采用安捷伦三重四极杆液质联用系统对鸡肉中抗病毒类药物金刚烷胺和利巴韦林进行分析 应用简报 食品检测和农业 作者李建中 吴翠玲 陆羽飞 薄涛 安蓉 张之旭 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司 摘要 本文采用 Agilent 19 Infinity 液相色谱系统 /66 三重四极杆液质联用系统建立了同时检测抗病毒药物金刚烷胺 (Amantadine) 和利巴韦林 (Ribavirin) 的分析方法 鸡肉样品经提取金刚烷胺和利巴韦林后, 分别采用 Agilent Bond Elut PCX 和 PBA 固相萃取柱净化, 采用薄壳型填料反相 C18 色谱柱 Agilent Poroshell 1 SB-Aq 色谱柱分离, 经配有安捷伦喷射流 (AJS) 电喷雾离子源的安捷伦三重四极杆液质联用系统在正离子模式下监测 该方法在.1-5 ng/ml 浓度范围内线性相关性良好, 相关系数 R.999; 利巴韦林的添加回收率在 8%-11% 金刚烷胺的添加回收率在 71%-79% 通过对方法灵敏度 精密度和线性范围等方法学参数进行考察, 得到所建立的方法能在 1 min 内对 种抗病毒药物金刚烷胺和利巴韦林完成快速 高灵敏度的检测分析, 完全满足法规监测要求 前言 13 年底央视曝光山东等地部分养殖户在肉鸡饲养过程中大量滥用抗生素 激素和抗病毒类药物, 违规喂食金刚烷胺 利巴韦林等抗病毒药品的 速成鸡 流入上海百盛旗下餐饮机构一事 美国快餐业巨头肯德基和麦当劳在中国被卷入 速成鸡 风波, 引发上海人士和全国消费者的广泛关注和担忧! 农业部对此事件高度重视, 及时责成山东有关部门去调查处理这件事情, 也派出了专家组奔赴山东 以往文献报道采用 LC/QQQ 分析血浆中利巴韦林或动物源食品中金刚烷胺 [1-3], 但没有此次事件中被曝光的抗病毒类药物利巴韦林和金刚烷胺同时检测的国家标准和方法, 这为相关政府执法检测部门 生产企业和第三方实验室迅速开展监督检查带来了技术上的困难
安捷伦科技作为分析仪器业界知名品牌, 多年来一直致力于为食品安全领域提供强有力的产品 技术 解决方案 为应对此次食品安全突发事件, 安捷伦科技为广大分析工作者提供了分析检测鸡肉中抗病毒类药物利巴韦林和金刚烷胺的完整解决方案 实验部分 试剂 化学品与消耗品所有试剂和溶剂均为色谱纯级或者分析纯级 甲醇 乙腈和异丙醇购自德国默克 (MERCK) 甲酸 乙酸铵 三氯乙酸和氨水购自美国 Sigma-Aldrich 公司 所用实验用水为 Millipore Milli-Q 超纯水系统现制备的高纯去离子水 金刚烷胺和利巴韦林标准品由北京出入境检验检疫局技术中心提供 仪器配置实验采用 Agilent 19 Infinity 液相色谱系统进行分离, 其由下列部件组成 : Agilent 19 Infinity 二元泵 (GA) Agilent 19 Infinity 标准自动进样器 (G6A) Agilent 19 Infinity 自动进样器冷却器 (G133B) Agilent 19 Infinity 柱温箱 (G1316C) 采用配有安捷伦喷射流 (AJS) 电喷雾离子源的 Agilent 66 三重四极杆液质联用系统, 在正离子模式下进行检测 采用 Agilent MassHunter 工作站软件 (B.7 或以上版本 ) 进行数据采集 定性和定量分析 所有标准品用甲醇配制为 1 mg/ml 储备液, 储存在 - C 冰箱内 ( 有效期 1 年左右 ) 用乙腈: 水 (5:5) 配制混合工作液 (1 µg/ml), 储存在 C 下 ( 有效期半个月左右 ) 使用时用水对混合工作液进行适当逐级稀释后使用, 现配现用 实验采用 Agilent Bond Elut PCX 和 PBA 固相萃取柱对样品提取液进行净化 样品前处理称取 g 鸡肉样品 ( 精确至.1 g) 至 15 ml 离心管中, 依次加入已知浓度的混合工作液 5 ml 的甲醇 :1% 三氯乙酸水溶液 (5:5,V/V), 涡旋 3 s, 超声 3 min,5 r/min 离心 1 min, 上清液全部转移至 15 ml 离心管中 ; 再加入 5 ml 的甲醇 :1% 三氯乙酸 (5:5,V/V) 重复提取一次, 合并全部提取液 ; 涡旋均匀后重新离心, 取出 5 ml 上清液, 过 PCX 和 PBA 固相萃取柱进行净化, 流程图如图 1 所示 采用 Bond Elut PCX 固相萃取柱净化金刚烷胺 采用 Bond Elut PBA 固相萃取柱净化利巴韦林 活化分别用 ml 甲醇和 3 ml 水过柱 活化分别用 ml 乙腈和 3 ml 乙酸铵缓冲液 (ph = 8.5) 过柱 上样取提取液过柱 上样取提取液过柱 淋洗用 3 ml % 盐酸和 3mL 甲醇淋洗 淋洗用 1 ml 含 1% 乙腈的乙酸铵缓冲液 (ph = 8.5) 淋洗 洗脱用 5 ml 氨 : 甲醇 : 异丙醇 (5:7:5) 的混合溶剂洗脱, 收集洗脱液 洗脱用 5 ml.1 mol/l 甲酸水溶液洗脱, 收集洗脱液 图 1. 固相萃取流程图
液相色谱条件 色谱柱 : Agilent Poroshell 1 SB-Aq,.1 x 1 mm,.7 µm 柱温 : 35 C 进样量 : 5 µl 自动进样器温度 : 1 C 流动相 : A) 含 5 mmol/l 乙酸铵和.1% 甲酸的 水溶液 B) 含.1% 甲酸的乙腈 流速 :.3 ml/min 梯度程序 : 时间 B% 1.5 3. 15. 15 6. 5 7.5 98 9.5 98 停止时间 : 1 min 后运行时间 : min 质谱条件 质谱仪 : 离子模式 : 66 三重四极杆液质联用系统 正离子 干燥气温度 : 3 C 干燥气流量 : 7 L/min 鞘气温度 : 35 C 鞘气流量 : 11 L/min 雾化器压力 : 35 psi 毛细管电压 : 3 V 喷嘴电压 : V EMV: V MS 1 和 MS 分辨率 : Unit MRM 参数 : 如表 1 所示 表 1. 化合物 MRM 参数列表 化合物 母离子 (m/z) 子离子 (m/z) 碎裂电压 (V) 碰撞能量 (V) 碰撞池加速器电压 (V) 保留时间 (min) 利巴韦林 (Ribavirin) 5.1 113 5 7 96 3 3 1.66 金刚烷胺 (Amantadine) 15. 135 18 1 93 3 3.73 结果与讨论 本文采用含有薄壳型填料颗粒的 Poroshell 1 SB-Aq 色谱柱对利巴韦林和金刚烷胺进行了有效的色谱分离 流动相中添加.1% 甲酸和 5 mmol/l 乙酸铵可以促进正模式下的离子化效率 根据利巴韦林和金刚烷胺的结构, 实验可以采用电喷雾离子源正离子模式测试 实验结果表明, 利巴韦林可以生成 [M+H] + (m/z 5.1) 和 [M+Na] + (m/z 67.1) 分子离子峰, 金刚烷胺可以生成 [M+H] + (m/z 15.) 分子离子峰 ; 分别选择 [M+H] + 峰进行子离子扫描, 最终确认利巴韦 林选择 m/z 113( 定量子离子 ) 和 96( 定性子离子 ) 金刚烷胺选择 m/z 135( 定量子离子 ) 和 93( 定性子离子 ) 作为多反应通道监测离子对, 所得 MRM 谱图如图 所示 在鸡肉样品基质中含有对利巴韦林色谱峰有干扰的物质, 影响结果测定 实验发现采用 SB-Aq 类型柱填料的色谱柱在 1% 水相流动相条件下起始, 可以实现干扰物与利巴韦林的基线分离, 避免定性定量的干扰, 如图 3 所示 实验发现采用 PCX 固相萃取柱对金刚烷胺净化时, 洗脱液中必须添加 5% 以上的异丙醇才能解吸下来 3
x1 利巴韦林 (Ribavirin) (5.1 -> 96.) 6 1.66 x1 3 利巴韦林 (Ribavirin) (5.1 -> 113.) 1.5 1.65.5 1 x1 金刚烷胺 (Amantadine) (15. -> 93.) 6.73 x1 3 金刚烷胺 (Amantadine) (15. -> 135.) 3.73 1.5 1 1.5.5 3 3.5.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 响应 vs. 采集时间 (min) 图. 1 ng/ml 利巴韦林和金刚烷胺混合工作液的 MRM 谱图 x1 1.3 1. 1.1.9 1.8.7.6.5..3..1 利巴韦林..6.8 1 1. 1. 1.6 1.8...6.8 3 3. 3. 响应 vs. 采集时间 (min) 图 3. 利巴韦林标准溶液 ( 绿色 ) 鸡肉基质空白样品 ( 黑色 ) 及加标样品 ( 红色 ) 的 TIC 叠加色谱图 实验在.1-5 ng/ml 浓度范围内测试了利巴韦林和金刚烷胺的定量线性 如图 和图 5 所示, 个化合物在此浓度范围内具有良好的线性相关性, 相关系数 R 均大于.998 响应 利巴韦林 (Ribavirin) x1 5 y = 958.517856 * x -.59138.5 R^ =.99893 3.5 3.5 1.5 1.5-8 1 16 8 3 36 8 5 浓度 (ng/ml) 图. 利巴韦林标准曲线 (.1-5 ng/ml) 响应 x1 6.9 1.8.7.6.5..3..1 -.1 金刚烷胺 (Amantadine) y = 169.585 * x - 173.77697 R^ =.9999181-8 1 16 8 3 36 8 5 浓度 (ng/ml) 图 5. 金刚烷胺标准曲线 (.1-5 ng/ml) 表. 利巴韦林和金刚烷胺的回收率数据 利巴韦林添加浓度 (µg/kg) 平均回收率 (%) 金刚烷胺添加浓度 (µg/kg) 平均回收率 (%) 8. 1 79.3 1 93. 5 73.3 1.9 1 71. 在鸡肉基质提取液中添加不同浓度的混合工作液测试回收率, 其中利巴韦林的回收率在 8%-11%; 金刚烷胺的回收率在 71%-79%, 见表
结论 采用 19 Infinity 液相色谱系统 /66 三重四极杆液质联用系统成功的实现了对鸡肉中抗病毒类药物金刚烷胺和利巴韦林残留量的高灵敏 快速的确证定量分析 本方法采用 Bond Elut PCX 和 PBA 固相萃取柱有效的实现了样品的净化 本文所述完整的解决方案可以满足对鸡肉制品中抗病毒药物的快速监督和监测 参考文献 1. Bjorn J. A. Berendsen & Robin S. Wegh. Quantitative trace analysis of a broad range of antiviral drugs in poultry muscle using column-switch liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Anal Bioanal Chem, 1, :1611 163. 云环等, 固相萃取 /LC-MS/MS 法检测动物源性食品中的金刚烷胺. 现代仪器,9,6:-5 3. Li-Tain Yeh ect. A Sensitive and Specific Method for the Determination of Total Ribavirin in Human Red Blood Cells by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry. Journal of Chromatographic Science, 3, 1:56-6 5
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