1544 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (10): 1544 1549 研究论文 抗 VEGFR-2 全人源 IgG1 抗体的构建及其在 CHO-k 细胞中的表达 李致科, 何远, 张娟 * *, 解伟, 曹婉璐, 王泽根, 王旻 ( 中国药科大学天然药物活性组分与药效国家重点实验室, 生命科学与技术学院, 江苏南京 210009) 摘要 : 本文在实验室构建的单链抗体 -Fc 融合抗体 [scfv(ak404r)-fc] 的基础上构建抗 VEGFR-2 全人源 IgG1 样全长抗体 (Mab-04) 利用重叠 PCR, 获得 Mab-04 的轻链和重链的核酸序列后分别克隆到真核表达载体 pcdna3.1, 获得重组质粒 脂质体法将重组质粒转染至 CHO-k 细胞, 经 Protein A 柱纯化细胞培养上清液获得目的蛋白, 利用 Western blotting 检测目的蛋白, ELISA 检测 Mab-04 与抗原亲和力 测序表明重组质粒构建成功, Western blotting 检测显示目的蛋白成功表达 (1 μg ml 1 ), ELISA 检测阐明该抗体能与抗原结合并呈浓度依赖性 (IC 50 为 50 nmol L 1 ), 表明 Mab-04 成功表达并正确装配, 为进一步大量制备该抗体及其活性研究打下基础 关键词 : VEGFR-2; 全长抗体 ; 抗肿瘤血管生成中图分类号 : R963 文献标识码 : A 文章编号 : 0513-4870 (2013) 10-1544-06 Construction of anti-vegfr-2 IgG1 like human antibody and its expression in CHO-k cells LI Zhi-ke, HE Yuan, ZHANG Juan *, XIE Wei, CAO Wan-lu, WANG Ze-gen, WANG Min * (State Key Laboratory of Natural Medicines, College of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China ) Abstract: Anti-angiogenesis mechanism plays a vital role in tumor targeting immunotherapy. Based on the amino acid sequence of an anti-vegfr-2 scfv-fc fusion antibody (AK404R-Fc), this article is aimed to generate an anti-vegfr-2 human IgG1-like full length antibody (Mab-04). Firstly, the light chain (L-chain) and heavy chain (H-chain) were obtained by overlap PCR and then linked to eukaryotic expression vector pcdna3.1, separately. The recombinant plasmids (pcdna3.1-l-chain and pcdna3.1-h-chain) were then co-transfected into CHO-k cells using liposome transient transfection. Subsequently, Mab-04 antibody was expressed and purified by Protein A affinity chromatography. Western blotting was applied to identify the expression of Mab-04 and its affinity was detected by ELISA assay. DNA sequencing revealed the successful construction of recombinant plasmids and Western blotting assay proved the successful expression of fulllength antibody (1 μg ml 1 ). Finally, ELISA assay illustrated that the binding of the antibody to its antigen was in a concentration-dependent manner (IC 50 : 50 nmol L 1 ). These outcomes above indicated that Mab-04 was successfully expressed and assembled, which laid the foundation for further preparation and antineoplastic activity study. Key words: VEGFR-2; full length antibody; anti-tumor angiogenesis 收稿日期 : 2013-04-01; 修回日期 : 2013-05-15. 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (81072561, 81102364); 天然药物活性组分与药效国家重点实验室资助项目 (JKGP201101); 江苏省青蓝工 程项目 (2010). * 通讯作者 Tel / Fax: 86-25-83271483, E-mail: juancpu@126.com; Tel / Fax: 86-25-83271395, E-mail: minwang@cpu.edu.cn
李致科等 : 抗 VEGFR-2 全人源 IgG1 抗体的构建及其在 CHO-k 细胞中的表达 1545 血管生成是肿瘤发生 发展的必要条件, 而血管内皮生长因子受体 (vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR) 作为血管生成关键因子 VEGF 的受体也成为抗肿瘤药物的靶向研究热点 [1] VEGFR 有 3 种亚型 : Flt1 (VEGFR-1) KDR (VEGFR-2) VEGFR-3, 其中 VEGFR-2 与 VEGF 具有高亲和力也是介导血管内皮生成的主要受体 [2 4] 利用 VEGFR-2 的单克隆抗体对其的竞争性结合, 阻断和 VEGF 的结合, 从而抑制 VEGF 促血管生长的作用, 进而发挥抗肿瘤效应 基因工程开发的全人源 IgG1 型抗体药物结构与人体内存在的天然抗体构象非常接近, 因此降低诱发免疫原性反应风险 此外, 与单链抗体 融合抗体片段相比, 完整的 IgG 样四聚体抗体具有完整的重链和轻链, 可以诱发较强的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用 (antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 效应 ; 同时, 全人源 IgG1 型抗体具有高特异性 高亲和力 体内半衰期长等特性, 可以发挥更大的生物活性 [5] 因此, 近几年来, 全人源及全长治疗性抗体药物在市场上显现出极强的市场竞争力 [6] 截止到 2012 年 3 月, 全世界已有 34 种治疗性抗体药物上市, 其中, 全人源抗体和人源化抗体比率高达 68%, 全长抗体占 75% [7] 与其他肿瘤分子靶向抗体药物相比, 抗肿瘤血管生成抗体具有靶向性 特异性 专一性等特性, 能特异性阻断肿瘤血管的发生发展, 降低对其他组织的杀伤作用 [8] 目前临床唯一的抗肿瘤血管生成的抗体药物贝伐单抗 (bevacizumab, Avastin) 于 2004 年被美国 FDA 批准用于非小细胞肺癌的治疗, 并在其他肿瘤的治疗中表现出良好的疗效 然而, 由于其全面阻断了 VEGF 介导的相关信号通路, 导致患者出现高血压 鼻出血 蛋白尿等严重不良反应 [9] 选择性地阻断 VEGFR-2 与其配体的相互作用所引发的信号传导, 可以有效地避免对 VEGFR-1 和 VEGFR-3 的抑制而引发的不良反应 本课题组在前期工作中获得抗 VEGFR-2 的单链抗体 scfv-ak404r 及融合抗体 scfv-fc [10, 11] 的基础上, 通过基因工程方法成功构建了抗 VEGFR2 的全人源 IgG1 样抗体 Mab-04 基因, 旨在获得更接近天然抗体构象的基因工程抗体, 提高抗体与抗原的亲和力并使其激活全部补体效应, 从而提高其对癌症的疗效 通过转染 CHO-k 细胞成功获得了一定量的蛋白, 在对其分子量大小进行检测和初步活性检测后, 证实了 Mab-04 构建表达成功, 为其大量制备和抗肿瘤活性研究打下了基础 材料与方法菌株 质粒与细胞株 TOP10 大肠杆菌购自美吉生物公司 ; 带有 IgG1 Fc 片段的真核表达载体 pcdna3.1 购自 Life Technologies 公司 ; AK404R-Fc 由本实验室构建, CHO-k 细胞 ( 野生型中国仓鼠卵巢细胞 ) 为本实验室保存 试剂质粒中提试剂盒 (Qiagen); 1 ml Hi-Trap Protein A 预装纯化柱 (GE Healthcare); T4 连接酶 限制性内切酶 Hind III EcoR I Xba I (Fermentas); Easy Taq 聚合酶 ( 北京全式金公司 ); HS 高保真 PCR 酶 (TaKaRa); 质粒小提试剂盒 琼脂糖凝胶回收 /PCR 产物纯化试剂盒 (Biomega 公司 ); Lipofectamine 2000 脂质体转染试剂盒 (Life Technologies); His 标记鼠单抗 (1 2 000, Cell Signaling, 27E8); HRP 标记羊抗鼠 IgG (1 5 000, MultiSciences Biotech, 11-GAM007); 鼠抗人 IgG1-HRP 单克隆抗体 (Life Technologies, 054220); DMEM 高糖培养基 新生牛血清 (Gibco); ECL 发光显色液 30 kd 超滤管 (Millipore) PCR 引物由上海捷瑞公司合成, KDR 胞外区蛋白由本实验室自行纯化获得, 其他试剂均为国产分析纯 抗 VEGFR-2 全人源全长抗体 Mab-04 的构建在 GenBank 中查找到适合的轻链恒定区 (CL) 及重链恒定区 1 (CH 1 ) 片段, 对其进行 CHO 偏爱密码子优化后合成 L-chain 及 CH 1 以实验室已构建好的 scfv-fc 融合抗体为模板, 分别设计 7 条引物 ( 表 1) 进行 PCR 扩增 以引物对 P1/P2 扩增 scfv-fc 获得其重链可变区 VH (94 5 min; 98 10 s, 55 10 s, 72 50 s, 30 个循环 ; 72 10 min), 以引物对 P5/P6 扩增 scfv-fc 获得 Fc 片段 利用重叠 PCR (overlap PCR), 以 VH 及 CH 1 为模板, 获得 VH-CH 1 (95 5 min; 98 10 s, 55 10 s, 72 50 s, 10 个循环 ; 加入引物对 P1/P4, 98 10 s, 55 10 s, 72 50 s, 20 个循环 ; 72 10 min) 最后用重叠 PCR 在相同条件下以 VH-CH 1 和 Fc 片段为模板 引物对 P1/P6 扩增获得完整重链基因 (H-chain) PCR 产物由 1% 琼脂糖凝胶电泳分析, 并对目的片段切胶回收 将 PCR 扩增产物 H-chain 和 pcdna3.1 载体均用 Hind III 和 Xba I 分步酶切, 用 Hind III 和 EcoR I 同步酶切 psg1-l-chain 及 pcdna3.1 载体, 对酶切产物切胶回收后用 T4 DNA 连接酶于 16 条件下过夜连接 ( 图 1) 将连接产物转入大肠杆菌 TOP10 感受态细胞, 涂布 1.5% 琼脂粉 LB 固体培养基平皿 37 培养过夜, 次日挑取单克隆接菌提取质粒进行酶切鉴定, 酶切
1546 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (10): 1544 1549 Table 1 Oligonucleotide primers used in the construction of the full length IgG1. GenBank accession number: VH (KF021248), VL (KF031143); see also reference [10] which contained the amino acid sequence of Mab-04 variable domain Primer Sequence (5' 3' ) P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 CCCAAGCTT[Hind III]CCACCATGGAGCCAGAGGGAAGACGGA TATACCCAAGCTTGCCACCATG ATAGTTTAGCGGCCGCAACCTTCT TCCGTCTTCCCTCTGGCTCCAT GAGCGCTGCGGCTCCCAAATCTTG GCTCTAGA[Xba I]GCGTTATTTACCTGGAGACAGGGAGAGG GGAATTC[EcoR I]GCGGCTTAGCTGCACTCAGCAGGG Figure 1 Construction of H-chain and L-chain. Fragments of L-chain and H-chain were connected by overlap PCR, primers were shown in Table 1. The H-chain and L-chain were double digested, separately and then linked with digested vectors 鉴定阳性克隆送上海美吉生物公司测序 CHO-k 细胞的培养及脂质体法转染 CHO-k 细胞用含 10% 新生牛血清的 DMEM 高糖培养基, 于 37 5% CO 2 的培养箱内贴壁培养 ; 隔天更换培养基, 细胞长至 95% 汇合度时用 0.25% 胰蛋白酶消化传代 取对数期 CHO-k 细胞铺 24 孔细胞培养板, 细胞数为 1 10 5 / 孔, 待细胞恢复生长状态, 采用 Life Technologies 公司的 Lipofectamine 2000 脂质体转染试剂盒, 参照说明书将重组质粒转染 CHO-k 细胞, 同时设置阴性对照组 转染 6 h 后更换无血清高糖 DMEM 培养基培养 72 h, 收集上清液 Protein A 亲和层析柱小样纯化取 72 h 培养基上清液, 4 8 000 r min 1 离心 10 min 去除细胞碎片, 参照 GE 公司 Hi-Trap Protein A 柱说明书, 用 20 倍柱体积 (column volume, CV) 平衡缓冲液平衡 Protein A HP 预装柱, 充分去除乙醇和杂质后上样 (<10 mg), 5CV 平衡缓冲液去除非特异性吸附后用洗 脱液洗脱至流出液 OD 280 < 0.01 整个操作过程流速 均为 1 ml min 1, 经柱纯化的样品用 1 mol L 1 缓冲液调其 ph 至 7.0 左右 Western blotting 检测目的蛋白的表达 Tris 用超滤 管对柱纯化后样品进行浓缩, 浓缩后样品被分为还 原组 ( 加 2% β- 巯基乙醇 ) 和非还原组 使用 10% 分 离胶和 5% 浓缩胶分别对还原与非还原样品进行 SDS-PAGE 分析 将蛋白凝胶电转印至 PVDF 膜, 5% 脱脂奶粉 37 封闭 2 h 后加入鼠抗人 IgG1-HRP 单克 隆抗体 (1 1 000), 37 孵育 1 h 后用 TBST 洗膜, 滴 加 ECL 发光显色液并用凝胶成像仪曝光拍照 ELISA 检测抗原抗体结合力 对 Mab-04 进行倍 比稀释, 稀释浓度为 (100 50 25 12.5 及 6.25 nmol L 1 ), 包被量为 100 μl/ 孔, 4 包被过夜, 每个 浓度做 3 个复孔 PBS 洗 3 次后, 加入 8% 脱脂牛奶, 37 封闭 2 h 0.1% PBST 和 PBS 各洗 3 次, 每次洗 5 min, 将 KDR3 单链抗体稀释至 1 000 nmol L 1, 每 孔加入 100 μl, 孵育后依次加入 His 标记鼠单抗 (1 2 000), HRP 标记羊抗鼠 IgG (1 5 000), 37 孵 育 1 h 后洗 5 次, 各孔加底物液 TMB 100 μl, 避光显 色 20 min 后, 用 2 mol L 1 H 2 SO 4 终止反应 酶标仪 读取 OD 450 及 OD 650 值 结果 1 轻重链基因的扩增和 pcdna3.1-h-chain 及 pcdna3.1-l-chain 重组质粒的构建和鉴定 Mab-04 重链片段 PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电 泳检测 ( 图 2), 在 306 bp (VH, lane 1) 436 bp (CH 1, lane 2) 及 750 bp (IgG1 Fc, lane 4) 均出现目的条带, 并在 736 bp (VH-CH 1, lane 3) 及 1 447 bp (H-chain: VH-CH 1 -IgG1 Fc, lane 5) 出现通过 overlap PCR 拼接 获得产物分子量相当的条带, 测序结果正确 将合成好的 PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳检 测, 在双酶切连接 L-chain (Hind III 及 Xba I) 的
李致科等: 抗 VEGFR-2 全人源 IgG1 抗体的构建及其在 CHO-k 细胞中的表达 1547 有条带, 同时阳性对照 (scfv-fc 融合抗体, 图 4B, lane 2) 在 60 kd 处有条带, 阴性对照 CHO-k 细胞培 养上清液呈阴性反应 (图 4B, lane 3), 说明瞬时转染 的 Mab-04 没有在细胞内发生装配错误, 且其表达量 约为 1 μg ml 1 Figure 2 Amplification of H-chain by PCR. Lane M: Marker; Lane 1: Heavy chain variable region (VH, 306 bp); Lane 2: Heavy chain constant region 1 (CH 1, 436 bp); Lane 3: Heavy chain variable region-constant region 1 (VH-CH 1, 736 bp); Lane 4: IgG Fc fragment (750 bp); Lane 5: Heavy chain (H-chain, VH-CH1-Fc, 1 447 bp) pcdna3.1 产物在 750 bp 出现与 L-chain 分子量相当 的条带 (图 3A, lane 2); 双酶切 H-chain (Hind III 及 EcoR I) 的 pcdna3.1 产物在 1 500 bp 出现与目的片 段大小相当的条带 (图 3B, lane 1), 与预期结果相 符 切胶回收后送上海美吉生物公司测序, 测序结果 正确, 表明重组质粒构建成功 Figure 4 Target protein expressed by transient transfected CHO-k cells detected by Western blotting. A: Non-reduced SDS-PAGE; lane 1, empty CHO-k cell culture (negative control); lane 2, L-pcDNA3.1 & H-pcDNA3.1 co-transfect CHO-k culture (full length IgG: 150 kd); lane 3, scfv-fc recombinant protein (dimer of scfv-fc: 120 kd, 1 μg ml 1) expressed by recombinant CHO-k cell. B: Reduced SDS-PAGE; lane 1, L-pcDNA3.1 & H-pcDNA3.1 co-transfect culture (H-chain: 50 kd; L-chain: 25 kd); lane 2, scfv-fc recombinant protein expressed by recombinant CHO-k cell (single scfv-fc: 55 kd); lane 3, empty CHO-k cell culture (negative control) 3 Mab-04 与 KDR 的 ELISA 检测 横 坐 标为 浓 度梯 度 稀释的 Mab-04, 纵 坐标 为 OD450 与 OD650 的差值, 阴性对照为 PBS 溶液, 阳 性对照为 100 nmol L 1 KDR3 (图 5) KDR3 与不同 稀释度 (6.25 12.5 25 50 及 100 nmol L 1) 的 Mab-04 均可发生结合反应 (mean ± SE, n = 3, P < Figure 3 Construction of recombinant plasmids. A: Lane M, DNA marker; lane 1, double digest pgs1-l-chain ( Hind III and Xba I), L-chain (750 bp); lane 2, double digest pcdna3.1l-chain (Hind III and Xba I), L-chain (750 bp). B: Lane M, DNA marker; lane 1, double digest pcdna 3.1-H-chain ( Hind III and EcoR I), H-chain (1 447 bp) 2 0.05), OD 450 与 OD650 的差值与 Mab-04 的浓度呈正相 关, 说明 Mab-04 具有与 KDR3 结合的能力且其 IC50 值为 50 nmol L 1 全长抗体基因瞬时转染 CHO-k 细胞表达抗体 Western blotting 检测 非还原条件下, CHO-k 细胞培养上清液呈阴性反 应 (图 4A, lane 1), Mab-04 在 150 kd 处有条带 (图 4A, lane 2), 本实验室已构建 scfv-fc 融合抗体作为阳性 对照, 于 120 kd (scfv-fc 二聚体, 1 μg ml 1) 处有条 带 (图 4A, lane 3), 说明瞬时转染可以表达四聚体形 式的完整 IgG1 样 Mab-04 在还原条件下, Mab-04 (图 4B, lane 1) 在 50 kd (重链) 及 25 kd (轻链) 处均 Figure 5 Target protein combined with KDR3 detected by ELISA assay (mean ± SE, n = 3, P < 0.05). Positive control: 100 nmol L 1 KDR3; Negative control: PBS solution; Mab-04: 6.25 100 nmol L 1; IC50: 50 nmol L 1
1548 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (10): 1544 1549 讨论 目前, 单克隆抗体在肿瘤的治疗和诊断方面得到 了广泛应用, 以 VEGF/VEGFR 为靶标, 封闭 VEGFR 竞争性抑制 VEGF 与 VEGFR 的结合等方向研发抗血 [12] 管生成抗肿瘤药物已取得了很大进展 如 Willett 等 研究发现抗 VEGF 单克隆抗体贝伐单抗 (Avastin) 能 抑制结肠癌患者肿瘤血管灌注及扩张, 降低肿瘤微 血管密度及组织液压并减少活性血管内皮细胞数量 本课题组基于全人源合成噬菌体抗体库中筛选 得到单链抗体 (scfv) 并验证了其可以抑制人内皮静 脉细胞增殖与迁移 [10] 与该 scfv 相比, Mab-04 的可 变区与其完全一致, 即可以识别相同的抗原决定簇, 发挥相同的生物学功能 ; 此外, Mab-04 含有 Fc 片段, 可以增强抗体的体内作用并可作为亲和标签简化纯 化步骤 [13, 14] 与 scfv-fc 融合抗体相比, Mab-04 构象 更接近天然人免疫球蛋白, 可以完全发挥抗体恒定 区的全部作用, 提高抗体可变区的亲和力以及相应 药效 [15] 与市售相似靶点抗体相比, Mab-04 是基于全 人源合成噬菌体抗体库中筛选 scfv 构建的全长抗体, 从根本上防止了鼠源性抗体或者嵌合抗体应用于人 体后产生强烈的人抗鼠抗体反应 (human anti-mouse antibody, HAMA) [16] 本研究在前期构建时发现, Overlap PCR 中两个 目的片段大小相仿能提高其成功率, 以本课题中重 链构建为例 : 宜先将 VH 及 CH 1 基因片段拼接为 VH- CH 1 (736 bp) 片段, 再与 IgG1 Fc (750 bp) 片段拼接 获得全长重链基因 在转染的方法方面, 脂质体法转 染操作手册上介绍细胞表达蛋白时间为 24~96 h, 实际表达过程中作者发现, 并不是表达的时间越长 越好, 以 Mab-04 为例 : 最佳表达时间为 72 h, 延长时 间蛋白表达量反而会降低 推测是由于 72 h 后 CHO-k 细胞状态逐渐变差, 细胞裂解物释放于培养基内, 这 会导致已经表达抗体发生降解 Western blotting 实验 显示 Mab-04 成功表达, 但表达量偏低 这可能是由 于 pcdna3.1 表达载体或转染方式限制所致, 故在后 续的研究工作中, 可以从优化载体或通过更换电击 转染方式入手, 来提高 Mab-04 的表达量并筛选稳定 高产细胞株 ELISA 检测证明抗体 Mab-04 与抗原结 合呈浓度依赖性, 验证了本研究的可行性, 为后续稳 定转染筛选稳定细胞株 大量制备抗 VEGFR-2 全长 抗体等工作奠定了基础 此外, 针对全长抗体分子大 组织穿透性差以及 临床使用剂量大 生产成本高的问题, 抗体药物偶联 物 (antibody drug conjugates, ADCs) 已日渐成为抗 [17, 肿瘤抗体药物研发的新热点 18] 而 IgG1 样抗体由 于分子量大且其构象接近天然抗体, 拥有较多药物 偶联位点, 对抗原有高亲和力, 并且在导向性和载药 量上有较大优势, 因而成为目前已批准上市的大部 分 ADCs 中首选的抗体类型 [19] 本文构建的 IgG1 样 抗体 Mab-04 为全人源抗体, 与已上市 ADCs 中鼠源 抗体及人鼠嵌合抗体相比免疫原性小, 以其为抗体 制备 ADCs 也会成为一个重要的研究方向 References [1] Rapisarda A, Melillo G. Role of the VEGF/VEGFR axis in cancer biology and therapy [J]. Adv Cancer Res, 2012, 114: 237 267. [2] Vecchiarelli-Federico LM, Cervi D, Haeri M, et al. Vascular endothelial growth factor a positive and negative regulator of tumor growth [J]. Cancer Res, 2010, 70: 863 867. [3] Kiselyov A, Balakin KV, Tkachenko SE. VEGF/VEGFR signalling as a target for inhibiting angiogenesis [J]. Expert Opin Investig Drugs, 2007, 16: 83 85. [4] Hsu JY, Wakelee HA. Monoclonal antibodies targeting vascular endothelial growth factor: current status and future challenges in cancer therapy [J]. BioDrugs, 2009, 23: 289 304. [5] Aaron LN, Eugen D, Janice MR. Development trends for human monoclonal antibody therapeutics [J]. Nat Rev Drug Discov, 2010, 39: 767 774. [6] Wang X, Das TK, Kumar S, et al. Potential aggregation prone regions in biotherapeutics: a survey of commercial monoclonal antibodies [J]. MAbs, 2009, 1: 254 267. [7] Reichert JM. Marketed therapeutic antibodies compendium[j]. MAbs, 2012, 4: 413 415. [8] Robert LF, Elizabeth MJ, Soldano F. Tumor antigentargeted, monoclonal antibody based immunotherapy: clinical response, cellular immunity, and immunoassayed [J]. J Clin Oncol, 2010, 28: 4390 4399. [9] Mulder K, Scarfe A, Spratlin J, et al. The role of bevacizumab in colorectal cancer: understanding its benefits and limitations [J]. Expert Opin Biol Ther, 2011, 11: 405 413. [10] Zhang J, Li H, Wang X, et al. Phage-derived fully human antibody scfv fragment directed against human vascular endothelial growth factor receptor 2 blocked its interaction with VEGF [J]. Biotechnol Prog, 2012, 28: 981 989. [11] Yang YL, Zhang J, Wang M, et al. Construction of anti- VEGFR-2 scfv-fc fusion antibody and stable expression in CHO-k cells [J]. Pharm Biotechnol, 2011, 18: 206 210.
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