应用简报 临床研究 临床研究中红细胞脂肪酸谱的测定 化学电离气相色谱串联质谱仪 作者 Yvonne Schober 1, Hans Günther Wahl 1,, Harald Renz 1,Wolfgang Andreas Nockher 1 和 Carrie J. Adler 1 德国马尔堡菲利普大学检验医学和病理生物化学研究所 Medizinisches Labor Wahl, 德国吕登沙伊德 安捷伦科技公司美国加利福尼亚州圣克拉拉 摘要 细胞脂肪酸 (FA) 谱被公认为各种人类疾病的生物标记物, 通常采用气相色谱质谱联用系统 (GC/MS) 对其进行分析, 而这种方法非常费时费力 因此临床研究中需要一种高通量的分析方法 在本研究中, 从红细胞 (RBC) 中提取 FA 后进行衍生化, 以生成脂肪酸甲酯 (FAME) 采用氨气诱导化学电离 (CI) 的气相色谱串联质谱 (GC/MS/MS) FA 谱分析法专为人 RBC 的分析而开发 有 70 个 RBC 样品采用 GC/MS/MS 进行了 FA 谱分析 将该分析方法与采用电子轰击电离 (EI) 的单杆 GC/MS 传统方法进行比较 氨气诱导 CI 分析能够生成足够数量的分子离子, 以对 FAME 进行进一步研究 该分析确定了 45 个 FA 谱的特定碎片, 用于实现可靠的定量分析和碎裂 使用传统 GC/MS 的典型分析时间长达 60 分钟, 但该 GC/MS/MS 分析方法的运行时间仅为 9 分钟 分析的所有 FA 批间与批内变异小于 10% 将氨气诱导 CI 与 GC/MS/MS 分析相结合, 可帮助临床研究实验室实现稳定 可靠的高通量 FA 谱分析
前言 为了测定临床研究实验室中的脂肪酸 (FA) 谱, 需要灵敏的特异分析方法 过去分离 FA 谱采用的是气相色谱 (GC) 结合火焰离子化检测器 (FID), 这个组合使研究人员能够分析不同基质中的单个 FA 1 质谱 (MS) 的引入改善了这种分析方式, 但传统 GC/MS 分析需要长时间的色谱分离才能确保可靠的鉴定和定量 本研究开发并验证了一种用于红细胞 (RBC) 等生物样本中 FA 高通量分析的特异 快速而灵敏的分析方法 为此, 使用化学电离 (CI) 与气相色谱串联质谱 (GC/MS/MS) 结合来测定 FA 采用这些技术可得到过去使用 GC/MS 进行 FA 分析的改进方法 配备 EI 的 GC/MS 配置和参数 仪器 参数 进样口温度 0 C 传输线温度 0 C 四极杆温度 150 C 分析柱 载气 柱温箱升温程序 值 配备分流 / 不分流进样口 (G45-67000) 的 Agilent 7890A GC (G440A) 配备化学电子轰击 (EI) 离子源的 Agilent 5975C MS (G4A) Agilent J&W CP-Sil 88 FAME 分析专用气相色谱柱, 100 m,0.5 mm,0.0 µm,7 英寸柱架 (CP7489) 氦气,.0 ml/min 10 C( 保持 5 分钟 ), 以 5 C/min 升至 0 C( 保持 5 分钟 ), 以 4 C/min 升至 40 C( 保持 10 分钟 ) 实验部分 停止时间 MS 采集模式 45.00 分钟 SIM 模式 配备 CI 的 GC/MS/MS 配置和参数 仪器 参数 进样口温度 50 C 离子源温度 50 C 四极杆温度 150 C 进样量 1 µl 保留间隙柱 分析柱 载气 CI 试剂 柱温箱升温程序 值 配备分流 / 不分流进样口 (G45-67000) 的 Agilent 7890A GC (G440A) 配备化学电离 (CI) 源的 Agilent 7000 MS/MS (G7010BA) 安捷伦 5 m, 0.5 mm 无涂层预柱 Agilent J&W CP-Sil 88 FAME 分析专用气相色谱柱, 50 m 0.5 mm,0.0 µm,7 英寸柱架 (CP7488) 氦气,. ml/min 氨气,1. ml/min 50 C( 保持 1 分钟 ), 以 10 C/min 升至 70 C, 以 45 C/min 升至 175 C, 以 5 C/min 升至 0 C( 保持.5 分钟 ) 化学品与试剂异丙醇 甲醇和己烷 (GC 级 ) 购自 Fisher Scientific (Schwerte, Germany) 水(LC/MS 级 ) 和三氟化硼 (BF )(14% 甲醇溶液 ) 购自 Sigma-Aldrich (Hamburg, Germany) 硫酸钠 (Na SO 4 ) 购自 Merck (Darmstadt, Germany) 经认证的 7 种脂肪酸甲酯 (FAME) 混合物 (TraceCERT) 购自 Sigma-Aldrich (Hamburg, Germany) 另一种 FAME 混合物购自 NuChekPrep (Elysian, MN, USA), 包括内标 C17:1( 十七碳烯酸甲酯 ) 在内的所有其他 FAME 均购自 Larodan (Malmö, Sweden) 使用常规实验室分析提交的 EDTA 抗凝血液等分试样 按照 赫尔辛基宣言 II 向受试者详细说明, 并获得使用不具名实验室数据的知情同意 停止时间 MS 采集模式 9.00 分钟 MRM 模式
FAME 分析的 MRM 参数 表 1. 分析物参数 脂肪酸 通用名 RT (min) 母离子 (m/z) 定量离子 (m/z) CID (V) 定性离子 (m/z) CID (V) C6:0.90 147.8 59.0 1 7 C8:0.90 175.8 159.1 5 57.0 5 C10:0 4.6 0.8 187.1 5 57.0 0 C11:0 4.58 17.8 01. 57.0 5 C1:0 4.79 1.8 15.5 57.0 0 C1:0 4.99 45.8 9. 5 57.0 0 C14:0 5.19 59.8 4. 5 57.0 5 C14:1t 5.9 57.8 41. 191.1 11 C14:1c 5.5 57.8 41. 191.1 11 C15:0 5.8 7.8 57. 5 57.0 5 C15:1 5.54 71.8 55. 9 05.1 11 C16:0 5.57 87.7 71. 5 57.0 5 C16:1t 5.67 85.9 69. 7. 9 C16:1c 5.71 85.9 69. 7. 9 C17:0 5.77 01.8 85. 7 10.0 5 C17:1 5.9 99.8 8. 51. 9 C18:0 5.98 15.8 99. 4 7 9 C18:1n9t 6.06 1.8 97. 4 65. 9 C18:1n9c 6.1 1.8 97. 7 65. 9 C18:n6t 6.1 11.9 95. 6. 9 C18:n6c 亚油酸 6. 11.9 95. 7 6. 9 C0:0 6.40 4.8 7. 85.0 5 C18:n6 6.49 09.9 9. 61. C0:1n9 6.56 41.8 5. 9. 9 C18:n α- 亚麻酸 6.60 09.9 9. 61. C1:0 6.64 57.8 41. 7 57.0 5 C18:4n 6.74 08.0 9 59.0 C0: 6.81 9.9. 91. 5 C:0 6.91 71.9 55. 7 10.0 0 C0:n9 7.00 7.9 1. 89. C0:n6 7.0 7.9 1. 5 89. C:1n9 7.10 69.9 5. 1. 11 C0:n 7.14 7.9 1. 89. C:0 7.1 85.8 69. 6 7 0 C0:4n6 花生四烯酸 7.1 5.9 19. 87. C: 7.4 67.9 51. 19. 7 C4:0 7.54 99.8 8.4 10.0 9 C0:4n 7.55 6.0 19. 5 87. 9 C0:5n 二十碳五烯酸 7.6.9 17. 85. C: 7.6 66.0 48.8 5 17.1 5 C4:1n9 7.79 97.9 81.4 49. 11 C:4n6 7.98 64.0 47. 5 97.1 5 C:5n6 8.0 6.0 45.0 5 C:5n 8.54 6.0 45.0 5 C:6n 二十二碳六烯酸 8.8 59.9 4. 11.
样品前处理为从血红细胞中提取 FA, 将 0.5 ml 全血和 10 ml 0.9% 盐水混合, 并在 500 g 下离心 5 分钟 弃去上清液后, 重复一次清洗步骤 之后加入 1 ml 蒸馏水使细胞溶解, 并在冰箱的低温条件中储存至少 0 分钟 然后将 FA 提取物与 5 ml 内标 (IS) 溶液混合, 并在 500 g 下离心 5 分钟 IS 溶液含有 0. mg/ml FAC17:1 己烷 / 异丙醇 (:) 溶液以及 ml Na SO 4 溶液 (6.7%) 然后将己烷相转移到干净的玻璃管中并用氮气将样品蒸干 在分离 FA 时, 加入 1 ml BF 甲醇溶液 (14%) 并在 100 C 下温育 10 分钟进行酯化 然后, 冷却至室温后, 将 1 ml 水和 ml 己烷加入样品中, 并在 500 g 下离心 5 分钟 将己烷相转移至干净的样品瓶中, 用氮气蒸干 最终的 FAME 样品溶于 50 ml 己烷中, 可储存在 5 C 条件下 分析前将样品以 1:0 的比例用己烷稀释 数据分析采用 Agilent MassHunter 软件进行数据采集 (Waldbronn, Germany) 为了对 FAME 进行正确鉴定和定量, 用两个碎片离子, 一个用于定量, 另一个用于确认 校准标样中采用 45 种 FAME( 表 1) 的混合物 将单个 FA 浓度计算为评估的 FA 集合中 100% 的相对百分比, 或计算为绝对值 采用 MassHunter 定量分析软件 5.0 和 MassHunter 定性分析软件 5.0 进行数据分析 使用分析物与内标的峰面积比值计算校准曲线 方法参数为了测定 GC/MS/MS 分析方法的线性和准确性, 使用了 45 种 FAME 混标在己烷和混合人红细胞中的一系列稀释溶液 方法的准确性同样用 45 种 FAME 混标在三个不同浓度范围内进行评估 为了评估批内精度, 对一份人血液混合样品的 10 个等分独立样品进行分析 以相同方式测定批间精度, 但将样品分散在不同天中测定 使用在分析当天配制的校准标样测定浓度 计算精度的相对标准偏差 (RSD) 对人血样品的分析灵敏度重复测定 10 次 根据所选分析物的信噪比 (S/N) 计算检测限 (LOD) 和定量下限 (LLOQ) 使用 MassHunter 定性分析软件计算信噪比 结果与讨论 GC/MS 分析 为比较 EI 和 CI 两种电离方法, 在 FAME 分析中展示了二十二 碳六烯酸甲酯 (DHA,C:6n) 的谱图 图 1A 中, 采用 EI 的 GC/MS 谱图显示出大量低质量数碎片 m/z = 67 m/z = 79 和 m/z = 99 等某些碎片是 LC-PUFA 的特征性碎片, 而这些 碎片不具有化合物特异性 采用 EI 碎裂方式后, 通常无法检 出 FAME 的分子离子 相反, 采用 CI 时,GC/MS 谱图中主 要的峰为分子离子 ([M+H] + ),m/z = 4( 图 1B) 氨气用作 CI 的反应气, 因此其他的主要峰为氨加合离子 ([M+NH 4 ] + ), m/z = 60 两种碎片都具有化合物特异性, 因为 MS/MS 模式中消耗的氨 ([M+NH 4 ] + & [M+H] + ) 可用作定量离子对 响应 响应 10 4 6 A 5 4 1 m/z 79 m/z 67 m/z 99 0 50 75 100 15 150 175 00 5 50 75 00 5 50 75 400 质荷比 (m/z) 10 4.0 B.5.0.5.0 0.5 [M+H] + m/z 4 [M+NH 4 ] + m/z 60 0 80 105 10 155 180 05 0 55 80 05 0 55 80 质荷比 (m/z) 图 1. DHA 甲酯的 GC/MS 谱图, 电离方法比较 A) EI 谱图 B) CI 谱图 4
由于只有质子亲和力足够强的分析物能够被电离, 与 EI 电离模式相比,CI 电离模式可降低化学背景浓度 采用 CI 以及 MRM 模式下的 GC/MS/MS 是专为 FA 分析优化的方法, 可在 9 分钟内完成分析 表 1 显示分析物特异参数 为实现正确的鉴定与定量, 对母离子 保留时间以及定 性和定量碎片离子进行了测定 图 显示出无明显背景峰 图 A 为 FAME 标样的 GC/MS/MS 色谱图 图 B 和图 C 为放大的两部分重叠峰 图 B 显示了 个轻微重叠的分析物信号, 而图 C 为两个完全重叠的分析物离子示例 未发现妨碍分析物定量的干扰峰 10 4 响应 8 7 6 5 4 1 0 A 4.0 4.4 4.8 5. 5.6 6.0 6.4 6.8 7. 7.6 8.0 8.4 8.8 采集时间 (min) B 定量离子对 C 定量离子对 C0:1 C18:n 10 4 10 5 10 4 m/z 4 & 5 m/z 10 & 9 C1:0 m/z 58 & 41 10 5 C0:4n6 m/z 6 & 19 10 4 C:0 m/z 86 & 69 0.5 0.5 0.5 6.6 6.56 6.60 6.64 采集时间 (min) 7. 7. 7. 采集时间 (min) 图. A) 45 种 FAME 的 GC/MS/MS 色谱图 B) 6.5 6.7 分钟间的放大色谱图以及对应的定量离子对 C) 7.1 7. 分钟间的放大色谱图以及对应的定量离子对 5
方法验证为获得 GC/MS/MS 方法的线性, 对浓度由 5 ng/ml 到 0 mg/ml 的一系列 FAME 混标稀释溶液进行分析 所有分析物的相关系数 (R ) 均高于 0.995 还对基质中 45 种 FAME 的系列稀释溶液进行了测定 所有分析物的 R 均高于 0.99, 并且未发现基质干扰 另外, 还使用三种不同浓度的 FAME 标样对准确度 LOD 和 LLOQ 进行了评估 所有分析物的准确度均在 90% 110% 间,LOD 和 LLOQ 均低至 ng/ml 级 ( 表 ) 将 10 种 FA 溶于 10 倍的人 RBC 混合样品中进行测定, 通过计算 RSD 获得精度结果 10 种选定 FA 的批内与批间 RSD 均低于 10%( 表 ) 表. 10 种选定 FA 的方法参数 日内与日间精度数据以总 FA 的百分比显示 脂肪酸 日内 日间 LOD LOQ 均值 RSD 均值 RSD ng/ml ng/ml C16:0 5. ±1.4 5. 5.7 ±.1 8.0 6. ±1.5 0.8 ±.1 C18:0 15.9 ±0.7 4.7 15.0 ±0.8 5.4 4.9 ±1. 16. ±.0 C18:1 顺式 18. ±0.8 4.5 19.5 ± 5. 4. ±0.5 1.6 ±1.6 C18: 顺式 10.7 ±0..6 11.8 ±0..4 4.6 ±0.4 15. ±1. C0:n6 1.5 ±0.1 5. 1.6 ±0.1 6.5 0.9 ±0.1.7 ±0.8 C0:4n6 17. ±0.9 5.1 15.8 ±1.6 10.0 0.9 ±0.1.1 ±0.4 C0:5n 0.4 ±0.1 7.1 0.5 ±0.1 8.7 1.9 ±0. 5.9 ±0.8 C:4n6.5 ±0. 8.5.7 ±0. 9.0 1. ±0.1 4. ±0.8 C:5n. ±0. 9.1.0 ±0. 8.6 1.6 ±0. 5. ±0.9 C:6n 4.1 ±0. 6. 4.1 ±0. 7.8. ±0. 7. ±1.1 6
结论 本研究开发了一种用于测定从衍生化到 FAME 的整个过程生物基质中 FA 谱的 GC/MS/MS 分析方法 方法可在 9 分钟内完成 45 种 FA 谱的定量分析, 并有良好的分析灵敏度与选择性 同时研究了其他参数, 包括样品前处理步骤 方法稳定性以及 GC 和 MS/MS 条件 可认为该方法稳定且分析时间短, 对 FA 分析有很广泛的适用性 参考文献 1. Boecking, C.; et al. Development and validation of a combined method for the biomonitoring of omega-/-6 fatty acids and conjugated linoleic acids in different matrices from human and nutritional sources, Clin. Chem. Lab. Med. 010, 48, 1757 176. Dodds, E. D.; et al. Gas chromatographic quantification of fatty acid methyl esters: flame ionization detection vs. electron impact mass spectrometry, Lipids 005, 40, 419 48 7
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