物 素 蛋 白 - 过 氧 化 物 酶 (S-P) 免 疫 组 化 试 剂 盒 购 自 北 京 中 山 生 物 技 术 有 限 公 司 ; 末 端 脱 氧 核 苷 酸 转 移 酶 介 导 的 dutp 缺 口 末 端 标 记 法 (TUNEL) 原 位 细 胞 凋 亡 检 测 试 剂 盒 为 美 国 Boehringer%Mannhein 公 司 产 品 1.3%% 动 物 分 组 及 模 型 制 备 实 验 动 物 术 前 12%h 禁 食, 自 由 进 水,0.3% 戊 巴 比 妥 钠 30%mg/kg 腹 腔 内 注 射 麻 醉, 取 上 腹 正 中 切 口, 入 腹 后 分 离 肝 十 二 指 肠 韧 带, 充 分 显 露 第 一 肝 门 部, 参 照 Nauta [2] 法 建 立 大 鼠 肝 脏 局 部 缺 血 再 灌 注 模 型, 用 无 创 小 血 管 夹 阻 断 尾 状 叶 及 左 肝 叶 血 流, 造 成 70% 肝 脏 缺 血, 但 不 阻 断 右 肝 叶 血 流, 以 防 门 静 脉 和 胃 肠 道 淤 血 将 动 物 随 机 分 为 3 组, 每 组 8 只 :(1) 假 手 术 组 (S 组 ): 入 腹 后 仅 分 离 肝 十 二 指 肠 韧 带, 但 不 阻 断 肝 门 血 供 ;(2) 缺 血 再 灌 注 组 (IR 组 ): 肝 脏 缺 血 60% min, 再 灌 注 120%min;(3) 缺 血 后 处 理 组 (IPC 组 ): 缺 血 60%min 后, 再 灌 注 2%min, 缺 血 2%min, 再 灌 注 3% 的 凋 亡 细 胞 每 例 标 本 的 切 片 随 机 选 取 5 个 400 倍 视 野, 计 算 出 平 均 每 100 个 细 胞 中 的 凋 亡 细 胞 数, 并 以 百 分 数 表 示 作 为 凋 亡 指 数 (apoptotic%index,ai) 凋 亡 细 胞 形 态 符 合 以 下 4 点 : 单 个 细 胞 周 围 无 炎 症 反 应 胞 膜 皱 缩 胞 核 致 密 深 染 呈 棕 黄 色 颗 粒 或 碎 片 1.7%% 肝 组 织 超 微 结 构 的 病 理 形 态 学 观 察 切 取 新 鲜 左 叶 肝 组 织 约 1%mm 3, 用 容 积 分 数 2.5% % 戊 二 醛 作 前 固 定,1%% 锇 酸 后 固 定, 梯 度 乙 醇 脱 水 后 氧 化 丙 烯 浸 透, 环 氧 树 脂 包 埋, 超 薄 切 片, 铅 - 铀 染 色, 在 H-600 透 射 电 镜 下 观 察 超 微 结 构 改 变, 用 美 国 Image%Pro%Plus 图 象 分 析 系 统 测 定 线 粒 体 截 面 面 积 (A) 截 面 周 长 (P), 并 计 算 线 粒 体 比 表 面 δ=4p/(πa) 1.8%% 统 计 学 分 析 实 验 所 得 数 据 用 均 数 ± 标 准 差 (x±s) 表 示, 采 用 完 全 随 机 设 计 的 单 因 素 方 差 分 析, 多 个 样 本 均 数 间 的 两 两 比 较 采 用 Student-Newman-Keuls%q 检 验, 以 P<0.05 为 差 异 有 显 著 性, 所 有 操 作 均 以 SPSS%11.0 统 计 软 件 完 成 min, 缺 血 2%min, 再 灌 注 5%min, 缺 血 2%min, 再 灌 注 7% min, 缺 血 2%min, 再 全 面 恢 复 血 液 灌 注 95%min 1.4%% 肝 组 织 MDA 含 量 及 SOD CAT GSH-PX 活 性 测 定 切 取 新 鲜 左 叶 肝 组 织 100%mg, 加 入 1%mol/L%HCL% 1%mL 混 匀 研 磨, 制 备 10% 肝 组 织 匀 浆,4% 3%000% r/min 离 心 10%min, 取 上 清 液 于 -70% 液 氮 保 存 至 检 测 ; 测 定 前 将 标 本 置 于 冷 水 中 复 融, 再 次 离 心, 取 上 清 液 按 试 剂 盒 说 明 用 比 色 法 检 测 2%% 结 果 2.1%% 肝 组 织 MDA 含 量 及 SOD CAT GSH-PX 活 性 变 化 再 灌 注 后,IR IPC 组 肝 组 织 中 MDA 含 量 迅 速 升 高, 而 SOD CAT GSH-PX 活 性 减 弱, 与 S 组 相 比 差 异 均 具 有 显 著 性 (P<0.05); 与 IR 组 相 比,IPC 组 肝 组 织 中 MDA 含 量 下 降, 而 SOD CAT GSH-PX 活 性 升 高, 其 差 异 亦 具 有 显 著 性 ( 表 1,P<0.05) 1.5%%Bcl-2 蛋 白 免 疫 组 化 检 测 切 取 新 鲜 左 叶 肝 组 织, 中 性 福 尔 马 林 固 定 12~24%h, 常 规 石 蜡 包 埋 并 作 肝 组 织 切 片 (4% μm), 切 片 经 常 规 二 甲 苯 脱 蜡 及 梯 度 乙 醇 脱 水 表 1%% 肝 组 织 MDA 含 量 及 SOD CAT GSH-PX 活 性 变 化 Tab.1 Measurement of MDA concentration and antioxidant enzymes activity(mean±sd,n=8) 后,0.01%mmol/L%PBS 漂 洗, 分 别 加 入 3% 过 氧 Group MDA(nmol/mg) SOD(U/mg%prot) CAT(U/mg%prot) GSH-Px(U/mg%prot) Sham 3.42±1.12 241.47±19.52 91.66±8.16 124.17±24.37 化 氢 液 和 1% 小 牛 血 清 各 孵 育 10 分 钟, 以 消 除 IR 17.56±4.80 %%132.99±22.11 %%%40.24±7.73 %%%%51.75±16.43 内 源 性 过 氧 化 酶 影 响 和 封 闭 非 特 异 性 反 应 切 IPC %%10.18±3.56 %%%%176.84±20.50 %%%%%64.81±7.19 %%%%%%89.70±28.15 片 加 入 小 鼠 抗 大 鼠 Bcl-2 单 克 隆 抗 体 孵 育 1%h P<0.05%vs sham%group;% P<0.05%vs IR%group 并 经 PBS 漂 洗 后, 采 用 S-P 免 疫 组 化 法 检 测 Bcl-2 蛋 白 表 达,HAIPS-2%000 高 清 晰 图 象 分 析 系 统 测 定 每 组 中 Bcl-2 平 均 光 密 度 值 (OD 值 ) 作 为 Bcl-2 2.2%%Bcl-2 蛋 白 表 达 状 况 IR 组 Bcl-2% OD 值 为 0.067 ±0.011, 与 S 组 蛋 白 含 量 评 定 1.6%% 原 位 细 胞 凋 亡 检 测 肝 组 织 石 蜡 切 片 制 作 方 法 同 上, 在 末 端 脱 氧 核 苷 酸 转 移 酶 (TdT) 介 导 下, 使 生 物 素 化 的 三 磷 酸 脱 氧 尿 苷 (dutp) 标 记 至 DNA 断 裂 后 形 成 的 3,-OH 末 端, 借 助 生 物 素 与 亲 和 素 的 特 异 结 合, 使 过 氧 化 物 酶 连 接 至 DNA 断 点, 最 后 加 入 底 物, 通 过 3,3- 二 胺 基 联 苯 胺 (DAB) 显 色, 可 在 光 镜 下 观 察 到 细 胞 核 棕 黄 着 色 (0.096±0.017) 相 比 差 异 具 有 显 著 性 (P<0.05);IPC 组 Bcl-2%OD 值 为 0.138±0.016, 与 IR 组 相 比 差 异 亦 具 有 显 著 性 (P<0.05)( 图 1) 2.3%% 肝 细 胞 凋 亡 状 况 光 镜 下 TUNEL 法 染 色 显 示 再 灌 注 早 期, 细 胞 损 伤 主 要 是 以 凋 亡 的 形 式 出 现, 凋 亡 细 胞 主 要 位 于 中 央 静 脉 周 围 ( 图 2); 电 镜 观 察 下, 从 凋 亡 的 最 初 表 现 如 细 胞 肿 胀 变 圆 脱 落 和 染 色 质 边 聚 到 典 型 的 凋 亡 表 现

南方医科大学学报 (J%South%Med%Univ)%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 第 29 卷 2482%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 如胞质和核浓缩 凋亡小体形成等均可见到 图 3 比 差 异 具 有 显 著 性 P<0.05 IPC 组 凋 亡 指 数 为 IR 组 凋 亡 指 数 为 46.53±3.47 与 S 组 2.05±0.83 相 23.16±2.67 与 IR 组相比差异亦具有显著性 P<0.05 A B C 图 1%% 肝组织 Bcl-2 免疫组化结果 Fig.1 Immunohistochemical staining of Bcl-2 protein in liver tissues(sp,%original%magnification:% 200) A B C 图 2%% 肝组织原位细胞凋亡检测 Fig.2 In situ TUNEL assay for apoptosis detection in the liver tissues in each group (Original%magnification:% 200) 再灌注后 IR IPC 组线粒体平均截面面积 周长 增加 而比表面缩小 与 S 组相比其差异均具有显著 性 P<0.05 IPC 组 与 IR 组 比 较 线 粒 体 截 面 面 积 周 长 减 小 而 比 表 面 增 大 其 差 异 亦 具 有 显 著 性 表 2 P<0.05 3%% 讨论 图 3%% 肝细胞凋亡的超微结构改变 在多种应激因素如活性氧 Ca2+ 超载 毒素等作 Fig.3 Morphological change of 用下 线粒体超微结构和功能受损 使得原先位于线 hepatocellular apoptosis in IR group 粒体内的某些与凋亡相关的活性物质包括细胞色素 (Original%magnification:% 15%000) C 被释放入胞质 3 一旦细胞色素 C 释放 细胞将通 2.4%%线粒体超微结构变化 S 组正常线粒体结构 线粒体呈圆形或椭圆形整 过两条途径死亡 一是通过快速凋亡机制 释放的细 齐排列 无肿胀 线粒体膜完整 嵴呈同心圆或纵形排 列 密集清晰 IR 组线粒体肿胀明显 膜模糊不清 部 分膜破裂 线粒体嵴明显疏松溶解 大量空泡形成 IPC 组线粒体结构基本正常 排列整齐 膜基本完整 线粒体嵴密集 无空泡形成 图 4 2.5%%线粒体立体形态的定量分析 胞 色 素 C 与 凋 亡 蛋 白 酶 激 活 因 子 -1 Apaf-1 caspase-9 结 合 形 成 CytC-Apaf-1-caspase-9 复 合 物 亦称凋亡体 导致 caspase-9 活化 继而顺序激活下游 的 caspase-3 启动凋亡的瀑布级联反应 同时仍有部 分未释放的细胞色素 C 牢固地结合于细胞色素 b-c1 和细胞色素 C 氧化酶 维持电子传递和有氧呼吸 产 生 足 够 的 ATP 为 凋 亡 进 程 提 供 能 量 保 障 4 二 是 细

第 12 期 孙 凯,% 等.% 缺 血 后 处 理 对 肝 脏 缺 血 再 灌 注 损 伤 的 保 护 效 应 2483 A B C 图 4%% 肝 细 胞 内 线 粒 体 超 微 结 构 改 变 Fig.4 Changes of mitochondrial ultrastructure in liver cells(original%magnification:% 15%000) 表 2%% 线 粒 体 形 态 特 征 参 数 的 变 化 Tab.2 Changes of parameters of mitochondrial morphology(mean±sd,n=8) Group Area(μm 2 ) Perimeter(μm) Surface(μm -1 ) Sham 76.2±8.1 22.7±4.6 0.39±0.04 IR %%278.3±22.2 %%60.9±5.9 %%0.17±0.05 IPC %%%%150.9±16.4 %%%%42.1±4.3 %%%%0.26±0.05 P<0.05%vs sham%group;% P<0.05%vs IR%group 胞 进 入 一 种 慢 速 的 坏 死 过 程, 通 透 性 转 化 孔 (permeability%transition%pore,ptp) 开 放, 线 粒 体 基 质 由 于 高 渗 而 膨 胀 破 裂, 原 先 存 在 的 线 粒 体 内 膜 跨 膜 电 位 ( ψm) 迅 速 崩 溃, 细 胞 色 素 C 大 量 释 放, 电 子 传 递 呼 吸 链 受 阻,ATP 含 量 骤 减, 无 法 维 持 有 效 供 能, 细 胞 走 向 坏 死 由 此 可 见, 线 粒 体 结 构 和 功 能 的 改 变 [5] 可 决 定 细 胞 是 凋 亡 还 是 坏 死 本 实 验 证 实, 再 灌 注 早 期 细 胞 损 伤 主 要 是 以 凋 亡 的 形 式 出 现 再 灌 注 后 肝 组 织 中 脂 质 过 氧 化 物 的 终 产 物 MDA 含 量 增 加, 而 SOD CAT 及 GSH-PX 作 为 细 胞 内 主 要 的 抗 氧 化 酶 和 自 由 基 清 除 剂, 其 水 平 却 显 著 降 低, 表 明 其 保 护 组 织 细 胞 免 受 活 性 氧 损 伤 的 效 能 减 弱, 过 量 的 氧 自 由 基 可 直 接 与 线 粒 体 膜 表 面 多 不 饱 和 脂 肪 酸 反 应, 造 成 其 结 构 和 功 能 破 坏, 细 胞 色 素 C 等 促 凋 亡 物 质 大 量 释 放, 触 发 细 胞 凋 亡 的 发 生 线 粒 体 立 体 形 态 的 定 量 分 析 表 明, 线 粒 体 损 伤 的 主 要 形 态 学 改 变 是 肿 胀 既 往 认 为 凋 亡 细 胞 主 要 表 现 为 染 色 质 固 缩 而 线 粒 体 几 乎 未 受 触 动, 近 来 越 来 越 多 的 证 据 表 明 在 凋 亡 细 胞 中 线 粒 体 呈 现 肿 胀 体 积 巨 [6] 增 固 缩 外 膜 崩 解 等 显 著 改 变 比 表 面 是 指 颗 粒 表 面 膜 的 平 均 面 积 与 其 体 积 之 比, 是 反 应 线 粒 体 肿 胀 程 度 的 客 观 指 标 再 灌 注 后, 线 粒 体 截 面 面 积 周 长 显 著 增 大, 而 比 表 面 明 显 降 低, 线 粒 体 肿 胀 明 显, 这 亦 与 电 镜 观 察 下 线 粒 体 超 微 结 构 的 变 化 趋 势 相 一 致 ; 而 经 后 处 理 后 线 粒 体 肿 胀 损 伤 程 度 明 显 减 轻, 肝 细 胞 凋 亡 指 数 亦 随 之 下 降, 说 明 线 粒 体 结 构 和 功 能 变 化 与 再 灌 注 后 细 胞 凋 亡 的 发 生 发 展 密 切 相 关, 线 粒 体 功 能 障 碍 可 能 是 细 胞 凋 亡 的 早 期 关 键 事 件, 而 IPC 对 线 粒 体 超 微 结 构 和 功 能 具 有 显 著 的 保 护 效 应 本 实 验 中 IPC 所 采 用 的 预 再 灌 停 灌 的 处 理 方 法 虽 与 缺 血 预 处 理 (ischemic%preconditioning,ip) 相 似, 但 两 者 最 根 本 的 不 同 之 处 在 于 处 理 时 机 的 差 异 预 处 理 发 生 在 缺 血 前, 系 通 过 启 动 组 织 细 胞 自 身 内 源 性 保 护 机 制, 而 使 其 能 够 耐 受 随 后 长 时 间 的 缺 血 损 伤 ; 后 处 理 面 对 的 则 是 已 缺 血 组 织, 是 从 建 立 一 种 更 有 效 的 再 灌 注 方 法 出 发, 旨 在 处 理 和 挽 救 缺 血 组 织, 最 大 程 度 的 减 轻 再 灌 注 损 伤 本 实 验 证 实,IPC 对 缺 血 肝 脏 确 具 有 明 显 的 保 护 作 用 我 们 推 测, 缺 血 再 灌 前 反 复 短 暂 的 预 再 灌 在 某 种 意 义 上 相 当 于 有 控 制 的 缓 慢 间 歇 性 复 氧, 可 减 少 突 然 复 氧 时 氧 自 由 基 的 爆 发 性 产 生, 并 刺 激 胞 内 抗 氧 化 酶 和 自 由 基 清 除 剂 的 释 放 而 发 挥 保 护 效 应 表 现 为 IPC 组 与 IR 组 相 比, 肝 组 织 中 MDA 含 量 下 降, 而 SOD CAT 及 GSH-PX 等 抗 氧 化 酶 活 性 则 显 著 升 高, 从 而 减 轻 了 毒 性 氧 自 由 基 对 线 粒 体 膜 脂 质 过 氧 化 反 应 的 损 伤 作 用, 维 持 线 粒 体 超 微 结 构 和 功 能 的 完 整 性, 拮 抗 肝 实 质 细 胞 凋 亡 的 发 生 [7] Cave 等 证 实, 缓 慢 再 灌 注 ( 缓 慢 松 开 微 米 缩 窄 器 ) 比 突 然 再 灌 注 ( 突 然 解 除 动 脉 夹 ) 的 心 肌 梗 死 范 围 缩 小 室 颤 发 生 率 降 低, 这 可 能 与 本 实 验 的 IPC 在 本 质 上 相 似, 两 者 亦 可 能 具 有 相 同 或 相 似 的 作 用 途 径, 但 其 确 切 作 用 机 制 尚 需 进 一 步 研 究 另 外, 为 了 解 线 粒 体 在 凋 亡 调 节 通 路 中 作 用, 我 们 在 实 验 中 还 测 定 了 肝 组 织 中 Bcl-2 蛋 白 含 量 的 变 化 Bcl-2 蛋 白 作 为 Bcl-2 家 族 中 凋 亡 抑 制 蛋 白 的 主 要 代 表, 通 过 其 羧 基 端 的 信 号 锚 定 序 列 横 跨 线 粒 体 膜 [8] 而 发 挥 作 用 Bcl-2 蛋 白 在 线 粒 体 上 可 通 过 调 节 膜 表 面 PTP 的 通 透 性 或 直 接 参 与 形 成 专 一 性 通 道, 而 维 持 线 粒 体 内 膜 跨 膜 电 位 的 稳 定 并 抑 制 细 胞 色 素 C 等 促 凋 亡 物 质 的 释 放, 从 而 抑 制 胞 质 中 caspase 的 激 活, 阻 断 了 细 胞 凋 亡 的 瀑 布 级 联 反 应 本 实 验 证 实, 经 过 IPC 后 肝 组 织 中 Bcl-2 蛋 白 光 密 度 值 明 显 高 于 IR 组, 而 凋 亡 指 数 亦 显 著 下 降, 说 明 IPC 可 通 过 上 调 跨

2484%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 南 方 医 科 大 学 学 报 (J%South%Med%Univ)%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 第 29 卷 线 粒 体 膜 Bcl-2 蛋 白 表 达 而 减 少 肝 脏 IRI 中 细 胞 凋 亡 的 发 生 综 上 所 述, 肝 脏 IRI 中 多 种 应 激 因 素 可 激 活 线 粒 体 介 导 的 凋 亡 通 路, 导 致 细 胞 凋 亡 增 加, 实 质 细 胞 总 数 减 少, 肝 组 织 结 构 和 肝 功 能 严 重 受 损 线 粒 体 凋 亡 途 径 参 与 了 肝 脏 IRI, 是 这 一 复 杂 机 制 的 一 个 环 节 IPC 可 通 过 抑 制 再 灌 注 后 氧 自 由 基 的 过 量 生 成 而 保 护 线 粒 体 超 微 结 构 和 功 能, 并 上 调 跨 线 粒 体 膜 Bcl-2 蛋 白 表 达 从 而 抑 制 细 胞 凋 亡, 减 轻 肝 脏 IRI; 而 且 IPC 是 在 手 术 完 成 后 恢 复 全 面 血 液 灌 注 之 前 施 与, 方 法 简 单, 时 间 从 容, 无 疑 具 有 直 接 的 临 床 应 用 价 值 参 考 文 献 : [1] Sun%K,%Liu%ZS,%Sun%Q.%Role%of%mitochondria%in%cell%apoptosis%during% hepatic% ischemia-reperfusion% injury% and% protective% effect% of% ischemic%postconditioning[j].%world%j%gastroenterol,%2004,%10(13):% 1934-8. [2] Nauta% RJ, % Tsimoyiannis% E, % Uribe% M, % et% al. % Oxygen-derived% free% radicals% in% hepatic% ischemia% and% reperfusion% injury% in% the% rat [J].% Surg%Gynecol%Obstet,%1990,%171%(2):%120-5. [3] Lee%WY,%Lee%SM.%Ischemic%preconditioning%protects%post-ischemic% oxidative%damage%to%mitochondria%in%rat%liver[j].%shock,%2005,%24 (4):%370-5. [4] Liu%Y,%Sercombe%R,%Xie%D,%et%al.%Inhibition%of%caspase-9%activation% and% apoptosis% is% involved% in% ischemic% preconditioning-induced% neuroprotection%in%rat%brain[j].%neurol%res,%2007,%29(8):%855-61. [5] Anderson%CD,%Pierce%J,%Nicoud%I,%et%al.%Modulation%of%mitochondrial% calcium%management%attenuates%hepatic%warm%ischemia-reperfusion% injury[j].%liver%transpl,%2005,%11(6):%663-8. [6] Ofluoglu%E,%Kerem%M,%Pasaoglu%H,%et%al.%Delayed%energy%protection% of%ischemic%preconditioning%on%hepatic%ischemia/reperfusion% injury% in%rats[j].%eur%surg%res,%2006,%38(2):%114-21. [7] Cave% AC, % Collis% CS, % Downey% JM, % et% al. % Improved% functional% recovery%by%ischaemic%preconditioning%is%not%mediated%by%adenosine% in% the% globally% ischaemic% isolated% rat% heart [J]. % Cardiovasc% Res,% 1993,%27(4):%663-8. [8] Oshiro%T,%Shiraishi%M,%Muto%Y.%Adenovirus%mediated%gene%transfer% of%antiapoptotic%protein%in%hepatic%ischemia-reperfusion%injury: %the% paradoxical%effect%of%bcl-2%expression%in%the%reperfused%liver [J].%J% Surg%Res,%2002,%103(1):%30-6. ( 上 接 2479 页 ) [3] 国 家 药 典 委 员 会.% 中 华 人 民 共 和 国 药 典 [M].%2000 年 版.% 二 部 : 附 录 85. [4] Leyland%JB.%Maximizing%the%response%to%Herceptin%therapy%through% optical% use% and% patient% selection [J]. % Anticancer% Drugs, % 2001, % 12 (suppl%4):%s11-s17. [5] Ewer%MS,%Gibbs%HR,% Swafford% J,% et% al.% Cardiotoxicity% in% patients% receiving% trastuzumab (Herceptin): % primary% toxicity, % synergistic% or% sequential%stress,%or%surveillance%artifact[j]?%semin%oncol,%1999,%26 (4%suppl%12):%99-101. [6] Suter% TM, % Cook% B, % Barton% C. % Cardiotoxicity% associated% with% trastuzumab% (Herceptin) % therapy% in% the% treatment% of% metastatic% breast%cancer[j].%breast,%2004,%13(3):%173-83. [7] Albanell%J,%Codony%J,%Rovira%A,%et%al.%Mechanism%of%action%of%anti-% HER2%monoclonal%antibodies:%scientific%update%on%trastuzumab%and% 2C4[J].%Adv%Exp%Med%Biol,%2003,%532:%253-68. [8] Fushs%IB,%Lands%S,%Buehler%H,%et%al.%Analysis%of%HER2%AND%HER1% in%the%heart%to%clarity%the%cardiotoxicity%of%herceptin [J]. %Proc%Am% Soc%Clin%Oncol,%2001,%20:%45. [9] Barton%C,%Suter%TM,%Cook%B,%et%al.%Cardiotoxicity%associated%with% Herceptin% in% the% therapy% of% metastatic% breast% cancer [J]. % Breast,% 2003,%12(4):%373-9. [10] Lefrak%E,%Pitha%J,%Tosenheim%S,%et%al.%Aclinicopathologic%analysis%of% adriamycin%cardiotoxocity[j].%cancer,%1973,%32:%302-14. [11] Chien % KR. % Myocyte % survival % pathways % and % cardiomyopathy : implications%for%tratuzumab%cardiotoxicity[j].%semin%oncol,%2000,% 27(6%Suppl%11):%9-14.