Gel Free cloning TM 不跑胶载体构建试剂盒 Gel Free Cloning TM Kit Gel Free cloning 技术是一种简单 快速并且高效的载体构建技术, 可将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点 该技术不受酶切位点限制, 也不需要线性化质粒, 只需要两步 PCR 即可将目的片段构建到载体的任意位点, 具有省时, 简便的特点 克隆阳性率可达 90% 以上 Gel Free cloning 载体构建试剂盒是新一代的克隆试剂盒, 该试剂盒中包含有反应所需缓冲液和特异优化的聚合酶 和重组克隆试剂盒相比, 省去了质粒线性化的步骤, 反应体系也可高效率的转化感受态细胞, 实现高效率克隆, 并大幅简化了实验步骤 产品组分 : 本试剂盒的包含如下表格所列的 4 种组分 Gel Free cloning TM 载体构建试剂盒 Kit Components 产品组成 H&Z QC01 (15X) H&Z FasHifi polymerase ( FasHifi 聚合酶 ) 22.5 μl 2X Optimized Master Mix (2X 优化的母液 ) 600 μl H&Z DL enzyme cocktail (DL 酶混合物 ) 15 μl HZ5alpha Competent Cell ( 可单独选购 ) 15 X 50 μl 如选购 HZ5alpha 感受态细胞, 请将 HZ5alpha Competent Cell 立即置于 -80 ºC 条件下保存, 最佳使用时 间为 6 个月以内, 其他组分可以在 -20 ºC 条件下保存 1 年 第一次使用时推荐将 PCR Master Mix 按照使 用频率分装成若干份, 每次使用时解冻一支分装的 Master Mix 产品特点 : 1. 无需跑胶 2. 仅需一对引物 3. 无酶切位点限制 4. 快捷简易 1
工作原理 : 使用本试剂盒时, 将引物设计为同时互补结合目的片段与待插入载体区域片段, 第一步 PCR 反应扩增目的片段如下图中 1 所示 所得的 PCR 产物, 推荐使用 PCR 产物回收试剂盒, 回收后作为第二步 PCR 反应的引物, 扩增载体序列, 这样将目的片段插入到载体序列中 ( 图 23), 载体序列模板可以利用 DL 酶混合物消化处理, 产物直接转化涂板 使用方法 : 依据下述方法, 将待插入载体序列粘贴到如下 http://www.rf-cloning.org/ 链接的 Plasmid Sequence ( 载体序列 ) 处 其中待插入位点加双感叹号!! 并将要插入的目的片段的序列粘贴在 Insert Sequence ( 插入序列 ) 处, 2
点击 Run, 即可获得待设计的引物 利用该引物第一步 PCR 扩增出目的片段, 反应体系设为 50 ul, 获取足够的产物做为第二步 PCR 的引物 第二步 PCR 反应时候, 需要的片段的量 (ng) 及模板的量 (ng) 也在引物设计时候由算法给出如下图红色框里所示 : PCR 将试剂盒中的各组分解冻, 按照如下表格的各组分的剂量配置反应体系 ( 此反应体系供参考, 实际反应条件会因模板 引物等的结构不同产生差异, 需根据实际情况设置最佳反应体系 ) 3
Components ( 组分 ) 50 μl System (50 μl 体系 ) Final Concentration ( 终浓度 ) H&Z FasHifi polymerase (FasHifi 聚合酶 ) 1.0 μl _ 2X Optimized Master Mix (2X 优化的母液 ) 25 μl 1X 10 μm Forward Primer (10 μm 正向引物 ) 2.5 μl 0.5 μm 10 μm Reverse Primer (10 μm 反向引物 ) 2.5 μl 0.5 μm Template Plasmid 1~25 ng/μl ( 模板质粒 1~25 ng/μl) 2.0 μl 1~25 ng ddh 2 O( 去离子水 ) 17 μl _ 并按照以下程序进行 PCR 反应 Steps Temperature Time Initial Denaturation ( 变性 ) 98 ºC 30 seconds 35 cycles ( 35 循环 ) 98 ºC 30 seconds 50~72 ºC 30 seconds 72 ºC 15~30 seconds/kb Final Extension ( 延伸 ) 72 ºC 5 min Hold on ( 停滞 ) 4~10 ºC 该反应程序为参考实验设置, 客户可根据自身实验进行相应调整 延伸时间取决于模板长度与 复杂度, 对于复杂度高的模板建议延长延伸时间 反应结束后利用 PCR 产物回收试剂盒, 回 收 PCR 产物, 并测量浓度 PCR 按照引物设计时提示的量混合插入片段与载体, 两者的摩尔比例恰好 ~20 反应体系如下: Components ( 组分 ) 25 μl System (25 μl 体系 ) Final Concentration ( 终浓度 ) H&Z FasHifi polymerase (FasHifi 聚合酶 ) 0.5 μl _ 2X Optimized Master Mix (2X 优化的母液 ) 10 μl 1X 回收的 PCR 产物 X μl _ Template Plasmid 1-25 ng/μl ( 模板质粒 1-25 ng/μl) X μl _ ddh 2 O( 去离子水 ) Upto 25 μl _ 4
并按照以下程序进行 PCR 反应 Steps Temperature Time Initial Denaturation ( 变性 ) 98 ºC 30 seconds 20 cycles ( 20 循环 ) 98 ºC 30 seconds 50~72 ºC 30 seconds 72 ºC 4~8 min Final Extension ( 延伸 ) 72 ºC 5 min DL 酶混合物 37 ºC 1 hour 退火温度推荐使用 55 度, 成功率在 90% 以上 ; 延伸时间取决于质粒总长度及复杂程度, 如质 粒总长度 8kb 建议使用 6 min 延伸时间 此外, 也可以省去退火步骤, 变性后直接进入延伸步 骤, 成功率也可以达到 90% 以上 ; Steps Temperature Time Initial Denaturation ( 变性 ) 98 ºC 30 seconds 20 cycles ( 20 循环 ) 98 ºC 30 seconds 72 ºC 4~8 min Final Extension ( 延伸 ) 72 ºC 5 min DL 酶混合物 37 ºC 1 hour PCR 程序结束后, 在反应体系里直接加入 1 μl DL enzyme 混合物,37 ºC 下消化 1 小时 带有甲 基化的模板质粒被酶切消化, 与此同时,PCR 反应新产生的环状质粒缺口可被连接酶连接上 1. 最终的产物取 3 μl 加入到冰上解冻的感受态细胞中, 并混匀 2. 继续置于冰上孵育 30 min 3. 42 ºC 热激 45sec, 然后立即置于冰上 2 min 4. 加入 200μl 不含抗生素的无菌 LB 培养基, 混匀后置于 37 ºC 摇床振荡培养 45~60min 使菌 体复苏 卡那, 链霉素, 氯霉素抗性要延长菌体复苏时间至 60~80min 5
5. 孵育结束后, 将所有菌液涂布到含相应抗生素的 LB 固体琼脂培养基上,37 ºC 培养 12~16 小时后, 挑克隆进行质粒抽提等后续步骤 Tips: 最终产物转化感受态细胞时不宜加入超过 5 μl, 且 42 度热激时间不宜超过 45 s 6